Summary
Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.
Abstract
Iniciação da tradução é a etapa limitante da síntese de proteínas e representa um ponto-chave na qual células regulam a produção de proteína. Regulação da síntese de proteínas é a chave para a resposta de estresse celular e desregulação é central para muitos Estados de doença, como o câncer. Por exemplo, embora o estresse celular leva para a inibição da tradução global pela atenuante cap-dependente iniciação, certas proteínas de estresse-resposta seletivamente são traduzidas em uma forma independente de cap. Discreto do RNA dos elementos reguladores, tais como sites de entrada celular Ribossoma interno (IRESes), permitem a tradução destes mRNAs específicos. Identificação de tais mRNAs e a caracterização dos seus mecanismos reguladores, tem sido uma área-chave em biologia molecular. Toeprinting é um método para o estudo da estrutura do RNA e função no que tange a iniciação da tradução. O objetivo do toeprinting é avaliar a capacidade do in vitro transcrito de RNA para formar complexos estáveis com ribossomas sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessórios fatores estão envolvidos no Ribossoma ligação — um pré-cursor para a iniciação da tradução eficiente. Ao lado de outras técnicas, tais como análise ocidental e polysome de perfil, toeprinting permite uma caracterização robusta de mecanismos para a regulação da iniciação da tradução.
Introduction
Como tradução consome energia mais celular, faz sentido que a tradução é fortemente regulamentado1. Por outro lado, a desregulação da tradução- e as consequentes alterações na saída de proteína-é frequentemente observada nos Estados-resposta ao estresse e doenças, como câncer,1,2. Uma grande vantagem do controle de translação é a velocidade com que as células podem alterar sua saída de proteína para responder a vários estímulos3. Regulamento de tradução, portanto, representa um importante mecanismo que pode influenciar a sobrevivência da pilha e morte1,2,3. As etapas da tradução, a iniciação é o mais altamente regulamentado e complexo3. Brevemente, mais eucarióticos mRNAs contêm uma 5' m7G tampa que quase sempre é essencial para a sua tradução. Cap-dependente iniciação requer iniciação eucariótico fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G (o complexo cap-reconhecimento) para interagir com a extremidade 5' do mRNA. 43S preinitiation ribosome complexo, que contém o limite eIF2 iniciador tRNA e eIF3, é recrutado à extremidade 5' do mRNA através de uma interação de eIF4G com eIF3. A complexo de pré-iniciação é pensada para fazer a varredura do mRNA, auxiliado por eIF4A (um RNA helicase) até que o códon de início (AUG) está localizado. A complexo de iniciação 48S posteriormente é formada e tRNA é entregue para o P-site do ribosome. Finalmente, as subunidades 60S e 40S do Ribossoma são Unidas para formar o início dos anos 80 complexo, seguido de tradução alongamento1,3,4. Em contraste, sites de entrada interno Ribossoma (IRESes) contornar a exigência de uma 5' cap, recrutando a subunidade ribossomal 40S diretamente para o codão de iniciação3. Condições de estresse fisiológico atenuam global tradução de mRNA devido a modificações dos fatores chave geral iniciação eucariótico (eIFs). No entanto, mecanismos de iniciação da tradução não-canônicos permitam tradução seletiva de certos mRNAs que muitas vezes codificam proteínas de estresse-resposta, e desregulação da iniciação da tradução não-canônicos está implicada em doenças como o câncer 1 , 2. elementos reguladores de RNA discreto, tais como IRESes celular, permitam a tradução de tais mRNAs2,3.
Um aspecto particularmente interessante de controle de translação é compreender os mecanismos da canonical versus não-canônicos tradução de um mRNA determinado. Toeprinting é uma técnica que permite o estudo detalhado e mecanicista de iniciação da tradução de RNAs específicos in vitro. O objectivo geral de toeprinting é para avaliar a capacidade de um RNA de interesse de nucleada a formação de um início de tradução complexa com o ribossoma sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessório fatores são necessários para a iniciação da tradução eficiente. Por exemplo, recrutamento de Ribossoma pode ser prejudicado na ausência de um cap 5' mas estimulado pela presença de um IRES.
O princípio da técnica é in vitro transcrever um RNA de interesse, incube-lo na presença de extratos celulares contendo componentes de tradução (ou os componentes purificados) para permitir que transcrevem complexos de iniciação ao formulário e para reverter o RNA com um primer específico. Complexos estáveis de RNA-Ribossoma causará a transcrição reversa de empatar na extremidade 3' do Ribossoma, o so-called 'toeprint'5,6,7.
No presente protocolo, subunidades ribossomais, eIFs, os tRNAs e IRES trans-fatores de atuação (ITAFs) são convenientemente contribuídos por Reticulócito coelho lisado (RRL). Outra vantagem deste protocolo é o uso de um primer fluorescente-etiquetadas e Imageador de fluorescência com base em gel, ao invés de um primer radiolabeled. Isso elimina etapas extras, incluindo radioativos o primer, bem como a secagem do gel e expô-lo a uma intensificação da tela. As bandas fluorescentes são registadas em tempo real, como a execução de gel, permitindo a maior resolução. Destampada ligada ao X inibidor da apoptose RNA de IRES de proteína (XIAP) é usado como exemplo aqui, apesar de mRNAs tampados também podem ser analisados por esta técnica8.
Ao contrário da análise ocidental, que mede a saída final do processo de tradução em lisados celulares, toeprinting é uma abordagem in vitro para medir a formação do complexo tradução iniciação em um RNA. Esta abordagem reducionista permite o estudo altamente detalhado de substratos ou fatores que regulam a iniciação da tradução (EG., tampadas ou un-tampado mRNA, IRES estrutura, presença ou ausência de cauda poli-A, disposição de fatores específicos da proteína, etc.). Daí, toeprinting pode ser usado para estudar os diferentes modos de tradução8 ou os efeitos das estruturas de mRNA, tais como IRESes, na síntese de proteína9,10.
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Protocol
Nota: O RNA é altamente suscetível à degradação por ribonucleases (RNases). Tome precauções padrão para manter o RNA intacto. Luvas mudam com frequência. Utilize pontas de pipetas filtrada, plasticware nuclease-free e livre de nuclease produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Utilização livre de nuclease ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratamento de água para todas as soluções.
1. preparação de soluções
- Preparar o tampão de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) de sacarose, espermidina ditiotreitol (DTT) e 0,5 mM de 2 mM a 100 mM.
- Loja TDT e espermidina em alíquotas de uso único, a-20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
Nota: TDT e espermidina devem ser adicionados para o buffer de toeprinting, imediatamente antes do uso. Uma solução sem TDT e espermidina pode ser armazenada a-20 ° C.
- Loja TDT e espermidina em alíquotas de uso único, a-20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
- Prepare alíquotas de 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) e 91 mM trifosfato de adenosina (ATP). Armazenar as alíquotas a-20 ° C.
- Preparar 450 mL de mistura de gel de 6% poliacrilamida - 7m ureia: 67,5 mL de acrylamide:bis de 40%-acrilamida (19:1), 189 g de ureia, 112,5 mL de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) e 120 mL de água. Dissolva a ureia por aquecimento em banho maria a 37 ° C ou em um prato quente com agitação. Filtrar a solução (por exemplo., 0,2 μm filtro de vácuo de nitrocelulose).
Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C, durante pelo menos um mês.
Cuidado: Acrilamida monomérica é uma neurotoxina que pode ser absorvida através da pele. Tome muito cuidado para evitar o contacto com a pele (i. e., um jaleco, luvas e proteção do olho). Poliacrilamida também deve ser manipulada com cuidado, como polimerização não pode proceder à realização de 100%. - Preparar o formamide tintura de carregamento: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v). Loja a-20 ° C.
- Dissolva 1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' fim-etiquetadas com 800 IRDye) em 100 μL de água para uma concentração de trabalho de 10 pmol/μL. Armazenar a-20 ° C em alíquotas de uso único (cerca de 10 µ l), protegido da luz.
2. preparação do mRNA
- Modelos de DNA para a síntese de mRNA pela reação em cadeia do polymerase (PCR) de modelos apropriados de amplificar (i. e., DNA genômico ou Plasmídeo, conforme o caso). Usar uma alta fidelidade DNA polimerase de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes condições de reação (35 ciclos): derreter, 98 ° C, 10 s; recoze, 53 ° C, 20 s; estender, 72 ° C, 30 s.
Nota: O primer para a frente (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora a sequência do promotor T7 para permitir a transcrição do RNA; o primer reverso (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) inclui 51 resíduos de timina para fornecer uma cauda poli-A para o RNA transcrito. Observe que o RNA também pode ser em vitro transcrito do ADN do plasmídeo. - Uso um kit apropriado transcrição in vitro transcrever IRES contendo RNA ou ARN tampado partir do modelo de DNA. Siga as instruções do fabricante. Prepare a amostra de RNA em volumes de reação padrão 20 μL. Tratar o RNA recém sintetizado com 2 unidades de DNase RNase-livre por 30 min a 37 ° C.
- Diluir o RNA DNase-tratada para 110 µ l com água livre de nuclease adicionar ácido fenol µ l 110, vórtice 5 s e centrífuga para 3 min a 20.000 x g à temperatura ambiente. Remover a 100 µ l da fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 10 µ l de acetato de sódio 3M e vórtice 2 s. Add, 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar o RNA a-20 ° C durante a noite.
- Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada e repita a centrifugação. Aspirar o máximo do líquido sobrenadante possível e deixe secar naturalmente a pelota para 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.
- Ressuspender o RNA no volume adequado de água livre de nuclease para produzir uma trabalho de concentração de 0.5 μg/μL. Isto pode ser armazenado a-80 ° C ou usado imediatamente.
3. Toeprinting reação
- Mix 15 μL de coelho lisado Reticulócito (RRL, nuclease não-tratados), 1 μL (40 unidades) de inibidor de RNase, 1 µ l de 91 mM ATP (1,82 mM final) e 1 μL de 85mm GMP-PNP (final de 1,7 mM) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube a 30 ° C por 5 min.
Nota: O RRL deve ser aliquotada para uma única utilização evitar o congelamento-descongelamento repetitiva. Um controle crítico é uma reação que falta RRL, a fim de elucidar as pausas naturais da transcrição reversa devido a estrutura secundária do RNA. Adicione toeprinting reserva para substituir RRL para este controle. - Adicionar 0,5 µ g (1 µ l) de RNA e incubar a 30 ° C por 5 min.
- Adicione 22 µ l de tampão de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 min.
- Adicionar 0,5 µ l (5 pmol) de primer IRDye-etiquetadas e incubar no gelo por 10 min.
- Adicionar 2 µ l de dNTPs 25 mM (concentração final: 1 mM cada), 2 µ l de Mg(OAc)2a 100 mM, 1 µ l de aviária Myeloblastosis vírus Transcriptase reversa (AMV-RT) e 3,5 µ l de tampão de Toeprinting. O volume final é 50 μL.
- Incube a reação a 30 ° C, durante 45 min.
- Adicionar 200 µ l de água livre de nuclease e extrair imediatamente com 250 µ l de 25:24:1 fenol: clorofórmio: isoamílico álcool (pH aproximadamente 8.0). Vórtice 5 s e centrifugar 20.000 x g por 3 min à temperatura ambiente. Retirar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar a-20 ° C durante a noite.
- Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o sedimento de DNA com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada. Centrifugar a > 20.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Aspirado de sobrenadante, tanto quanto possível e ar seco que a pelota de 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.
- Dissolva a pelota em 6 μL de água livre de nuclease e adicionar 3 μL de formamida tintura de carregamento.
4. reações de sequenciamento de
- Use o modelo de DNA de 2.1 e o primer IRDye-rotulado de passo 3.4 para reações de sequenciamento padrão, usando dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadeia. Usar um kit de sequenciamento de DNA apropriado e siga as instruções do fabricante.
- Mix 6 μL de cada reação de sequenciamento com 3 μL de formamida tintura de carregamento.
5. preparação do Gel e eletroforese de sequenciamento
Nota: Este protocolo usa um Imageador de fluorescência com base em gel e um 21 x 23 cm x gel de 0,2 mm, mas pode ser adaptado para outros sequenciadores ou gel-tamanhos, se necessário.
- Limpe cuidadosamente os espaçadores de 0,2 mm, bem como o curto (23 x 25 cm) e tempo placas de vidro (30 × 25 cm) com 100% de etanol. Secar ao ar.
- Misture 30 mL de gel de ureia de poliacrilamida - 7M 6% misturar com 200 μL de persulfato de amónio de 10% (p/v) (APS) e 20 μL de tempted (TEMED). Despeje o gel, com cuidado para evitar bolhas e inserir o ' tubarão ' gel de pente. Permitir que o gel polimerizar por 1h à temperatura ambiente.
- Montar o aparelho de sequenciamento e encher os reservatórios com 1 x TBE.
- Pre-executada por 15 min em 1500 V até que seja alcançada a temperatura ideal de 55 ° C.
- Aqueça a mistura de corante de amostra/carregamento (a partir de passos 3.9 ou 4.2) a 85 ° C por 5 min. carga 1 μL para o gel de sequenciamento.
- Funcione o gel em 1500 V em 8 h. A máquina vai ler as faixas em tempo real.
- Desmontar o aparelho e elimine-o gel do acrilamido e buffer de execução.
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Representative Results
Descrevemos anteriormente a capacidade da IRES XIAP para apoiar a iniciação de tradução tampão-independente em vitro8,10. Toeprinting foi a chave técnica para interrogar os detalhes mecanicistas da iniciação XIAP IRES complexo. Uma construção de DNA codificação um mRNA contendo o XIAP IRES (Figura 1A) estava em vitro transcritas e submetidas a análise de toeprinting. As variantes mutantes do mRNA XIAP IRES usados aqui são representadas na Figura 1B. Transcrição reversa do complexo mRNA-Ribossoma XIAP rendeu típico toeprints + 17 para + 19 nt a jusante de agosto (Figura 1C, faixa 1). Isso é indicativo de recrutamento Ribossoma para o códon de início e a formação do Ribossoma-RNA estável complexos5,6,7. Recrutamento de Ribossoma foi fortemente prejudicado na ausência de uma cauda poli-A (Figura 1C, lane 9), como relatado anteriormente11. Formação de Toeprint foi também fortemente prejudicada na ausência de RRL e GMP-PNP (Figura 1C, faixa 8) e para o mutante de códon de início (Figura 1C, lane 7), afirmando que o toeprint observado não é uma estrutura induzida pausa de transcrição reversa mas é, na verdade, específica para a formação do complexo de iniciação. Formação de Toeprint foi prejudicada por 5' spliciossoma do trato (PPT) mutante (Figura 1C, lane 2) e o 3' PPT mutante (Figura 1C, faixa 4), que perturbam a estrutura IRES (Figura 1B)8 ,10,12. Formação de Toeprint foi restaurada quando os mutantes PPT foram transcritas com um cap 5' (Figura 1C, faixas 3 e 5). Formação de Toeprint também foi restaurada para o PPT duplo mutante (Figura 1C, faixa 6), que restaura a estrutura secundária (Figura 1B)10. Juntos, esses dados indicam que a estrutura secundária de IRES a XIAP é fundamental para a iniciação da tradução do RNA un-tampado e estrutura de IRES é dispensável para a iniciação da tradução de cap-dependente. Para demonstrar ainda mais a exigência específica para uma cap 5' na ausência de uma estrutura de IRES, mRNA de β-globina humana (HBB) foi submetido à análise de toeprinting (Figura 1D). Nenhum toeprint foi observado na ausência de um cap 5' (Figura 1D, faixa 1) mas os ribossomas com êxito foram recrutados para tampado HBB RNA (Figura 1D, faixa 2).
Figura 1 . Toeprinting análise confirma a importância da estrutura secundária de IRES para a formação de complexos de iniciação da tradução em um RNA de IRES XIAP destampado. (A) diagrama esquemático da construção de DNA codificação do RNA de IRES XIAP utilizado nesta análise. Extremidade 3' do primer toeprinting é 42 bp a jusante do códon de início. (B) estruturas secundárias da IRES de XIAP WT (superior esquerdo), o mutante 5' PPT (superior direito), o mutante 3' PPT (canto inferior esquerdo) e o PPT duplo mutante (inferior direito). 'Mutante PPT' refere-se a um ponto de mutação (UU para AA) em um trato spliciossoma crítico, que interrompe a estrutura secundária do IRES8,10,12. O códon de início é processador; as mutações pontuais são indicadas com asteriscos (*). (C) Toeprinting análise da capacidade de variantes XIAP IRES para formar complexos de iniciação de tradução em RRL tratados com GMP-PNP e ATP. O início codão AUG foi substituído com AAC no códon começar mutante. Para tornar o RNA faltando uma cauda poli-A, o primer reverso, usado para tornar o modelo de transcrição em vitro simplesmente faltava um trato de poli-T. (D) complexo de iniciação foi formado sobre o tampado (mas não o un-tampado) 5' UTR de β-globina humana (HBB). Em painéis (C) e (D), as mais à esquerda 4 pistas representam reações de sequenciamento com os nucleotídeos dideoxy indicados acima de cada raia; a sequência é indicada à esquerda de cada painel. FL, longa-metragem. Todos os RNAs foram un-tampados, a menos que especificado de outra forma. Esta figura foi modificada de anteriores Publicações8,10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Toeprinting é uma técnica poderosa para medir diretamente a capacidade de um RNA de interesse para apoiar a formação de complexos de iniciação da tradução em circunstâncias altamente controlados. Este protocolo descreve uma técnica simplificada para toeprinting mamíferos RNAs. Reticulócito coelho lisado (RRL) é usado como uma fonte conveniente de ribossomos, eIFs, iniciador tRNA e IRES trans-agindo fatores (ITAFs). O experimentador fornece seu RNA de escolha e também pode complementar a reação de toeprinting com cofactores específicos de sua escolha. Por exemplo, 48S contra 80 complexos de iniciação de tradução podem ser diferenciados com base na distribuição das intensidades de fluorescência do toeprints7. A complexo de iniciação observada dependerá do tipo de nucleotídeo guanina usado. No caso da IRES XIAP discutidos aqui, GMP-PNP mais ATP estabiliza 48S complexos de pré-iniciação, caracterizados por uma distribuição de toeprint + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP é um nonhydrolyzable GTP analógico que inibe o subunit ribosomal juntar-se, assim, bloqueando a iniciação da tradução em 48S etapa13. Em contraste, GTP, ATP, ou ATP mais GTP estabiliza complexos de iniciação dos anos 80, caracterizados por toeprint distribuição + 17 + 19 + < 18 >8.
O usuário terá de considerar o tipo de RNA que desejam toeprint. Se o objetivo é estudar um mecanismo independente de tampa, como um elemento de IRES, o RNA pode ser em vitro transcritas com qualquer kit disponível comercialmente. No entanto, qualquer mamífero RNA pode ser submetido a este método de toeprinting, desde que tem uma estrutura de cap 5'. Tampado mRNA deverá ser gerado usando um kit apropriado. Em qualquer caso, protocolos do fabricante devem ser seguidos de perto, como a preparação do RNA de alta qualidade representa um passo fundamental no procedimento. Outro ponto crítico é que a extração do fenol na etapa 3.7 deve ser realizada no ou acima de pH neutro; Se o ácido fenol é usado nesta fase, o cDNA recentemente sintetizado serão perdido. É interessante notar que a concentração de acetato de magnésio usado na etapa 3.5 pode influenciar a eficiência da transcrição reversa e pode ter que ser otimizado para cada mRNA.
Alguns controles chaves são necessárias para assegurar a especificidade do toeprint. Em primeiro lugar, não toeprint robusta deve ser observado na ausência de RRL ou nucleotídeo. Isso garante que a pausa observada a transcrição reversa é devida a um complexo Ribossoma-RNA ao invés de uma estrutura secundária do RNA estável ou algum defeito com a reação de transcrição reversa em si. Em segundo lugar, não toeprint deve ser observado se o códon de início é uma mutação. Isso garante que o ribossoma formou um complexo especificamente com o códon de início do RNA e que o usuário corretamente identificou extremidade 3' do ribosome complexo com o códon de início. Isto é particularmente importante para elementos de IRES, que podem recrutar o ribossoma para um códon de início alternativo14. Da mesma forma, o toeprint pode ser prejudicada na ausência de uma cauda poli-A, como foi o caso para o XIAP IRES8. Porém, alguns elementos de IRES fazer toeprints na ausência de uma cauda poli-A, como o de IRES CrPV10. Finalmente, o toeprint adequada, além de outras pausas de transcrição reversa podem ser observadas. Estes podem simplesmente representam pausas devido a estruturas secundárias estáveis no ARN, ou podem ser devido a um fenômeno apelidado "Ribossoma pulando", no qual o ribossomo desliza do códon de início para outros locais na RNA15. Para diferenciar entre estas possibilidades, a reação de toeprinting pode ser realizada na presença de cicloheximida8, que efetivamente imobiliza o ribossoma para o códon de início e deve reduzir toeprints alternativa devido ao Ribossoma pulando. Notavelmente, mRNAs diferentes terão diferentes estruturas secundárias, significando que o número e a intensidade de invertam as pausas de transcrição (i. e., bandas de fundo) também irá variar.
Uma possível limitação dessa técnica é que mede o recrutamento de Ribossoma para um mRNA em vitro, mas a formação de uma complexo de iniciação de tradução não significa necessariamente que a tradução ocorrerá em vivo. Portanto, toeprinting é particularmente poderosa quando combinado com técnicas na vivo para medir tradução (ex., polysome de perfil16) e os níveis de proteína resultante (EG., análise ocidental).
Uma técnica mais recente é "Ribossoma o perfil" (também chamado de "footprinting do Ribossoma"), onde a sequenciação do ARN de alto rendimento é usada para medir a presença de ribossomas no mRNA celular total. Esta é uma técnica poderosa para medir recrutamento Ribossoma na escala transcriptome. Inerente ao Ribossoma perfilamento é o uso de reagentes, tais como cicloheximida, estabilizar ribossomos na mRNAs. Potencialmente, isso representa uma desvantagem, como um número desproporcional de ribossomas pode ser parado não específica da região 5' untranslated (UTR), que pode ser interpretado como não-canônicos tradução iniciação17. Em toeprinting, cicloheximida não é parte integrante do processo, eliminando a possibilidade de tais falsos positivos. Além disso, qualquer único mRNA pode ser estudado em maior detalhe por toeprinting, como é fácil conduzir muitos experimentos de controle e iterações (por exemplo, testar o efeito de várias mutações pontuais, ou a ausência de cauda poli-A, no recrutamento de Ribossoma). Seria demorado e caríssimo para realizar uma matriz equivalente de experimentos de controle no contexto de um ribossoma experiência de criação de perfil. Toeprinting é, portanto, uma abordagem complementar às técnicas de alta produtividade baseada no sequenciamento e é ainda comumente utilizado para estudos com o objetivo de elucidar os mecanismos de tradução do Regulamento8,9,10, 18.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum conflito de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um ciências naturais e engenharia Conselho de Canadá-Discovery bolsa de investigação (05463-RGPIN-2017), a Fundação de Canadá para inovação-John R. Evans líderes fundo (35017), o programa inova do Campus Alberta e Ministério de Alberta Comércio e desenvolvimento econômico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
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