Summary
Vi presenterer en detaljert tilnærming til å utføre spytt samling, inkludert murine tracheostomi og isolasjon av tre store spyttkjertler.
Abstract
Hyposalivation er ofte observert hos autoimmun reaksjon Sjögrens syndrom eller følgende stråling skader store spyttkjertler. I disse tilfellene forblir spørsmålene om sykdom patogenesen og effektive tiltak. En optimalisert teknikk som lar funksjonelle vurdering av spyttkjertler er uvurderlig for å undersøke exocrine kjertel biologi og dysfunksjon therapeutics. Her presenterer vi en trinnvis tilnærming til å utføre pilokarpin stimulert spytt sekresjon, inkludert tracheostomi og Disseksjon av tre store murine spyttkjertler. Vi har også detalj den aktuelle murine hode og nakken anatomien brukt i løpet av disse teknikkene. Denne tilnærmingen er skalerbar, slik at flere mus behandles samtidig, dermed effektivisering av arbeidsflyten. Vi tar sikte på å forbedre reproduserbarhet disse metodene hver har ytterligere programmer innen. I tillegg til spytt samling diskutere vi beregninger for kvantifisere og normalisere funksjonelle kapasiteten til disse vev. Representant data inkluderes fra submandibular kjertler med deprimert salivary kjortelen funksjonen to ukene etter fraksjonert stråling (4 doser av 6.85 Gy).
Introduction
Salivary kjortelen lidelser inkluderer syndromer dysregulated eller svekket sekresjon fører til overproduksjon (sialorrhea) eller underproduksjon (xerostomia og hyposalivation) av spytt1. I begge tilfeller er det en interesse i å forbedre vår forståelse av salivary kjortelen biologi mot målet av terapeutiske utvikling2.
Spyttkjertler er svært radiosensitive organer, og er ofte skadet under hode og nakke kreft strålebehandling, fører til permanent tørr munn (xerostomia)3,4. I motsetning til andre radiosensitive vev, men salivary kjortelen omløpshastighet er relativt lav, og mekanismen av sekretoriske tap er dårlig forstått5,6. I denne unike skade innstillingen krever vev gjenfødelse og radioprotection strategier salivary funksjonelle vurdering. Eksperimentelt, er murine spytt samlingen et særlig verdifullt verktøy i evalueringen kjertel svaret både stråling og terapeutiske agenter.
Her presenterer vi en metode for å utføre og kvantifisere stimulert spytt sekresjon med pilokarpin, en potent muscarinic Agonistiske7. Pilokarpin stimulerer det autonome nervesystemet å indusere kjertel sekresjon8,9. For å fullføre denne testen riktig, er en tracheostomi nødvendig å sikre at musen opprettholder en patent airway hele prosedyren, og redusere risikoen for kvelende og aspirasjon fra gruppert sekreter i munnhulen10.
Dette er en terminal prosedyre, kulminerte i fjerning av tre store spyttkjertler: Parodisk (PG), submandibular (SMG) og sublingvaltabletter (SLG). For funksjonelle studier, kjertel vekter registreres og brukes ofte til å normalisere spytt måler11,12,13. Dette er spesielt viktig i stråling studier, hvori kjertel atrofi er en forventet utfall14,15
Det er variasjoner i litteraturen med hensyn til hvordan stimulert spytt sekresjon er utført og rapportert16. For eksempel pilokarpin doser innen litteratur span minst tre størrelsesordener17,18,19,20,21,22,23. Her presenterer vi en optimalisert høy dose pilokarpin protokoll for forbedret reproduserbarhet i metoden kjøring, samt gi en modulær plattform teknikker (tracheostomi, spytt samling og kjertel disseksjon) som kan tilpasses som nødvendig.
I tillegg til protokollen demonstrasjon inkludere vi representant funksjonelle data av spytt flyt to uker etter fraksjonert stråling (4 doser av 6.85 Gy) til regionen SMG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle i vivo prosedyrer skissert nedenfor ble godkjent av universitetet dyr ressurser ved University of Rochester, Rochester. NY.
1. forberedelse
- Bruker en analytical balanse, vei 20 mg av pilokarpin. Oppløse den i 2 mL sterilt saltvann i et microcentrifuge rør.
Merk: Fordi pilokarpin er følsomt for lys og mister aktivitet over tid, denne løsningen bør være forberedt dagen av injeksjon og beskyttet fra lys til administrert. - Bruker en analytical balanse, veier og identifisere alle samling rør og glass kapillærer. Antall samling rør og glass kapillærene tilsvare antall mus.
2. tracheostomi
- Veie C57/BL6 mus med en analytical balanse.
- Bruke en 0,5 mL sprøyte med 29G x ½" nål, bedøve mus med en intraperitoneally injisert sterilt saltvann av 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine. Videre til følgende trinn når musen ikke lenger reagerer på stimuli (dvs. fravær av pedal uttak refleks), som vanligvis oppstår innen 5 til 10 min etter injeksjon.
- Etter dispensing smøremiddel på en bomull-tipped applicator, forsiktig gjelder øyne og plassere musen i supine posisjon på scenen. Bedøvet dyr holdes på varm overflate.
Merk: Alle trinnene utføres ved romtemperatur. - Sikre nese, lemmer, og halen på scenen med kirurgisk tape.
- Rengjør og våt halsen med en alkohol-tørke.
Merk: Dette vil forhindre pels inn påfølgende snitt. - Heve ventrale midtlinjen halsen huden med tang, gjøre en liten, overfladiske kutt med dissecting saks. Guide saksen inn i åpningen og åpne sakte bladene subcutaneously å skille vev fly.
- Holde huden hevet, nøye beskjært til 1 cm nedenfor munningen.
- Foreta to laterale snitt på de underlegne og overlegen aspektene av det første kuttet. Ved hjelp av pinsett, forsiktig gjenspeile bort huden for å aktivere tilgang til hodet og nakken strukturer.
- Bruk av dissecting mikroskopet på 8 X forstørrelse, visualisere submandibular kjertler (midtlinjen: figur 1).
- Bruke fine tang, løft kjertel å avsløre fire infrahyoid (REM) musklene overliggende luftrøret. Unngå rive eller forstyrre det omkringliggende blodkar eller excretory kanaler.
- Hvis samler spytt fra mer enn én mus, gjentar du trinnene 2.1-2.10 med hver musen før du fortsetter.
Merk: Denne fremgangsmåten kan utføres sikkert på opp til 5 mus samtidig. - Med liten dissecting saks, fjerne den mediale delen av stroppen muskler mens du bor så nær midtlinjen som mulig. Kuttet bare som nødvendig for å visualisere trachea og holde stroppen muskler ut av veien under prosedyren. Unngå skår alle nærliggende fartøy fordi hvis det er volum uttømming sekundært til betydelig blødning, pilokarpin ikke vil være effektiv på inducing sekret.
- Gjenspeile stroppen musklene fra luftrøret.
- Visualisere strupehode, trachea og skjoldbruskkjertelen. Kontroller at luftrøret er klar av overliggende vev.
- Gjøre en horisontal snitt i luftrøret mindreverdig/bakre til skjoldbrusk med liten dissecting saks. Kontroller at luftveiene er patent og klar væske.
3. spytt samling
- Fjerne tapen nær munnen og vinkel disseksjon scenen nedover (45°, cranially) å hjelpe med spytt flyt.
- Bruke en 0,5 mL sprøyte med 29G x ½" nål, utføre intraperitoneal injeksjon av 10 µL/g kroppen vekt pilokarpin for en total dose av 100 mg/kg.
- Start en tidtaker. Hvis dosering flere mus, redusere leveringstiden beveger seg raskt og har en assistent som samtidig injisere gjenværende musene.
- Bruker standard tang, åpen munn kapillær tube tilgang.
- Når en perle av spytt er observert i munnen, plasser den proksimale enden av kapillær røret til væsken, med den klubbeformede enden plassert i en samle tube plassert nedenfor dissecting scenen (begge rør pre veide).
Merk: C57/BL6 kvinnelige mus 6-10 ukens av alderen, brutto spyttsekresjon oppstår innen 2 min pilokarpin injeksjon. - Hvis spytt bygning i munnen, men ikke strømmer gjennom røret, reattempt forrige trinn. Kontroller at røret ikke er plassert direkte mot en slimhinnen, som kan hindre innløpet.
- Samle spytt totalt 12 minutter etter pilokarpin stimulering. Påse at stomi klart.
Merk: Økt Tidalvolum og sekreter (salivary, urin, avføring) er vanlig i denne perioden. - Hvis mus har deprimert spytt funksjonen (f.eks., på grunn av skade eller intervensjon), overføre gjenværende væsken fra munnen til samling røret med P200 brønnene. Hvis samle fra flere mus, må du kontrollere at tips endres.
- Registrere vekten innsamlede spytt pluss rør 12 minutter etter pilokarpin injeksjon.
4. kjertel disseksjon
- Euthanize mus av CO2 euthanasia (som beskrevet i AVMA retningslinjene for Euthanasia av dyr: 2013 Edition) etterfulgt av thoracotomy, ta vare for å bevare strukturer av hodet. Derfor unngå cervical forvridning som en metode for euthanasia.
- Plass musen i supine posisjon på scenen. Omplasser kjertler i det opprinnelige området over luftrøret (figur 1).
- Bruke dissecting mikroskop under 8 X forstørrelse, visualisere store kjertler: PG, SMG og SLG. For å skille kjertler under dissection, identifisere at PG er diffust, ligger lateralt SMG og SLG.
Merk: Hvis dissekere PG, dette bør gjøres først fordi det er den minste definert og mest sannsynlig vil bli revet. - Hold halen av PG med tang, trekke det fra underliggende strukturer, og forsiktig gjelder spenning før kutte hodet av PG med dissekere saks.
- Brudd kapselen rundt SMGs ved hjelp av pinsett. Forsiktig separat venstre og høyre SMG.
- Gratis dorsal aspekt av SMG fra overholdt nonglandular vev ved hjelp av pinsett.
- Fjern SMG fra halsen ved å tegne Wharton's duct stram med tang og kutte kanalens med dissekere saks.
- Forsiktig skille SLG fra SMG ved hjelp av pinsett.
Merk: SLG er i det superolateral aspektet ved SMG. - Bruker en analytisk balanse, registrere SMG vekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når utfører høy dose pilokarpin stimulert spytt samling, er det viktig å opprettholde airway å hindre aspirasjon eller choking fra sekreter i munnhulen. En skjematisk av tracheostomi tilbys (figur 1). Etter tracheal snitt, må stomi være klar av vev og væsker.
For å styrke capillary handling under spytt samling, skal mus plasseres med hodet nedover i 45° vinkel. Denne fremgangsmåten kan utføres på > 1 mus, men det ikke anbefales å overskride 5 mus samtidig (figur 2). Når samlingen er fullført, anbefales det at rør veies raskt for å unngå fordamping tap.
Etter spytt samling, mus er euthanized. Cervical forvridning bør ikke utføres, da dette kan skade hodet og nakken strukturer. Mus returneres til dissecting scenen, og kjertler bør plasseres over luftrøret, som opprinnelig plassert. Kjertel disseksjon (Figur 3) bør begynne med PG, både sin posisjon og diffus konsistens. Den SMG og SLG er fast, og kan fjernes lett.
Etter 4 fraksjoner av 6.85 Gy stråling til murine SMG, spytt funksjonen betydelig reduseres med 2 uker (Figur 4). Begge totalt spytt sekresjon, og sekresjon normalisert kjertel våt vekt var plottet. Bruker enten metriske, reduseres salivary funksjonsevne, som forventet, to uker etter bestråling24.
Kjertel vev kan være faste og inndelte for histologiske flekker og/eller immunohistochemistry. Hematoxylin og Eosin flekker (H & E) viser lignende brutto SMG arkitektur både med eller uten pilokarpin stimulering (figur 5). Flekker for Nkcc1, viser en membran kalium natriumklorid transporter, lignende celle morfologi uansett pilokarpin stimulering (figur 6).
Figur 1 . Tracheostomi skjematisk. (A) etter åpning nakken regionen, visualisere store strukturer. (B) for å fullføre en tracheostomi, forsiktig løfte, men ikke ta, SMGs uten å forstyrre nærliggende strukturer, inkludert blod forsyning, gir og excretory kanaler. Kuttet stroppen musklene å avsløre tracheal brusk før et snitt inn i luftrøret. La SMG og luftrøret eksponert under hele spytt datainnsamling prosedyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Spytt samling. Pilokarpin stimulering, vinkel mus nedover og samle spytt gjennom kapillære rør i pre vektet samling rør, som er plassert under disseksjon scenen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Store salivary kjortelen disseksjon. Når mus ha blitt euthanized, flytte og separate SMG venstre og høyre. Forsiktig skille hver kjertel fra rundt nonglandular vev og blod fartøy. PG er en diffus, lateral struktur. Den SMG og SLG sammenføyes, men kan være rent atskilt med tang. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Representant sekresjon data. To uker etter fraksjonert stråling (4 doser av 6.85 Gy) til SMG, ble pilokarpin-stimulert spytt sekresjon målt. Salivary funksjonen rapporteres som totalt spytt volum (A) og total spytt volum (B) normalisert til SMG våt totalvekt. Som forventet, det er en betydelig reduksjon i den funksjonelle kapasiteten til SMG (mener ± SD **p < 0,01 med tosidig kort t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Hematoxylin og Eosin SMG flekker. SMG vev ble høstet fra en mus etter pilokarpin stimulering (100 mg/kg, høyre) sammenlignet med kontroll, ubehandlet musen SMG (til venstre). H & E flekker viser brutto kjertel strukturen på 10 X (skala barer: 200 µm) (A, B) og 40 X (skala barer: 50 µm) (C, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Nkcc1 SMG Immunohistochemistry. SMG vev ble høstet fra en mus etter pilokarpin stimulering (100 mg/kg, høyre) sammenlignet med kontroll, ubehandlet musen SMG (til venstre). Nkcc1 er en membran protein og kan brukes til å evaluere mobilnettet morfologi. DAPI brukes som en kjernefysisk counterstain (skala barer: 75 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en må metode for å vurdere salivary kjortelen funksjonen, hvilke kan brukes for å studere kjertel skade og therapeutics. Våre prosedyren innebærer tracheostomi, spytt samling og kjertel disseksjon, hver har eksperimentell programmer som støtter en integrert studie av salivary kjortelen biologi. For eksempel har murine tracheostomi blitt brukt for generelle airway ledelse under prosedyrer hindrer munnhulen.
Riktig disseksjon tracheal snitt kreves og pilokarpin stimulert spytt sekresjon ved 100 mg/kg. Alternativt en redusert pilokarpin dose kunne unngå behovet for tracheostomi og derfor brukes for langsgående vurdering av spytt sekresjon16.
I tillegg opptak spytt sekresjon, gir denne protokollen også en nøyaktig, konsekvent måte å samle spytt for ytterligere analyser. Slike studier er Reologi, Proteomikk, enzym aktivitet, spytt osmolaritet25,26,27og biomarkør oppdagelsen28,29.
Endelig har standardisert disseksjon metoder for store spyttkjertler verktøyet utover spytt samling. Det er en interesse i å forstå kjertel utvikling og svar på skader. For effektiv undersøkelser er det viktig å utføre konsekvent, ren disseksjoner av store spyttkjertler. Ren og effektiv kjertel isolasjon er avgjørende for kulturer stammer fra primær celler som er mekanisk og enzymatisk atskilt fra de store spyttkjertler30,31, og for histologic og immunohistochemical forberedelser. Videre, når flekker for utskilles proteiner i kjertel vev deler, er det viktig å vurdere og kontrollere for sannsynlig uttømming av disse produktene etter stimulert spytt samling.
Kvantifisere salivary kjortelen funksjon i undersøkelser av skade eller intervensjon er en viktig eksperimentelle teknikk. Kjertel histologi er informativ og kan framprovosere viktige observasjoner, men konklusjoner støttes beste klar funksjonelle data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av det nasjonale Institutt for Dental og Craniofacial forskning (NIDCR) og National Cancer Institute (NCI) av National Institutes of Health under prisen nummer R56 DE025098, UG3 DE027695 og F30 CA206296. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health. Dette arbeidet ble også støttet av NSF DMR 1206219 og IADR-innovasjon i muntlig bekymre Award (2016).
Vi vil gjerne takke Dr. Eri Maruyama og Andrew Hollomon for deres hjelp med spytt samling. Vi vil gjerne takke Pei-Lun Weng for hans hjelp med kjertel disseksjon. Vi vil gjerne takke Matthew Ingalls for hans hjelp figur forberedelse. Vi vil gjerne takke Dr. Elaine Smolock og Emily Wu for kritisk lesning av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
- Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
