Summary
Här presenterar vi en metod för att konstruera genomet hos C. elegans med CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins och homologi beroende reparation mallar.
Abstract
De klustrade regelbundet interspersed palindromic repetitioner (CRISPR) - CRISPR - associerade protein 9 (Cas9) prokaryota adaptiva immunförsvaret system har varit adjungerad som ett kraftfullt verktyg för exakt eukaryota genomet engineering. Här presenterar vi en snabb och enkel metod med chimära enda guide RNAs (sgRNA) och CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) för effektiv och exakt generering av genomisk punktmutationer i C. elegans. Vi beskriver ett försäljningsförlopp för val av sgRNA mål, homologi-regisserad reparation (HDR) malldesign, CRISPR-Cas9-RNP komplexbildande och leverans och en strategi för genotypning som gör den stabil och snabb identifieringen av korrekt redigerade djur. Vår strategi inte bara tillåter lättköpt generering och identifiering av önskad genomisk punkt muterade djur, men också underlättar upptäckt av andra komplexa ditsatta alleler i cirka 4-5 dagar med hög effektivitet och en minskad screening arbetsbelastning.
Introduction
Senaste tekniska framsteg radikalt förändrat och accelererade förmåga att just ingenjör genomen. I synnerhet har CRISPR-Cas9 systemet, som bygger på den RNA-guidad Amiiiiin Cas9 att inducera en dubbel strand paus (DSB) nära målet sekvensen av intresse, använts i stor utsträckning att korrekt ingenjör genomet hos majoriteten av modellorganismer som används i biomedicinsk forskning1,2,3,4. Avsevärt, har användningen av CRISPR-Cas9 olåst gen editering även i svåra arter som C. elegans5. Oavsett art, generera punktmutationer med CRISPR-Cas9 baserat genomet redigering system bygger på tre huvudkomponenter: 1) Cas9 Amiiiiin, 2) en enda guide RNA (sgRNA) som styr den Cas9 Amiiiiin till en mål-sekvens, och 3) en användare som utformats homologi-regisserad reparation (HDR) mallen som innehåller de önskade redigering(ar) intresse2.
Det finns flera metoder som kan användas för att införa riktade sgRNA och Cas9 nuclease in celler inklusive plasmid, RNA och viral-baserade leverans metoder6. Nyligen, direktleverans av pre-komplex sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) har vuxit fram som ett kraftfullt och effektivt verktyg i CRISPR-Cas9-baserade genomet redigering7. Direkt leverans av pre-komplex CRISPR-Cas9 RNPs har flera distinkta fördelar, nämligen: 1) RNPs förbifartsleden nöden för cellulära transkription och translation, 2) RNPs rensas snabbt, vilket kan öka specificiteten genom att minska tillgänglig tid för off-target klyvning och 3) RNPs innehåller inga främmande DNA/RNA-element som kringgår införandet av icke-infödda sekvenser i värd genomet genom slumpmässiga integration. Tillsammans ger dessa attribut sannolikt en kortlivad explosion av på målet CRISPR redigering samtidigt minimera off-target effekter.
Vi beskriver ett enkelt och effektivt protokoll för att införa platsspecifika genomiska förändringar i C. elegans. Detta protokoll innehåller inriktning sgRNA och enda stranded oligonukleotiden (ssODN) HDR malldesign, sgRNA-Cas9 RNP komplexbildande och leverans och en genotypning strategi för entydig identifiering av ordentligt redigerade djur. Använda denna strategi, inte bara kan platsspecifika ändringarna återvinnas, men andra icke-specifika ditsatta mutationer kan också återvinnas. Sålunda, vår strategi tillåter generationen av en alleliska serien använder en enda strategi, där både mono-allela, bi-allela, och ditsatta mutanter kan genereras i F1 generationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurens vård och experimentella rutiner följde anvisningen från National Institutes of Health och institutionell djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Michigan. Använd RNase-fria lösningar och Pipettera tips i hela protokollet. Ren det arbetsområdet, pipetter, rör och centrifugera med RNase sanering lösning enligt tillverkaren riktlinjerna (se Material tabell).
1. sgRNA val av mål
- Med hjälp av en webbläsare, öppna webbsidan: http://crispor.tefor.net8
- Ingång ~ 60 baspar (bp) av sekvens flankerande önskad redigera av intresse (dvs. 30 bp 5' och 3' för önskad edit).
- Välj Caenorhabditis elegans genomet från rullgardinsmenyn.
- Välj Protospacer angränsande motivet (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) från rullgardinsmenyn.
- Klicka på Skicka. På resultatsidan, välja sekvensen topp rankade mål närmast redigera sevärdheter. Om det finns inget lämpligt mål platser inom kompletterande 60 bp ingående sekvensen, expandera sekvensen fråga upp till 100 bp (dvs 50 bp endera sidan av önskad edit).
- Från en tillgänglig källa, t.ex. synthego, skaffa en 20-mer mål sgRNA med följande specifikationer: 3 nmol; inga ändringar.
- Vid mottagandet, Centrifugera frystorkade sgRNA innehållande röret vid > 12 000 x g för 1 min i rumstemperatur. Tillsätt 60 µL nuclease-gratis TE i röret, och försiktigt återsuspendering genom pipettering upp och ner 15 - 20 gånger med P200 pipett. Den slutliga koncentrationen är 50 µM.
2. homologi-regisserad reparation malldesign
- Designa en ssODN HDR mall innehållande: 1) mutationen av intresse, 2) en unik i-frame begränsning Amiiiiin webbplats, 3) en tyst mutation av en eller båda av Gs inom NGG PAM sekvensen och 4) 50 bp 5' och 3' armar homologi flankerande första och sista mutationen. (Figur 1 c) 9 , 10.
- Om mutationen av NGG PAM sekvensen inte är möjligt, införa 5-6 tysta mutationer i sgRNA målet erkännande sekvensen att förhindra sgRNA-medierad klyvning av mallen ssODN HDR.
- Från en tillgänglig källa, t.ex. idtdna, skaffa en ”Ultramer DNA oligonukleotiden” med följande parametrar: skala: 4 nmol; Formulering: None; Rening: Standard avsaltning.
- Vid mottagandet, Centrifugera frystorkade ssODN innehållande röret vid > 12 000 x g för 1 min i rumstemperatur. Försiktigt återsuspendering ssODN till en slutlig koncentration på 100 µM i nuclease-fri ddH2O genom pipettering upp och ner 15 - 20 gånger med P200 pipett.
3. design genotypning grundfärger
- Designa en primer ställa flankerande genomet modifiering för att generera en ~ 400-700 bp PCR-amplikon11.
- Optimera PCR cykling villkor att producera en enda och specifika amplikon11.
4. Förbered injektion Mix
- Centrifugera tabell 1 reagenser med maximal hastighet under 2 minuter vid 4 ° C.
- I angiven ordning, lägga till tabell 1 reagenser till en nuclease-fri PCR-röret.
- Blanda omsorgsfullt genom att försiktigt pipettering upp och ner 10 gånger med P20 pipett.
- Inkubera injektion mix för 10 min i rumstemperatur.
5. injektionen protokoll
- Load injektion mikropipett med ungefär hälften av injektionen blanda12. Spara resterande injektion mix om injektionsnålen träskor eller bryter.
- Bryta mikropipett spets så att ~ 20-30 p.s.i. producerar en gradvis flödande lösning12.
Obs: Större diameter tips negativt påverkar djurens hälsa och minska F1 avkomma avkastning. - Injicera 10-15 unga vuxna maskar i båda gonadala armarna om möjligt12. Om så inte är fallet, injektion i en gonadala arm räcker.
- Tillåta injicerade djur (P0) att återvinna för 1-2 h i rumstemperatur på en OP50-seedade 35 mm nematoder media (NGM) tillväxtplattan. Därefter plocka enstaka injicerade P0 djur till enskilda OP50-seedade 35 mm NGM plattor med en platina tråd mask12.
6. skärmen P0 plattor och enda mCherry(+) F1s
- Två dagar efter injektion, identifiera P0 plattor som innehåller F1 avkomma att uttrycka mCherry i svalget med hjälp av en fluorescerande stereomikroskopet (figur 1 d, dag 2 - 3). Välj tre P0 plattor som innehåller de flesta mCherry(+) F1 djuren.
- Från varje av de tre valda P0 plattorna, singel 8-12 mCherry(+) F1 djur för totalt 24-36 mCherry(+) F1s med en mask plocka (figur 1 d, dag 2 - 3).
Obs: mCherry(-) djur kan också skiljas från dessa P0 plåtar, men sannolikheten för att identifiera korrekt redigeras djur är mycket lägre (figur 2A). - Tillåta enskilda F1s self-fertilize och lägga ägg i 1-2 dagar i rumstemperatur.
7. enkel mask PCR och genotypning
- Efter 1-2 dagar efter äggläggningen, över den F1s till enskilda PCR-strip tube caps innehåller 7 µL mask lyseringsbuffert använder en mask plocka (tabell 2, figur 1 d, dag 4-5).
- Centrifugera PCR-rör med maximal hastighet för 1 min i rumstemperatur att få djur längst tube och frysa rören vid-80 ° C i 1 h.
Obs: Maskar kan lagras vid-80 ° C på obestämd tid. - Lysera frusna maskar i en termocykler använder följande program: 60 ° C i 60 min, 95 ° C i 15 min, 4 ° C håller.
- Set-up PCR mastermix som visas i tabell 3.
- Tillsätt 21 µL av PCR mastermix i ren PCR-rören och sedan lägga 4 µL av masken Lys från steg 3. Blanda väl med en pipett och köra PCR-program tillverkare riktlinjer (se Material tabell).
- Rena PCR-reaktioner med en ren DNA och koncentrat kit, följa instruktionerna för tillverkaren (se Material tabell). Eluera DNA genom att tillsätta 10 µL vatten till kolumnen spin.
- Set-up restriktionsenzym mastermix som visas i tabell 4.
- Tillsätt 10 µL av den restriktionsenzym mastermix till varje rengjorda PCR-reaktion och inkubera i 1-2 timmar vid 37 ° C13.
- Separat rötas PCR-produkter på en 1,5% agarosgel kör vid 120 V använder 1 x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert14.
8. identifiering och sekvens verifiering av redigerade djur
- Undersöka enzymet smälts prov för förekomst av band som indikerar potential redigeras djur14 (figur 1 d, dag 4-5).
Lägg en N2-kontroll för att identifiera potentiella ditsatta mutationer som kan observeras som förskjutningar i bandstorlek eller oväntade och komplexa restriktionsenzym matsmältningen banding mönster. - Efter att identifiera potentiella redigerade djur, använda de återstående 3 µL av masken lysis och upprepa PCR-reaktionen. Rengör inte eller restriktionsenzym smälta PCR-reaktionen när programmet har slutförts. Ladda PCR-reaktionen på en 1% agarosgel, separat och extrahera bandet använder en gel utvinning kit15 (se Material tabell).
- Sanger sekvens16 gel extraheras DNA använder F1 primer för att identifiera korrekt redigerade djur (figur 1A)
Obs: Heterozygot läser kommer att innehålla överlagras toppar på grund av den vilda typen och konstruerad allel. - Att få homozygot djur från verifierade heterozygot redigerade djur, enda 8-12 F2 djur och utför steg 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutationer i mänskliga superoxiddismutas 1 (SOD1) står för ~ 10-20% av familjär amyotrofisk lateralskleros, en förödande neurodegenerativ sjukdom som undantagslöst leder till förlamning och död17. Mänskliga SOD-1 är en evolutionärt bevarat protein delar 55% identitet och 70% likhet med C. elegans SOD-1 proteinet (figur 1B). För att demonstrera den enkelhet, genomförbarhet och effektivitet av metoden CRISPR-Cas9 RNP-baserade, riktade vi C. elegans sod-1 genen att införa sjukdomsassocierade mänskliga G93A varianten i masken genomet (figur 1A).
För att iscensätta G93A mutationen i C. elegans genomet, valdes en sgRNA vars PAM erkännande webbplats sitter 3 bp uppströms i den G93 kodon (figur 1 c). Vi har utformat en ssODN HDR reparation mall innehållande: 1) nukleotid förändringar konvertera den G93 Codonen till A93 (GGA GCA), 2) en tyst ändring NGG PAM sekvens (CGG CAG) för att förhindra sgRNA-Cas9-medierad klyvning av mallen HDR, 3) en tyst mutation (CT) som introducerar en unik HindIII restriktionsenzym plats för genotypning, och 4) 50 bp 5' och 3' homologi armar (figur 1 c). En PCR-primer uppsättning (F1-R1) var utformad för att producera en enda 592 bp PCR-produkt i N2 kontroller (figur 1A). En injektion mix som innehåller sgRNA, var Cas9, ssODN och en fluorescerande markör plasmid (pCFJ90) blandas, inkuberas i 10 min i rumstemperatur och laddas in i Mikroskop pipett.
Figur 1 d skildrar arbetsflödet efter injektion mixen läses in i en injektion mikropipett. Dag 0 injicerades 10-15 P0 djur i en eller båda gonad armar med standard Mikroskop teknik18,19. Injicerade djur återvinns för 1-2 h och var sedan individuellt ströks på OP50-seedade NGM tallrikar. Efter 2-3 dagar identifierades framgångsrika P0 injektioner av dem som har mCherry(+) F1 avkomma. Tre P0 takplattorna (dvs. de som har det största antalet mCherry(+) F1s) valdes för efterföljande analys. Från var och en av dessa tre plåtar (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s valdes till enskilda OP50-seedade 35 mm NGM plattor för totalt 24 mCherry(+) F1s. Efter 2-3 dagar efter äggläggningen (dag 4 - 5), var den enskilda F1s övergår i PCR-rör som innehåller mask lyseringsbuffert och fryst för 1 h vid-80 ° C. Därefter den F1s var lyserat för att befria genomiskt DNA, och utsätts för PCR. PCR-produkterna var sedan renas och smält med HindIII för 1 h, och köra på en 1,5% agarosgel för att identifiera potentiella redigeras djur. I korrekt redigerade djur, HindIII matsmältningen skär fullängds PCR-produkten (592 bp) till två band av 370 bp och 222 bp. Denna genotypning strategi otvetydigt gör åtskillnad mellan mellan vildtyp (592 bp), heterozygot (592, 370, 222 bp) och homozygote (370, 222 bp) djur. Figur 2A visar genotypning resultaten för 24 mCherry(+) djur.
För att visa att den fluorescerande mCherry markören berikar genomet ändring, plockade vi också 8 mCherry(-) djur från var och en av de tre P0 plattorna. Av 24 mCherry(+) F1s screening (röd stapel), innehöll 10 mono-alleliska eller bi-alleliska modifiering (42%), 10 var vildtyp (42%), 3 potentiella indels (13%), och det fanns 1 PCR misslyckande (figur 2A). Däremot av 24 mCherry(-) F1s screening, var endast 1 djur korrekt modifierade (4%), medan, 23 var vildtyp (96%) (Figur 2A). Figur 2B visar kromatogrammet från de fullängds gel extraherade PCR-produkten (F18-6), visar att de exakta nukleotid förändringarna utformade i mallen ssODN HDR införlivades troget i genomet hos denna homozygot F 1 djur. Särskilt, utställda F1 djur 10-7, 10-8 och 12-3 oväntade PCR-produktstorlekar och begränsning digest banding mönster, tyder på att dessa djur kan bära komplexa ditsatta mutationer (figur 2A). Sålunda, vår metod är inte bara kan generera önskat genomet modifieringen eller modifieringarna med lätthet, effektivitet och trohet, men också tillåter identifiering och återställning av unika ditsatta alleler som kan sprida viktig och oväntad insikt geners funktion.
Figur 1 . CRISPR-Cas9 konstruktion av den C. eleganssod-1 locus. (A) Schematisk illustration föreställande exon-intron struktur det sod-1 locus i C. elegans. Den röda stapeln anger placeringen av G93 i exon 3. Primer par uppsättningen noteras av de röda pilarna (F1-R1). (B) sekvens justering av mänskliga och C. elegans (worm) SOD-1 proteiner. Riktade G93 återstoden är markerade i rött. (C) överst, en del av genomisk DNA kring den G93 Codonen visas som referens, och den PAM (grön) och sgRNA målet (blå) platser markeras. Botten, den enda stranded oligonukleotiden (ssODN) homologi regisserad reparation (HDR) mallen visas som innehåller: kodon redigera ändra G93 till A93, en tyst förändring till PAM motivet att hindra klyvning av sgRNA-Cas9 komplexet, en tyst ändra till införa en unik HindIII restriktionsenzym plats (gul ruta), och 5' och 3' 50 bp homologi armar (svarta staplar). Alla nukleotid förändringar designad i ssODN är markerad röd. (D) Schematisk illustration av rörledningen för generering och identifiera CRISPR-Cas9 RNP-baserade punkt mutanter. Dag 0, injicera 10-15 P0 djur injektion mix. På dag 2-3, identifiera framgångsrikt injicerade P0 djur av de som innehåller fluorescerande F1 avkomma och välj tre P0 plattor med mest fluorescerande avkomman. Från varje av de tre P0 plattorna, enda 8 fluorescerande F1 avkomma. Dag 4-5, (a) steg 1, enskilda F1s plockas och placeras i PCR-rör som innehåller lyseringsbuffert; (b) steg 2, är efter frysning vid-80 ° C, PCR-rör som innehåller F1 maskar lyserat för att släppa genomiskt DNA, som används som en mall för PCR. PCR-produkterna sedan rengöras och rötas med den unika restriktionsenzym; (c) i steg 3, enzymet smälts produkter löses på en agarosgel där vilda typ (+/ +), heterozygot (m / +), och homozygot (m/m) djur kan identifieras av begränsning digest banding mönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Genotypning data för sod-1 (G93A) mutanter. (A) Gel bilden av F 1 djur som var individuellt lyserat, PCRed och smälts med HindIII. För varje P0 platta (P0-8, P0-10, P0-12) analyserades 8 mCherry(+) och 8 mCherry(-) F1 djur. Både mono-alleliska (blå siffror) och bi-alleliska (röda siffror) redigerade djur omhändertogs. Storlek skiftade PCR-produkter eller oförutsedda HindIII smält band återfanns också som är vägledande för ditsatta mutanter (gula siffror). N2 kontroller visas som en referens för PCR-produkt dimensionering och enzym specificitet. (B) toppen, kodon avstånd och aminosyra översättningar visas ovan för den vilda typen (WT) och nedan för G93A den strandar. Önskad redigera markeras av en röd ruta, och de tysta förändringar som skapar en i-frame HindIII begränsning webbplats är markerade med en gul ruta. Alla utformade nukleotid ändringar visas i fetstil. Botten, representativa kromatogrammet från homozygot F1 djur 8-6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Volym | Slutlig koncentration |
| ddH2O | 6.3 ΜL | ---- |
| KCl (4M) | 0,94 ΜL | 300 mM |
| HEPES (0.5M) pH 7,4 | 0,5 ΜL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μl) | 1,25 ΜL | 2,5 ng/μl |
| ssODN (500 ng/μl) | 1,25 ΜL | 50 ng/μl |
| sgRNA (50 μM) | 1,25 ΜL | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1,03 ΜL | 5 ΜM |
| Slutlig volym | 12.5 ΜL | ---- |
Tabell 1. CRISPR-Cas9 RNP injektion Mix. Alla reagens bör vara åter svävande i nuclease-fri ddH2O. RNase gratis teknik bör användas vid hantering av reagenser och när du gör injektion mixen.
| Reagens | [Slutlig] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8,3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2,5 mM |
| NP-40 | 0,45% |
| Tween-20 | 0,45% |
| Proteinas K | 1 mg/mL |
Tabell 2. Worm Lysis buffert recept. Proteinas K bör läggas färska före varje användning.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12.5 ΜL | 300 ΜL |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Worm Lysis | 4 ΜL | ---- |
| ddH2O | 6 ΜL | 144 ΜL |
| Slutlig volym | 25 ΜL | 504 ΜL |
Tabell 3. PCR-Mastermix. The PCR mastermix ska blandas väl av pipettering tills lösningen är homogen. 21 µL av PCR mastermix bör läggas till ren PCR-rören och sedan 4 µL av enskilda mask lysate bör läggas till korrekt märkta rör.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 10 x enzym buffert | 2 ΜL | 48 ΜL |
| Rengjorda PCR-reaktion | 10 ΜL | ---- |
| ddH2O | 7 ΜL | 168 ΜL |
| Restriktionsenzym (10 U/μL) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| Slutlig volym | 20 ΜL | 240 ΜL |
Tabell 4. Restriktionsenzym Mastermix. Den restriktionsenzym mastermix ska blandas väl av pipettering tills lösningen är homogen. 10 µL av den restriktionsenzym mastermix bör läggas till 10 µL av rengjorda PCR-produkten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR-Cas9 systemet är ett kraftfullt och effektivt verktyg för att just ändra genomet hos modellorganismer. Här visar vi den chimära sgRNAs20 tillsammans med ssODN HDR mallar kan mycket effektiv generering av genomisk punktmutationer i C. elegans. Ännu viktigare, visar vi att RNP leverans producerar hög redigering effektivitet när fluorescens används som en markör för samtidig urval belyser den lätthet och tillförlitlighet av tekniken.
Majoriteten av CRISPR-Cas9 metoder för C. elegans genomet engineering är beroende av specifika genetiska bakgrunder eller co-CRISPR strategier1. Co-CRISPR metoden har visat sig vara ett otroligt användbart verktyg som ökar sannolikheten för att erhålla en framgångsrik genomet redigera. Co-CRISPR metoder kräver dock att införa en fenotyp-valbar redigera på en markör locus som berikar för genomet redigera sevärdheter. Samtidigt kraftfull, kan införa valbara fenotyp-bärande mutationer vara oönskade om den stammen att redigera eller önskad punkt mutationen av intresse själv uppvisar fenotyper som kan förvärras eller undertryckt av markör fenotypen. Co-CRISPR strategier kräver dessutom att skapa en ytterligare dubbel strand semester på en markör locus som kan bidra till att off-target effekter. Här presenterar vi en metod som använder en övergående fluorescerande markör som inte bara tjänar till att identifiera framgångsrikt injicerade P0 djur, men också berikar för korrekt genomet redigeringar. Våra data visar metoden betydligt berikar för framgångsrikt redigerade djur jämfört med icke-fluorescerande djur, och ger flera olika fördelar: 1) endast en inriktning på platsspecifika sgRNA krävs, 2) en 5-faldig minskning av Cas9 och sgRNA koncentration, 3) stam - och fenotyp-selection självständighet, och 4) en nominell screening arbetsbelastning (~ 24 F1s). Robust CRISPR-Cas9 gen editering i F1 generationen observerades med denna metod. Särskilt, kan PCR-restriktion enzym-baserad detektion strategin beskrivs otvetydig detektering av mono - och bi-alleliska redigerade djur i F1 generationen. Slutligen, genotypning strategin underlättar identifiering av potentiella ditsatta mutationer, som kan observeras som PCR-bandet skiftar när jämfört med N2 kontroller som antingen inte mottagliga för begränsning sammanfattad eller avkastning complex band när rötas.
Tillkomsten av nästa generations sekvensering tillsammans med storskalig genomisk ansträngningar har accelererat identifiering av genetiska varianter som segregera med sjukdom21. Funktionella tester av patogenicitet har dock inte visats för majoriteten av varianter i cellulär och organismers modellsystem. I denna studie vi riktade sod-1 genen i C. elegans att införa den allmänt studerade ALS-associerade SOD-1G93A mutation. Hittills har denna mutation modelleras och studerade i C. elegans och möss primärt med hjälp av transgena överuttryck. Även om överuttryck av varianter i djurmodeller kan sammanfatta nyckel cellulära, molekylär och beteendemässiga aspekter av sjukdom, det är alltmer uppenbart att 'dos' är en förmildrande omständighet vid bedömningen fenotyper22. Till exempel uppvisar hög kopia nummer SOD-1G93A möss bära ~ 24 kopior av muterade mänskliga SOD-1 genen kraftigt accelererad sjukdomsförloppet jämfört med SOD-1G93Adl möss, som bär endast ~ 8-10 kopior23,24. Här, visar vi att vår CRISPR-Cas9 RNP-baserade metod kan utnyttjas för att snabbt generera mänskliga variant-mutationer i genen orthologous mask utan transgena överuttryck, i ett försök att mer exakt replikera den genetiska samband med sjukdomen. Vår metod ger en möjlig plattform för att producera och testa genomisk varianter av okänd betydelse i samband med endogena tillsyn och uttryck, som utesluter ramarna för överuttryck. Slutligen har vi också använt denna metod för att tagga endogena gener med fluorescerande proteiner (dvs GFP), som kommer att utgöra ytterligare ett redskap för att visualisera hur varianter påverkar protein lokalisering, aggregation och omsättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi tackar medlemmar för Beg laboratoriet för kritisk läsning av detta manuskript. Stammar tillhandahölls av stadens Caenorhabditis genetik, som är finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Forskning i Beg laboratoriet stöds genom bidrag från NIH (R01 NS094678) och muskeldystrofi Association (MDA382300) till A.A.B.
Acknowledgments
Det finns inga intressekonflikter som relaterade till detta betänkande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
