Summary
هنا، نقدم أسلوب هندسة الجينوم من C. ايليجانس باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر-Cas9 وقوالب إصلاح يعتمد التماثل.
Abstract
يكرر المتناوب اينتيرسبيرسيد بانتظام متفاوت المسافات (كريسبر)-كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (Cas9) نظام الدفاع المناعي التكيفي بدائية يختارهم كأداة قوية لهندسة الجينوم حقيقية النواة الدقيقة. وهنا نقدم طريقة سريعة وبسيطة باستخدام الكشف دليل واحد تشيميريك (سجرنا) وكريسبر-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) لتوليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسكفاءة ودقة. يصف لنا خط أنابيب لاختيار الأهداف سجرنا وإصلاح موجه التماثل (HDR) قالب تصميم، إلى كريسبر-Cas9-رنب والتسليم واستراتيجية التنميط التي تمكن من تحديد هوية قوية وسريعة من الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح. نهجنا لا يسمح بتوليد السطحية وتحديد نقطة الجينوم المطلوب الحيوانات المسخ فحسب، بل أيضا يسهل الكشف عن الآليلات إينديل معقدة أخرى في حوالي 4-5 أيام مع الكفاءة العالية وفحص خفض عبء عمل.
Introduction
جذريا حولت التطورات التكنولوجية الحديثة وتسريع القدرة على الضبط مهندس الجينوم. على وجه الخصوص، النظام كريسبر-Cas9، الذي يعتمد على اندونوكليسي الموجهة بالحمض النووي الريبي Cas9 لحمل فاصل حبلا مزدوجة (جهاز تسوية المنازعات) قرب تسلسل الهدف الفائدة، قد استخدمت على نطاق واسع دقة هندسة الجينوم الأغلبية من طراز الكائنات المستخدمة في بحوث الطب الأحيائي1،2،،من34. إلى حد كبير، وقد مقفلة استخدام كريسبر-Cas9 الجينوم التحرير حتى في الأنواع الصعبة مثل ايليجانس جيم-5. بغض النظر عن الأنواع، تولد الطفرات مع الجينوم كريسبر-Cas9 على أساس تحرير النظام يعتمد على ثلاثة عناصر أساسية: 1) Cas9 اندونوكليسي, 2) دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) الذي يوجه اندونوكليسي Cas9 إلى تسلسل مستهدفة، ومستخدم 3) تصميم إصلاح موجه التماثل (HDR) قالب يحتوي على edit(s) المطلوب لمصلحة2.
وهناك العديد من الطرق التي يمكن استخدامها لإدخال استهداف سجرنا و Cas9 نوكلاس داخل الخلايا بما في ذلك بلازميد، والجيش الملكي النيبالي، والفيروسية على أساس التسليم أساليب6. في الآونة الأخيرة، برز التسليم المباشر من قبل الرصاصية سجرنا-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) كأداة قوية وفعالة في الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير7. التسليم المباشر من قبل الرصاصية كريسبر-Cas9 "رنبس" له العديد من المزايا المتميزة، إلا وهي: 1) رنبس تجاوز الحاجة إلى النسخ الخلوية وسرعة مسح الترجمة، 2) رنبس، التي قد تزيد من خصوصية بتخفيض الوقت المتاح ل إيقاف المستهدفة الانقسام، و 3) رنبس يحتوي على لا عناصر أجنبية في الحمض النووي/الحمض النووي الريبي التي تلتف الأخذ بتسلسل غير أصلية في مجال المجين المضيف من خلال التكامل عشوائي. معا، هذه السمات يحتمل تقديم انفجار لم تدم طويلاً لتحرير كريسبر على الهدف مع التقليل من الآثار خارج الهدف.
يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة لإدخال تغييرات الجينوم الخاصة بالموقع في C. ايليجانس. ويشمل هذا البروتوكول تستهدف سجرنا وتصميم قالب واحد اليغنوكليوتيد الذين تقطعت بهم السبل (سودن) تقرير التنمية البشرية، وإلى رنب سجرنا-Cas9 والتسليم، واستراتيجية الوراثي لتحديد الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح لا لبس فيه. باستخدام هذه الاستراتيجية، ليس فقط يمكن استرداد التغييرات المطلوبة الخاصة بالموقع، ولكن يمكن أيضا استرداد الطفرات إينديل غير محددة أخرى. وهكذا، استراتيجيتنا تصاريح توليد سلسلة الاليلي استخدام استراتيجية واحدة، حيثما مونو الاليلي، استقصاء المعلومات الجينية على حد سواء، ويمكن أن تتولد طفرات إينديل في الجيل1 و.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان يتبع المبدأ التوجيهي من المعاهد الوطنية للصحة والرعاية المؤسسية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ميشيغان. استخدام حلول خالية من رناسي و "الماصة؛" نصائح طوال البروتوكول. تنظيف مساحة العمل والماصات وأنابيب، وأجهزة الطرد المركزي مع الحل "تطهير رناسي" اتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد).
1-سجرنا اختيار الهدف
- باستخدام مستعرض ويب، افتح صفحة ويب: http://crispor.tefor.net8
- مدخل ~ 60 قاعدة أزواج (bp) لتسلسل المرافقة التحرير المنشود لمصلحة (أي 30 بي بي 5 'و 3' لتحرير المطلوب).
- حدد الجينوم ايليجانس كاينورهابديتيس من القائمة المنسدلة.
- حدد "عزر المتاخمة بروتوسباسير" (20 شركة بريتيش بتروليوم-نج-SpCas9، SpCas9-HF1، eSPCas9 1.1) من القائمة المنسدلة.
- انقر فوق إرسال. في صفحة النتائج، اختر تسلسل الهدف المرتبة الأعلى الأقرب إلى التحرير للفائدة. إذا كان هناك لا المواقع المستهدفة المناسبة ضمن تسلسل الإدخال bp 60 ترافقه، توسيع سلسلة استعلام ما يصل إلى 100 شركة بريتيش بتروليوم (أي 50 بي بي أي من جانبي المطلوب تحرير).
- من مصدر متاح، مثل سينثيجو، الحصول على سجرنا هدف 20-مير مع المواصفات التالية: نمول 3؛ أية تعديلات.
- عند استلام، الطرد المركزي سجرنا المجففة بالتبريد التي تحتوي على أنبوب في > ز س 12,000 لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 60 ميليلتر من TE نوكلاس خالية للأنبوب، وإعادة تعليق بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً من 15-20 مرة باستخدام ماصة P200. يكون التركيز النهائي 50 ميكرومتر.
2-التماثل-توجه إصلاح قالب تصميم
- تصميم يتضمن قالب HDR سودن: 1) تحول اهتمام و 2) موقع فريد من نوعه في إطار قيود endonuclease 3) طفرة صامت واحد أو كليهما من فئة الخدمات العامة ضمن التسلسل بام نج 4) 50 بي بي 5 '3' التماثل الأسلحة والمرافقة الطفرة الأولى والأخيرة. (الشكل 1) 9 , 10.
- إذا لم يكن ممكناً الطفرة في التسلسل بام نج، استحداث الطفرات الصامتة 5-6 ضمن تسلسل الاعتراف الهدف سجرنا لمنع انشقاق سجرنا وساطة قالب تقرير التنمية البشرية سودن.
- من مصدر متاح، مثل إيدتدنا، الحصول "اليغنوكليوتيد أولترامير الحمض النووي" مع المعلمات التالية: مقياس: نمول 4؛ صياغة: لا شيء؛ تنقية: الملحي القياسي.
- عند استلام، الطرد المركزي سودن المجففة بالتبريد التي تحتوي على أنبوب في > ز س 12,000 لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بلطف إعادة تعليق سودن بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر في ddH نوكلاس خالية2س من بيبيتينج صعودا وهبوطاً من 15-20 مرة باستخدام ماصة P200.
3-تصميم التنميط الإشعال
- تصميم كتاب تعيين المرافقة بتعديل الجينوم لتوليد ~ 400-700 بي بي بكر أمبليكون11.
- تحسين ظروف ركوب PCR لإنتاج أمبليكون واحدة ومحددة11.
4-إعداد مزيج حقن
- الطرد المركزي الكواشف 1 الجدول بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- في الترتيب المسرود، إضافة الكواشف الجدول 1 إلى أنبوب بكر نوكلاس مجاناً.
- مزيج دقيق من بيبيتينج برفق صعودا وهبوطاً 10 مرات مع ماصة P20.
- احتضان حقن المزيج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5-حقن البروتوكول
- تحميل ميكروبيبيتي حقن مع حوالي نصف مزيج حقن12. حفظ المتبقي مزيج الحقن في حالة إبرة حقن السدادات أو فواصل.
- كسر نصيحة ميكروبيبيتي حيث أن المبادرة ~ 20-30 وتنتج حل تتدفق تدريجيا12.
ملاحظة: أكبر قطرها نصائح تؤثر سلبا على الصحة الحيوانية وانخفاض الغلة ذرية1 و. - حقن الشباب 10-15 الديدان الكبار في كلا ذراعيه جوندال إذا أمكن12. إذا لم يكن الأمر كذلك، حقن في الذراع جوندال واحدة غير كافية.
- السماح بحقن الحيوانات (ف0) لاسترداد ح 1-2 في درجة حرارة الغرفة على صفيحة وسائط الإعلام (NGM) نمو السلكية OP50 المصنفة 35 ملم. وفي وقت لاحق، اختيار الحيوانات0 ف حقن واحدة إلى لوحات NGM الفردية المصنفة OP50 35 مم دودة سلك البلاتين باستخدام12.
6-الشاشة ف0 لوحات و mCherry(+) واحدة و1ثانية
- حقن بعد يومين، تحديد ف0 لوحات تتضمن ذرية1 و الإعراب عن مشري في البلعوم باستخدام ستيريوميكروسكوبي نيون (الشكل 1، يوم 2-3). اختر لوحات0 ف الثلاث التي تحتوي على معظم الحيوانات1 mCherry(+) و.
- من كل مجموعة من ثلاث لوحات0 ف مختارة، واحد 8-12 mCherry(+) و1 الحيوانات لما مجموعة 24-36 mCherry(+) و1s استخدام دودة بيك (الشكل 1، يوم 2-3).
ملاحظة: يمكن أيضا أن يكون خص الحيوانات mCherry(-) من هذه اللوحات0 ف، ولكن احتمال تحديد بشكل صحيح تحرير الحيوانات الكثير أقل (الشكل 2A). - السماح للموظف1و سيلففيرتيليزي ووضع البيض لمدة 1-2 يوما في درجة حرارة الغرفة.
7-واحد دودة بكر والتنميط
- 1-2 أيام وضع البيض، وبعد نقل s1و إلى قبعات أنبوب قطاع بكر الفردية التي تحتوي على 7 ميليلتر من "دودة تحلل المخزن المؤقت" استخدام اختيار دودة (الجدول 2و الشكل 1يوم 4-5).
- أجهزة الطرد المركزي أنابيب PCR بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة جلب الحيوانات إلى قاع الأنبوبة، وتجميد أنابيب في-80 درجة مئوية ح 1.
ملاحظة: الديدان يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. - الديدان المجمدة في ثيرموسيكلير استخدام البرنامج التالي: عقد 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 4 درجة مئوية.
- إنشاء PCR mastermix كما هو مبين في الجدول 3.
- إضافة ميليلتر 21 من PCR mastermix في تنظيف أنابيب PCR ثم قم بإضافة 4 ميليلتر من تحلل دودة من الخطوة 3. كذلك استخدام ماصة مزيج وتشغيل البرنامج بكر اتباع إرشادات المصنعين (انظر الجدول المواد).
- تنقية PCR ردود الفعل باستخدام مجموعة نظيفة الحمض النووي والتركيز، اتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد). الوت الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميليلتر المياه إلى العمود بزيادة ونقصان.
- إنشاء mastermix إنزيم التقييد كما هو مبين في الجدول 4.
- إضافة 10 ميليلتر من mastermix إنزيم التقييد لكل تفاعل PCR تنظيفها واحتضانها ح 1-2 في13من 37 درجة مئوية.
- منفصلة هضم منتجات PCR على 1.5% [اغروس] هلام تشغيل في 120 V استخدام المخزن المؤقت تريس-خلات-يدتا (تاي) x 114.
8-تحديد وتسلسل التحقق من الحيوانات المحرر
- فحص عينات إنزيم يهضم وجود العصابات التي تشير إلى إمكانية تحرير الحيوانات14 (الشكل 1، يوم 4-5).
ملاحظة: تحميل عنصر تحكم N2 التعرف على الطفرات إينديل المحتملة التي يمكن ملاحظتها كالتغيرات في حجم الفرقة و/أو إنزيم التقييد غير متوقعة وغير المعقدة الهضم تباين أنماط. - بعد تحديد الحيوانات المحرر المحتملة، استخدم ميليلتر 3 المتبقية من تحلل دودة وكرر الرد بكر. لا تنظيف أو تقييد إنزيم هضم تفاعل PCR بعد الانتهاء من البرنامج. تحميل رد بكر على 1% [اغروس] هلام، منفصلة واستخراج الفرقة باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل15 (انظر الجدول المواد).
- سانغر التسلسل16 جل استخراج الحمض النووي باستخدام F1 التمهيدي للتعرف على الحيوانات بشكل صحيح تم تحريره (الشكل 1A)
ملاحظة: هيتيروزيجوتي سوف تحتوي على ما يلي: مضافين قمم نظراً لوجود نوع البرية وهندستها اليل. - للحصول على الحيوانات متماثل من الحيوانات متخالف المحررة التي تم التحقق منها، واحد 8-12 الحيوانات2 وقم بإجراء الخطوات 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الطفرات في الإنسان فائق أكسيد الفاءق 1 (SOD1) تمثل ~ 10-20% من الأسرى التصلب العضلي الجانبي، مرض الأعصاب مدمرة تؤدي دائماً إلى الشلل والموت17. الهيئة العامة للسدود البشرية-1 بروتين تقحم مصانة تقاسم تشابه هوية و 70% 55% مع البروتين الأحمق-1 C. ايليجانس (الشكل 1B). تثبت البساطة والجدوى والكفاءة للنهج القائم على "رنب" كريسبر-Cas9، نحن استهداف الجين ايليجانس جيم-الهيئة العامة للسدود-1 إدخال متغير G93A البشرية المرتبطة بالمرض في جينوم دودة (الشكل 1A).
هندسة G93A الطفرة في الجينوم C. ايليجانس ، اختير سجرنا موقع الاعتراف بام الذي يجلس 3 bp المنبع من كودون G93 (الشكل 1). صممنا سودن HDR إصلاح قالب يحتوي على: 1) النوكليوتيدات التغييرات لتحويل كودون G93 A93 (GGA الائتلاف)، 2) تغيير صامت إلى بام نج تسلسل (وظفته كاج) لمنع انشقاق سجرنا-Cas9-بوساطة من قالب تقرير التنمية البشرية، 3) طفرة صامت (CT) التي يقدم موقع إنزيم التقييد هنديي فريدة من نوعها للتنميط، و 4) 50 بي بي 5 '3' التماثل الأسلحة (الشكل 1). تم تصميم مجموعة التمهيدي بكر (F1-R1) لإنتاج منتج PCR bp 592 واحد في ضوابط N2 (الشكل 1A). مزيج حقن المحتوية على سجرنا، Cas9 وسودن بلازميد علامة نيون (pCFJ90) كانت مختلطة معا، المحتضنة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتحميلها في microinjection ماصة.
يصور الشكل 1 سير العمل بعد تحميل هذا المزيج الحقن إلى ميكروبيبيتي حقن. في اليوم 0، تم حقن الحيوانات0 ف 10-15 في واحد أو كلا من الأسلحة الغدد التناسلية باستخدام تقنية microinjection القياسية18،19. حقن الحيوانات استرداد ح 1-2 وكانت ثم مطلي فردياً على لوحات NGM المصنف OP50. بعد 2-3 أيام، حددت الناجحة ف0 حقن بتلك الحاجة mCherry(+) و1 ذرية. لوحات0 ف الثلاثة العليا (أي الحاصلين على أكبر عدد من mCherry(+) و1s) واختيرت للتحليل اللاحق. من كل من هذه اللوحات الثلاث (ف0-8، ف0-10، ف0-12)، قد خص mCherry(+) 8 و1s إلى لوحات NGM الفردية المصنفة OP50 35 ملم لما مجموعة 24 ق1و mCherry(+). بعد 2-3 أيام وضع البيض (يوم 4-5)، تم تحويلها إلى أنابيب PCR الذي يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل دودة s1و الفردية والمجمدة ح 1 في-80 درجة مئوية. وفي وقت لاحق، s1و تم تفكيك لتحرير الحمض النووي، وتعرض لبكر. منتجات PCR ثم تنقيته وهضمها مع هيندييي ح 1، وتشغيل على 1.5% [اغروس] هلام لتحديد إمكانات تحرير الحيوانات. في الحيوانات، وتحريرها بشكل صحيح تخفيضات الهضم هنديي المنتج بكر كامل طول (592 bp) في نطاقات اثنين من 370 bp و 222 bp. يميز هذه الاستراتيجية التنميط لا لبس فيه بين البرية من نوع (592 bp)، هيتيروزيجوتي (592، 370، 222 bp) وهوموزيجوتي (370، 222 bp) الحيوانات. ويوضح الشكل 2 ألف النتائج الوراثي للحيوانات mCherry(+) 24.
وللتدليل على أن يثري علامة نيون مشري لتعديل الجينوم، اخترنا أيضا الحيوانات mCherry(-) 8 من كل من لوحات0 ف ثلاثة. 24 mCherry(+) و1ق فرزهم (شريط أحمر)، تضمنت 10 تعديل الاليلي أحادية أو ثنائية الاليلي (42 في المائة)، 10 نوع البرية (42 في المائة)، وقد كانت 3 إينديلس المحتملة (13%)، وكان هناك فشل PCR 1 (الشكل 2A). في المقابل، ق1mCherry(-) 24 و فرزهم، كان الحيوان فقط 1 معدلة بشكل صحيح (4 ٪)؛ بينما كانت 23 نوع البرية (96%) (الشكل 2A). الشكل 2B يظهر chromatogram من كامل طول جل المستخرجة PCR المنتج (و18-6)، مما يدل على أن التغييرات النوكليوتيدات الدقيقة التي صممت في قالب تقرير التنمية البشرية سودن أدرجت إخلاص جينوم هذا و متماثل 1 الحيوان. جدير بالذكر أن تعرض الحيوانات1 و 10-7 و 10-8 و 12-3 أحجام المنتج بكر غير متوقعة وتقييد هضم أنماط النطاقات، مما يوحي بهذه الحيوانات قد تحمل طفرات إينديل معقدة (الشكل 2A). وهكذا، لدينا أسلوب ليس فقط قادرة على توليد modification(s) الجينوم المطلوب بسهولة وكفاءة، والإخلاص، ولكن أيضا يسمح بتحديد هوية والانتعاش من الآليلات إينديل الفريدة التي يجوز إلقاء نظرة ثاقبة وظيفة الجينات الهامة وغير متوقعة.
الشكل 1 . هندسة كريسبر-Cas9 من C. ايليجانسالأحمق-1 موضع. (A) التخطيطي التوضيح تصور هيكل محور 1 الهيئة العامة للسدود في C. ايليجانسإكسون-إنترون. شريط أحمر يدل على موقع G93 في إكسون 3. ويلاحظ مجموعة زوج التمهيدي بالسهام الحمراء (F1-R1). (ب) تسلسل المحاذاة للإنسان والبروتينات الأحمق-1 C. ايليجانس (دودة). يتم تمييز بقايا G93 المستهدفة باللون الأحمر. (ج) أعلى، يظهر مقطع من الحمض النووي المحيطة كودون G93 كمرجع، وسلط الضوء على أن بام (الأخضر) والمواقع المستهدفة (الأزرق) سجرنا. أسفل، توجه التماثل اليغنوكليوتيد الذين تقطعت بهم السبل واحد (سودن) يظهر قالب إصلاح (HDR) تحتوي على: تحرير كودون تغيير G93 A93، تغيير صامت عزر بام لمنع الانقسام بالمجمع سجرنا-Cas9، صامتة بتغيير إلى يعرض موقع إنزيم التقييد هنديي فريدة من نوعها (المربع الأصفر)، والمرافقة 5 'والتماثل بي بي 3' 50 من الأسلحة (أشرطة سوداء). هي كافة التغييرات النوكليوتيدات المصممة في سودن الأحمر المميز. (د) رسم توضيحي التخطيطي لخط الأنابيب لتوليد وتحديد طفرات نقطة أساس "رنب" كريسبر-Cas9. في اليوم 0، حقن الحيوانات0 ف 10-15 مع حقن المزيج. في يوم 2-3، تحديد بنجاح حقن الحيوانات0 ف بتلك التي تحتوي على ذرية1 و الفلورسنت، وحدد ثلاثة ف0 لوحات مع ذرية الفلورسنت الأكثر. من كل من لوحات0 ف ثلاثة، واحد و 8 نيون1 ذرية. في يوم 4-5، (أ) خطوة 1، اختار s1و الفردية ووضعها في أنابيب PCR الذي يحتوي على "المخزن المؤقت لتحلل"؛ (ب) الخطوة 2، بعد تجميد في-80 درجة مئوية، أنابيب PCR الذي يحتوي على الديدان1 و هي تفكيك للإفراج عن الحمض النووي، الذي يتم استخدامه كقالب PCR. منتجات PCR ثم تنظيفها وهضمها مع الإنزيم قيود فريدة من نوعها؛ (ج) الخطوة 3، إنزيم يهضم منتجات مصممون على [اغروس] هلام حيث البرية نوع (+ +)، متخالف (m/+)، ويمكن تحديد الحيوانات متماثل (m/m) من خلاصة القيد تباين أنماط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . بيانات التنميط الهيئة العامة للسدود-1 طفرات (G93A). (A) صورة جل و 1 الحيوانات التي كانت منفردة تفكيك، بكريد وهضمها مع هنديي. لكل ف0 لوحة (ف0-8، ف0-10، ف0-12)، وحللت 8 mCherry(+) و mCherry(-) و 81 الحيوانات. وعثر مونو الاليلي (أرقام زرقاء) والحيوانات المحرر ثنائي الاليلي (أرقام حمراء). وتحول حجم منتجات PCR أو هنديي الهائل العصابات هضمها وعثر أيضا التي تدل على إينديل طفرات (الأرقام الصفراء). وترد ضوابط N2 كمرجع لخصوصية التحجيم والانزيم المنتج PCR. (ب) أعلىوتباعد كودون والترجمات من الأحماض الأمينية هي المبينة أعلاه لنوع البرية (WT) وأدناه من أجل G93A تعديل مسارات. تحرير المطلوب وهو أبرز مربع أحمر، ويلقي الضوء على التغييرات الصامتة التي إنشاء موقع تقييد هنديي في إطار مربع أصفر. وتظهر جميع النوكليوتيدات المصممة التغييرات بخط غامق. أسفل، chromatogram الممثل من متماثل و1 الحيوان 8-6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | وحدة التخزين | التركيز النهائي |
| ddH2س | 6.3 ميكروليتر | ---- |
| بوكل (4 م) | ميكروليتر 0.94 | 300 ملم |
| حبيس (0.5M) الأس الهيدروجيني 7.4 | ميكروليتر 0.5 | 20 مم |
| pCFJ90 (25 نانوغرام/ميكروليتر) | ميكروليتر 1.25 | 2.5 نانوغرام/ميكروليتر |
| سودن (500 نانوغرام/ميكروليتر) | ميكروليتر 1.25 | 50 نانوغرام/ميكروليتر |
| سجرنا (50 ميكرومتر) | ميكروليتر 1.25 | 5 ميكرومترات |
| Cas9 (61 ميكرومتر) | ميكروليتر 1.03 | 5 ميكرومترات |
| الحجم النهائي | ميكروليتر 12.5 | ---- |
الجدول 1. كريسبر-Cas9 رنب حقن المزيج. ينبغي أن تكون جميع الكواشف إعادة معلقة في ddH نوكلاس خالية2رناسي سين ينبغي استخدام تقنيات مجاناً عند التعامل مع المواد الكاشفة، وعند إجراء هذا المزيج حقن.
| كاشف | [النهائي] |
| بوكل | 50 مم |
| تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.3 | 10 ملم |
| مجكل2 | 2.5 مم |
| NP-40 | 0.45 في المائة |
| 20-توين | 0.45 في المائة |
| بروتيناز ك | 1 ملغ/مل |
الجدول 2. دودة تحلل وصفه المخزن المؤقت. "ك بروتيناز" ينبغي إضافة جديدة قبل كل استعمال.
| كاشف | س 1 | 24 x |
| 2 × Mastermix س 5 | ميكروليتر 12.5 | 300 ميكروليتر |
| F1 التمهيدي (10 ميكرومترات) | ميكروليتر 1.25 | ميكروليتر 30 |
| R1 التمهيدي (10 ميكرومترات) | ميكروليتر 1.25 | ميكروليتر 30 |
| تحلل دودة | 4 ميكروليتر | ---- |
| ddH2س | ميكروليتر 6 | ميكروليتر 144 |
| الحجم النهائي | 25 ميكروليتر | ميكروليتر 504 |
الجدول 3. PCR Mastermix. ينبغي أن تكون مختلطة PCR mastermix جيدا من قبل بيبيتينج حتى يتم الحل متجانسة. ميليلتر 21 من mastermix بكر ينبغي أن تضاف إلى أنابيب PCR نظيفة ومن ثم تضاف 4 ميليلتر من دودة الفردية ليستي للأنابيب المسماة بشكل صحيح.
| كاشف | س 1 | 04: |
| 10 × الإنزيم المخزن المؤقت | 2 ميكروليتر | ميكروليتر 48 |
| تفاعل PCR تنظيفها | 10 ميكروليتر | ---- |
| ddH2س | ميكروليتر 7 | ميكروليتر 168 |
| إنزيم التقييد (يو 10/ميكروليتر) | 1 ميكروليتر | 24 ميكروليتر |
| الحجم النهائي | 20 ميكروليتر | ميكروليتر 240 |
الجدول 4. Mastermix إنزيم التقييد. ينبغي أن تكون مختلطة mastermix إنزيم التقييد جيدا من قبل بيبيتينج حتى يتم الحل متجانسة. 10 ميليلتر من mastermix إنزيم التقييد ينبغي أن تضاف إلى 10 ميليلتر من تنظيفها PCR المنتج
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظام كريسبر-Cas9 أداة قوية وفعالة لتعديل التحديد الجينوم من طراز الكائنات الحية. هنا، علينا أن نظهر أن سجرناس تشيميريك20 مقترنة بتمكين قوالب HDR سودن توليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسذات كفاءة عالية. الأهم من ذلك، نبدي أن التسليم رنب تنتج عالية الكفاءة التحرير عندما يتم استخدام الأسفار كعلامة اختيار المشارك، تسليط الضوء على سهولة وموثوقية تقنية.
معظم أساليب كريسبر-Cas9 لهندسة الجينوم C. ايليجانس تعتمد على خلفيات وراثية محددة أو استراتيجيات كريسبر co1. الأسلوب كريسبر co ثبت أن تكون أداة مفيدة بشكل لا يصدق أن يزيد من احتمال الحصول تحرير جينوم ناجحة. ومع ذلك، تتطلب أساليب كريسبر co الأخذ تحرير النمط الظاهري-قابل للتحديد في موضع علامة تثري لتحرير الجينوم للفائدة. في حين قوية، الأخذ باختيار النمط الظاهري-تأثير الطفرات قد تكون غير مرغوب فيها إذا كان الضغط لتحرير أو طفرة نقطة المطلوب من الاهتمام نفسه يسلك تعمل قد أدى إلى تفاقم أو قمعها بالنمط الظاهري العلامة. وعلاوة على ذلك، تتطلب استراتيجيات كريسبر co إنشاء فاصل حبلا مزدوجة إضافية في موضع علامة التي قد تسهم في الآثار المستهدفة. نقدم هنا، أسلوب يستخدم علامة نيون عابرة أنه لا يساعد على تحديد نجاح حقن الحيوانات0 ف فحسب، بل أيضا يثري للتحرير السليم الجينوم. لدينا بيانات تثبت هذا الأسلوب إلى حد كبير يثري للحيوانات المحرر بنجاح بالمقارنة مع الحيوانات غير الفلورية، ويوفر العديد من المزايا المتميزة: 1) فقط أحد استهداف مواقع محددة سجرنا مطلوب، 2) 5 إضعاف الحد في Cas9 و تركيز سجرنا، 3) استقلال السلالة واختيار النمط الظاهري، و 4) عبء عمل فحص القيمة اسمية (~ 24 F1s). ولوحظ الجينوم كريسبر-Cas9 قوي التحرير في الجيل1 و باستخدام هذا الأسلوب. جدير بالذكر أن تمكن الاستراتيجية الكشف على أساس إنزيم PCR-التقييد وصف الكشف لا لبس فيه من الحيوانات المحرر الاليلي أحادية وثنائية في الجيل1 و. أخيرا، استراتيجية التنميط يسهل تحديد الطفرات إينديل المحتملة، التي يمكن ملاحظتها الفرقة بكر تحولات عند مقارنة بضوابط N2، التي أما غير معرضة لخلاصة القيد أو الغلة معقدة العصابات عندما يهضم.
ظهور الجيل القادم تسارعت تسلسل مقترنة بجهود واسعة النطاق الجينوم تحديد المتغيرات الجينية التي فصل مع المرض21. ومع ذلك، قد لم يثبت الاختبارات الوظيفية للقدرة الإمراضية لمعظم المتغيرات في نظم نموذجية الخلوية والعضوي. في هذه الدراسة، ونحن استهداف الجينات 1 الهيئة العامة للسدود في C. ايليجانس إدخال درس على نطاق واسع الطفرات المرتبطة بالمرض الأحمق-1G93A . وحتى الآن، على غرار هذه الطفرة، ودرس في C. ايليجانس والفئران في المقام الأول باستخدام أوفيريكسبريشن المعدلة وراثيا. على الرغم من أن قد الخص overexpression متغيرات في نماذج حيوانية مفتاح الهاتف الخلوي، الجوانب الجزيئية والسلوكية للمرض، الواضح بشكل متزايد أن 'جرعة' يعد عاملاً مخففا في تحديد تعمل22. على سبيل المثال، يحمل رقم 1-الهيئة العامة للسدود نسخة عاليةG93A الفئران يحمل نسخاً ~ 24 الجينات البشرية متحولة الأحمق-1 دورة المرض الإسراع إلى حد كبير مقارنة بالفئران الهيئة العامة للسدود-1G93Adl ، التي تحمل فقط ~ 8-10 نسخ23،24. هنا، علينا أن نبرهن أن لدينا أسلوب المستندة إلى Cas9 رنب كريسبر يمكن أن تستخدم لسرعة توليد الطفرات البشرية المرتبطة بمتغير في الجينات دودة أورثولوجوس دون اشتراط overexpression المعدلة وراثيا، في مسعى لأدق النسخ المتماثل الجينية سياق مرض. لدينا طريقة توفر منهاجا عمليا لإنتاج واختبار المتغيرات الجينية ذات أهمية غير معروفة في سياق المراقبة التنظيمية الذاتية، والتعبير، والذي يحول دون حدود overexpression. أخيرا، نحن أيضا قد استخدمت هذه الطريقة للوسم الجينات الذاتية مع البروتينات الفلورية (أي التجارة والنقل)، الذي سيوفر أداة إضافية لتصور كيف تؤثر متغيرات الترجمة البروتين، والتجميع، ودوران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ونشكر أعضاء المختبر التسول لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وقدمت سلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). البحث في المختبر بيغ معتمد من قبل المنح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS094678) ورابطة ضمور العضلات (MDA382300) إلى A.A.B.
Acknowledgments
لا يوجد أي تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
