Summary
Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.
Abstract
De geclusterde regelmatig afgewisseld palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR - geassocieerde proteïne 9 (Cas9) prokaryote adaptieve immuunsysteem verdedigingssysteem is gecoöpteerd als een krachtig hulpmiddel voor precieze eukaryotische genoom engineering. Hier presenteren we een snelle en eenvoudige methode met behulp van chimeer één gids RNAs (sgRNA) en CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) voor de efficiënte en nauwkeurige generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. We beschrijven een pijpleiding voor sgRNA-doelverschuiving sjabloonontwerp homologie geleide reparatie (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie waarmee de robuuste en snelle identificatie van correct bewerkte dieren. Onze aanpak niet alleen toelaat de facile generatie en de identificatie van de gewenste genomic punt mutant dieren, maar ook vergemakkelijkt de opsporing van andere complexe indel allelen in ongeveer 4-5 dagen met hoog rendement en een verminderde screening werklast.
Introduction
Recente technologische vooruitgang hebben radicaal getransformeerd en versnelde de mogelijkheid om precies ingenieur genomen. Met name is de CRISPR-Cas9-systeem, dat gebaseerd op de endonuclease van RNA-geleide Cas9 is voor het opwekken van een dubbele streng pauze (DSB) in de buurt van de opeenvolging van de doelgroep van belang, uitgebreid gebruikt voor het nauwkeurig ingenieur het genoom van de meerderheid van de modelorganismen gebruikt in biomedisch onderzoek1,2,3,4. Aanzienlijk, heeft het gebruik van CRISPR-Cas9 ontgrendeld genoom bewerken zelfs in moeilijke soorten zoals C. elegans5. Ongeacht soort, genereren van puntmutaties met het genoom van de CRISPR-Cas9 gebaseerd editing systeem berust op drie componenten van de kern: 1) Cas9 endonuclease, 2) een enkele gids-RNA (sgRNA) die de endonuclease van de Cas9 aan een reeks van doel, en 3) een gebruiker ontworpen leidt homologie geleide reparatie (HDR)-sjabloon met de gewenste edit(s) van belang2.
Er zijn verschillende methoden die kunnen worden gebruikt om de targeting sgRNA en Cas9 in cellen, met inbegrip van de plasmide, RNA en virale gebaseerde levering methoden6nuclease. Onlangs, directe levering van pre-complexvorm sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) heeft ontpopt als een krachtig en efficiënt hulpmiddel in CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom7bewerken. De directe levering van pre-complexvorm CRISPR-Cas9 RNPs heeft verschillende duidelijke voordelen, namelijk: 1) RNPs omzeilen de noodzaak voor cellulaire transcriptie en vertaling, 2) RNPs zijn snel gewist, specificiteit kunnen verhogen door vermindering van de beschikbare tijd voor af-target decolleté, en 3) RNPs bevatten geen buitenlandse DNA/RNA-elementen die de introductie van uitheemse sequenties in het genoom van de host door middel van willekeurige integratie omzeilt. Samen bieden deze kenmerken waarschijnlijk een kortstondige uitbarsting van aan-target CRISPR bewerken terwijl het minimaliseren van uit-target effecten.
Beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de invoering van site-specific genomic veranderingen in C. elegans. Dit protocol omvat gericht op sgRNA en één gestrande oligonucleotide (ssODN) HDR sjabloonontwerp, sgRNA-Cas9 RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie voor de ondubbelzinnige identificatie van goed bewerkte dieren. Met behulp van deze strategie, niet alleen kunnen de gewenste specifieke wijzigingen worden hersteld, maar andere niet-specifieke indel mutaties kunnen ook worden teruggevorderd. Dus onze strategie toelaat de generatie van een allèlique reeks met behulp van één enkele strategie, waar zowel mono-allèlique, bi-allèlique en indel mutanten kunnen worden gegenereerd op de F1 generatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierenverzorgers en experimentele procedures gevolgd het richtsnoer van het National Institutes of Health en de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan. Gebruik RNase-vrije oplossingen en Pipetteer tips in het gehele protocol. Reinig het werkgebied, pipetten, buizen en centrifuge met RNase decontaminatie oplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant (Zie Materialen tabel).
1. sgRNA-doelverschuiving
- Met behulp van een webbrowser, opent u de webpagina: http://crispor.tefor.net8
- Ingang ~ 60 basenparen (bp) van reeks begeleidende de gewenste bewerking van belang (d.w.z. 30 bp 5' en 3' voor gewenste edit).
- Selecteer het genoom Caenorhabditis elegans in het pulldown menu.
- Selecteer het Protospacer naast motief (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) in het pulldown menu.
- Klik op verzenden. Kies de hoogste gerangschikte doel volgorde dichtst bij het bewerken van belang in de resultatenpagina. Als er geen geschikt doel binnen de begeleidende 60 bp input sequentie zijn, vouwt u de query-reeks tot 100 bp (d.w.z. 50 bp aan weerszijden van de gewenste bewerken).
- Verkrijgen van een beschikbaar bron, bijvoorbeeld synthego, een 20-mer doel sgRNA met de volgende specificaties: 3 nmol; geen wijzigingen.
- Na ontvangst, centrifugeer gelyofiliseerd sgRNA buis op met > 12.000 x g voor 1 minuut bij kamertemperatuur. 60 µL voor nuclease-gratis TE toevoegen aan de buis, en zachtjes resuspendeer door pipetteren naar boven en beneden de 15 - 20 keer met behulp van een precisiepipet van P200. De eindconcentratie is 50 µM.
2. een door de homologie geleide reparatie sjabloonontwerp
- Ontwerp een ssODN HDR sjabloon, bevattende: 1) de mutatie van belang, 2) een unieke in-frame beperking endonuclease site, 3) een stille mutatie van een of beide van de Gs binnen de NGG PAM-reeks, en 4) 50 bp 5' en 3' homologie armen flankerend de eerste en laatste mutatie. (Figuur 1 c) 9 , 10.
- Als de mutatie van de sequentie NGG PAM niet mogelijk is, voeren 5-6 stille mutaties binnen de sgRNA doel erkenning volgorde om te voorkomen dat sgRNA-gemedieerde splitsing van de ssODN HDR-sjabloon.
- Vanuit een beschikbare bron, bijvoorbeeld idtdna, een "Ultramer DNA oligonucleotide" te verkrijgen met de volgende parameters: schaal: 4 nmol; Formulering: None; Zuivering: Standaard ontzouten.
- Na ontvangst, centrifugeer gelyofiliseerd ssODN buis op met > 12.000 x g voor 1 minuut bij kamertemperatuur. Zachtjes resuspendeer ssODN om een eindconcentratie van 100 µM in nuclease-vrije ddH2O door pipetteren naar boven en beneden de 15 - 20 keer met behulp van een precisiepipet van P200.
3. ontwerp-genotypering Primers
- Ontwerp een begeleidende de genoom wijziging instellen voor het genereren van een ~ 400-700 bp PCR amplicon11primer.
- Optimaliseren van PCR fietsen voorwaarden voor de productie van een interne en specifieke amplicon11.
4. bereid injectie Mix
- Centrifugeer tabel 1 reagentia op maximale snelheid gedurende 2 minuten bij 4 ° C.
- In de aangegeven volgorde, aan een PCR nuclease-gratis buis met toevoegen van tabel 1 reagentia.
- Meng door zachtjes op en neer 10 keer met een pipet P20 pipetteren.
- Injectie mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
5. injectie Protocol
- Injectie micropipet met ongeveer de helft van de injectie mix12laden. Sla de resterende injectie mix in het geval de injectie naald klompen of breekt.
- Breken micropipet uiteinde zodat ~ 20-30 psi een geleidelijke vloeiende oplossing12 produceert.
Opmerking: Grotere diameter tips negatief van invloed zijn op de gezondheid van dieren en verlagen F1 nakomelingen opbrengst. - Injecteren van 10-15 jonge volwassen wormen in beide gonadale armen indien mogelijk12. Als dat niet het geval is, injectie in één gonadale arm is voldoende.
- Toestaan dat ingespoten dieren (P,0) om te herstellen voor 1-2 h bij kamertemperatuur op een 35 mm OP50-geplaatste nematode media (NGM) groeischijf. Vervolgens kies één ingespoten P0 dieren aan individuele OP50-geplaatste 35 mm NGM platen met behulp van een platina wire worm12.
6. screen P0 platen en enkele mCherry(+) F1s
- Twee dagen na injectie, identificeren P0 platen met F1 nakomelingen uiting van mCherry in de farynx met een fluorescerende stereomicroscoop (Figuur 1 d, dag 2 - 3). Kies drie P0 platen die de meeste mCherry(+) F1 dieren bevatten.
- Uit elk van de drie geselecteerde P0 platen, één 8-12 mCherry(+) F1 dieren voor een totaal van 24-36 mCherry(+) F1s met behulp van een worm halen (Figuur 1 d, dag 2 - 3).
Opmerking: mCherry(-) dieren kunnen ook een honkslag sloeg uit deze P0 platen, maar de kans om correct te identificeren bewerkt dieren is veel lager (figuur 2A). - Toestaan dat individuele F1s tot self-fertilize en leggen eieren voor 1-2 dagen bij kamertemperatuur.
7. één Worm PCR en genotypering
- Na 1-2 dagen voor het leggen van eieren, breng u de F1s in individuele PCR strip tube caps met 7 µL van Worm Lysis Buffer met behulp van een worm pick ( Figuur 1 d,tabel 2, dag 4-5).
- Centrifuge PCR buizen bij maximumsnelheid voor 1 minuut bij kamertemperatuur te brengen dieren naar de onderkant van de buis, bevriezen buizen bij-80 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: Wormen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. - Lyse van bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma: 60 ° C gedurende 60 minuten, 95 ° C gedurende 15 minuten, 4 ° C houdt.
- Set-up PCR mastermix zoals aangegeven in tabel 3.
- Voegt toe 21 µL van het PCR mastermix in schone PCR buizen, en vervolgens 4 µL van lysis van de worm uit stap 3. Meng goed met behulp van een precisiepipet en PCR-programma volgens de richtlijnen van de fabrikanten (Zie Materialen tabel).
- Zuiveren van PCR reacties met behulp van een schone DNA en concentraat kit, volgens de instructies van de fabrikant (Zie Materialen tabel). Elueer DNA door 10 µL water toe te voegen aan de kolom van de spin.
- Set-up restrictie-enzym mastermix zoals aangegeven in tabel 4.
- 10 µL van het restrictie-enzym mastermix toevoegen aan elke schoongemaakte PCR-reactie en incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 ° C13.
- Aparte verteerd PCR producten op een 1,5% agarose gel op 120 V met 1 x Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer14uitgevoerd.
8. identificatie en verificatie van de opeenvolging van bewerkte dieren
- Onderzoeken enzym verteerd monsters op de aanwezigheid van bands die wijzen op potentieel bewerkt dieren14 (Figuur 1 d, dag 4-5).
Opmerking: Een N2-besturingselement ter identificatie van potentiële indel mutaties die kunnen worden waargenomen als verschuivingen in de band grootte en/of onverwachte en complexe restrictie-enzym spijsvertering "banding" patronen laden. - Na het identificeren van potentiële bewerkte dieren, gebruik de resterende 3 µL van lysis van de worm en herhaal de PCR-reactie. Niet schoon of restrictie-enzym verteren de PCR reactie nadat het programma is voltooid. De PCR-reactie op een 1% agarose gel, afzonderlijke laden en haal de band met behulp van een gel extractie kit15 (Zie Materialen tabel).
- Sanger reeks16 gel geëxtraheerde DNA met behulp van de F1-primer te identificeren correct bewerkte dieren (figuur 1A)
Opmerking: Heterozygote leest zal bevatten overlay pieken als gevolg van de aanwezigheid van de wild-type en gemanipuleerde allel. - Te verkrijgen bij homozygoot dieren geverifieerde heterozygoot bewerkte dieren, één 8-12 F2 dieren stappen 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutaties in menselijke superoxide dismutase 1 (SOD1) goed voor ~ 10-20% van de familiale Amyotrofische laterale sclerose, een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die steevast tot verlamming en dood17 leidt. Menselijke SOD-1 is een evolutionair Geconserveerde proteïne delen van 55% identiteit en 70% gelijkenis met de C. elegans SOD-1 proteïne (figuur 1B). Om aan te tonen de eenvoud, haalbaarheid en doeltreffendheid van de CRISPR-Cas9-RNP gebaseerde aanpak, we gericht het C. elegans sod-1 gen in te voeren van de ziekte-geassocieerde menselijke G93A variant in het genoom van de worm (figuur 1A).
Om ingenieur de G93A mutatie in het genoom van C. elegans , een sgRNA werd gekozen waarvan PAM erkenning de site zit 3 bp stroomopwaarts van de G93-codon (Figuur 1 c). We ontwierpen een ssODN HDR reparatie sjabloon, bevattende: 1) nucleotide wijzigingenin het G93 codon omzetten in A93 (GGA GCA), 2) een stille verandering aan de NGG PAM volgnummer (CGG CAG) om te voorkomen dat sgRNA-Cas9-gemedieerde splitsing van de HDR-sjabloon, 3) een stille Mutatie (CT) die introduceert een unieke HindIII restrictie-enzym site voor genotypering, en 4) 50 bp 5' en 3' homologie wapens (Figuur 1 c). Een PCR Inleiding set (F1-R1) werd speciaal ontworpen om één 592 bp PCR product in N2 besturingselementen (figuur 1A). Een injectie mix met het sgRNA, werden Cas9, ssODN en een fluorescerende marker plasmide (pCFJ90) vermengd, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en geladen in een microinjection pipet.
Figuur 1 d schildert de werkstroom nadat de injectie mix in een injectie micropipet is geladen. Op dag 0, waren 10-15 P0 dieren geïnjecteerd in één of beide gonaden armen met behulp van de standaard microinjection techniek18,19. Ingespoten dieren herstelde zich voor 1-2 h en vervolgens afzonderlijk op OP50-geplaatste NGM platen werden verguld. Na 2-3 dagen, werden succesvolle P0 injecties geïdentificeerd door degenen die mCherry(+) F1 nakomelingen. De kopplaten van de drie P-0 (dat wil zeggen degenen die het grootste aantal mCherry(+) F1s) werden gekozen voor de daaropvolgende analyse. Uit elk van deze drie platen (P0-8, P0-10, P0-12), 8 mCherry(+) F1s waren een honkslag en individuele OP50-geplaatste 35 mm NGM platen voor een totaal van 24 mCherry(+) F1s. Na 2-3 dagen van leggen van eieren (dag 4 - 5), de individuele F1s waren overgedragen in PCR buizen met worm lysis-buffermengsel en bevroren gedurende 1 uur bij-80 ° C. Vervolgens werden de F1s lysed om te bevrijden van genomic DNA, en onderworpen aan PCR. De PCR-producten werden vervolgens gezuiverd verteerd met HindIII voor 1 h en uitgevoerd op een 1,5% agarose gel om te identificeren van potentieel bewerkt dieren. In goed bewerkte dieren, HindIII spijsvertering snijdt de full-length PCR product (592 bp) in twee bands van 370 bp en 222 bp. Deze genotypering strategie ondubbelzinnig onderscheidt tussen wild-type (592 bp), heterozygote (592, 370, 222 bp) en homozygote (370, 222 bp) dieren. Figuur 2A toont de resultaten van de genotypering voor de 24 mCherry(+) dieren.
Om aan te tonen dat de fluorescerende mCherry markering voor wijziging van het genoom verrijkt, pakte wij ook 8 mCherry(-) dieren van elk van de drie P0 platen. Van de 24 mCherry(+) F1s gescreend (rode balk), opgenomen 10 mono-allèlique of bi-allèlique wijziging (42%), 10 waren wild type (42%), 3 waren potentiële microdeleties (13%), en er was 1 PCR mislukking (figuur 2A). In tegenstelling van de 24 mCherry(-) F1s gescreend, werd slechts 1 dier correct gemodificeerde (4%); Overwegende dat 23 waren wild type (96%) (Figuur 2A). Figuur 2B toont het chromatogram van de full-length gel uitgepakte PCR product (F18-6), getrouw aan te tonen dat de precieze nucleotide-wijzigingen in de sjabloon ssODN HDR ontworpen werden opgenomen in het genoom van deze homozygoot F 1 dier. Met name tentoongesteld F1 dieren 10-7, 10-8, en 12-3 onverwachte PCR product maten en beperking digest banding patronen, suggereren dat deze dieren kunnen overgaan tot complexe indel mutaties (figuur 2A). Dus, onze methode is niet alleen geschikt voor het genereren van gewenste genoom modification(s) met gemak, efficiëntie en trouw, maar maakt ook de identificatie en het herstel van unieke indel allelen die belangrijke en onverwachte inzicht genfuncties kunnen werpen.
Figuur 1 . CRISPR-Cas9 engineering van de C. eleganssod-1 locus. (A) Schematische illustratie beeltenis van de exon-intron structuur van de sod-1 locus in C. elegans. De rode balk geeft de locatie van G93 in exon 3. De primer paar set wordt opgemerkt door de rode pijlen (F1-R1). (B) volgnummer uitlijning van mens en C. elegans (worm) SOD-1 eiwitten. Het gerichte G93 residu is rood gemarkeerd. (C) Top, een deel van genomic DNA rondom de G93-codon wordt weergegeven als een referentie, en de PAM (groen) en sgRNA (blauw) doel sites worden gemarkeerd. Bodem, de één gestrande oligonucleotide (ssODN)-homologie geregisseerd reparatie (HDR)-sjabloon wordt weergegeven met: het codon bewerken G93 omzetten in A93, een stille wijziging van het PAM motief om te voorkomen dat splitsing door de sgRNA-Cas9-complex, een stille omzetten invoering van een uniek HindIII restrictie-enzym site (gele box) en ondersteunende 5' en 3' 50 bp homologie wapens (zwarte balken). Alle wijzigingen van de nucleotide ontworpen in de ssODN zijn gemarkeerd rood. (D) Schematische illustratie van de pijpleiding voor het genereren en het identificeren van CRISPR-Cas9-RNP gebaseerde punt mutanten. Injecteren op dag 0, 10-15 P0 dieren met injectie mix. Op dag 2-3, identificeren met succes ingespoten P0 dieren door degenen met fluorescerende F1 nakomelingen en selecteer drie P0 platen met de meest fluorescerende nakomelingen. Op elk van de drie P0 platen, single 8 fluorescerende F1 nakomelingen. Op dag 4-5, onder a, stap 1, individuele F1s zijn geplukt en geplaatst in PCR buizen met Lysis Buffer; (b) stap 2, zijn na het bevriezen bij-80 ° C, PCR buizen met F1 wormen lysed om genomic DNA, die wordt gebruikt als een sjabloon PCR vrij te geven. De PCR-producten worden vervolgens gereinigd en verteerd met de unieke restrictie-enzym; (c) stap 3, enzym verteerd producten worden opgelost op een agarose gel waar wild type (+/ +), heterozygoot (m / +), en homozygoot (m/m) dieren kunnen worden geïdentificeerd door beperking digest "banding" patronen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Genotypering gegevens voor sod-1 (G93A) mutanten. ()A) Gel beeld van F 1 -dieren die individueel werden lysed, PCRed en verteerd met HindIII. Voor elke P0 plaat (P0-8, P0-10, P0-12), werden 8 mCherry(+) en 8 mCherry(-) F1 dieren geanalyseerd. Mono-allèlique (blauwe cijfers) en/of bi-allèlique (rode cijfers) bewerkte dieren werden teruggevonden. Grootte verschoven PCR producten of onvoorspelbare HindIII verteerd bands werden ook teruggevonden die zijn indicatief van indel mutanten (gele getallen). N2 besturingselementen worden weergegeven als een referentie voor PCR product Sorteringsvoorschriften en enzym specificiteit. (B) Top, codon afstand en aminozuur vertalingen voor het wild-type (WT) zijn hierboven en hieronder voor G93A gewijzigd strengen. De gewenste bewerking is gemarkeerd met een rood vakje, en de Stille wijzigingen waarmee de beperkingsplaats van een in-frame-HindIII worden gemarkeerd door een gele box. Alle ontworpen nucleotide wijzigingen zijn vetgedrukt. Bodem, representatieve chromatogram van homozygoot F1 dier 8-6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | Volume | Eindconcentratie |
| ddH2O | 6.3 ΜL | ---- |
| KCl (4M) | 0.94 ΜL | 300 mM |
| HEPES (0.5M) pH 7.4 | 0,5 ΜL | 20 mM |
| pCFJ90 (25 ng/μl) | 1,25 ΜL | 2.5 ng/μL |
| ssODN (500 ng/μl) | 1,25 ΜL | 50 ng/l |
| sgRNA (50 μM) | 1,25 ΜL | 5 ΜM |
| Cas9 (61 μM) | 1,03 ΜL | 5 ΜM |
| Eindvolume | 12.5 ΜL | ---- |
Tabel 1. CRISPR-Cas9 RNP injectie Mix. Alle reagentia moeten opnieuw geschorst in nuclease-vrije ddH2O. RNase gratis technieken moeten worden gebruikt bij de behandeling van reagentia en bij het maken van de injectie-mix.
| Reagens | [Laatste] |
| KCl | 50 mM |
| Tris-HCl pH 8.3 | 10 mM |
| MgCl2 | 2.5 mM |
| NP-40 | 0,45% |
| Tween-20 | 0,45% |
| Proteïnase K | 1 mg/mL |
Tabel 2. Recept van de Buffer van worm Lysis. Proteïnase K vers vóór elk gebruik moeten worden toegevoegd.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 2 x Q5 Mastermix | 12.5 ΜL | 300 L |
| Primer F1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Primer R1 (10 μM) | 1,25 ΜL | 30 ΜL |
| Lysis van de worm | 4 ΜL | ---- |
| ddH2O | 6 ΜL | 144 ΜL |
| Eindvolume | 25 ΜL | 504 ΜL |
Tabel 3. PCR Mastermix. De PCR mastermix moet goed door pipetteren totdat de oplossing is een homogeen gemengd worden. 21 µL van het PCR-mastermix moet worden toegevoegd aan schone PCR buizen, en vervolgens 4 µL van individuele worm lysate moet worden toegevoegd aan goed gelabelde buizen.
| Reagens | 1 x | 24 x |
| 10 x enzym Buffer | 2 ΜL | 48 ΜL |
| Schoongemaakte PCR reactie | 10 ΜL | ---- |
| ddH2O | 7 ΜL | 168 ΜL |
| Restrictie-enzym (10 U/μl) | 1 ΜL | 24 ΜL |
| Eindvolume | 20 ΜL | 240 ΜL |
Tabel 4. Restrictie-enzym Mastermix. De restrictie-enzym mastermix moet goed door pipetteren totdat de oplossing is een homogeen gemengd worden. 10 µL van het restrictie-enzym mastermix moet worden toegevoegd aan 10 µL van het PCR-product gereinigd
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het CRISPR-Cas9-systeem is een krachtige en effectieve tool om het genoom van modelorganismen juist te wijzigen. Hier, we laten zien dat chimeer sgRNAs20 in combinatie met ssODN HDR sjablonen inschakelen de hoogefficiënte generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. Nog belangrijker is, we laten zien dat RNP levering bewerken hoogrenderende produceert wanneer fluorescentie wordt gebruikt als een marker co selectie, markeren het gemak en de betrouwbaarheid van de techniek.
De meerderheid van de CRISPR-Cas9 methoden voor C. elegans genoom engineering is afhankelijk van specifieke genetische achtergronden of co-CRISPR strategieën1. De co-CRISPR methode gebleken te zijn van een ongelooflijk nuttig hulpmiddel dat de kans verhoogt voor het verkrijgen van een succesvolle genoom bewerken. Co-CRISPR methoden vereist echter dat de invoering van een fenotype-selecteerbare bewerken op een marker locus die voor het bewerken van het genoom van belang verrijkt. Terwijl krachtig, invoering van selecteerbare fenotype dragende mutaties mogelijk ongewenst als de spanning om te bewerken of de gewenste mutatie van het punt van belang zelf vertoont fenotypen die kunnen worden verergerd of onderdrukt door het fenotype van de markering. Bovendien, co-CRISPR strategieën noodzakelijk het aanmaken van een extra dubbele strand break op de locus van een marker die bijdragen kan om uit-target effecten. Hier presenteren we een methode die een voorbijgaande fluorescerende markering die niet alleen dient ter identificatie van de met succes ingespoten P0 dieren, maar ook verrijkt voor juiste genoom bewerkingen worden gebruikt. Onze gegevens tonen deze methode aanzienlijk verrijkt met succes bewerkte dieren in vergelijking met niet-belichting fluorescerende dieren, en biedt diverse onmiskenbare voordelen: 1) alleen gericht op site-specific sgRNA vereist is, 2) een vermindering van de 5-fold in Cas9 en de concentratie van de sgRNA, 3) stam - en fenotype-de selectie van onafhankelijkheid, en 4) een nominale screening werklast (~ 24 F1s). Robuuste CRISPR-Cas9 genoom bewerken in de F1 generatie werd waargenomen met behulp van deze methode. Met name, kan de strategie van de PCR-restrictie-enzym gebaseerde detectie beschreven de ondubbelzinnige detectie van mono - en bi-allèlique bewerkte dieren in de F1 generatie. Tot slot de genotypering strategie vergemakkelijkt de identificatie van potentiële indel mutaties, die kunnen worden waargenomen als PCR band wanneer verschuivingen vergeleken met N2 besturingselementen, die niet vatbaar zijn voor beperking digest of opbrengst complexe bands wanneer verteerd.
De komst van de volgende generatie sequencing in combinatie met grootschalige genomic inspanningen de identificatie van genomic varianten die met ziekte21 scheidenheeft versneld. Echter, functionele tests van pathogeniteit zijn niet aangetoond voor de meeste varianten in cellulaire en organisch modelsystemen. In deze studie, we gericht het sod-1 gen in C. elegans om de grote schaal bestudeerde ALS-geassocieerde SOD-1G93A mutatie. Deze mutatie is tot op heden, gemodelleerd en studeerde in C. elegans en muizen die voornamelijk met behulp van transgene overexpressie. Hoewel overexpressie van varianten in diermodellen sleutel cellulaire recapituleren kan, moleculaire en gedragsmatige aspecten van ziekte, het wordt steeds duidelijker dat 'dosis' een verzachtende factor is bij het bepalen van de fenotypen22. Bijvoorbeeld vertonen hoge kopie nummer SOD-1G93A muizen uitvoering van ~ 24 kopieën van de mutant menselijke SOD-1 gen sterk versnelde ziekte cursus in vergelijking met SOD-1G93Adl muizen, waaraan slechts ~ 8-10 exemplaren23,24. Hier, we laten zien dat onze CRISPR Cas9 RNP-gebaseerde methode kan worden gebruikt om snel genereren van de menselijke variant-geassocieerde mutaties in het gen orthologous worm zonder transgene overexpressie, in een poging om het meer precies repliceren de genetische modificatie kader van de ziekte. Onze methode biedt een haalbaar platform voor het produceren en testen van genomic varianten van onbekende betekenis in de context van endogene wettelijke controle en expressie, die zich verzet tegen de grenzen van overexpressie. Ten slotte hebben we ook gebruikt deze methode om tag van endogene genen met fluorescerende eiwitten (d.w.z. GFP), die voor een extra hulpmiddel zorgt voor het visualiseren van de invloed van varianten eiwit lokalisatie, aggregatie, en omzet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij danken de leden van de Beg-laboratorium voor kritische lezing van dit manuscript. Stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Onderzoek in het laboratorium Beg wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS094678) and Muscular Dystrophy Association (MDA382300) naar A.A.B.
Acknowledgments
Er zijn geen conflicten van belang in verband met dit verslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
