Summary
Toeprinting har til formål at måle evne til i vitro transskriberet RNA til form oversættelse indledningen komplekser med ribosomer under forskellige betingelser. Denne protokol beskriver en metode til toeprinting pattedyr RNA og kan bruges til at studere både cap-afhængige og IRES-drevet oversættelse.
Abstract
Oversættelse indledningen er det hastighedsbegrænsende trin i proteinsyntese og udgør et centralt punkt, hvor cellerne regulerer deres protein produktion. Regulering af proteinsyntesen er nøglen til cellulære stress-respons, og dysregulering er centralt i mange sygdomstilstande, såsom kræft. For eksempel, selv om cellulært stress fører til hæmning af globale oversættelse af formildende cap-afhængige indledning, visse stress-respons proteiner selektivt er oversat i en cap-uafhængig måde. Diskret RNA regulerende elementer, såsom cellulære intern ribosom indrejse steder (IRESes), giver mulighed for oversættelsen af disse specifikke mRNAs. Identifikation af sådanne mRNAs og karakterisering af deres reguleringsmekanismer, har været et centralt område i Molekylærbiologi. Toeprinting er en metode til undersøgelse af RNA struktur og funktion, som den vedrører oversættelse indledningen. Målet med toeprinting er at vurdere evne til i vitro transskriberet RNA til at danne stabile komplekser med ribosomer under en række betingelser, for at afgøre, hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er involveret i ribosomet bindende — en pre-cursor for effektiv oversættelse indledningen. Sammen med andre teknikker, såsom vestlige analyse og polysome profilering, giver toeprinting mulighed for en robust karakterisering af mekanismer til regulering af oversættelse indledningen.
Introduction
Som oversættelse forbruger mest cellulære energi, giver det mening at oversættelsen er stramt reguleret1. Omvendt dysregulering af oversættelsen- og de deraf følgende ændringer i protein output-er ofte observeret i stress-respons og sygdom stater, såsom kræft1,2. En stor fordel for Translationel kontrol er den hastighed, hvormed cellerne kan ændre deres protein output for at reagere på forskellige stimuli3. Oversættelse forordning udgør således en vigtig mekanisme, der kan påvirke celle overlevelse og død1,2,3. Af trinene i oversættelse er indledning den de fleste stærkt reguleret og komplekse3. Kort, mest eukaryote mRNAs indeholder en 5' m7G cap, der næsten altid er afgørende for deres oversættelse. Cap-afhængige indledningen kræver eukaryote indledning faktorer eIF4E, eIF4A og eIF4G (fælles landbrugspolitik-anerkendelse komplekse) at interagere med 5' enden af mRNA. 43S preinitiation ribosomet kompleks, som indeholder eIF2-bundet initiativtager tRNA og eIF3, er rekrutteret til 5'-enden af mRNA via et samspil mellem eIF4G og eIF3. Preinitiation komplekse menes at scanne mRNA, hjulpet af eIF4A (et RNA-helicase) indtil start codon (AUG) er placeret. 48S indledning komplekse dannede efterfølgende og tRNA leveres i P-site af ribosomet. Endelig er 60S og 40S ribosom underenheder forenet til at danne 80S indledning komplekse, efterfulgt af oversættelse brudforlængelse1,3,4. Derimod omgå intern ribosom indrejse steder (IRESes) kravet om en 5' fælles landbrugspolitik ved at rekruttere 40S ribosomale subunit direkte til indledning codon3. Fysiologiske stress betingelser dæmpe globale mRNA oversættelse på grund af ændringer af vigtige generelle eukaryote indledning faktorer (eIFs). Dog ikke-kanoniske oversættelse indledningen mekanismer mulighed for selektiv oversættelse af visse mRNAs, som ofte indkode stress-respons proteiner, og dysregulering af ikke-kanoniske oversættelse indledningen er involveret i sygdomstilstande som kræft 1 , 2. diskret RNA regulerende elementer, såsom cellulære IRESes, giver mulighed for oversættelse af sådanne mRNAs2,3.
Et særligt interessant aspekt af Translationel kontrol er at forstå mekanismerne for kanoniske versus ikke-kanoniske oversættelse af en given mRNA. Toeprinting er en teknik, der giver mulighed for detaljerede mekanistiske studier af oversættelse indledningen af specifikke RNA'er in vitro. Det overordnede mål med toeprinting er at vurdere muligheden for en RNA af interesse at samme dannelsen af en oversættelse indledningen kompleks med ribosomet under en række betingelser, for at afgøre, hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er nødvendige for effektiv oversættelse indledningen. For eksempel kan ribosomet rekruttering hæmmes i mangel af en 5' cap men stimuleres af tilstedeværelsen af en IRES.
Princippet for teknikken er til in vitro- omskrive en RNA af interesse, inkuberes det i overværelse af cellulære ekstrakter som indeholder komponenter, oversættelse (eller de renset dele) for at tillade indledning komplekser til form og vende transskribere RNA med en specifik primer. Stabil RNA-ribosomet komplekser vil forårsage reverse transkription til stall på 3' kanten af ribosomet-den såkaldte 'toeprint'5,6,7.
I denne protokol, ribosomale underenheder, eIFs, tRNAer og IRES trans-virkende faktorer (ITAFs) er bekvemt bidraget af kanin reticulocyte lysate (RRL). En anden fordel ved denne protokol er brugen af en fluorescently mærket primer og fluorescens gel-baserede imager, snarere end en radiolabeled primer. Dette eliminerer ekstra foranstaltninger, herunder radiolabeling primer, samt tørring gel og udsætte den for en intensivere skærm. De fluorescerende bands registreres i realtid, som gel kører, giver mulighed for højere opløsning. Ikke-reducerede X-linked hæmmer af apoptose proteiner (XIAP) IRES RNA er brugt som et eksempel her, selvom udjævnede mRNAs kan også analyseres ved denne teknik8.
I modsætning til vestlige analyser, som måler det endelige output af oversættelsesprocessen i cellelysater, er toeprinting en in vitro- metode til at måle oversættelse indledningen kompleks dannelse på en RNA. Denne reduktionistiske tilgang giver mulighed for meget detaljerede undersøgelse af substrater eller faktorer, der regulerer oversættelse indledningen (fx., loft eller un-udjævnede mRNA, IRES struktur, tilstedeværelse eller fravær af poly-en hale, bestemmelse af specifikke protein faktorer, etc.). Toeprinting kan dermed bruges til at studere forskellige former for oversættelse8 eller virkningerne af mRNA strukturer, såsom IRESes, protein syntese9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: RNA er meget modtagelige for nedbrydning af ribonukleaser (RNases). Tage standard forholdsregler til at holde RNA intakt. Ændre handsker hyppigt. Bruge filtrerede pipette tips, nukleasen-fri plasticware og nukleasen-fri kemikalier i alle trin i protokollen. Brug nukleasen-fri eller diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand til alle løsninger.
1. forberedelse af løsninger
- Forberede Toeprinting buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) saccharose, 2 mM dithiothreitol (DTT) og 0,5 mM spermidine.
- Gemme DTT og spermidine i engangsbrug alikvoter ved-20 ° C for at undgå gentagne fryse-tø cykler.
Bemærk: DTT og spermidine bør tilføjes til toeprinting buffer umiddelbart før brug. En løsning mangler DTT og spermidine kan opbevares ved-20 ° C.
- Gemme DTT og spermidine i engangsbrug alikvoter ved-20 ° C for at undgå gentagne fryse-tø cykler.
- Forberede delprøver af 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) og 91 mM adenosintrifosfat (ATP). Gemme alikvoter ved-20 ° C.
- Forberede 450 mL 6% polyacrylamid - 7M urinstof gel mix: 67,5 mL 40% acrylamide:bis-acrylamid (19:1), 189 g urea, 112,5 mL 5 x TBE (Borat-Tris-thylenediaminetetraacetic syre (EDTA)) og 120 mL vand. Opløses urinstof ved opvarmning i et 37 ° C vandbad eller på en varmeplade med omrøring. Opløsningen filtreres (fx., 0,2 μm nitrocellulose vakuum filter).
Bemærk: Løsningen kan opbevares ved 4 ° C i mindst en måned.
Forsigtig: Monomere acrylamid er en nervegift, der kan optages gennem huden. Tage stor forsigtighed for at undgå kontakt med huden (dvs., bære handsker, en laboratoriekittel og eye protection). Polyacrylamid bør også håndteres med forsigtighed, som polymerisering ikke kan fortsætte til 100% afsluttet. - Forberede formamid lastning farvestof: 95% formamid, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) sodium dodecyl sulfat (SDS), 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol. Opbevares ved-20 ° C.
- Opløs 1 nmol primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' enden-mærket med IRDye 800) i 100 μl vand til en fungerende koncentration af 10 pmol/μl. Opbevares ved-20 ° C i engangsbrug delprøver (ca. 10 µL), beskyttet mod lys.
2. forberedelse af mRNA
- Forstærke DNA skabeloner til syntese af mRNA ved polymerase kæde reaktion (PCR) fra passende skabeloner (dvs., genomisk DNA eller plasmid DNA, som passende). Bruge en high-fidelity DNA polymerase ifølge fabrikantens anvisninger, med følgende reaktionsbetingelser (35 cykler): Smelt, 98 ° C, 10 s; bind, 53 ° C, 20 s; udvide, 72 ° C, 30 s.
Bemærk: Den forreste primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) indeholder T7 promotor sekvens til RNA transskription; den omvendte primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) indeholder 51 thymin restkoncentrationer for at give en poly-A hale for de transskriberede RNA. Bemærk, at RNA kan også være i vitro transskriberet fra plasmid DNA. - Brug en passende transskription kit til in vitro- transskribere IRES-holdige RNA eller udjævnede RNA fra skabelonen DNA. Følg producentens anvisninger. Forberede RNA prøven i standard 20 μL reaktion diskenheder. Behandle den nyligt syntetiserede RNA med 2 enheder af RNase-fri DNase i 30 min. ved 37 ° C.
- Fortynd den DNase-behandlede RNA til 110 µL med nukleasen-gratis vand tilføje 110 µL syre phenol, vortex 5 s og centrifugeres i 3 min på 20.000 x g ved stuetemperatur. Fjerne 100 µL af den vandige fase til en ny 1,5 mL mikrofuge rør, tilsæt 10 µL af 3 M natriumacetat og vortex 2 s. Tilføj, 3 bind af 100% ethanol, vortex 5 s, og bundfald RNA ved-20 ° C natten over.
- Der centrifugeres ved > 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten. Vaske pellet med 500 µL af iskold 70% (v/v) ethanol og gentage centrifugeringen. Aspirat så meget af supernatanten som muligt og lufttørre pellet i 5-10 min. være omhyggelig med ikke at løsne pelleten.
- Resuspend RNA i den passende mængde nukleasen-gratis vand til at give en arbejdende koncentration på 0,5 μg/μL. Dette kan opbevares ved-80 ° C eller bruges umiddelbart.
3. Toeprinting reaktion
- Mix 15 μL kanin Reticulocyte Lysate (RRL, ikke nukleasen-behandlet), 1 μL (40 enheder) af RNase Inhibitor, 1 µL af 91 mM ATP (1.82 mM endelige) og 1 μL af 85 mM GMP-PNP (1,7 mM endelige) i 1,5 mL mikrofuge rør. Der inkuberes ved 30 ° C i 5 min.
Bemærk: RRL skal være aliquoted til enkelt brug at undgå gentagne fryse-optøning. En kritisk kontrol er en reaktion mangler RRL, for at belyse de naturlige pauser af reverse transkription som følge af sekundær struktur af RNA. Tilføj toeprinting buffer for at erstatte RRL for denne kontrol. - Tilsæt 0,5 µg (1 µL) af RNA og inkuberes ved 30 ° C i 5 min.
- Tilføje 22 µL af Toeprinting buffer og inkuberes ved 30 ° C i 3 min.
- Tilsættes 0,5 µL (5 pmol) af IRDye-mærket primer og der inkuberes i isbad i 10 min.
- Tilføj 2 µL af 25 mM dNTP'er (endelig koncentration: 1 mM), 2 µL af 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL af aviær Myeloblastosis Virus Reverse transkriptase (AMV-RT) og 3,5 µL af Toeprinting buffer. Den endelige rumfang er 50 μL.
- Inkuber reaktion ved 30 ° C i 45 min.
- Tilføje 200 µL nukleasen-gratis vand og straks uddrag med 250 µL 25:24:1 phenol: chloroform: isoamyl alkohol (pH ca 8,0). Vortex 5 s og centrifugeres ved 20.000 x g i 3 min ved stuetemperatur. Fjerne den vandige fase til en ny 1,5 mL mikrofuge tube, tilføje 3 bind af 100% ethanol, vortex 5 s, og udfældes ved-20 ° C natten over.
- Der centrifugeres ved > 20.000 x g i 30 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten. Vask DNA pellet med 500 µL af iskold 70% (v/v) ethanol. Der centrifugeres ved > 20.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Aspirat så meget supernatanten som muligt og luft tørre pellet i 5-10 min. være omhyggelig med ikke at løsne pelleten.
- Opløses pellet i 6 μL nukleasen-gratis vand og tilsættes 3 μL af formamid lastning farvestof.
4. sekventering reaktioner
- Brug skabelonen DNA fra 2.1 og den IRDye-mærket primer fra trin 3.4 for standard sekventering reaktioner, ved hjælp af dideoxynucleotides (ddNTPs) som kæde terminators. Brug en passende DNA-sekventering kit og Følg fabrikantens anvisninger.
- Mix 6 μL af hver sekventering reaktion med 3 μL af formamid lastning farvestof.
5. forberedelse af sekventering Gel og elektroforese
Bemærk: Denne protokol bruger et fluorescens gel-baserede imager og et 21 cm x 23 cm x 0,2 mm gel, men kan tilpasses til andre sequencere eller gel-størrelser, hvis det kræves.
- Grundigt rene 0,2 mm spacere samt kort (23 × 25 cm) og lange (30 × 25 cm) glasplader med 100% ethanol. Lufttørre.
- Mix 30 mL 6% polyacrylamid - 7M urinstof gel blandes med 200 μl af 10% (w/v) ammonium persulfat (APS) og 20 μL af tetramethylethylenediamine (TEMED). Hæld gel, at tage sig for at undgå boblerne, og Indsæt 'haj-tand' gel kam. Tillad gel til at polymerisere i 1 time ved stuetemperatur.
- Samle sekventering apparater og fylde reservoirerne med 1 x TBE.
- Pre-køre for 15 min på 1500 V, indtil den optimale temperatur på 55 ° C opnås.
- Opvarmes prøven/lastning farvestof mix (fra trin 3.9 eller 4.2) til 85 ° C i 5 min. belastning 1 μL på sekventering gel.
- Kør gelen på 1500 V for 8 h. Maskinen vil læse bands i realtid.
- Adskille apparatet, og afhænde acrylamid gel og kører buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere beskrevet XIAP IRES evne til at støtte cap-uafhængig oversættelse indledningen in vitro-8,10. Toeprinting var den vigtigste teknik til at afhøre de mekanistiske detaljer om XIAP IRES indledning komplekse. En DNA konstruktion kodning en mRNA indeholdende XIAP IRES (fig. 1A) var i vitro transskriberet og udsat for toeprinting analyse. De mutante varianter af den XIAP IRES mRNA bruges her er repræsenteret i figur 1B. Reverse transkription af XIAP mRNA-ribosomet kompleks givet typisk toeprints + 17 til + 19 nt nedstrøms af august (figur 1C, lane 1). Dette er vejledende af ribosomet rekruttering til start codon og dannelsen af stabil ribosomet-RNA komplekser5,6,7. Ribosomet rekruttering blev stærkt forringet i mangel af en poly-A hale (figur 1C, lane 9), som tidligere rapporteret11. Toeprint dannelse var også stærkt svækket i mangel af RRL og GMP-PNP (figur 1C, lane 8) og til start codon mutant (figur 1C, lane 7), bekræfter, at den observerede toeprint ikke er en struktur-induceret pause af reverse transkription er men faktisk specifikke for indledningen kompleks dannelse. Toeprint dannelse blev nedsat til 5' polypyrimidine tarmkanalen (PPT) mutanten (figur 1C, lane 2) og 3' PPT mutanten (figur 1C, lane 4), som forstyrrer IRES struktur (figur 1B)8 ,10,12. Toeprint dannelse blev restaureret når PPT mutanter blev transskriberet med en 5' cap (figur 1C, baner 3 og 5). Toeprint dannelse blev også restaureret for PPT dobbelt mutanten (figur 1C, lane 6), som genskaber sekundær struktur (figur 1B)10. Sammen, viser disse data, at XIAP IRES sekundær struktur er kritisk for oversættelse indledningen af un-udjævnede RNA og at IRES struktur er undværes til cap-afhængige oversættelse indledningen. Yderligere viser de specifikke krav for en 5' cap i mangel af en IRES struktur, blev menneskelige β-globin (Ulla) mRNA udsat for toeprinting analyse (fig. 1D). Ingen toeprint blev observeret i mangel af en 5' cap (figur 1D, lane 1) men ribosomer rekrutteret med held at udjævnede Ulla RNA (figur 1D, lane 2).
Figur 1 . Toeprinting analyse bekræfter betydningen af IRES sekundær struktur for dannelsen af oversættelse indledningen komplekser på en ikke-reducerede XIAP IRES RNA. (A) skematisk diagram over den DNA konstruktion kodning XIAP IRES RNA bruges i denne analyse. 3'-enden af toeprinting primer er 42 bp nedstrøms af start codon. (B) sekundær strukturer af WT XIAP IRES (øverst til venstre), 5' PPT mutant (øverst til højre), de 3' PPT mutant (lavere venstre) og PPT dobbelt mutant (nederst til højre). 'PPT Mutant' refererer til en punkt mutation (UU til AA) i en kritisk polypyrimidine tarmkanalen, som forstyrrer sekundærstruktur IRES8,10,12. Start codon er boxed; punktmutationer er angivet med asterisk (*). (C) Toeprinting analyse af XIAP IRES varianter evne til form oversættelse indledningen komplekser i RRL behandlet med GMP-PNP og ATP. Start codon AUG blev erstattet med AAC i Start Codon Mutant. For at gøre RNA mangler en poly-en hale, manglede den omvendte primer anvendes til at gøre skabelonen i vitro transskription blot en poly-T tarmkanalen. (D) indledning kompleks blev dannet på det udjævnede (men ikke den un-udjævnede) 5' UTR af menneskelige β-globin (Ulla). I paneler (C) og (D), venstre-mest 4 baner repræsenterer sekventering reaktioner med dideoxy nukleotider anført ovenfor hver lane; sekvensen er angivet til venstre for hvert panel. FL, fuld-længde. Alle RNA'er var un-udjævnede, medmindre andet er angivet. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publikationer8,10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting er en effektiv teknik til direkte måle evne af en RNA af interesse at støtte dannelsen af oversættelse indledningen komplekser under stærkt kontrollerede forhold. Denne protokol beskriver en forenklet teknik for toeprinting pattedyr RNA'er. Kanin reticulocyte lysate (RRL) bruges som en bekvem kilde af ribosomer, eIFs, initiativtager tRNA og IRES trans-handler faktorer (ITAFs). Eksperimentatoren giver deres RNA valg, og kan også supplere toeprinting reaktionen med specifikke cofaktorer for deres valg. For eksempel kan 48S versus 80S oversættelse indledningen komplekser differentieres baseret på fordelingen af fluorescens intensiteter af toeprints7. Indledningen komplekse observeret vil afhænge af typen af guanin nukleotid anvendes. I tilfælde af XIAP IRES diskuteret her, GMP-PNP plus ATP stabiliserer 48S før indledningen komplekser, karakteriseret ved en toeprint distribution + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP er et nonhydrolyzable GTP analog, der hæmmer ribosomale subunit sammenføjning, således blokere oversættelse indledningen på 48S trin13. Derimod stabiliserer GTP, ATP, eller ATP plus GTP 80S indledning komplekser, karakteriseret ved toeprint distribution + 17 < + > 18 + 198.
Brugeren bliver nødt til at overveje, hvilken type af RNA de ønsker at toeprint. Hvis formålet er at studere en cap-uafhængig mekanisme, f.eks en IRES element, kan RNA være i vitro transskriberet med ethvert kommercielt tilgængeligt kit. Men enhver pattedyr RNA kan blive udsat for denne toeprinting metode, forudsat at det har en 5' cap struktur. Udjævnede mRNA skal oprettes ved hjælp af en passende kit. Under alle omstændigheder bør producentens protokoller nøje følges, da forberedelsen af høj kvalitet RNA repræsenterer et vigtigt skridt i proceduren. Et andet kritisk punkt er, at phenol udvinding i trin 3.7 foretages på eller over neutral pH; Hvis syre phenol er brugt på dette stadium, vil den nyligt syntetiserede cDNA gå tabt. Det er værd at bemærke, at koncentrationen af magnesium acetat bruges i trin 3.5 kan påvirke effektiviteten af reverse transkription og måske nødt til at være optimeret til hver mRNA.
Et par centrale kontroller er nødvendige for at sikre toeprint specificitet. Først, ikke robust toeprint bemærkes i mangel af RRL eller nukleotid. Dette sikrer, at den observerede reverse transkription pause grund et ribosom-RNA kompleks snarere end en stabil RNA sekundær struktur eller nogle fejl med reverse transkription reaktionen, selv. Andet, ingen toeprint bør være overholdt, hvis start codon er muteret. Dette sikrer at ribosomet har dannet en kompleks specifikt med start codon af RNA og at brugeren har korrekt identificeret 3' kanten af ribosomet i kompleks med start codon. Dette er især vigtigt for IRES elementer, som kunne rekruttere ribosom til en alternativ start codon14. På samme måde, at toeprint kan blive forringet i mangel af en poly-en hale, som det var tilfældet for XIAP IRES8. Men nogle IRES elementer udgør toeprints i mangel af en poly-en hale, som CrPV IRES10. Endelig, ud over toeprint korrekte, andre omvendt transkription pauser kan observeres. Disse kan blot repræsenterer pauser på grund af stabile sekundære strukturer i RNA, eller de kunne være på grund af et fænomen døbt "ribosom hoppe", hvori ribosomet glider fra start codon til andre steder på RNA15. For at skelne mellem disse muligheder, kan toeprinting reaktionen udføres under tilstedeværelse af cycloheximide8, som effektivt immobiliseres ribosomet på start codon og bør reducere alternative toeprints på grund af ribosomet hoppe. Navnlig forskellige mRNAs vil have forskellige sekundære strukturer, hvilket betyder, at antallet og intensiteten af reverse transkription pauser (dvs., baggrund bands) varierer også.
En eventuel begrænsning af denne teknik er den måler ribosomet rekruttering til en mRNA in vitro, at dannelsen af en oversættelse indledningen komplekse betyder ikke nødvendigvis at oversættelsen sker in vivo. Toeprinting er derfor særligt stærke, når det kombineres med i vivo teknikker at måle oversættelse (fx., polysome profilering16) og de resulterende protein niveauer (fx., vestlige analyse).
En nyere teknik er "ribosom profilering" (også kaldet "ribosom fodspor"), hvori høj overførselshastighed RNA sekventering bruges til at måle tilstedeværelsen af ribosomer på samlede cellulære mRNA. Dette er en effektiv teknik til at måle ribosomet ansættelse på en transkriptom-plan. Iboende til ribosomet profilering er brugen af reagenser, såsom cycloheximide, til at stabilisere ribosomer på mRNAs. Dette repræsenterer potentielt en ulempe, som et uforholdsmæssigt stort antal ribosomer kan ikke-specifikt i stå i 5' utranslaterede regionen (UTR), der kan mistolkes som ikke-kanoniske oversættelse indledning17. I toeprinting er cycloheximide ikke en integreret del af proceduren, virkningsløs muligheden af sådanne falske positiver. Endvidere, enhver enkelt mRNA kan studeres nærmere af toeprinting, som det er letkøbt at gennemføre mange kontrol eksperimenter og gentagelser (f.eks teste effekten af flere punktmutationer eller fraværet af en poly-en hale på ribosom rekruttering). Det ville være tidskrævende og cost-uoverkommelige at foretage en tilsvarende række kontrol eksperimenter inden for rammerne af et ribosom profilering eksperiment. Toeprinting er således en supplerende tilgang til høj overførselshastighed sekventering-baserede teknikker, og er stadig almindeligt anvendt til undersøgelser med henblik på at belyse mekanismerne i oversættelse forordning8,9,10, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikt-af-interesse at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en naturvidenskab og teknisk forskning Rådet af Canada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Canada Foundation for Innovation-John R. Evans ledere fond (35017), Campus Alberta innoverer Program og Alberta Miljøministeriet Økonomisk udvikling og handel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
