Summary
Toeprinting a pour but de mesurer la capacité de in vitro transcrit RNA pour former des complexes initiation traduction de ribosomes dans une variété de conditions. Ce protocole décrit une méthode pour toeprinting ARN chez les mammifères et peut être utilisé pour étudier la traduction fois cap-dépendante et pilotée par l’IRES.
Abstract
Initiation de la traduction est l’étape limitante de la synthèse protéique et représente un point essentiel au cours de laquelle les cellules régulent leur production de protéines. Régulation de la synthèse de la protéine est la clé de la réponse cellulaire au stress, et le dérèglement est au cœur de nombreux états pathologiques, comme le cancer. Par exemple, bien que le stress cellulaire entraîne l’inhibition de la traduction globale par atténuation dépendante de PAC initiation, certaines protéines de la réponse au stress sont sélectivement traduits d’une manière indépendante du cap. Discrets éléments régulateurs de RNA, tels que les sites d’entrée cellulaire ribosome interne (IRESes), permettant la traduction de ces ARNm spécifiques. Identification de ces ARNm et la caractérisation de leurs mécanismes de régulation, ont été un domaine essentiel en biologie moléculaire. Toeprinting est une méthode pour l’étude de structure d’ARN et de la fonction en ce qui touche à l’initiation de la traduction. Toeprinting vise à évaluer la capacité du in vitro transcrit RNA pour former des complexes stables avec des ribosomes dans une variété de conditions, afin de déterminer quelles séquences, éléments structuraux ou accessoires facteurs sont impliqués dans les ribosomes lie — un précurseur pour l’initiation de la traduction efficace. Aux côtés d’autres techniques, telles que l’analyse occidentale et le polysome profilage, toeprinting permet une caractérisation fiable des mécanismes de la régulation de l’initiation de la traduction.
Introduction
Comme traduction consomme de l’énergie plus cellulaire, il est logique que la traduction est étroitement réglé1. À l’inverse, le dérèglement de la traduction- et les altérations qui en résulte dans la production de protéine-est souvent observée aux réponse au stress et la maladie, comme le cancer1,2. Un avantage majeur de contrôle de la traduction est la vitesse avec laquelle les cellules peuvent modifier leur production de protéines afin de répondre aux divers stimuli3. Règlement de traduction représente donc un mécanisme important qui peut influer sur la survie des cellules et la mort1,2,3. Les étapes de la traduction, l’initiation est la plupart très réglementé et complexe3. Brièvement, l’ARNm eucaryotes plus contiennent une 5' m7G PAC est presque toujours indispensable pour leur traduction. Initiation PAC-dépendant nécessite initiation eucaryote facteurs eIF4E, eIF4G et eIF4A (le complexe de cap-reconnaissance) pour interagir avec l’extrémité 5' de l’ARNm. 43 s pré-initiation ribosome complex, qui contient eIF2 lié aux initiateur tRNA et eIF3, est recruté à l’extrémité 5' de l’ARNm via une interaction entre eIF4G et eIF3. La complexe de pré-initiation est pensée pour numériser des ARNm, aidé par eIF4A (une hélicase de RNA) jusqu'à ce que le codon de début (AUG) se trouve. La complexe d’initiation de 48 s est formée par la suite et l’ARNt est livré dans le site P du ribosome. Enfin, les sous-unités de ribosomes 60 s et 40 s sont Unies pour former la complexe, d’initiation 80 s suivi de translation élongation1,3,4. En revanche, les sites d’entrée des ribosomes interne (IRESes) contournement l’exigence pour un plafond de 5' en recrutant la sous-unité ribosomique 40 s directement à l’initiation codon3. Conditions de stress physiologique atténuent traduction ARNm globale en raison de modifications des facteurs d’initiation eucaryote générales clés (SIFE). Cependant, mécanismes d’initiation de traduction non canoniques permettant la traduction sélective de certains ARNm qui souvent codent pour des protéines de la réponse au stress, et le dérèglement de l’initiation de la traduction non canonique est impliqué dans des États de maladie comme le cancer 1 , 2. éléments régulateurs RNA discrets, tels que IRESes cellulaires, permettant la traduction de ces ARNm2,3.
Un aspect particulièrement intéressant de contrôle de la traduction est de comprendre les mécanismes de canonique versus non canonique traduction d’un ARNm donnée. Toeprinting est une technique qui permet l’étude mécanistique détaillée d’initiation de la traduction de l’ARN spécifique in vitro. L’objectif global du toeprinting consiste à évaluer la capacité d’un ARN d’intérêt de nucléée la formation d’une complexe avec le ribosome dans une variété de conditions, d’initiation de traduction afin de déterminer quelles séquences, éléments structuraux ou accessoire facteurs sont requis pour l’initiation de la traduction efficace. Par exemple, recrutement du ribosome pourrait être entravé en l’absence d’un plafond de 5' mais stimulé par la présence d’une IRES.
Le principe de la technique est à in vitro transcrire un ARN d’intérêt, il incuber en présence des extraits cellulaires contenant des composants de translation (ou les composantes purifiées) permettant de transcrivent les complexes de l’initiation à la forme et d’inverser l’ARN avec une amorce spécifique. Des complexes stables de RNA-ribosome provoquera la transcription inverse à caler au bord 3' du ribosome, le soi-disant « toeprint »5,6,7.
Dans ce protocole, les sous-unités ribosomiques, SIFE, ARNt et IRES trans-des facteurs (ITAFs) sont idéalement fournis par lysate de reticulocyte de lapin (RRL). Un autre avantage de ce protocole est l’utilisation d’une amorce marquée fluorescent et imageur de gel à base de fluorescence, plutôt qu’un apprêt radiomarqué. Cela permet d’éliminer des étapes supplémentaires, y compris le radiomarquage l’amorce, ainsi que le gel de séchage et exposer à un écran renforçateur. Les bandes fluorescentes sont enregistrés en temps réel, comme les essais de gel, ce qui permet une plus grande résolution. Non plafonné liée à le X inhibiteur de l’apoptose protéine (XIAP) IRES ARN est utilisé comme un exemple ici, bien que plafonnés ARNm peut également être analysés par cette technique8.
Contrairement à l’analyse de l’Ouest, qui mesure la production finale de la traduction dans les lysats cellulaires, toeprinting est une approche in vitro pour mesurer la formation du complexe initiation traduction de l’ARN. Cette approche réductrice permet l’étude très détaillée des substrats ou facteurs qui régulent l’initiation de la traduction (e.g., plafonnés ou non plafonnés ARNm, IRES structure, présence ou absence de queue polyA, disposition des facteurs protéiques spécifiques, " etc..). Par conséquent, toeprinting peut être utilisé pour étudier les différents modes de traduction8 ou les effets de structures de l’ARNm, comme IRESes, sur la synthèse de protéines9,10.
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Protocol
Remarque : L’ARN est très sensible à la dégradation par des ribonucléases (RNases). Prendre des précautions standards pour garder l’ARN intact. Changer fréquemment. Utiliser des pointes de pipette filtrée, exempte de nucléase de contenants de plastique et de produits chimiques exempte de nucléase dans toutes les étapes du protocole. Utilisation exempte de nucléase ou diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-traiter l’eau pour toutes les solutions.
1. préparation des Solutions
- Préparer Toeprinting tampon : 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KACO, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5 % (p/v) de sucrose, la spermidine le dithiothréitol (DTT) et 0,5 mM de 2 mM.
- Stocker la TNT et la spermidine dans jetables aliquotes à-20 ° C pour éviter les cycles de gel-dégel répétés.
NOTE : TNT et la spermidine devraient être ajoutées au tampon de toeprinting juste avant l’emploi. Une solution manque de TNT et la spermidine peut être conservée à-20 ° C.
- Stocker la TNT et la spermidine dans jetables aliquotes à-20 ° C pour éviter les cycles de gel-dégel répétés.
- Préparer des aliquotes de 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) et 91 mM l’adénosine triphosphate (ATP). Stocker les aliquotes à-20 ° C.
- Préparez 450 mL de mélange de gel de 6 % polyacrylamide - 7M urée : 67,5 mL de 40 % acrylamide:bis-acrylamide (19:1), 189 g d’urée, 112,5 mL de 5 x TBE (Tris/borate/thylenediaminetetraacetic acide (EDTA)) et 120 mL d’eau. Dissoudre l’urée en chauffant au bain-marie à 37 ° C ou sur une plaque chauffante en agitant. Filtrer la solution (e.g., 0,2 μm filtre à vide nitrocellulose).
Remarque : La solution peut être conservée à 4 ° C pendant au moins un mois.
ATTENTION : L’acrylamide monomère est une neurotoxine qui peut être absorbée par la peau. Prendre grand soin d’éviter le contact avec la peau (i.e., porter des gants, une blouse de laboratoire et lunettes de protection). Polyacrylamide doit également être manipulé avec soin, car la polymérisation ne peut procéder à l’achèvement de 100 %. - Préparer la formamide chargement colorant : 95 % formamide, 18 mM EDTA, 0.025 % (p/v) dodécylsulfate de sodium (SDS), le bleu de bromophénol 0.025 % (p/v), 0.025 % (p/v) de xylène cyanol. Conserver à-20 ° C.
- Dissoudre 1 nmol d’apprêt (5' CTCGATATGTGCATCTGTA ; 5' fin marquées avec IRDye 800) dans 100 μL d’eau pour une concentration de travail de 10 pmol/μL. Conserver à-20 ° C en aliquotes à usage unique (environ 10 µL), abri de la lumière.
2. préparation de l’ARNm
- Amplifier les matrices d’ADN pour la synthèse de l’ARNm par polymerase chain reaction (PCR) de modèles appropriés (i.e., ADN génomique ou l’ADN plasmidique, selon le cas). Utiliser une haute fidélité ADN polymérase conformément aux instructions du fabricant, avec les conditions de la réaction suivante (35 cycles) : faire fondre, 98 ° C, 10 s ; recuire, 53 ° C, 20 s ; étendre, 72 ° C, 30 s.
NOTE : L’amorce vers l’avant (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpore la séquence du promoteur T7 permettant la transcription de l’ARN ; l’apprêt inverse (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) comprend 51 résidus thymine afin de fournir une queue poly-A pour l’ARN transcrit. Notez que RNA peut également en vitro transcrit de l’ADN de plasmide. - Utiliser un kit de transcription appropriée à in vitro transcrire RNA contenant IRES ou RNA plafonné de la matrice d’ADN. Suivez les instructions du fabricant. Préparation des échantillons de RNA standard 20 volumes de réaction μL. Traiter l’ARN nouvellement synthétisé avec 2 unités de DNase RNase-libre pendant 30 min à 37 ° C.
- Diluer l’ARN imprégnées de DNase pour 110 µL d’eau exempte de nucléase ajouter 110 µL acide phénol, le vortex 5 s et centrifuger pendant 3 min à 20 000 x g à la température ambiante. Supprimer 100µl de la phase aqueuse dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 10 µL d’acétate de sodium 3M et vortex 2 s. Ajouter, 3 volumes d’éthanol à 100 %, vortex, 5 s et précipiter l’ARN à-20 ° C pendant la nuit.
- Centrifuger à > 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laver le culot avec 500 µL d’éthanol à 70 % (v/v) glacée et répétez la centrifugation. Aspirer aussi bien de surnageant possible et sécher le culot pour 5-10 min. faites attention de ne pas déloger la pastille.
- Remettre en suspension l’ARN dans le volume approprié d’eau exempte de nucléase pour produire une travail concentration de 0,5 μg/μL. Cela peut être conservé à-80 ° C ou utilisé immédiatement.
3. réaction de Toeprinting
- Mix 15 μL de lapin Reticulocyte Lysate (RRL, nucléase non traités), 1 μL (40 unités) de l’inhibiteur de RNase, 1 µL de 91 mM ATP (1,82 mM final) et 1 μL de 85 mM GMP-PNP (1,7 mM final) dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Incuber à 30 ° C pendant 5 min.
Remarque : La RRL doit être aliquoté à usage unique éviter le gel-dégel répété. Un contrôle critique est une réaction manque RRL, afin d’élucider les pauses naturelles de transcription inverse en raison de la structure secondaire de l’ARN. Ajouter toeprinting tampon pour remplacer RRL pour ce contrôle. - Ajouter 0,5 µg (1 µL) de l’ARN et incuber à 30 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 22 µL de tampon de Toeprinting et incuber à 30 ° C pendant 3 min.
- Ajouter 0,5 µL (5 pmol) d’apprêt IRDye marqués et incuber sur glace pendant 10 min.
- Ajouter 2 µL de 25 mM dNTPs (concentration finale : 1 mM chacun), 2 µL de 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL d’aviaire myéloblastose Virus Reverse Transcriptase (AMV-RT) et 3,5 µL de tampon de Toeprinting. Le volume final est 50 μL.
- Incubez la réaction à 30 ° C pendant 45 min.
- Ajouter 200 µL d’eau exempte de nucléase et extraire immédiatement avec 250 µL de 25:24:1 phénol : chloroforme : isoamylique alcool (pH environ 8,0). Vortex 5 s et centrifuger à 20 000 x g pendant 3 min à température ambiante. Éliminer la phase aqueuse dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 3 volumes d’éthanol à 100 %, vortex, 5 s et précipiter à-20 ° C durant la nuit.
- Centrifuger à > 20 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laver le culot d’ADN avec 500 µL d’éthanol à 70 % (v/v) glacée. Centrifuger à > 20 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Aspirat surnageant autant que possible et de sécher que le culot pour 5-10 min. faites attention de ne pas déloger la pastille à l’air.
- Dissoudre le culot dans 6 μL d’eau exempte de nucléase et ajouter 3 μl du formamide colorant de chargement.
4. les réactions de séquençage
- Utilisez la matrice d’ADN de 2,1 et l’apprêt IRDye marquée de l’étape 3.4 pour les réactions de séquençage standard, à l’aide de didéoxynucléotide (ddNTPs) comme indicateurs de fin de chaîne. Utiliser un kit de séquençage ADN approprié et suivez les instructions du fabricant.
- Mix 6 μL de chaque réaction de séquençage avec 3 μl de formamide colorant de chargement.
5. préparation du séquençage Gel et électrophorèse
Remarque : Ce protocole utilise un imageur de gel à base de fluorescence et une 21 cm x 23 cm x 0,2 gel de mm, mais peut être adapté pour d’autres séquenceurs ou gel-tailles, si nécessaire.
- Bien nettoyer les entretoises de 0,2 mm ainsi que les courtes (23 × 25 cm) et longues plaques de verre (30 × 25 cm) avec 100 % d’éthanol. Sécher à l’air.
- Mélanger 30 mL de 6 % gel de polyacrylamide - 7M urée mélanger avec 200 μL de persulfate d’ammonium 10 % (p/v) (APS) et 20 μL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED). Verser le gel, en prenant soin d’éviter les bulles et insérer le peigne de gel « dent de requin ». Laisser le gel polymériser pendant 1 h à température ambiante.
- Assembler l’appareil de séquençage et de remplir les réservoirs de 1 x TBE.
- Avant courir pendant 15 min à 1500 V jusqu'à atteindre la température optimale de 55 ° C.
- Faire chauffer le mélange colorant échantillon/chargement (à partir de mesures 3.9 ou 4.2) à 85 ° C pendant 5 min. charge 1 μL sur le gel de séquençage.
- Exécutez le gel à 1500 V pendant 8 h. La machine lit les bandes en temps réel.
- Démonter l’appareil et de disposer le gel d’acrylamide et le tampon en cours d’exécution.
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Representative Results
Nous avons déjà décrit la capacité de l’IRES XIAP pour soutenir la traduction chapeau-indépendante initiation in vitro8,10. Toeprinting est la technique clée pour interroger les détails mécanistiques de la complexe d’initiation de XIAP IRES. Une construction d’ADN codant un ARNm contenant l’IRES XIAP (Figure 1A) a été en vitro transcrit et soumis à l’analyse de toeprinting. Les variantes mutantes de l’ARNm de XIAP IRES utilisés ici sont représentées dans la Figure 1B. La transcription inverse de XIAP mRNA-ribosome complexe donné typique toeprints + 17 à + 19 nt en aval de l’AUG (Figure 1C, de la voie 1). Ceci est indicatif du recrutement du ribosome sur le codon de début et de la formation du ribosome-RNA stable complexes5,6,7. Recrutement du ribosome a été fortement réduite en l’absence d’une queue poly-A (Figure 1C, piste 9), comme indiqué précédemment11. Toeprint formation était également fortement affaiblie en l’absence de RRL et GMP-PNP (Figure 1C, voie 8) et pour le mutant de codon de départ (Figure 1C, voie 7), confirmant que la toeprint observée n’est pas induite par une structure pause de transcription inverse mais est, en effet, spécifique à la formation d’un complexe initiation. Toeprint formation a été réduite pour le 5' polypyrimidine tract (PPT) mutant (Figure 1C, allée 2) et le mutant 3' PPT (Figure 1C, de la piste 4), qui perturbent la structure de l’IRES (Figure 1B)8 ,10,12. Toeprint formation fut restaurée quand les PPT mutants ont été transcrits avec une casquette 5' (Figure 1C, les pistes 3 et 5). Formation de Toeprint a été également restaurée pour le mutant double PPT (Figure 1C, voie 6), qui restaure la structure secondaire (Figure 1B)10. Ensemble, ces résultats indiquent que la structure secondaire de l’IRES XIAP est critique pour l’initiation de la traduction de l’ARN non plafonné et que la structure de l’IRES est dispensable pour l’initiation de la traduction de cap-dépendante. Pour démontrer davantage l’exigence particulière pour un plafond de 5' en l’absence d’une structure de l’IRES, ARNm de β-globine humaine (HBB) a été soumis à l’analyse toeprinting (Figure 1D). Aucun toeprint a été observée en l’absence d’un bouchon 5' (Figure 1D, de la voie 1) mais les ribosomes ont réussi à recruter à l’ARN de HBB plafonnés (Figure 1D, de la voie 2).
Figure 1 . Toeprinting analyse confirme l’importance de la structure secondaire IRES pour la formation des complexes d’initiation de traduction sur un ARN de IRES XIAP non plafonnés. (A) schéma de principe de la construction de l’ADN codant l’ARN de IRES XIAP utilisée dans cette analyse. L’extrémité 3' de l’amorce de toeprinting est de 42 PB en aval du codon de démarrage. (B) les structures secondaires de l’IRES de XIAP WT (en haut à gauche), le mutant 5' PPT (en haut à droite), le mutant 3' PPT (en bas à gauche) et le mutant double PPT (en bas à droite). « PPT Mutant » se réfère à une mutation ponctuelle (UU à AA) dans un tractus polypyrimidine critique, qui perturbe la structure secondaire de l’IRES8,10,12. Le codon de début est convertie (boxed) ; les mutations ponctuelles sont indiquées par des astérisques (*). (C) Toeprinting analyse de la capacité des variantes de XIAP IRES pour former des complexes initiation traduction en RRL traités avec GMP-PNP et ATP. Le start codon AUG a été remplacé avec AAC dans le Mutant de Codon Start. Pour rendre le RNA manque une queue poly-A, l’apprêt inverse utilisé pour rendre le modèle de transcription in vitro manquait simplement un tract de poly-T. (D) Initiation complexe a été formé sur la plafonnés (mais pas le non plafonnés) 5' UTR de β-globine humaine (HBB). En panneaux (C) et (D), les plus à gauche 4 voies représentent des réactions de séquençage avec les nucléotides didésoxy indiquées au-dessus de chaque voie ; la séquence est indiquée à gauche de chaque panneau. FL, pleine longueur. Tous les ARN ont été non plafonnés, sauf indication contraire. De précédentes publications8,10, ce chiffre a été modifié. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Toeprinting est une technique puissante pour mesurer directement la capacité d’un ARN d’intérêt pour soutenir la formation de translation initiation complexes dans une situation très contrôlée. Ce protocole décrit une technique simplifiée pour toeprinting ARN chez les mammifères. Lysat de reticulocyte de lapin (RRL) est utilisé comme une source commode de ribosomes, SIFE, initiateur tRNA et IRES trans-agissant de facteurs (ITAFs). L’expérimentateur fournit leur ARN de choix et peut également compléter la réaction de toeprinting avec des cofacteurs spécifiques de leur choix. Par exemple, 48 s par rapport aux années 80 complexes initiation de la traduction peuvent être différenciés selon la répartition des intensités de fluorescence de la toeprints7. La complexe d’initiation observée dépendra du type de nucléotide guanine utilisé. Dans le cas de l’IRES XIAP discutés ici, GMP-PNP plus d’ATP se stabilise complexes d’initiation pré 48 s, caractérisées par une distribution de toeprint + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP est un non hydrolysable GTP analogique qui inhibe la sous-unité ribosomique collage, bloquant ainsi l’initiation de la traduction à l’étape de 48 s13. En revanche, GTP, ATP, ou ATP et GTP stabilise complexes d’initiation des années 80, caractérisées par toeprint distribution + 17 + 19 + < 18 >8.
L’utilisateur devra considérer le type d’ARN ils veulent toeprint. Si le but est d’étudier un mécanisme indépendant du cap, tel qu’un élément de l’IRES, l’ARN peut être in vitro transcrit avec n’importe quel kit disponible dans le commerce. Cependant, n’importe quel mammifère RNA peut être soumise à cette méthode de toeprinting, pourvu qu’elle possède une structure de cap 5'. ARNm plafonnés doit être généré à l’aide d’un kit approprié. Dans tous les cas, protocoles du fabricant doivent être suivies de près, comme la préparation d’ARN de qualité représente une étape clé dans la procédure. Un autre point critique est que l’extraction de phénol à l’étape 3,7 doit être réalisée égale ou supérieure à pH neutre ; Si l’acide phénol est utilisé à ce stade, l’ADNc nouvellement synthétisée seront perdue. Il est à noter que la concentration d’acétate de magnésium utilisé à l’étape 3.5 peut influencer l’efficacité de la transcriptase inverse et peut-être devoir être optimisé pour chaque ARNm.
Quelques contrôles clés sont nécessaires pour garantir la spécificité de la toeprint. Il convient tout d’abord, aucune toeprint robuste en l’absence de RRL ou nucléotides. Cela garantit que la pause de la transcription inverse observée est due à un complexe de l’ARN du ribosome plutôt qu’une stable structure secondaire de l’ARN ou des défauts avec la réaction de transcription inverse elle-même. Deuxièmement, aucun toeprint ne devrait être observé si le codon de début est muté. Cela garantit que le ribosome s’est formé un complexe plus précisément avec le codon de début de l’ARN et que l’utilisateur a correctement identifié le bord 3' du ribosome complexe avec le codon de démarrage. Cela est particulièrement important pour les éléments IRES, qui pourraient recruter le ribosome d’un codon de départ alternatifs14. De même, le toeprint pourrait être compromise en l’absence d’une queue poly-A, comme ce fut le cas pour les protéines XIAP IRES8. Cependant, certains éléments IRES font toeprints en l’absence d’une queue poly-A, par exemple le CrPV IRES10. Enfin, en plus de la toeprint bon, autres pauses de transcription inverse peuvent être observées. Ceux-ci peuvent représenter simplement pauses en raison des structures secondaires stables dans l’ARN, ou ils pourraient être dû à un phénomène surnommé « ribosome jumping », dans lequel le ribosome glisse du codon start vers d’autres emplacements sur le RNA15. Pour différencier ces possibilités, la réaction de toeprinting peut être effectuée en présence de cycloheximide8, qui effectivement permet d’immobiliser le ribosome au codon de démarrage et devraient réduire toeprints alternative en raison de ribosome sautant. Notamment, les ARNm différents auront différentes structures secondaires, ce qui signifie que le nombre et l’intensité de la reverse transcription pauses (i.e., bandes de fond) variera également.
Une possibilité de limiter cette technique est qu’il mesure le recrutement du ribosome d’un ARNm in vitro, mais la formation d’une complexe d’initiation de traduction ne signifie pas nécessairement que la traduction aura lieu in vivo. Toeprinting est donc particulièrement puissant lorsqu’il est combiné avec des techniques in vivo pour mesurer la traduction (e.g., polysome profilage16) et le taux de protéines qui en résulte (e.g., analyse occidentale).
Une technique plus récente est « ribosome profilage » (également appelé « empreinte de ribosome »), dans lequel le séquençage haut débit RNA est utilisé pour mesurer la présence de ribosomes sur l’ARNm cellulaire totale. Il s’agit d’une technique puissante pour mesurer le recrutement du ribosome sur une échelle de transcriptome. Inhérente aux ribosomes de profilage est l’utilisation de réactifs, tels que de la cycloheximide, pour stabiliser les ribosomes sur l’ARNm. Cela représente potentiellement un inconvénient, comme un nombre disproportionné de ribosomes peut être non spécifiquement calé dans la région 5' non traduite (UTR), qui peut être interprété à tort comme non-canoniques translation initiation17. Dans toeprinting, la cycloheximide n’est pas partie intégrante de la procédure, en niant la possibilité de ces faux positifs. En outre, toute seul ARNm peut être étudiés plus en détail en toeprinting, car il est facile de mener de nombreuses expériences de contrôle et les itérations (par exemple, tester l’effet de plusieurs mutations ponctuelles, ou l’absence d’une queue poly-A, sur le recrutement du ribosome). Il serait fastidieux et coûteux de réaliser un tableau équivalent d’expériences de contrôle dans le cadre d’un ribosome profilage experiment. Toeprinting est donc une approche complémentaire à des techniques basées sur le séquençage haut-débit et reste couramment utilisé pour les études visant à élucider les mécanismes de translation règlement8,9,10, 18.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Sciences naturelles et ingénierie recherche Conseil de Canada-subvention à la découverte (RGPIN-2017-05463), la Fondation canadienne pour l’Innovation-John R. Evans Fonds des Leaders (35017), le programme Campus Alberta Innovates et le ministère de l’Alberta Développement économique et du commerce.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
