Summary
Vi præsenterer en detaljeret tilgang til udførelse af spyt samling, herunder murine trakeostomi og isolation af tre store spytkirtler.
Abstract
Hyposalivation er almindeligt observeret i den autoimmune reaktion af Sjögrens syndrom eller følgende stråling skade de store spytkirtler. I disse tilfælde forbliver spørgsmål vedrørende sygdom patogenese og effektive interventioner. En optimeret teknik, der giver mulighed for funktionel vurdering af spytkirtlerne er uvurderlig for at undersøge eksokrine kirtel biologi, dysfunktion og terapi. Vi præsenterer her, en trinvis tilgang til udfører pilocarpin stimuleret spyt sekretion, herunder trakeostomi og dissektion af de tre store murine spytkirtler. Vi detalje også den passende murine hoved og hals anatomi adgang til under disse teknikker. Denne tilgang er skalerbart, giver mulighed for flere mus skal behandles samtidig, dermed forbedre effektiviteten i arbejdsgangen. Vi sigter mod at forbedre reproducerbarhed af disse metoder, hver har yderligere programmer inden for feltet. Ud over spyt indsamling diskuterer vi målinger til kvantificering og normalisere funktionelle kapacitet af disse væv. Repræsentative data medtages fra submandibulære kirtler med deprimeret spytkirtel funktion 2 uger efter fraktionerede stråling (4 doser af 6.85 Gy).
Introduction
Spytkirtel lidelser omfatter syndromer af dysregulated eller nedsat sekretion fører til overproduktion (sialorrhea) eller underproduktion (xerostomia og hyposalivation) af spyt1. I begge tilfælde er der en interesse i at forbedre vores forståelse af spytkirtel biologi mod det endelige mål for terapeutisk udvikling2.
Spytkirtlerne er stærkt radiosensitive organer, og er ofte beskadiget under hoved og hals kræft strålebehandling, fører til permanent mundtørhed (xerostomia)3,4. I modsætning til andre radiosensitive væv, dog spytkirtel omsætning sats er relativt lav, og mekanismen af sekretoriske tab er dårligt forstået5,6. I indstillingen unikke skade kræver væv regeneration og strålingsbeskyttelse strategier spyt funktionel vurdering. Eksperimentelt, er murine spyt samling et særligt værdifuldt værktøj i evaluering kirtel svar på både stråling og terapeutiske agenter.
Vi præsenterer her, en metode til udførelse og kvantificere stimuleret spyt sekretion ved hjælp af pilocarpin, en potent muskarine agonist7. Pilocarpin stimulerer det autonome nervesystem for at fremkalde kirtel sekretion8,9. For at fuldføre denne test passende, er en trakeostomi forpligtet til at sikre, at musen fastholder en patent luftvejene under hele proceduren og reducere risikoen for kvælning og aspiration fra poolede sekret i mundhulen10.
Dette er en terminal procedure, som kulminerede i fjernelsen af de tre store spytkirtler: parotideale (PG), de submandibulære (SMG) og sublinguale (SLG). For funktionelle studier, kirtel vægte registreres og bruges ofte til at normalisere spyt måling11,12,13. Disse data er særlig vigtig i stråling undersøgelser, hvori kirtel atrofi er en forventet resultat14,15
Der er variation i litteratur med hensyn til hvordan stimuleret spyt sekretion er udført og rapporteret16. For eksempel, pilocarpin doser inden for litteratur span mindst tre størrelsesordener17,18,19,20,21,22,23. Her præsenterer vi en optimeret højdosis pilocarpin protokol med hensigten at bedre reproducerbarhed i Metodekørsel, samt give en modulær platform af teknikker (tracheostomi, spyt samling og kirtel dissektion), der kan tilpasses nødvendig.
Ud over protokollen demonstration medtager vi repræsentative funktionelle data af spyt flow på 2 uger efter fraktionerede stråling (4 doser af 6.85 Gy) til regionen SMG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle i vivo procedurer skitseret nedenfor blev godkendt af universitetet Udvalget om dyret ressourcer på University of Rochester, Rochester. NY.
1. forberedelse
- Bruger en Analysevægt, veje 20 mg pilocarpin. Opløses det i 2 mL sterilt saltvand i et microcentrifuge rør.
Bemærk: Fordi pilocarpin er lysfølsomt og mister aktivitet over tid, denne løsning bør være rede dag af injektion, og beskyttet mod lys indtil administreres. - Brug en Analysevægt, vejer og identificere alle indsamling rør og glas kapillærer. Antallet af indsamling rør og glas kapillærer bør svare til antallet af mus.
2. tracheostomi
- Veje C57/BL6 mus ved hjælp af en Analysevægt.
- Ved hjælp af en 0,5 mL sprøjte med 29G x ½" nål, bedøver mus med en intraperitoneal injiceres steril saltvandsopløsning af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin. Gå videre til det følgende trin, når musen ikke længere reagerer på stimuli (dvs. fravær af pedal tilbagetrækning refleks), hvilket normalt sker indenfor 5-10 min efter injektion.
- Efter udlevering smøremiddel på en bomuld tippes applikator, forsigtigt anvende til øjne og placere musen i en liggende stilling på scenen. De bedøvede dyr skal holdes på varm overflade.
Bemærk: Alle trin er udført ved stuetemperatur. - Sikre næse, lemmer og hale på scenen, ved hjælp af kirurgisk tape.
- Ren og våde hals med en alkohol-serviet.
Bemærk: Dette vil hjælpe med at forhindre pels fra indtastning efterfølgende snit. - Raising ventrale midterlinjen halsen huden med pincet, gør en lille, overfladiske snit bruger dissekere saks. Guide saksen i åbningen og langsomt åbne vinger subkutant for at adskille væv fly.
- At holde huden rejst, omhyggeligt skåret til 1 cm under munden.
- Gør to laterale indsnit på de ringere og overlegen aspekter af det første snit. Brug af pincet, afspejle forsigtigt væk hud for at aktivere adgang til strukturer, hoved og hals.
- Ved hjælp af den dissekere mikroskop på 8 X forstørrelse, visualisere de submandibulære kirtler (midterlinjen: figur 1).
- Bruger fine pincet, forsigtigt løfte kirtler at eksponere de fire infrahyoid (REM) muskler overliggende luftrøret. Undgå rive eller forstyrre den omkringliggende Vaskulaturen eller ekskretionsorganerne kanaler.
- Hvis indsamling spyt fra mere end en mus, skal du gentage trin 2.1-2.10 med hver mus før du fortsætter.
Bemærk: Denne procedure kan sikkert udføres på op til 5 mus samtidigt. - Med små dissekere saks, fjerne den mediale del af rem muskler mens de opholder sig så tæt på midterlinjen som muligt. Skære kun så meget som nødvendigt at visualisere luftrøret og holde rem muskler af vejen under proceduren. Undgå nicking nærliggende fartøjer, fordi hvis der er volumen udtynding sekundært til betydelige blødning, pilocarpin ikke vil være effektiv på overtalelse sekretion.
- Afspejle rem muskler fra luftrøret.
- Visualisere strubehoved, luftrør og skjoldbruskkirtlen. Sikre at luftrøret fremgår af overliggende væv.
- Foretage en vandret snit i luftrøret ringere/posterior til skjoldbruskkirtlen ved hjælp af små dissekere saks. Sikre, at luftvejene er patent og klar væske.
3. spyt samling
- Fjern tape i nærheden mund og vinkel dissektion scenen nedad (45°, cranially) at hjælpe med spyt flow.
- Ved hjælp af en 0,5 mL sprøjte med 29G x ½" nål, udføre intraperitoneal injektion af 10 µL/g organ vægt pilocarpin for en total dosis på 100 mg/kg.
- Start en timer. Hvis dosering flere mus, reducere leveringstiden ved at flytte hurtigt og ved at have assistent samtidigt injicere de resterende mus.
- Bruger standard pincet, åbne munden for kapillarrør adgang.
- Når en perle af spyt er observeret i munden, sted den proksimale ende af kapillarrør i væsken, med den distale ende placeres i en indsamling rør placeret under dissekere scenen (begge rør pre vejes).
Bemærk: I C57/BL6 hunmus 6-10 uger gammel, brutto spytsekretion sker inden for 2 min af pilocarpin injektion. - Hvis spyt opbygge i munden, men ikke strømmer gennem røret, reattempt forrige trin. Sikre at røret ikke anbringes direkte mod en slimhinden, som kan blokere fjorden.
- Indsamle spyt for i alt 12 min efter pilocarpin stimulation. Sikre, at stomien forbliver klar.
Bemærk: Øget tidalvolumen og sekreter (spyt, urin, fækal) er normale i løbet af denne tid. - Hvis mus har deprimeret spyt funktion (fx. på grund af skade eller intervention), overføres den resterende væske fra munden til samling røret ved hjælp af en P200 mikropipette. Hvis indsamling fra flere mus, sikre at tips er ændret.
- Optage vægt indsamlet spyt plus rør 12 min efter pilocarpin injektion.
4. kirtel dissektion
- Aflive mus af CO2 eutanasi (som beskrevet i de AVMA retningslinjer for aflivning af dyr: 2013 Edition) efterfulgt af torakotomi, at tage sig til at bevare strukturerne af hoved og hals. Derfor undgå livmoderhalskræft dislokation som en metode af aktiv dødshjælp.
- Placere musen i en liggende stilling på scenen. Flytte kirtler i det oprindelige websted over i luftrøret (figur 1).
- Ved hjælp af en dissekere mikroskop under 8 X forstørrelse, visualisere de store kirtler: PG, SMG og SLG. For at skelne kirtler under dissektion, identificere at PG er diffus, liggende lateral SMG og SLG.
Bemærk: Hvis dissekere PG, dette bør gøres først fordi det er den mindste defineret og mest sandsynligt at være splittet. - Forstå halen af PG med pincet, trække det væk fra underliggende strukturer, og forsigtigt anvende spænding før skære hovedet af PG med dissekere saks.
- Brud kapsel omgiver SMGs med pincet. Forsigtigt adskille den venstre og højre SMG.
- Gratis den dorsale aspekt af SMG fra overholdt nonglandular væv ved hjælp af pincet.
- Fjerne SMG fra halsen ved tegning Whartons kanalen henslængt med pincet og skære kanalen med dissekere saks.
- Forsigtigt adskille SLG fra SMG med pincet.
Bemærk: SLG er i superolateral aspekt af SMG. - Ved hjælp af et analytisk balance, registrere SMG vægte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når udfører høj dosis pilocarpin stimuleret spyt samling, er det vigtigt at opretholde luftvejene for at forhindre aspiration eller kvælning fra sekreter i mundhulen. En skematisk af en trakeostomi er fastsat (figur 1). Efter trakeal indsnit, skal stomien forblive klar i væv og væsker.
For at forbedre kapillaritet under spyt indsamlingen, skal mus placeres med hovedet nedad i en 45° vinkel. Disse trin kan udføres på > 1 mus, men det ikke anbefales at overstige 5 mus på én gang (figur 2). Når indsamlingen er fuldført, anbefales det, at rør vejes hurtigt for at undgå fordampning tab.
Efter spyt samling, mus er euthanized. Cervikal dislokation bør ikke udføres, da det kan beskadige hoved og hals strukturer. Mus er tilbage til dissekere scenen, og kirtler skal flyttes over i luftrøret, som oprindeligt placeret. Kirtel dissektion (figur 3) bør begynde med PG, på grund af både sin position og diffuse konsistens. SMG og SLG er fast, og kan fjernes nemt.
Følge 4 fraktioner af stråling, 6.85 Gy murine SMG nedsætter spyt funktion betydeligt ved 2 uger (figur 4). Begge samlede spyt sekretion, og sekretion normaliseret til kirtel våd vægt var afbildet. Ved hjælp af enten metrikværdi, er spyt funktionelle kapacitet reduceret, som forventet, på 2 uger efter bestråling24.
Kirtel væv kan være fast og sektioneret for histologiske pletter og/eller Immunhistokemi. Hæmatoxylin og Eosin farvning (H & E) viser lignende brutto SMG arkitektur både med eller uden pilocarpin stimulation (figur 5). Farvning for Nkcc1, viser en membran-kalium-natriumklorid transporter, lignende celle morfologi uanset pilocarpin stimulation (figur 6).
Figur 1 . Tracheostomi skematisk. (A) efter åbning halsregionen, visualisere de store strukturer. (B) for at fuldføre en tracheostomi, forsigtigt løfte, men ikke løsrive, SMGs uden at forstyrre omkringliggende strukturer, herunder blodforsyning, innervation og ekskretionsorganerne kanaler. Skære rem muskler til at udsætte trakeale brusk før du foretager et snit ind i luftrøret. Forlade SMG i sted og luftrøret udsat under hele spyt samling procedure. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Spyt samling. Efter pilocarpin stimulation, vinkel mus nedad og indsamle spyt gennem kapillarrør i pre vejes indsamling rør, som er placeret under dissektion scenen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Major spytkirtel dissektion. Når mus har været aflivet, ændre placeringen og adskille de venstre og højre SMG. Forsigtigt adskille hver kirtel fra de omkringliggende nonglandular væv og blodkar. PG er en diffus, lateral struktur. SMG og SLG er sluttet, men kan være rent adskilt med pincet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentative sekretion data. To uger efter fraktionerede stråling (4 doser af 6.85 Gy) til SMG, blev pilocarpin-stimuleret spyt sekretion målt. Spyt funktion er rapporteret som samlede spyt volumen (A) og total spyt volumen (B) normaliseret til total SMG vådvægt. Som forventet, er der et betydeligt fald i den funktionelle kapacitet af SMG (betyde ± SD **p < 0,01 ved hjælp af to-sidede uparret t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Hæmatoxylin og Eosin SMG farvning. SMG væv blev høstet fra en mus efter pilocarpin stimulation (100 mg/kg, højre) sammenlignet med kontrol, ubehandlede mus SMG (til venstre). H & E farvning viser brutto kirtel struktur på 10 X (skala barer: 200 µm) (A, B) og 40 X (skala barer: 50 µm) (C, D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Nkcc1 SMG Immunhistokemi. SMG væv blev høstet fra en mus efter pilocarpin stimulation (100 mg/kg, højre) sammenlignet med kontrol, ubehandlede mus SMG (til venstre). Nkcc1 er en membran protein og kan bruges til at evaluere cellulære morfologi. DAPI bruges som en nuklear kontrastfarve (skala barer: 75 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en omstændelig metode til at vurdere spytkirtel-funktion, som kan anvendes til at studere kirtel skade og therapeutics. Vores procedure indebærer tracheostomi, spyt samling og kirtel dissektion, hver har eksperimentelle programmer, der kan understøtte en integreret undersøgelse af spytkirtel biologi. For eksempel, er murine trakeostomi blevet brugt for generelle airway management under procedurer blokerer mundhulen.
Ordentlig dissektion og luftrør indsnit kræves for pilocarpin stimuleret spyt sekretion på 100 mg/kg. Alternativt, en reduceret pilocarpin dosis kunne undgå behovet for trakeostomi og derfor bruges til langsgående vurdering af spyt sekretion16.
Ud over optagelse spyt sekretion, giver denne protokol også en nøjagtige og ensartede middel til at indsamle spyt for yderligere analyser. Disse undersøgelser omfatter reologi, proteomics, enzymaktivitet, spyt osmolaritet25,26,27og biomarkør discovery28,29.
Endelig har standardiseret dissektion metoder for de store spytkirtler nytte ud over spyt samling. Der er en interesse i at forstå kirtel udvikling og reaktion på skade. For effektive undersøgelser er det vigtigt at udføre konsekvent, ren dissektioner af de store spytkirtler. Ren og effektiv kirtel isolation er kritisk for kulturer afledt af primærelementer, der er mekanisk og enzymatisk adskilles fra de store spytkirtler30,31, og for histologiske og immunhistokemiske præparater. Desuden, når farvning for udskilles proteiner i kirtel væv sektioner, det er kritisk at overveje og kontrollere for sandsynligt nedbrydningen af disse produkter efter stimuleret spyt samling.
Kvantificere spytkirtel funktion i undersøgelser af skade eller intervention er en vital eksperimentel teknik. Kirtel histologi er informative og kan fremkalde centrale bemærkninger, men konklusioner understøttes bedst af klare funktionelle data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af den nationale Dental-Institut og Craniofacial forskning (NIDCR) og National Cancer Institute (NCI) af National Institutes of Health under Award antallet R56 DE025098, UG3 DE027695 og F30 CA206296. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health. Dette arbejde blev også støttet af NSF DMR 1206219 IADR Innovation i Oral Care Award (2016).
Vi vil gerne takke Dr. Eri Maruyama og Andrew Hollomon for deres hjælp med spyt samling. Vi vil gerne takke Pei-Lun Weng for hans hjælp med kirtel dissektion. Vi vil gerne takke Matthew Ingalls for sin bistand i figur forberedelse. Vi vil gerne takke Dr. Elaine Smolock og Emily Wu for kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
