Summary
ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア リング方法を提示します。
Abstract
クラスター化された定期的に散在させていて回文繰り返し (CRISPR) - CRISPR - に関連したタンパク質 9 (Cas9) 原核生物の適応免疫の防衛システムが抱き込まれてしまった正確な真核生物ゲノム工学のための強力なツールとして線虫のゲノムの点変異の効率的で正確な世代キメラ シングル ガイド Rna (sgRNA) と CRISPR Cas9 Ribonucleoproteins (結合) を使用して迅速かつ簡単な方法を紹介します。SgRNA ターゲットの選択、ホモロジー監督修復 (HDR) テンプレート デザイン、CRISPR Cas9 RNP 錯化と配信、および正しく編集した動物の堅牢かつ迅速な同定を可能にする遺伝子型戦略のパイプラインについて述べる。我々 のアプローチは、変異動物安易な世代とゲノムの任意の場所の同定が可能だけでなく、高効率および減らされたスクリーニング作業負荷で約 4-5 日で他の複雑な塩基の対立遺伝子の検出を容易にも。
Introduction
最近の技術の進歩が根本的に形質転換し、正確にエンジニアのゲノムに能力を加速します。特に、RNA 誘導エンドヌクレアーゼの興味のターゲット シーケンスに近い二重鎖切断 (DSB) を誘導する Cas9 に頼る、CRISPR Cas9 システムは広くモデル有機体の使用の大半のゲノムを正確にエンジニアに使用されています生物医学研究1,2,3,4。大幅に CRISPR Cas9 の使用は、ゲノムはc. の elegans5のような困難な種でも編集ロックを解除が。種に関係なく編集システム基づく CRISPR Cas9 ゲノムと点突然変異を生成する 3 つのコア コンポーネントに依存しています: 1) Cas9 エンドヌクレアーゼ、ターゲット シーケンスと 3) 設計ユーザーに Cas9 エンドヌクレアーゼを指示する 2) シングル ガイド RNA (sgRNA)2興味の目的の編集を含むホモロジー監督修理 (HDR) テンプレートです。
ターゲットの sgRNA と Cas9 を紹介するために使用できるいくつかの方法があるプラスミッド、RNA ウイルス ベースの配信方法6などのセルにヌクレアーゼ。最近、中古複合 sgRNA Cas9 Ribonucleoproteins (結合) の直接配信は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム編集7で強力で効率的なツールとして浮上しています。中古複合 CRISPR Cas9 結合の直接配信はいくつかのメリット、すなわち: 1) 結合細胞のトランスクリプションのための必要性のバイパス、翻訳、2) 結合が急速にクリアされ、特異性を増加するには可能性があります利用可能な時間の短縮オフ ターゲット胸の谷間、そして 3) 結合に非ネイティブのシーケンスをランダムな統合により宿主ゲノムに導入を回避する外国の DNA ・ RNA 要素が含まれていません。一緒に、これらの属性の可能性が高いターゲットに CRISPR 編集オフターゲット効果を最小限に抑えながらの短いバーストを提供します。
線虫 c. エレガンスのサイト固有の genomic 変更を導入するための簡単かつ効率的なプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、ターゲットに正しく編集した動物を明確に同定のジェノタイピング戦略と配信、sgRNA Cas9 RNP 錯単一鎖オリゴヌクレオチド (ssODN) HDR テンプレート デザイン sgRNA 含まれています。この戦略を使用すると、目的のサイト固有の変更を回復できる、だけでなく他の非特定塩基の変異を回復も可能性があります。したがって、当社の戦略は、1 つの戦略を使用してモノラル対立、bi 対立、対立シリーズの生成を許可、F1世代で塩基変異を生成できます。
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Protocol
すべての動物の世話と実験手順は、国立衛生研究所と動物介護施設使用委員会 (IACUC)、ミシガン大学からガイドラインを追った。RNase フリー ソリューションを使用して、ピペットのプロトコル全体のヒント。RNase 除染液が製造元のガイドライン (表を参照)、次に作業領域、ピペット、チューブ、および遠心分離機をきれい。
1. sgRNA ターゲットの選択
- Web ブラウザーを使用して web ページを開く: http://crispor.tefor.net8
- 興味の目的の編集を並ぶシーケンスの ~ 60 塩基対 (bp) を入力 (つまり30 bp 5' と 3' の目的の編集)。
- 線虫ゲノムをプルダウン メニューから選択します。
- Protospacer 隣接するモチーフを選択 (20 bp NGG - SpCas9、SpCas9-HF1、eSPCas9 1.1) プルダウン メニューから。
- [送信] をクリックします。結果ページで、関心の編集に最も近い上位ランク ターゲット シーケンスを選択します。並ぶ 60 bp 入力シーケンス内の適切なターゲット ・ サイトがない場合は 100 までクエリ シーケンスを展開 bp (すなわち50 bp 目的のいずれかの側を編集)。
- 利用可能なソース、例えばsynthego から以下の仕様で 20 mer ターゲット sgRNA を取得: 3 nmol;変更はありません。
- 受領後、遠心チューブを含む凍結乾燥 sgRNA > 室温で 1 分間 12,000 × g。チューブにヌクレアーゼ フリーのテの 60 μ L を追加し、軽く P200 ピペットを使用して 15-20 回上下ピペッティング再停止します。最終濃度は 50 μ M です。
2 相同監督修復テンプレート デザイン
- SsODN の HDR テンプレート含む設計: 最初と最後の変異を並ぶ 4) 50 bp 5' と 3' の相同性腕 3) NGG PAM シーケンス内で Gs の一方または両方のサイレント突然変異、2) ユニークなフレームに制限酵素サイト 1) 関心の突然変異。(図 1)9,10。
- NGG PAM 一連の突然変異が可能でない場合は、ssODN ヘッダー テンプレートの sgRNA を介した胸の谷間を防ぐために sgRNA ターゲット認識シーケンス内で 5-6 サイレント変異をご紹介します。
- 使用可能なソース、例えばidtdna から次のパラメーターを「Ultramer DNA オリゴヌクレオチド」を取得: スケール: 4 nmol;定式化: どれも;浄化: 標準脱塩。
- 受領後、遠心チューブを含む凍結乾燥 ssODN > 室温で 1 分間 12,000 × g。軽く P200 ピペットを使用して 15-20 回上下ピペッティングによるにヌクレアーゼ フリー ddH2O の最終濃度 100 μ M の ssODN を中断再。
3. 設計遺伝子型プライマー
- 400 ~ 700 bp PCR 増幅11を生成するゲノム修飾を側面に設定プライマーを設計します。
- シングル、特定私アンプリコン11を生成する PCR サイクリング条件を最適化します。
4. 注入ミックスを準備します。
- 2 分 4 ° C で最大速度でテーブル 1試薬を遠心分離します。
- 順番は、ヌクレアーゼ フリー PCR チューブに表 1試薬を追加します。
- P20 ピペットでピペッティング 10 回上下に優しくによって徹底的にミックスします。
- 注入ミックス室温で 10 分間、インキュベートします。
5. 注入のプロトコル
- 注入ミックス12の約半分をインジェクション ピペットをロードします。注射針は下駄や中断に備えて注入ミックスの残りを保存します。
- 20 ~ 30 p.s.i. は、段階的な流れるソリューション12を生成できるように、マイクロ ピペット チップを破る。
注: より大きい直径のヒント否定的動物の健康に影響を与えるし、F1後代の収量を減少させます。 - 注入 10-15 若い成虫は両方生殖腕の中で可能であれば12。ない場合は、片腕生殖腺への注入で十分です。
- OP50 シード 35 線虫成長メディア (NGM) プレートに注入された動物 (P0) 室温で 1-2 時間を回復するを許可します。その後、白金線ワームを使用して個々 の OP50 シード 35 mm NGM プレートに単一の注入 P0動物は12を選ぶ。
6. 画面 P0板と単一 mCherry(+) F1s
- 2 日間投与後、蛍光顕微鏡を用いた咽頭で mCherry を表現する F1子孫を含んでいる P0版を識別する (図 1一日 2-3)。ほとんどの mCherry(+) F1動物を含む 3 つの P0プレートを選択します。
- シングル 24 36 mCherry(+) F1のワームを使用しての合計のための 8-12 mCherry(+) F1動物選ぶ、3 つの選択した P0プレートから (図 1一日 2-3)。
注: mCherry(-) 動物はこれらの P0プレートからも指摘することができますが、正しく識別する確率はあまり動物の編集 (図 2 a) を下げます。 - 個々 の F1s を self-fertilize し、室温で 1 〜 2 日のための卵を産みます。
7. シングル ワーム PCR および遺伝子型解析
- 産卵の 1-2 日後に、ワーム ピック (表 2図 1一日 4-5) を使用してワームの換散バッファーの 7 μ L を含む個別 PCR ストリップ管キャップに F1s を転送します。
- 遠心チューブ下部に動物をもたらす、-80 ° C 1 時間で管を固定するために室温で 1 分最大速度で PCR チューブ。
注: ワームが-80 ° C で不明確に保存されます。 - 次のプログラムを使用してたちで冷凍ワームを溶解: 95 ° C、15 分、60 分の 60 ° C 4 ° C を保持します。
- セットアップ PCR マスター ミックス表 3に示すように。
- きれいな PCR チューブに PCR マスター ミックスの 21 μ L を追加し、手順 3 からワームの換散の 4 μ L を追加します。ピペットを使用してミックスし、PCR プログラム (材料表参照) 製造業者の指針を次を実行します。
- 製造元の指示に従って、DNA 清潔濃縮キットを使用して PCR 反応を浄化 (材料表を参照してください)。スピンの列に 10 μ L の水を追加することによって DNA を溶出します。
- 表 4に示すように、セットアップ制限酵素マスターをミックス。
- 各洗浄の PCR 反応に制限酵素マスターミックスプロの 10 μ L を追加し、37 ° C13で 1-2 時間インキュベートします。
- 個別は、120 V 1 × トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファー14の使用で実行 1.5% の agarose のゲルの PCR の製品を消化しました。
8. 識別と編集された動物のシーケンスの検証
- 潜在的な編集動物14 (図 14-5 日) を示すバンドの存在のため消化酵素サンプルを確認します。
注: は、バンドのサイズおよび/またはバンディング パターン予期しない、複雑な制限の酵素の消化力の変化として観察することができます潜在的な塩基変異を識別するために N2 コントロールを読み込みます。 - 潜在的な編集した動物を識別した後ワーム換散の残りの 3 μ L を使用し、PCR 反応を繰り返します。きれいにしていないか、プログラムが完了した後、制限酵素は PCR 反応を消化します。別 1% の agarose のゲルの PCR の反作用をロードし、ゲル抽出キット15を使用してバンドを抽出 (材料表を参照してください)。
- サンガー シーケンス16ゲルが F1 のプライマーを使用して正しく編集した動物 (図 1 a) を識別する DNA を抽出
注: 読み取りは、ヘテロ野生型の存在のためのピークをオーバーレイし、対立遺伝子を設計しました。 - 取得してホモ動物検証ヘテロ接合体の編集された動物、単一 8 122動物 7-8 の手順に従います。
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Representative Results
人間スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症、麻痺と死の17に必ずや壊滅的な神経変性疾患の 10 ~ 20% を占めます。ヒト SOD 1 です (図 1 b) c. の elegans SOD 1 タンパク質と 55% のアイデンティティおよび 70% の類似性を共有進化上保存されたタンパク質です。シンプルさ、可能性、CRISPR Cas9 RNP ベースのアプローチの効率を示すためには、ワームのゲノム (図 1 a) 疾患関連の人間 G93A バリアントを紹介する線虫 sod 1遺伝子を対象とします。
線虫ゲノム G93A 変異をエンジニアに、sgRNA が選ばれたが PAM 認識サイトに座っている 3 bp 上流 G93 コドン (図 1)。我々 は、ssODN HDR 修理テンプレートを含む設計: A93 G93 コドンに変換する 1) ヌクレオチドの変更 (GGA GCA) 2) NGG PAM にサイレント変更シーケンス (CGG CAG) HDR テンプレート、3) サイレント突然変異 (CT) の sgRNA Cas9 仲介された胸の谷間を防ぐためにします。遺伝子型、及び 4 のユニークな HindIII 制限酵素サイトを紹介) 50 bp 5' と 3' の相同性の腕 (図 1)。PCR プライマー セット (F1 R1) は、N2 コントロール (図 1 a) で単一 592 bp PCR の製品を生成する設計されました。SgRNA を含む注入ミックス、Cas9、ssODN、蛍光マーカー プラスミド (pCFJ90) が混在、室温で 10 分間インキュベートされマイクロインジェクション ピペットに読み込まれます。
図 1は、インジェクション ピペットに注入ミックスが読み込まれた後、ワークフローを示しています。0 日 10-15 P0動物は標準的なマイクロインジェクション法18,19を使用して 1 つまたは両方の生殖腺腕に注入されました。注入された動物に 1-2 時間回復し、OP50 シード NGM プレート上個別にメッキされたし。2 〜 3 日後成功した P0注射は mCherry(+) F1子孫を持っているそれらによって識別されました。トップの 3 つの P0プレート (すなわちmCherry(+) F1s の最大数を有するもの) その後の分析のために選ばれました。これらの 3 つのプレート (P0-8、P0-10, P0-12) から、8 mCherry(+) F1s は個々 OP50 シード 35 NGM プレート 24 mCherry(+) F1s の合計のために選抜しました。産卵 (一日 4 - 5) の 2-3 日後、個々 の F1s がワームの換散バッファーを含む PCR チューブに移され、-80 ° C で 1 時間の冷凍その後、F1s だったゲノム DNA を解放するために分離、PCR を受けます。PCR の製品がその後、精製 HindIII 1 h の消化し、1.5% の agarose のゲルの実行可能性を識別するために動物を編集します。正しく編集した動物、HindIII 消化を切るフルレングスの PCR の製品 (592 bp) 370 の 2 つのバンドに bp と 222 bp。野生型間この遺伝子多型の戦略で明確に区別する (592 bp)、ヘテロ (592, 370, 222 bp) とホモ接合体 (370、222 bp) 動物。図 2 aは、24 の mCherry(+) 動物のジェノタイピングの結果を示しています。
ゲノム育種の蛍光 mCherry マーカーを富ませることを示すため、また 3 P0板のそれぞれから 8 mCherry(-) 動物を選んだ。24 mCherry(+) F1s の上映 (赤いバー)、10 含まれているモノラル対立または bi 対立に変更 (42%)、10 野生のタイプ (42%) だった 3 が潜在的なオクターリピート (13%)、および 1 の PCR エラー (図 2 a) が発生しました。対照的に、上映 24 mCherry(-) F1s ののみ 1 動物は正しく変更された (4%); 23 は、野生のタイプ (96%) だったに対し、(図 2 a)。ゲルの抽出された PCR の製品 (18-6 F)、忠実にこのホモ接合体 F のゲノムに組み込まれた正確なヌクレオチドの変更が ssODN ヘッダー テンプレートで設計されていることを示す、図 2 bはフルの長さからクロマト グラムを示しています1動物。特に、F1動物 10-7、10-8、および 12-3 展示予期しない PCR の製品のサイズと制限のダイジェスト バンディング パターン、これらの動物は、複雑な塩基変異 (図 2 a) を運ぶことができることを示唆します。したがって、本手法はだけ使いやすさ、効率と忠実度、必要なゲノムの変更を生成することがない、同定と遺伝子の機能に重要な予期しない洞察力を当てることがありますユニークな塩基の対立遺伝子の回復ができます。
図 1.CRISPR Cas9 エンジニア リング、 c. の eleganssod 1 軌跡。(A) C. の elegansのsod 1座のエクソン ・ イントロン構造を表す模式図。赤色のバーは、G93 エクソン 3 の位置を示します。プライマーのペア セットは赤い矢印 (F1 R1) で指摘しました。(B) 人間と線虫(ワーム) SOD 1 蛋白質のマルチプルアライメントします。ターゲットを絞った G93 残渣は、赤色でハイライトされます。(C)上部、G93 コドンを囲むゲノム DNA のセクションは、参照として表示されます、パム (緑) と sgRNA (青) のターゲット ・ サイトが強調表示されます。下、単一鎖オリゴヌクレオチド (ssODN) 相同性監督を含む修理 (HDR) テンプレートが表示されます: sgRNA Cas9 複合体による胸の谷間を防ぐために PAM モチーフにサイレント変更 A93 G93 に変更するコドン編集サイレントに変更ユニークな HindIII 制限酵素サイト (イエロー ボックス) を紹介し、(黒いバー) の武器 5' と 3' 50 bp ホモロジーを並ぶします。SsODN で設計されたすべてのヌクレオチドの変更が強調表示された赤です。(D) を生成し、CRISPR Cas9 RNP ベースのポイント突然変異を識別するためのパイプラインの模式図。0 日注入ミックス 10-15 P0動物を注入します。2 3 日目蛍光 F1子孫を含むそれらによって正常に挿入された P0動物を識別し、大部分の蛍光灯の子孫と 3 P0プレートを選択します。3 つの P0板から、単一の 8 蛍光 F1子孫を実行します。(A) の手順 1 4 5 日目で個々 の F1s が選ばれ、換散バッファー; を含む PCR チューブに配置(b) 手順 2 F1ワームを含む PCR チューブを-80 ° C で凍結後、PCR のテンプレートとして使用される DNA を解放するため分離が。PCR の製品は洗浄し、; ユニークな制限の酵素と消化(c) ステップ 3、消化酵素が野生の agarose のゲルの製品が解決型 (+ +)、ヘテロ接合体 (m/+)、ホモ (m/m) 動物は制限のダイジェストのバンディング パターンによって識別できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.遺伝子多型データ sod 1 (G93A) 変異体.(A)F のゲル画像個別に1動物によって、PCRed および HindIII で消化します。各 P0板 (P0-8, P0P0-12-10)、8 mCherry(+) と 8 mCherry(-) F1動物を行った。モノラル対立 (青ナンバー) と bi 対立 (赤い数字) 編集した動物が回収されました。サイズにシフト PCR の製品か消化バンドは回収されたも予期せぬ HindIII で塩基変異体 (黄色ナンバー) を示しています。N2 コントロールは、PCR の製品のサイズと酵素の特異性への参照として表示されます。(B)上部、コドン間隔およびアミノ酸翻訳野生型 (WT) の上に表示されて、下 G93A のストランドを変更します。目的の編集が赤いボックスで強調表示され、フレームの HindIII 制限サイトを作成サイレント変更は、黄色のボックスで強調表示されます。すべての設計されたヌクレオチドの変更は太字で示されます。下からホモ F1動物 8-6 代表的なクロマト グラム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬 | ボリューム | 最終濃度 |
| ddH2O | 6.3 Μ L | ---- |
| KCl (4 M) | 0.94 Μ L | 300 mM |
| HEPES (0.5M) pH 7.4 | 0.5 Μ L | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μ L) | 1.25 の Μ L | 2.5 ng/μ l |
| ssODN (500 ng/μ L) | 1.25 の Μ L | 50 ng/μ l |
| sgRNA (50 μ M) | 1.25 の Μ L | 5 Μ M |
| Cas9 (61 μ M) | 1.03 Μ L | 5 Μ M |
| 最終巻 | 12.5 Μ L | ---- |
テーブル 1。CRISPR Cas9 RNP 注入ミックス。すべての試薬はヌクレアーゼ フリー ddH2O. RNase 無料テクニックを使わなければ、注入ミックスを行う際に試薬を処理するときに再度中断する必要があります。
| 試薬 | [Final] |
| KCl | 50 mM |
| トリス塩酸 pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| NP 40 | 0.45% |
| トゥイーン 20 | 0.45% |
| プロテイナーゼ K | 1 mg/mL |
表 2。ワーム換散バッファー調理法。プロティナーゼ K 新鮮な各使用する前に追加してください。
| 試薬 | 1 x | 04: |
| Q5 マスター ミックス × 2 | 12.5 Μ L | 300 Μ L |
| プライマー F1 (10 μ M) | 1.25 の Μ L | 30 Μ L |
| プライマー R1 (10 μ M) | 1.25 の Μ L | 30 Μ L |
| ワームの換散 | 4 Μ L | ---- |
| ddH2O | 6 Μ L | 144 Μ L |
| 最終巻 | 25 Μ L | 504 Μ L |
表 3。PCR マスター ミックス。PCR マスター ミックスでピペッティング ソリューションが均一になるまでよく混合されるべき。きれいな PCR チューブ PCR マスター ミックスの 21 μ L を追加必要があり、ライセート個々 のワームの 4 μ L 正しくラベル付けされた管に追加する必要があります。
| 試薬 | 1 x | 04: |
| 酵素バッファー x 10 | 2 Μ L | 48 Μ L |
| 洗浄された PCR の反作用 | 10 Μ L | ---- |
| ddH2O | 7 Μ L | 168 Μ L |
| 制限酵素 (10 U/μ L) | 1 Μ L | 24 Μ L |
| 最終巻 | 20 Μ L | 240 Μ L |
表 4。マスター ミックス制限酵素。制限酵素マスターミックスプロでピペッティング ソリューションが均一になるまでよく混合されるべき。10 μ L の PCR の製品をきれいに制限酵素マスターミックスプロの 10 μ L を追加します。
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Discussion
CRISPR Cas9 システムのモデル生物のゲノムを正確に変更するための強力かつ効果的なツールです。ここでは、そのキメラ sgRNAs20と相まって ssODN HDR 有効テンプレートに線虫の遺伝子の点変異の高効率生成を示します。重要なは、示す共同選択マーカーとして使用する蛍光 RNP 配信が編集効率を生成する使いやすさと手法の信頼性を強調.
線虫ゲノム工学 CRISPR Cas9 メソッドの大半は、特定の遺伝的背景や co CRISPR 戦略1に依存します。Co CRISPR メソッドは、成功したゲノム編集を得ることの可能性を増加させる非常に便利なツールであると証明しました。しかし、co CRISPR メソッドは豊かに関心のゲノム編集用マーカーの軌跡で表現型が選択可能な編集を導入することを必要です。一方、強力な選択可能な表現型ベアリング変異導入望ましくないかもしれない場合編集するひずみまたは自体興味の目的の点突然変異表現型悪化またはマーカーの表現型によって抑制される可能性があります。また、co CRISPR 戦略ターゲット オフの効果に貢献するかもしれないマーカー遺伝子座で、追加の二重鎖切断を作成する必要があります。適切なゲノム編集に正常に挿入された P0動物を識別するだけでなく、豊かにも過渡蛍光マーカーを使用する方法を紹介します。我々 のデータを示すこのメソッドは大幅非蛍光性動物と比較して正常に編集した動物の豊かし、いくつかの明確な利点を提供します: 1) のみ、1 つのサイト固有の sgRNA をターゲットが必要、2) Cas9 の割増の低減とsgRNA 濃度、3) ひずみと表現型の選択の独立、および 4) 公称スクリーニング作業負荷 (〜 24 F1s)。堅牢な CRISPR Cas9 ゲノム編集 F1世代では、このメソッドを使用して観察されました。特に、説明されている PCR 制限酵素ベースの検出方法は F1世代のモノと bi 対立編集された動物の明確な検出を有効。 にします。最後に、遺伝子多型の戦略を容易に観察できる時にシフトを PCR バンドの潜在的なの塩基変異の同定でない N2 コントロールに比べて制限のダイジェストや複雑な利回りに影響を受けやすいときバンドを消化します。
出現次世代の大規模なゲノムの努力と相まってシーケンスは病気21分離ゲノムの亜種の同定を加速しています。ただし、病原性の機能テストないで実証されている亜種の大半の細胞および個体モデル システム。本研究では、広く研究を紹介する線虫でsod 1遺伝子を対象とした ALS 関連 SOD 1G93A変異。までに、この突然変異はモデル化し、線虫マウス遺伝子の過剰発現は主に使用されています。動物モデルにおける変異の発現可能性があります携帯電話のキーを要約するだろう、病気の分子と行動の側面が '量' が22の表現型を決定する際に酌量すべき要因であることはますます明確。たとえば、~ 24 変異ヒト SOD 1 遺伝子のコピーを運ぶ高コピー数 SOD 1G93Aマウスのみ 8 〜 10 コピー23,24を運ぶ SOD 1G93Adlマウスと比較して大幅に加速の病気の経過を表わします。ここでは、急速により正確に遺伝子を複製するために遺伝子発現を必要とせずオーソログ ワーム遺伝子で人間バリアント関連変異体を生成する CRISPR ベース Cas9 RNP の手法を利用できることを示す疾患のコンテキスト。本手法は、生成し、内因性の規制と排除過剰発現の範囲の式のコンテキストで不明な意義のゲノムのバリエーションをテスト可能なプラットフォームを提供します。最後に、我々 もタグ内因性遺伝子蛍光タンパク質 (すなわちGFP)、蛋白質のローカリゼーション、集約、および売り上げ高の変形の影響を可視化する追加のツールを提供するのにこのメソッドを使用しています。
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Disclosures
頼むこの原稿の批判的研究室のメンバーに感謝いたします。系統は、線虫の遺伝学センター研究インフラストラクチャ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。頼む研究室での研究は NIH (R01 NS094678) や筋ジストロフィー協会 (MDA382300) からの補助金によってサポートされて A.A.B. に
Acknowledgments
このレポートに関連する利害の関係はありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
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