Summary
Toeprinting syftar till att mäta förmågan av in vitro transkriberade RNA till formuläret översättning inledande komplex med ribosomer under olika villkor. Detta protokoll beskriver en metod för toeprinting däggdjur RNA och kan användas för att studera både cap-beroende och IRES-driven översättning.
Abstract
Översättning inledande är det hastighetsbegränsande steget i proteinsyntesen och representerar en viktig punkt där celler reglerar deras protein produktion. Reglering av proteinsyntesen är nyckeln till cellulär stress-svar och dysreglering är central för många sjukdomstillstånd, exempelvis cancer. Exempelvis även om cellulär stress leder till hämning av globala översättning av förmildrande cap-beroende initiering, översätts vissa stressreaktionen proteiner selektivt på en cap-oberoende sätt. Diskret RNA reglerande faktorer, såsom cellulär intern Ribosomen inträde platser (IRESes), möjliggör för översättning av dessa specifika mRNA. Identifiering av sådana mRNA och karakterisering av regleringsmekanismerna, har varit ett nyckelområde i molekylärbiologi. Toeprinting är en metod för studier av RNA struktur och funktion som det avser den översättningen inledandet. Målet med toeprinting är att bedöma möjligheten av in vitro transkriberade RNA bildar stabila komplex med ribosomer under olika förhållanden, för att avgöra vilka sekvenser, strukturella element eller tillbehör faktorer är inblandade i Ribosomen bindande — en förelöpare för effektiv översättning inledande. Tillsammans med andra tekniker, såsom västra analys och polysome profilering, möjliggör toeprinting en robust karakterisering av mekanismer för reglering av översättningen inledandet.
Introduction
Som översättning förbrukar mest cellulär energi, är det vettigt att översättningen är hårt reglerade1. Omvänt, dysreglering av översättning- och de därav följande förändringarna i protein utdata-är ofta observeras i stressreaktionen och sjukdomar, såsom cancer1,2. En stor fördel med translationell kontroll är hastigheten med vilken celler kan förändra deras protein produktion för att möta olika stimuli3. Översättning förordning utgör därmed en viktig mekanism som kan påverka cellöverlevnad och död1,2,3. Av steg i översättning är inledande de flesta mycket reglerad och komplexa3. Kort, de flesta eukaryota mRNA innehålla en 5' m7G cap som nästan alltid är avgörande för deras översättning. Cap-beroende initiering kräver eukaryota inledande faktorer eIF4E, eIF4A och eIF4G (cap-erkännande komplexet) att interagera med 5' slutet av mRNA. 43S preinitiation Ribosomen komplex, som innehåller eIF2-bundna initieraren tRNA och eIF3, rekryteras 5' ände till mRNA via växelverkan av eIF4G med eIF3. Den komplexa preinitiationskomplexet tros Skanna mRNA, understödda av eIF4A (en RNA helicase) tills den start-kodon (AUG) ligger. 48S inledande komplex bildas därefter och tRNA levereras in P-platsen av Ribosomen. Slutligen, 60S och 40S Ribosomen subunitsna förenas att bilda 80S inledande komplexa, följt av översättning töjning1,3,4. Däremot kringgå intern Ribosomen inträde platser (IRESes) krav för en 5' cap genom att rekrytera den ribosomal subuniten för 40S direkt till den inledande kodon3. Fysiologisk stress villkor dämpa globala mRNA översättning på grund av ändringar av viktiga allmänna eukaryota inledande faktorer (gamla). Men icke-kanoniska översättning inledande mekanismer gör det möjligt för selektiv översättning av vissa mRNA som ofta kodar stressreaktionen proteiner och dysreglering av icke-kanoniska översättning inledande är inblandad i sjukdomstillstånd som cancer 1 , 2. diskret RNA reglerande faktorer, såsom cellulär IRESes, möjliggör för översättning av sådant mRNA2,3.
En särskilt intressant aspekt av translationell kontroll är att förstå mekanismerna för kanoniska kontra icke-kanoniska översättningen av en viss mRNA. Toeprinting är en teknik som möjliggör detaljerade mekanistiska studier av översättningen inledandet av specifika RNAs in vitro. Det övergripande målet för toeprinting är att bedöma förmågan hos en RNA av intresse att kärnbildas bildandet av en översättning inledande komplex med Ribosomen under olika förhållanden, för att avgöra vilka sekvenser, strukturella element eller tillbehör faktorer som krävs för effektiv översättning inledande. Ribosomen rekrytering kan exempelvis vara hindras i avsaknad av en 5' cap men stimuleras av närvaron av en IRES.
Principen om tekniken är att in vitro transkribera en RNA av intresse, inkubera det i närvaro av cellulära extrakt som innehåller översättning komponenter (eller renade komponenter) för att tillåta inledande komplex form och omvänd transkribera RNA med en specifik primer. Stabil RNA-Ribosomen komplex kommer att orsaka omvänd Transkription till stall vid 3' kanten av Ribosomen-den så kallade 'toeprint'5,6,7.
I detta protokoll, ribosomal subenheter, gamla, tRNAs och IRES trans-agerar faktorer (ITAFs) är ett bekvämt bidragit med kanin retikulocyter lysate (RRL). En annan fördel med detta protokoll är användningen av en fluorescently-märkt primer och fluorescens gel-baserad imager, snarare än en radiomärkt primer. Detta eliminerar extra åtgärder, inklusive radiolabeling primer, samt torkning gelen och utsätta den för en allt intensivare skärm. De fluorescerande banden registreras i realtid, som gel körningarna, vilket möjliggör större upplösning. Icke-utjämnade X-länkade hämmare av apoptos protein (XIAP) IRES RNA används som exempel här, även om utjämnade mRNA kan också analyseras genom denna teknik8.
Till skillnad från västra analys, som mäter den slutliga utmatningen av översättningsprocessen i cellen lysates, är toeprinting en in vitro -metod att mäta översättning inledande komplexa bildande på ett RNA. Denna reduktionistiska strategi tillåter för mycket detaljerade studier av substrat eller faktorer som reglerar översättning inledande (t.ex., tak eller un-capped mRNA, IRES struktur, närvaro eller frånvaro av poly-A svans, tillhandahållande av särskilda protein faktorer, (se etc.). Toeprinting kan därför användas för att studera olika lägen av översättning8 eller effekterna av mRNA strukturer, såsom IRESes, på proteinsyntes9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: RNA är mycket mottagliga för nedbrytning av ribonucleases (RNaser). Ta vanliga försiktighetsåtgärder för att hålla RNA intakt. Byt handskar ofta. Använda filtrerade pipettspetsar, nuclease-fri plasticware och nuclease-fri kemikalier i alla steg av protokollet. Användning nuclease-fri eller dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten för alla lösningar.
1. beredning av lösningar
- Förbereda Toeprinting buffert: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) sackaros, 2 mM Ditiotreitol (DTT) och 0,5 mM spermidine.
- Lagra DTT och spermidine i engångsbruk alikvoter vid-20 ° C till undvika upprepad frysning-tining cykler.
Obs: DTT och spermidine bör läggas till den toeprinting buffert omedelbart före användning. En lösning som saknar DTT och spermidine kan förvaras vid-20 ° C.
- Lagra DTT och spermidine i engångsbruk alikvoter vid-20 ° C till undvika upprepad frysning-tining cykler.
- Förbereda alikvoter av 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) och 91 mM adenosintrifosfat (ATP). Lagra alikvoter vid-20 ° C.
- Förbereda 450 mL 6% polyakrylamid - 7M karbamid gel mix: 67,5 mL 40% acrylamide:bis-akrylamid (19:1), 189 g urea, 5 x TBE (Tris/Borat/thylenediaminetetraacetic syra (EDTA)) 112,5 mL och 120 mL vatten. Lös Ureaen genom uppvärmningen i 37 ° C vattenbad eller på en värmeplatta med omrörning. Filtrera lösningen (t.ex., 0,2 μm nitrocellulosa vakuum filter).
Obs: Lösningen kan förvaras vid 4 ° C i minst en månad.
Försiktighet: Monomer akrylamid är ett nervgift som kan absorberas genom huden. Ta stor omsorg att undvika hudkontakt (dvs., bära handskar, en labbrock, och ögonskydd). Polyakrylamid bör också hanteras med försiktighet, eftersom polymerisation inte kan fortsätta till 100% avslutad. - Förbereda formamid lastning färgämne: 95% formamid, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol. Förvaras vid-20 ° C.
- Lös 1 nmol primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' slutet-märkt med IRDye 800) till 100 μL av vatten för en arbetande koncentration av 10 pmol/μL. Förvaras vid-20 ° C i engångsbruk alikvoter (ca 10 µL), skyddas från ljus.
2. beredning av mRNA
- Förstärka DNA mallar för syntesen av mRNA av polymeras-kedjereaktion (PCR) från lämpliga mallar (dvs., genomiskt DNA eller plasmid-DNA, i förekommande fall). Använda en HiFi-DNA polymeras enligt tillverkarens instruktioner, med följande reaktion villkor (35 cykler): smälta, 98 ° C, 10 s; glödga, 53 ° C, 20 s; utvidga, 72 ° C, 30 s.
Obs: Forward primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) innehåller sekvensen T7 promotorn för RNA transkriptionen; reverse primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) omfattar 51 tymin återstoder för att ge en poly-A svans för transkriberade RNA. Observera att RNA kan också vara i vitro transkriberas från plasmid DNA. - Använd ett lämpligt transcription kit för in vitro- transkribera IRES-innehållande RNA eller utjämnade RNA från mallen DNA. Följ tillverkarens instruktioner. Förbereda det RNA-provet i standard 20 μL reaktion volymer. Behandla nyligen-synthesized RNA med 2 enheter av RNase-fri DNAS under 30 minuter vid 37 ° C.
- Späd DNAS-behandlade RNA till 110 µL med nuclease-fritt vatten tillsätt 110 µL syra fenol, vortex 5 s och Centrifugera under 3 minuter vid 20 000 x g vid rumstemperatur. Ta bort 100 µL av vattenfasen till en ny 1,5 mL mikrofugrör, tillsätt 10 µL av 3 M natriumacetat och vortex 2 s. Lägg, 3 volymer av 100% etanol, vortex 5 s, och fällningen RNA vid-20 ° C över natten.
- Centrifugera vid > 20.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C och Kassera supernatanten. Tvätta pelleten med 500 µL av iskall 70% (v/v) etanol och upprepa centrifugeringen. Sug ut så mycket av supernatanten som möjligt och lufttorka pelleten för 5-10 min. var noga med att inte rubba pelleten.
- Återsuspendera RNA i lämplig volym av nuclease-fritt vatten för att ge en fungerande koncentration av 0,5 μg/μL. Detta kan lagras vid-80 ° C eller användas omedelbart.
3. Toeprinting reaktion
- Mix 15 μl kanin retikulocyter Lysate (RRL, inte nuclease-behandlade), 1 μL (40 enheter) av RNase Inhibitor, 1 µL 91 mM ATP (1,82 mM slutlig) och 1 μL av 85 mM GMP-PNP (1,7 mM slutlig) i ett 1,5 mL mikrofugrör. Inkubera vid 30 ° C i 5 min.
Obs: RRL bör vara aliquoted för engångsbruk att undvika repetitiva frysa-upptining. En kritisk kontroll är en reaktion som saknar RRL, för att belysa de naturliga pauserna av omvänd Transkription på grund av det sekundära strukturerar av RNA. Lägg till toeprinting buffert för att ersätta RRL för denna kontroll. - Tillsätt 0,5 µg (1 µL) av RNA och inkubera vid 30 ° C i 5 min.
- Tillsätt 22 µL av Toeprinting buffert och inkubera vid 30 ° C under 3 minuter.
- Tillsätt 0,5 µL (5 pmol) IRDye-märkt primer och inkubera på is i 10 min.
- Tillsätt 2 µL av 25 mM dNTP (slutlig koncentration: 1 mM varje), 2 µL av 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL av aviär Myeloblastosis Virus omvänt transkriptas (AMV-RT) och 3,5 µL av Toeprinting buffert. Den slutliga volymen är 50 μL.
- Inkubera reaktionen vid 30 ° C i 45 min.
- Tillsätt 200 µL nuclease-gratis vatten och omedelbart extrahera med 250 µL av 25:24:1 fenol: kloroform: isopentanol (pH cirka 8,0). Vortex 5 s och centrifugera vid 20 000 x g under 3 minuter vid rumstemperatur. Ta bort den vattenhaltiga fasen till ett nytt 1,5 mL mikrofugrör, Lägg till 3 volymer av 100% etanol, vortex 5 s, och fällningen vid-20 ° C över natten.
- Centrifugera vid > 20.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C och Kassera supernatanten. Tvätta DNA pelleten med 500 µL av iskall 70% (v/v) etanol. Centrifugera vid > 20.000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten så mycket som möjligt och lufttorka pelleten för 5-10 min. var noga med att inte rubba pelleten.
- Lös pelleten i 6 μL nuclease-gratis vatten och tillsätt 3 μL av formamid lastning färgämne.
4. sekvensering reaktioner
- Använd mallen DNA från 2.1 och IRDye-märkt primer från steg 3,4 för standard sekvensering reaktioner, med dideoxynucleotides (ddNTPs) som kedjan terminators. Använd en lämplig DNA sekvensering kit och följ tillverkarens anvisningar.
- Blanda 6 μL av varje sekvensering reaktion med 3 μL av formamid lastning färgämne.
5. beredning av sekvensering Gel och elektrofores
Obs: Detta protokoll använder en fluorescens gel-baserad imager och en 21 x 23 cm x 0,2 mm gel, men kan anpassas för andra sequencers eller gel-storlekar, om det behövs.
- Ren noggrant de 0,2 mm distanserna samt de kort (23 × 25 cm) och lång (30 × 25 cm) glasskivor med 100% etanol. Lufttorka.
- Mix 30 mL 6% polyakrylamid - 7M karbamid gel blanda med 200 μL 10% (w/v) ammonium persulfatoxidation (APS) och 20 μL av tetramethylethylenediamine (TEMED). Häll i gel, för att undvika bubblor, och infoga 'shark-tand' gel kammen. Låt gelen att polymerisera för 1 h i rumstemperatur.
- Montera sekvensering apparaten och Fyll behållarna med 1 x TBE.
- Förväg kör för 15 min vid 1500 V tills optimal temperatur 55 ° c uppnås.
- Värm provet/lastning dye mixen (från steg 3.9 eller 4.2) till 85 ° C för 5 min. belastning 1 μL på sekvensering gelen.
- Kör gelen vid 1500 V för 8 h. Maskinen kommer att läsa banden i realtid.
- Ta isär apparaten och släng i akrylamid gel och rinnande buffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare beskrivit de XIAP IRES förmåga att stödja cap-oberoende översättning inledande in vitro-8,10. Toeprinting var den viktigaste tekniken att förhöra de mekanistiska detaljerna av XIAP IRES inledande komplexa. En DNA-konstruktion kodning en mRNA som innehåller de XIAP IRES (figur 1A) var i vitro transkriberas och utsätts för toeprinting analys. De muterade varianterna av XIAP IRES mRNA används här är representerade i figur 1B. Omvänd Transkription av XIAP mRNA-Ribosomen komplexet gav typiska toeprints + 17 till 19 nt nedströms av AUG (figur 1C, lane 1). Detta är tecken på Ribosomen rekrytering till den start-kodon och bildandet av stabil ribosom-RNA komplex5,6,7. Ribosomen rekrytering var starkt nedsatt i avsaknad av en poly-A svans (figur 1C, lane 9), som tidigare rapporterats11. Toeprint bildande var också starkt nedsatt i avsaknad av RRL och GMP-PNP (figur 1C, lane 8) och för start kodon mutant (figur 1C, lane 7), bekräftar att den observerade toeprint inte är en struktur-inducerad paus på omvänd Transkription är men i själva verket specifika för inledande komplexa bildande. Toeprint bildande var nedsatt för 5' polypyrimidine tarmkanalen (PPT) mutant (figur 1C, lane 2) och 3' PPT mutant (figur 1C, lane 4), som störa IRES struktur (figur 1B)8 ,10,12. Toeprint bildande återställdes när PPT mutanter var transkriberas med en 5' cap (figur 1C, körfält 3 och 5). Toeprint bildande restaurerades också för PPT dubbel mutant (figur 1C, lane 6), som återställer den sekundära struktur (figur 1B)10. Tillsammans, indikerar dessa data att det sekundära strukturerar av den XIAP IRES är kritisk för översättningen inledandet av un-capped RNA och att IRES struktur är dispensable för cap-beroende översättning inledande. För att ytterligare demonstrera det specifika kravet för en 5' cap i avsaknad av en IRES struktur, utsattes mänskliga β-globin (HBB) mRNA för toeprinting analys (figur 1D). Ingen toeprint observerades i avsaknad av en 5' cap (figur 1D, lane 1) men ribosomer rekryterades framgångsrikt utjämnade HBB RNA (figur 1D, lane 2).
Figur 1 . Toeprinting analys bekräftar vikten av IRES sekundärt strukturera för bildandet av översättning inledande komplex på en icke-utjämnade XIAP IRES RNA. (A) Schematisk bild av den DNA konstruktionen kodning XIAP IRES RNA används i denna analys. 3' ände toeprinting primer är 42 bp nedströms av den start-kodon. (B) sekundära strukturer av de WT XIAP IRES (övre vänstra), 5' PPT mutant (övre högra), 3' PPT mutant (lägre vänster) och PPT dubbel mutant (nedre högra). 'PPT Mutant' refererar till en punktmutation (UU till AA) i en kritisk polypyrimidine tarmkanalen, vilket stör det sekundära strukturerar av IRES8,10,12. Den start-kodon är boxed; punktmutationer anvisas med en asterisk (*). (C) Toeprinting analys av XIAP IRES varianter förmåga att bilda översättning inledande komplex i RRL behandlas med GMP-PNP och ATP. Den start-kodon AUG ersattes med AAC i starta kodon Mutant. För att göra RNA saknar en poly-A svans, saknade reverse primer används för att göra mallen i vitro transkription helt enkelt en poly-T-tarmkanalen. (D) inledande komplex bildades den utjämnade (men inte den un-capped) 5' UTR av mänskliga β-globin (HBB). I paneler (C) och (D), de vänstra 4 körfält representerar sekvensering reaktioner med de dideoxy nukleotider som anges ovan varje lane; sekvensen är indicerat till vänster om varje panel. FL, hellångt. Alla RNAs var un-capped såvida inte annat anges. Denna siffra har ändrats från föregående publikationer8,10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting är en kraftfull teknik för att direkt mäta förmågan hos en RNA av intresse att stödja bildandet av översättning inledande komplex under mycket kontrollerade omständigheter. Det här protokollet beskriver en förenklad teknik för toeprinting däggdjur RNAs. Kanin retikulocyter lysate (RRL) används som en bekväm källa av ribosomer, gamla, initiativtagare tRNA och IRES trans-agerar faktorer (ITAFs). Experimentledaren ger deras RNA av val, och kan även komplettera den toeprinting reaktionen med specifika kofaktorer som de valt. Exempelvis kan 48S kontra 80S översättning inledande komplex differentieras utifrån fördelningen av fluorescens intensiteter av toeprints7. Inledande komplexa observerats beror på vilken typ av guanin nukleotid används. När det gäller den XIAP IRES diskuteras här, GMP-PNP plus ATP stabiliserar 48S före initiering komplex, kännetecknas av en toeprint distribution + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP är en nonhydrolyzable GTP analog som hämmar ribosomal subuniten att gå, vilket blockerar översättning inledande vid 48S steg13. Däremot stabiliserar GTP, ATP, eller ATP plus GTP 80S inledande komplex, kännetecknas av toeprint distribution + 17 < + > 18 + 198.
Användaren kommer att behöva överväga vilken typ av RNA som de vill efter toeprint. Om syftet är att studera en cap-oberoende mekanism, till exempel ett IRES element, kan RNA vara i vitro transkriberas med någon kommersiellt tillgänglig kit. Dock kan några däggdjur RNA underkastas denna toeprinting metod, förutsatt att den har en 5' cap struktur. Utjämnade mRNA måste genereras med hjälp av en lämplig kit. I alla fall, bör tillverkarens protokollen följas noggrant, eftersom utarbetandet av högkvalitativa RNA utgör ett viktigt steg i förfarandet. En annan kritisk punkt är att fenol utvinning i steg 3,7 måste utföras vid eller över neutralt pH; om syra fenol används i detta skede, förloras den nyligen syntetiserade cDNA. Det är värt att notera att koncentrationen av magnesium acetat används i steg 3.5 kan påverka effektiviteten i omvänd Transkription, och kan behöva optimeras för varje mRNA.
Några viktiga kontroller är nödvändiga för att säkerställa toeprint specificitet. Först, ingen robust toeprint observeras i avsaknad av RRL eller nukleotid. Detta säkerställer att den observerade omvänd Transkription pausen beror på en ribosom-RNA komplex snarare än en stabil RNA sekundära struktur eller någon defekt med omvänd Transkription reaktionen själv. Andra, ingen toeprint bör iakttas om den start-kodon är muterad. Detta säkerställer att Ribosomen har bildat en komplex specifikt med de start-kodon av RNA och att användaren har korrekt identifierade 3' kanten av Ribosomen i komplex med de start-kodon. Detta är särskilt viktigt för IRES element, som kan rekrytera Ribosomen till en alternativ start kodon14. Likaså kan toeprint vara nedsatt i avsaknad av en poly-en svans, som var fallet för XIAP IRES8. Emellertid, vissa IRES element bildar toeprints i avsaknad av en poly-A svans, såsom de CrPV IRES10. Slutligen, förutom toeprint korrekt, andra omvänd Transkription pauser kan observeras. Dessa kan helt enkelt representerar pauser på grund av stabil sekundära strukturer i RNA, eller de kan bero på ett fenomen som dubbade ”Ribosomen hoppning”, vari Ribosomen glider från den start-kodon till andra platser på RNA15. För att skilja mellan dessa möjligheter, kan toeprinting reaktionen utföras i närvaro av Kungliga Automobilklubben8, som immobilizes Ribosomen på den start-kodon och bör minska alternativa toeprints på grund av Ribosomen hoppning effektivt. Särskilt olika mRNA kommer att ha olika sekundära strukturer, vilket innebär att antalet och intensiteten av omvänd Transkription pauser (dvs., bakgrund band) varierar också.
En möjlig begränsning av denna teknik är att den mäter Ribosomen rekrytering till en mRNA in vitro, men bildandet av en översättning inledande komplexa betyder inte nödvändigtvis att översättning kommer att inträffa i vivo. Därför toeprinting är särskilt kraftfull när den kombineras med in-vivo -tekniker för att mäta översättning (t.ex., polysome profilering16) och de resulterande proteinnivåerna (t.ex., västra analys).
En nyare teknik är ”Ribosomen profilering” (även kallad ”Ribosomen Footprints”), vari hög genomströmning RNA-sekvensering används för att mäta förekomsten av ribosomer på totala cellular mRNA. Detta är en kraftfull teknik för att mäta Ribosomen rekrytering på en transkriptom skala. Inneboende till Ribosomen profilering är användningen av reagens, såsom Kungliga Automobilklubben, att stabilisera ribosomer på mRNA. Detta innebär potentiellt en nackdel, eftersom ett oproportionerligt stort antal ribosomer kan vara icke-specifikt avstannat i 5' oöversatta regionen (UTR), som kan misstolkas som icke-kanoniska översättning inledande17. I toeprinting är Kungliga Automobilklubben inte en integrerad del av förfarandet, förneka möjligheten av sådana falska positiva. Dessutom någon enda mRNA kan studeras mer i detalj av toeprinting, eftersom det är lättköpt att genomföra många kontroll experiment och iterationer (exempelvis testa effekten av flera punktmutationer, eller avsaknaden av en poly-A svans, på Ribosomen rekrytering). Det skulle vara tidskrävande och kostnad-oöverkomliga att genomföra en motsvarande rad kontroll experiment i samband med en ribosom profilering experiment. Toeprinting är alltså en kompletterande strategi för hög genomströmning sekvensering-baserad teknik, och används fortfarande ofta för studier som syftar till att klarlägga mekanismer av översättning förordning8,9,10, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konflikt-of-intresse att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av en naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet till Kanada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Stiftelsen Kanada för Innovation-John R. Evans ledare Fund (35017), Campus Alberta utvecklar programmet och Alberta ministeriet för Ekonomisk utveckling och handel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
