Summary
Toeprinting mål å måle evne til i vitro transkribert RNA til skjemaet oversettelse innvielsen komplekser med ribosomer under en rekke forhold. Denne protokollen beskriver en metode for toeprinting pattedyr RNA og kan brukes til å studere både cap-avhengige og IRES-drevet oversettelse.
Abstract
Oversettelse innvielsen er hastighetsbegrensningen skritt av proteinsyntese, og representerer et nøkkel punkt der celler regulere utdataene protein. Regulering av proteinsyntese er nøkkelen til mobilnettet stressrespons feilregulering er mange sykdomstilstander, som kreft. Selv om mobilnettet stress fører til hemming av global oversettelse av demping cap-avhengige initiation, oversettes for eksempel selektivt visse stressrespons proteiner i en cap-uavhengig måte. Diskret RNA regulatoriske elementer, for eksempel mobilnettet intern ribosom oppføring nettsteder (IRESes), lar for oversettelsen av disse spesifikke mRNAs. Identifikasjon av slike mRNAs og karakterisering av deres regulatoriske mekanismer, har vært et sentralt område i molekylærbiologi. Toeprinting er en metode for studier av RNA struktur og funksjon som gjelder oversettelse innvielsen. Målet med toeprinting er å vurdere muligheten av in vitro transkribert RNA danner stabile kompleksene med ribosomer under en rekke forhold, for å avgjøre hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er involvert i ribosom binding-en pre-markøren for effektiv oversettelse innvielsen. Sammen med andre teknikker, for eksempel western analyse og polysome profilering, gir toeprinting robust karakteristikk av mekanismer for regulering av oversettelse innvielsen.
Introduction
Som oversettelse forbruker mest celleenergien, er det fornuftig at oversettelsen er strengt regulert1. Derimot feilregulering oversettelse- og påfølgende endringer i protein utdata-er ofte observert i stress- og sykdom stater, som kreft1,2. En stor fordel av translasjonsforskning kontroll er hastigheten som cellene kan endre utdataene protein for å svare på ulike stimuli3. Oversettelse forordning representerer derfor en viktig mekanisme som kan påvirke celle overlevelse og død1,2,3. Trinnene av oversettelse er oppstart de fleste sterkt regulert og komplekse3. Kort, inneholder de fleste eukaryotic mRNAs en 5 m7G cap som er nesten alltid viktig for deres oversettelse. Cap-avhengige innvielse krever eukaryote innvielsen faktorer eIF4E, eIF4A og eIF4G (cap-anerkjennelse komplekset) å samhandle med 5' slutten av mRNA. Det 43S preinitiation ribosomet komplekset, som inneholder eIF2-bundet initiatoren tRNA og eIF3, rekruttert til 5' slutten av den mRNA via et samspill av eIF4G med eIF3. Preinitiation komplekse antas å skanne mRNA, hjulpet av eIF4A (en RNA helicase) før start codon (august) ligger. 48S initiering komplekse er senere dannet og tRNA leveres i P-området av ribosomet. Til slutt, i 60-årene og 40S ribosom underenheter er forent til 80 initiering komplekse, etterfulgt av oversettelsen forlengelse1,3,4. Derimot omgå intern ribosom oppføring nettsteder (IRESes) behovet for en 5' cap ved rekruttering 40S ribosomal delenhet direkte til innvielsen codon3. Fysiologiske stress forhold attenuere globale mRNA oversettelsen på grunn av endringer av viktige generelle eukaryote innvielsen faktorer (eIFs). Imidlertid ikke-kanoniske oversettelse innvielsen mekanismene tillatelse for selektiv oversettelse av visse mRNAs som ofte kodes stressrespons proteiner og feilregulering av ikke-kanoniske oversettelse innvielsen er involvert i sykdom stater som kreft 1 , 2. diskret RNA regulatoriske elementer, for eksempel mobilnettet IRESes, tillater for oversettelse av slike mRNAs2,3.
Et spesielt interessant aspekt av translasjonsforskning kontroll er å forstå mekanismene av kanoniske versus ikke-kanoniske oversettelse av en gitt mRNA. Toeprinting er en teknikk som gjør at detaljert mekanistisk studiet av oversettelse innvielsen av bestemte RNAs i vitro. Det overordnede målet med toeprinting er å vurdere muligheten for en RNA rundt å nucleate dannelsen av en oversettelse innvielsen med ribosom under en rekke forhold, for å avgjøre hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er nødvendig for effektiv oversettelse innvielsen. For eksempel kan ribosom rekruttering bli hindret i fravær av en 5' cap men stimulert av tilstedeværelsen av en IRES.
Prinsippet om teknikken er in vitro transkribere RNA en interesse, ruge det i nærvær av mobilnettet ekstrakter som inneholder oversettelse komponenter (eller renset komponentene) for å tillate innvielsen komplekser form, og å reversere transkribere RNA med en bestemt primer. Stabil RNA-ribosom komplekser får omvendt transkripsjon til stall på 3 kanten av ribosom-den såkalte "toeprint"5,6,7.
I denne protokollen, ribosomal underenheter, eIFs, tRNAs og IRES trans-fungerende faktorer (ITAFs) praktisk formidles av kanin retikulocytt lysate (RRL). En annen fordel med denne protokollen er bruken av en fluorescently-merket primer og fluorescens gel-baserte imager, snarere enn en radiolabeled primer. Dette eliminerer ekstra trinn, inkludert radiolabeling primer, samt tørking gel og utsette det til en intensiverer skjermen. Fluorescerende bandene registreres i sanntid, som gel kjører, slik at større oppløsning. Uncapped X-tilknyttet hemmer av apoptose protein (XIAP) IRES brukes som et eksempel her, selv om avkortet mRNAs kan også analyseres av denne teknikken8.
I motsetning til vestlige analyse, som måler det endelige resultatet av oversettelsesprosessen i celle lysates, er toeprinting i vitro tilnærming til å måle oversettelse innvielsen komplekse formasjon på en RNA. Denne reduksjonistiske gir svært detaljerte studier av underlag eller faktorer som regulerer oversettelse innvielsen (f.eks., avkortet un avkortet mRNA, IRES struktur, tilstedeværelse eller fravær av poly-en hale, bestemmelse av bestemt protein faktorer, osv.). Derfor kan toeprinting brukes til å studere forskjellige moduser av oversettelse8 eller effekten av mRNA strukturer, for eksempel IRESes, på protein syntese9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: RNA er svært utsatt for degradering av ribonucleases (RNases). Ta standard forholdsregler for å holde RNA intakt. Endre hansker ofte. Bruke filtrerte pipette-spisser og nuclease-gratis plasticware nuclease uten kjemikalier i alle trinn av protokollen. Bruk nuclease-fri eller diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann for alle løsningene.
1. forberedelse av løsninger
- Forberede Toeprinting buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2,5 Mg(OAc)2, 5% (w/v) sukrose, 2 mM dithiothreitol (DTT) og 0,5 mM spermidine.
- Lagre DTT og spermidine i engangs dele på 20 ° C å unngå gjentatte fryse-Tin sykluser.
Merk: DTT og spermidine skal legges til toeprinting buffer umiddelbart før bruk. En løsning mangler DTT og spermidine kan lagres på 20 ° C.
- Lagre DTT og spermidine i engangs dele på 20 ° C å unngå gjentatte fryse-Tin sykluser.
- Forberede dele 85 mM 5-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) og 91 mM Adenosintrifosfat (ATP). Lagre dele på 20 ° C.
- Forberede 450 mL av 6% polyakrylamid - 7M urea gel mix: 67.5 mL av 40% acrylamide:bis-akrylamid (19:1), 189 g urea, 112.5 mL 5 x TBE (Tris/borate/thylenediaminetetraacetic acid (EDTA)) og 120 mL vann. Oppløse urea av oppvarming i et 37 ° C vannbad eller på en kokeplate med omrøring. Filtrere løsningen (f.eks., 0,2 μm nitrocellulose vakuum filter).
Merk: Løsningen kan lagres på 4 ° C i minst en måned.
Forsiktig: Monomerisk akrylamid er en neurotoxin som kan absorberes gjennom huden. Ta stor forsiktighet for å unngå hudkontakt (dvs. bruke hansker, en labfrakk, og øyevern). Polyakrylamid bør også håndteres med forsiktighet, som polymerisasjon ikke kan fortsette å 100% fullført. - Forberede formamide lasting fargestoff: 95% formamide, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) natrium dodecyl sulfate (SDS), 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol. Butikken på 20 ° C.
- Oppløses 1 nmol av primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA, 5' slutten-merket med IRDye 800) i 100 μL av vann for en arbeider konsentrasjon av 10 pmol/μL. Lagre på 20 ° C i engangs dele (ca. 10 µL), beskyttet mot lyset.
2. utarbeidelse av mRNA
- Forsterke DNA maler for syntese av mRNA av polymerasekjedereaksjons (PCR) fra aktuelle maler (dvs., genomisk DNA eller plasmider DNA, etter behov). Bruker en høy-troskapen DNA polymerase i henhold til produsentens instruksjoner, med følgende reaksjon (35 sykluser): smelte, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; utvide, 72 ° C, 30 s.
Merk: Den fremover primeren (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) inkorporerer T7 promoter sekvensen å tillate RNA transkripsjon; omvendt primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) inkluderer 51 thymine rester for å gi en poly-en hale transkribere RNA. Merk at RNA kan også være i vitro transkribert fra plasmider DNA. - Bruk en passende transkripsjon kit in vitro transkribere IRES inneholder RNA eller avkortet RNA fra malen DNA. Følg instruksjonene fra produsenten. Forberede RNA prøven i standard 20 μL reaksjon volumer. Behandle den nylig syntetisert RNA med 2 enheter av RNase-gratis DNase i 30 min på 37 ° C.
- Fortynne den DNase-behandlet RNA til 110 µL med nuclease-fritt vann legge 110 µL syre fenol, vortex 5 s og sentrifuge for 3 min 20.000 x g ved romtemperatur. Fjerne 100 µL av vandige fasen til en ny 1,5 mL microfuge tube, legge til 10 µL av 3 M natrium acetate og vortex 2 s. Legg til 3 mengder 100% etanol, vortex 5 s, og utløse RNA på 20 ° C over natten.
- Sentrifuge på > 20.000 x g i 30 min 4 ° C og Forkast nedbryting. Vask pellets med 500 µL av iskalde 70% (v/v) etanol og gjenta sentrifugering. Sug opp så mye av nedbryting som mulig og air-dry pellet for 5-10 min. være forsiktig med å dislodge pellet.
- Resuspend RNA i den aktuelle mengden nuclease-fritt vann å gi en arbeider konsentrasjon på 0,5 μg/μL. Dette kan være lagret på-80 ° C eller brukes umiddelbart.
3. Toeprinting reaksjon
- Mix-15 μL av kanin retikulocytt Lysate (RRL, ikke nuclease-behandlet), 1 μL (40 enheter) RNase hemmer, 1 µL 91 mm ATP (1.82 mM endelige) og 1 μL 85 mM GMP-PNP (1,7 mM endelige) i en 1,5 mL microfuge tube. Ruge på 30 ° C i 5 minutter.
Merk: RRL skal aliquoted for enkel bruk å unngå repeterende fryse-tining. En kritisk kontroll er en reaksjon mangler RRL, for å belyse naturlig pauser i omvendt transkripsjon på grunn av sekundær strukturen av den. Legge til toeprinting buffer for å erstatte RRL for denne kontrollen. - Legg til 0,5 µg (1 µL) av RNA og ruge på 30 ° C i 5 minutter.
- Legg til 22 µL Toeprinting bufferen og ruge på 30 ° C i 3 minutter.
- Legg til 0,5 µL (5 pmol) av IRDye-merket primer og ruge på is 10 min.
- Legge til 2 µL av 25 mM dNTPs (siste konsentrasjon: 1 mM), 2 µL av 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL av Avian Myeloblastosis Virus revers transkriptase (AMV-RT) og 3,5 µL Toeprinting bufferen. Det siste bindet er 50 μL.
- Inkuber reaksjonen på 30 ° C i 45 minutter.
- Legg til 200 µL nuclease uten vann og umiddelbart ekstra med 250 µL 25:24:1 fenol: kloroform: isoamyl alkohol (pH ca 8.0). Vortex 5 s og sentrifuge 20.000 x g for 3 min ved romtemperatur. Fjern den vandige fasen til en ny 1,5 mL microfuge tube, legge 3 mengder 100% etanol, vortex 5 s, og utløse på 20 ° C over natten.
- Sentrifuge på > 20.000 x g i 30 min 4 ° C og Forkast nedbryting. Vask DNA pellets med 500 µL av iskalde 70% (v/v) etanol. Sentrifuge på > 20.000 x g i 15 min på 4 ° C. Leveringstanken så mye supernatant som mulig og lufttørke pellet i 5-10 min. være forsiktig med å dislodge pellet.
- Oppløse pellet i 6 μL nuclease-fritt vann og legge 3 μL formamide lasting fargestoff.
4. sekvensering reaksjoner
- Bruk malen DNA fra 2.1 og IRDye-merket primer fra trinn 3.4 for standard sekvensering reaksjoner, bruker dideoxynucleotides (ddNTPs) som kjeden terminatorer. Bruke en passende DNA sekvensering kit, og følg produsentens instruksjoner.
- Mix 6 μL av hver sekvensering reaksjon med 3 μL formamide lasting fargestoff.
5. utarbeidelse av sekvensering Gel og geleelektroforese
Merk: Denne protokollen bruker en fluorescens gel-baserte imager og en 21 cm x 23 cm x 0.2 mm gel, men kan tilpasses andre sequencere eller gel-størrelser, hvis nødvendig.
- Rengjør 0.2 mm avstandsstykkene samt kort (23 x 25 cm) og lange (30 × 25 cm) glassplater med 100% etanol. Lufttørke.
- Mix 30 mL av 6% polyakrylamid - 7M urea gel bland med 200 μL av 10% (w/v) ammonium persulfate (APS) og 20 μL tetramethylethylenediamine (TEMED). Hell gel, ta vare for å unngå bobler, og sett den "hai-' gel kam. Tillate gel til danner 1t ved romtemperatur.
- Montere sekvensering apparatet og fylle reservoarene med 1 x TBE.
- Pre kjøre i 15 min på 1500 V til optimale temperaturen på 55 ° C er oppnådd.
- Varme utvalg/lasting fargestoff mix (fra trinn 3.9 eller 4.2) til 85 ° C for 5 min. Last 1 μL på sekvensering gel.
- Kjør gel på 1500 V 8 h. Maskinen leser bandene i sanntid.
- Demontere apparatet og kast akrylamid gel og kjører buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere beskrevet muligheten for XIAP IRES å støtte cap-uavhengig oversettelse innvielsen i vitro8,10. Toeprinting var viktige teknikken avhøre mekanistisk detaljer om XIAP IRES initiering komplekse. En DNA konstruere koding en mRNA inneholder XIAP IRES (figur 1A) var i vitro transkribert og utsatt for toeprinting analyse. Mutant variantene av XIAP IRES mRNA her er representert i figur 1B. Omvendt transkripsjon av XIAP mRNA-ribosom komplekset gitt typisk toeprints +17 til 19 nt nedstrøms i august (figur 1C, lane 1). Dette er et tegn på ribosom rekruttering til start codon og dannelse av stabil ribosom-RNA komplekser5,6,7. Ribosom rekruttering var sterkt svekket i fravær av en poly-en hale (figur 1C, lane 9), som tidligere rapportert11. Toeprint formasjon var også sterkt svekket i fravær av RRL og GMP-PNP (figur 1C, lane 8) og start codon mutant (figur 1C, lane 7), bekrefter at den observerte toeprint ikke er en struktur-indusert pause omvendt transkripsjon er men faktisk gjelder for innvielse komplekse formasjon. Toeprint formasjon ble nedsatt for 5' polypyrimidine skrift (PPT) mutant (figur 1C, lane 2) og 3' PPT mutant (figur 1C, lane 4), som forstyrre IRES struktur (figur 1B)8 ,10,12. Toeprint formasjon ble gjenopprettet når PPT mutanter ble transkribert med en 5' cap (figur 1C, baner 3 og 5). Toeprint formasjon ble også restaurert til PPT dobbel mutant (figur 1C, lane 6), som gjenskaper den sekundære struktur (figur 1B)10. Sammen viser disse dataene at sekundære oppbygning XIAP IRES er kritisk for oversettelse innvielsen av un avkortet og at IRES struktur er unnværlig for cap-avhengige oversettelse innvielsen. For å ytterligere vise bestemte kravet for en 5' cap i fravær av en IRES struktur, ble menneskelige β-globin (HBB) mRNA utsatt for toeprinting analyse (figur 1D). Ingen toeprint ble observert i fravær av en 5' cap (figur 1D, lane 1), men ribosomer var vellykket rekruttert til avkortet HBB RNA (figur 1D, lane 2).
Figur 1 . Toeprinting analysen bekrefter viktigheten av IRES sekundære struktur for dannelsen av oversettelse innvielsen komplekser på en uncapped XIAP IRES RNA. (A) skjematisk diagram av DNA Konstruer koding XIAP IRES RNA brukes i denne analysen. 3 slutten av toeprinting primer er 42 bp nedstrøms av start codon. (B) sekundære strukturer av WT XIAP IRES (øverst til venstre), 5' PPT mutant (øverst til høyre), 3' PPT mutant (nedre venstre) og PPT dobbel mutant (nederst til høyre). "PPT Mutant" refererer til en punkt mutasjon (UU til AA) i en kritisk polypyrimidine område, noe som forstyrrer den sekundære strukturen av IRES8,10,12. Start codon er innestengt; punkt mutasjoner identifiseres med stjerner (*). (C) Toeprinting analyse av den XIAP IRES varianter skjemaet oversettelse innvielsen blant RRL behandlet med GMP-PNP og ATP. Start codon august ble erstattet med AAC i starte Codon Mutant. For å gjøre RNA mangler en poly-en hale, manglet omvendt primer brukes til å lage malen i vitro transkripsjon bare en poly-T traktat. (D) initiering komplekset ble dannet på den avkortet (men ikke den un avkortet) 5' UTR av menneskelig β-globin (HBB). I panel (C) og (D), de siste 4 banene representerer sekvensering reaksjoner med dideoxy nukleotider angitt over hver kjørebane sekvensen vises til venstre for hvert panel. FL, full lengde. Alle RNAs var un avkortet med mindre annet er angitt. Dette tallet er endret fra tidligere publikasjoner8,10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting er en kraftfull teknikk direkte måle evne til en RNA av interesse å støtte dannelsen av oversettelse innvielsen komplekser under kontrollerte forhold. Denne protokollen beskriver en forenklet teknikk for toeprinting pattedyr RNAs. Kanin retikulocytt lysate (RRL) brukes som en praktisk kilde til initiativtakeren, ribosomer, eIFs tRNA og IRES trans-fungerende faktorer (ITAFs). Eksperimentator gir deres RNA valgfrihet, og kan også supplere toeprinting reaksjon med bestemte kofaktorer å velge sine. For eksempel kan 48S versus 80 oversettelse innvielsen komplekser være differensiert basert på distribusjon av fluorescens intensiteter av toeprints7. Initiering komplekse observert vil avhenge av guanine nukleotid brukes. Ved XIAP IRES diskutert her, GMP-PNP pluss ATP stabiliserer 48S før innvielsen komplekser, preget av en toeprint distribusjon + 17≥ + 18 > 19. GMP-PNP er en nonhydrolyzable GTP analoge som hemmer ribosomal delenhet begynte, dermed blokkerer oversettelse innvielsen på 48S trinn13. I kontrast, stabiliserer GTP, ATP, eller ATP pluss GTP 80 innvielsen komplekser, preget av toeprint distribusjon +17 < 18 > 198.
Brukeren må du vurdere hvilken av de ønsker å toeprint. Hvis målet er å studere en cap-uavhengig mekanisme, for eksempel IRES, kan RNA i vitro transkribert med alle kommersielt tilgjengelig kit. Alle pattedyr RNA kan imidlertid utsettes for denne toeprinting metoden, forutsatt at den har en 5' cap struktur. Avkortet mRNA må genereres ved hjelp av en passende pakke. I alle fall skal produsentens protokoller være tett fulgt, som utarbeidelse av høy kvalitet RNA representerer et viktig skritt i prosedyren. En annen kritisk punkt er at fenol utvinning i trinn 3.7 må utføres på eller over nøytral pH; Hvis acid fenol brukes på dette stadiet, tapt den nylig syntetisk cDNA. Det er verdt å merke seg at konsentrasjonen av magnesium acetat brukte i trinn 3.5 kan påvirke effektiviteten av omvendt transkripsjon, og må være optimalisert for hver mRNA.
Noen viktige kontroller er nødvendig for å sikre spesifisiteten av toeprint. Først, ikke robust toeprint bør være observert i fravær av RRL eller nukleotid. Dette sikrer at observert omvendt transkripsjon pause skyldes et ribosom-RNA kompleks heller enn en stabil RNA sekundære struktur eller noen feil med omvendt transkripsjon reaksjonen selv. Andre ingen toeprint bør være observert Hvis start codon er mutert. Dette sikrer at ribosomet har dannet et kompleks med start codon av det og at brukeren har riktig identifisert 3 kanten av ribosom i kompleks med start codon. Dette er spesielt viktig for IRES elementer, som kan rekruttere ribosom til en alternativ start codon14. Tilsvarende kan toeprint svekkes i fravær av en poly-en hale, som var tilfellet for XIAP IRES8. Men danner noen IRES elementer toeprints i fravær av en poly-en hale, som CrPV IRES10. Til slutt, i tillegg til toeprint riktig, andre omvendt transkripsjon pauser kan observeres. Dette kan bare representere pauser på grunn av stabil sekundære strukturer i RNA, eller de kan være et fenomen kalt "ribosom hoppe", hvor ribosomet lysbilder fra start codon til andre steder på RNA15. For å skille mellom disse mulighetene, kan toeprinting reaksjonen utføres i nærvær av gapestokk8, som effektivt immobilizes ribosom på start codon og bør redusere alternativ toeprints på grunn av ribosom hopping. Spesielt, ulike mRNAs vil ha ulike sekundære strukturer, betyr at antall og intensitet reversere transkripsjon pauser (dvs., bakgrunn band) varierer også.
En mulig begrensning av denne teknikken er at den måler ribosom rekruttering til en mRNA i vitro, men dannelsen av en oversettelse innvielsen komplekse betyr ikke nødvendigvis at oversettelsen vil skje i vivo. Toeprinting er derfor spesielt kraftig kombinert med i vivo teknikker å måle oversettelse (f.eks., polysome profilering16) og de resulterende protein nivåene (f.eks., vestlige analyse).
En nyere teknikk er "ribosom profilering" (også kalt "ribosom footprinting"), hvor høy gjennomstrømming RNA sekvensering brukes til å måle tilstedeværelsen av ribosomer på totalt mobilnettet mRNA. Dette er en kraftfull teknikk å måle ribosom rekruttering på en transcriptome-bred skala. Iboende ribosom profilering er bruk av reagenser, som gapestokk, å stabilisere ribosomer på mRNAs. Dette er potensielt en ulempe, som et uforholdsmessig stort antall ribosomer kan være nonspecifically stoppet i 5' uoversatt region (UTR), som kan feiltolkes som ikke-kanoniske oversettelse innvielsen17. I toeprinting er gapestokk ikke en integrert del av prosedyren, benektende muligheten for slike falske positiver. Videre noen enkelt mRNA kan studeres i større detalj ved toeprinting, som det er lettvint å gjennomføre mange kontroll eksperimenter og gjentakelser (for eksempel testing effekten av flere punkt mutasjoner eller fravær av en poly-en hale, på ribosom rekruttering). Det ville være tidkrevende og kostnadseffektive uoverkommelige å utføre en tilsvarende rekke kontroll eksperimenter i sammenheng med en ribosom profilering eksperiment. Toeprinting er således en utfyllende tilnærming til høy gjennomstrømming sekvensering-baserte teknikker, og er fortsatt vanlig for studier å belyse mekanismer av oversettelse regulering8,9,10, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikt-av-begrave å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en naturvitenskap Engineering rådet av Canada-Discovery forskningsstipend (RGPIN-2017-05463) og Canada grunnlaget for innovasjon-John R. Evans ledere Fund (35017), Campus Alberta fornyer programmet og Alberta Miljøverndepartementet Økonomisk utvikling og kommersiell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
