Summary
Apresentamos uma abordagem detalhada para realizar coleta de saliva, incluindo murino traqueostomia e o isolamento dos três glândulas salivares maiores.
Abstract
Hipossalivação é comumente observada na reação auto-imune da síndrome de Sjögren ou seguir lesão de radiação para as glândulas salivares maiores. Nestes casos, perguntas permanecem sobre a patogênese da doença e de intervenções eficazes. A técnica otimizada que permite a avaliação funcional das glândulas salivares é inestimável para investigação terapêutica, disfunção e biologia de glândula exócrina. Aqui, apresentamos uma abordagem passo a passo para executar pilocarpina estimulou a secreção de saliva, incluindo a traqueostomia e a dissecação das três principais murino glândulas salivares. Também detalhamos a anatomia cabeça e pescoço murino apropriada acessada durante estas técnicas. Esta abordagem é escalável, permitindo vários mouses para serem processados simultaneamente, melhorando assim a eficiência do fluxo de trabalho. Nosso objetivo é melhorar a reprodutibilidade destes métodos, cada qual tem mais aplicativos dentro do campo. Além da recolha de saliva, discutimos métricas para quantificar e normalizando a capacidade funcional desses tecidos. Dados representativos são incluídos a partir de glândulas submandibulares com função deprimida glândula salivar 2 semanas seguintes à radiação fracionada (4 doses de 6.85 Gy).
Introduction
Distúrbios da glândula salivar incluem síndromes de desregulação ou secreção prejudicada, levando a subprodução (xerostomia e hipossalivação) de saliva1ou superprodução (sialorrhea). Em ambos os casos, há interesse em melhorar a nossa compreensão da biologia da glândula salivar com o objectivo final de desenvolvimento terapêutico2.
As glândulas salivares são órgãos altamente radiosensitive e muitas vezes são danificadas durante a radioterapia de câncer de cabeça e pescoço, levando a permanente boca seca (xerostomia)3,4. Ao contrário de outros tecidos radiosensitive, no entanto, a taxa de rotatividade das glândulas salivares é relativamente baixa, e o mecanismo de perda secretora é mal compreendido5,6. Neste cenário de lesão única, estratégias de regeneração e protecção contra as radiações de tecido requerem avaliação funcional salivar. Experimentalmente, coleta de saliva murino é uma ferramenta particularmente valiosa em avaliar a resposta de glândula a radiação e agentes terapêuticos.
Aqui, apresentamos um método para executar e quantificar a secreção de saliva estimulada usando pilocarpine, um potente agonista muscarínico7. Pilocarpina estimula o sistema nervoso autônomo para induzir a secreção de glândula8,9. Para completar este teste apropriadamente, uma traqueostomia é necessária para garantir que o rato mantém uma via aérea patente durante todo o procedimento e para reduzir os riscos de asfixia e aspiração de secreções em pool na cavidade oral10.
Este é um procedimento terminal, culminando na remoção de uma das três principais glândulas salivares: as parótidas (PG), a submandibular (SMG) e a sublingual (SLG). Para estudos funcionais, glândula pesos são registados e são frequentemente usados para normalizar a saliva medição11,12,13. Este dados são particularmente importantes em estudos de radiação, em que a atrofia da glândula é um resultado esperado14,15
Há variabilidade na literatura em relação à secreção de saliva como estimulada é executada e relatou16. Por exemplo, doses de pilocarpina dentro da literatura extensão pelo menos três ordens de magnitude17,18,19,20,21,22,23. Aqui, apresentamos um protocolo de pilocarpina otimizada de alta dose com a intenção de melhor reprodutibilidade na execução do método, bem como fornecendo uma plataforma modular de técnicas (traqueostomia, coleta de saliva e dissecação de glândula) que pode ser adaptado como precisava.
Além de demonstração de protocolo, incluímos dados funcionais representativos do fluxo de saliva em 2 semanas seguintes à radiação fracionada (4 doses de Gy 6.85) para a região SMG.
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Protocol
Todos na vivo os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pela Comissão Universidade recursos animais na Universidade de Rochester, Rochester. NY.
1. preparação
- Usando uma balança analítica, pese 20 mg de pilocarpina. Dissolvê-lo em 2 mL de solução salina estéril em um tubo de microcentrifugadora.
Nota: Porque pilocarpina é sensível à luz e perde atividade ao longo do tempo, esta solução deve ser preparada no dia da injeção e protegida da luz até administrado. - Usando uma balança analítica, pesar e identificar todos os tubos de coleção e capilares de vidro. O número de tubos de coleção e capilares de vidro deve corresponder ao número de ratos.
2. traqueostomia
- Pese de camundongos C57/BL6 usando uma balança analítica.
- Utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 29 x ½", anestesia os ratos com uma solução salina estéril intraperitonealmente injetado de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Prossiga para a etapa seguinte quando o mouse não responde mais aos estímulos (ou seja, ausência do reflexo de retirada de pedal), que geralmente ocorre dentro de 5 a 10 min após a injeção.
- Depois da preparação de lubrificante em um aplicador com ponta de algodão, delicadamente aplicam-se aos olhos e posicione o mouse em uma posição supina no palco. O animal anestesiado deve ser mantido na superfície quente.
Nota: Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente. - Proteger o nariz, os membros e cauda no palco usando fita cirúrgica.
- Limpar e molhar a garganta com uma compressa com álcool.
Nota: Isto vai ajudar a impedir a entrada de incisões subsequentes de peles. - Levantar a pele do pescoço na linha média ventral com fórceps, fazer um corte pequeno, superficial, usando tesouras de dissecação. Orientar a tesoura na abertura e abra lentamente as lâminas por via subcutânea para separar tecido aviões.
- Mantendo a pele levantada, cuidadosamente, corte 1 cm abaixo da boca.
- Faça duas incisões laterais em aspectos inferiores e superiores do primeiro corte. Usando fórceps, delicadamente afastado refletem a pele para permitir o acesso a estruturas de cabeça e pescoço.
- Usando o microscópio de dissecação na ampliação de X 8, Visualizar as glândulas submandibulares (mediana: Figura 1).
- Usando a pinça fina, levante suavemente as glândulas para expor os quatro músculos infra-hioideos (cinta) sobrejacente a traqueia. Evite rasgar ou interromper a vasculatura circundante ou ductos excretores.
- Se a coleta de saliva de mais de um rato, repita passos 2.1-2.10 com cada rato antes de continuar.
Nota: Este procedimento pode ser realizado com segurança em até 5 ratos simultaneamente. - Com tesouras pequenas de dissecação, remova a porção medial dos músculos enquanto permanecer tão próximo quanto possível na linha mediana. Só corte quanto for necessário para visualizar a traqueia e manter músculos fora do caminho durante o procedimento. Evite roubar qualquer navios nas proximidades, porque se houver depleção de volume secundário a hemorragia significativa, a pilocarpina não será eficaz na indução de secreção.
- Refletem os músculos da cinta da traqueia.
- Visualize a laringe, traqueia e glândula tireoide. Certifique-se de que a traqueia é clara de sobrejacente tecido.
- Faça uma incisão horizontal na traqueia inferior/posterior a tireoide usando tesouras pequenas de dissecação. Certifique-se de que as vias aéreas é patente e clara de fluido.
3. saliva coleção
- Remova a fita perto palco de dissecação boca e ângulo para baixo (45°, cranialmente) para ajudar com o fluxo de saliva.
- Utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 29 x ½", execute a injeção intraperitoneal de 10 pilocarpina de peso de corpo µ l/g para uma dose total de 100 mg/kg.
- Inicie um timer. Se vários mouses de dosagem, reduza o tempo de chumbo movendo-se rapidamente e por ter um assistente injetar simultaneamente os ratos restantes.
- Usando pinças padrão, abra a boca para acesso de tubo capilar.
- Depois de observa-se uma gota de saliva na boca, coloca a extremidade proximal do tubo capilar no fluido, com a extremidade distal, colocada em um tubo de coletando posicionado abaixo do palco dissecação (ambos os tubos pre-pesados).
Nota: Em ratos fêmeas C57/BL6 6-10 semanas de idade, salivação bruta ocorre dentro de 2 min de injeção de pilocarpina. - Se saliva está construindo na boca, mas não flui através do tubo, tente novamente o passo anterior. Certifique-se de que o tubo não é colocado diretamente contra uma superfície da mucosa, que pode obstruir a entrada.
- Colete a saliva para um total de 12 min após estimulação de pilocarpina. Garantir que o estoma permanece claro.
Nota: Aumento do volume tidal e secreções (salivares, urinárias, fecais) são normais durante este tempo. - Se os ratos têm deprimido função de saliva (ex., devido a lesão ou a intervenção), transfira o líquido restante da boca para o tubo de coleta usando uma micropipeta P200. Se a recolha de vários mouses, certifique-se de que as dicas são alteradas.
- Registro do peso da saliva coletada mais tubos de 12 min após a injeção de pilocarpina.
4. a glândula dissecação
- Eutanásia em ratos pela eutanásia de CO2 (conforme descrito nas orientações AVMA para eutanásia de animais: edição de 2013) seguido por toracotomia, tendo o cuidado de preservar as estruturas da cabeça e do pescoço. Por esta razão, evite deslocamento cervical como um método de eutanásia.
- Coloque o mouse em uma posição supina no palco. Reposicione as glândulas no site original sobre a traqueia (Figura 1).
- Usando um microscópio dissecação sob magnificação de X 8, Visualizar as glândulas maiores: o PG, SMG e SLG. Para distinguir as glândulas durante a dissecção, identifica que o PG é difuso, lateral para a SMG e SLG a mentir.
Nota: Se a dissecar o PG, isto deve ser feito primeiro porque é o menos definidas e mais susceptível de ser rasgado. - Agarrar a cauda do PG com fórceps, puxando-o longe de estruturas subjacentes e aplicar suavemente a tensão antes de cortar a cabeça do PG com tesoura de dissecação.
- Ruptura da cápsula que rodeia os SMGs usando fórceps. Separe delicadamente SMG a torto e a direito.
- Livre o dorso da SMG de tecido nonglandular aderido, usando fórceps.
- Remova o SMG do pescoço pelo ducto de Wharton tenso de desenho com fórceps e cortar o duto com tesoura de dissecação.
- Suavemente separa o SLG a SMG usando fórceps.
Nota: A SIG é o aspecto súpero a SMG. - Usando uma balança analítica, pesos registros de SMG.
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Representative Results
Quando realizar pilocarpina dose alta estimulada coleta de saliva, é importante manter as vias aéreas para evitar aspiração ou asfixia de secreções na cavidade oral. Um esquema da traqueostomia é fornecido (Figura 1). Após incisão traqueal, o estoma deve ficar claro de tecidos e fluidos.
Para aprimorar a ação capilar durante a coleta de saliva, ratos devem ser posicionados de cabeça para baixo em um ângulo de 45°. Estas etapas podem ser executadas em > 1 rato, embora não se recomenda exceder 5 ratos simultaneamente (Figura 2). Concluída a coleta, é recomendado que tubos ser pesados rapidamente para evitar perdas por evaporação.
Após a coleta de saliva, os ratos são sacrificados. Deslocamento cervical não deve ser realizado, pois poderá danificar as estruturas de cabeça e pescoço. Os ratos são retornados para a fase de dissecação, e as glândulas devem ser reposicionadas sobre a traqueia, como originalmente localizado. Dissecação da glândula (Figura 3) deve começar com o PG, devido à sua posição e a consistência difusa. O SMG SLG são firmes e pode ser removido facilmente.
Após 4 fracções de 6.85 Gy radiação para a SMG murino, função de saliva diminui significativamente por 2 semanas (Figura 4). Ambos total de secreção de saliva e secreção normalizada ao peso molhado glândula foram plotados. Usando qualquer métrica, capacidade funcional salivar é reduzida, como esperado, em 2 semanas após irradiação24.
Tecido da glândula pode ser fixas e seccionadas para manchas histológicas e/ou imuno-histoquímica. Hematoxilina e eosina, coloração (H & E) mostra semelhante bruto arquitetura SMG com ou sem estimulação pilocarpina (Figura 5). Coloração para Nkcc1, um transportador de membrana de cloreto de sódio-potássio, mostra semelhante morfologia celular independentemente da estimulação de pilocarpina (Figura 6).
Figura 1 . Traqueostomia esquemática. (A) depois de abrir a região do pescoço, visualize as estruturas importantes. (B) para completar uma traqueostomia, suavemente levantar, mas não separar, os SMGs sem interromper a estruturas vizinhas, incluindo o fornecimento de sangue, inervação e ductos excretores. Corte os músculos da cinta para expor a cartilagem traqueal antes de fazer uma incisão na traqueia. Deixe SMG no lugar e expostos durante o procedimento de coleta de saliva toda a traqueia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Coleta de saliva. Após a estimulação de pilocarpina, ângulo de ratos para baixo e coletar saliva através de tubos capilares em tubos de coleção pré-pesados, que são colocados abaixo do palco de dissecação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Principais glândulas salivares dissecação. Uma vez que os ratos têm sido sacrificados, reposicionar e separar a SMG esquerdo e direito. Separe com cuidado cada glândula de tecidos nonglandular e vasos sanguíneos circundantes. O PG é uma estrutura difusa, lateral. O SMG e SLG são Unidas, mas podem ser separadas de forma limpa com fórceps. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Dados do representante secreção. Duas semanas após radiação fracionada (4 doses de Gy 6.85) para a SMG, secreção de saliva estimulada de pilocarpina foi medida. Função salivar é relatada como o volume de saliva total (A) e o volume total de saliva (B) normalizado para SMG molhado peso total. Como esperado, há uma diminuição significativa da capacidade funcional da SMG (média ± DP * *p < 0,01 usando bicaudal pareado t-teste). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Hematoxilina e eosina SMG manchando. Tecido SMG foi colhido de um rato após estimulação de pilocarpina (100 mg/kg, direita), comparado ao controle, o rato não tratado SMG (à esquerda). Coloração H & E mostra a estrutura bruta glândula em 10 X (escala bares: 200 µm) (A, B) e 40 X (escala bares: 50 µm) (C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Imuno-histoquímica SMG Nkcc1. Tecido SMG foi colhido de um rato após estimulação de pilocarpina (100 mg/kg, direita), comparado ao controle, o rato não tratado SMG (à esquerda). Nkcc1 é uma proteína de membrana e pode ser usado para avaliar a morfologia celular. DAPI é usado como um corante de contraste nuclear (escala bares: 75 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos um método várias etapas para avaliar a função de glândula salivar, que pode ser aplicada para estudar terapêutica e lesão da glândula. Nosso procedimento envolve a traqueostomia, coleta de saliva e dissecação de glândula, cada qual com aplicações experimentais que podem suportar um estudo integrado da biologia de glândula salivar. Por exemplo, traqueostomia murino tem sido usada para gestão geral das vias respiratórias durante os procedimentos de obstruir a cavidade oral.
Adequada dissecção e incisão traqueal são necessários para pilocarpina estimulou a secreção de saliva em 100 mg/kg. Alternativamente, uma dose reduzida de pilocarpina pode evitar a necessidade de traqueostomia e, portanto, ser utilizada para avaliação longitudinal de saliva secreção16.
Além de gravar a secreção de saliva, este protocolo também oferece um meio exato, consistente para coletar saliva para análises adicionais. Tais estudos incluem a reologia, proteômica, atividade enzimática, saliva osmolaridade25,26,27e biomarcador descoberta28,29.
Finalmente, métodos de dissecação padronizado para as glândulas salivares maiores têm utilidade além da coleta de saliva. Há um interesse em compreender o desenvolvimento da glândula e resposta à lesão. Para investigações eficazes, é importante realizar dissecações consistentes, limpas das glândulas salivares maiores. Limpar e glândula eficiente isolamento é crítico para as culturas derivadas de células primárias que são mecanicamente e enzimaticamente dissociadas da glândulas salivares maiores30,31e para histológico e imuno-histoquímica preparativos. Além disso, quando a coloração para proteínas secretadas em cortes de tecido de glândula, é fundamental considerar e controlar para o provável esgotamento desses produtos após a colheita de saliva estimulada.
Quantificar a função da glândula salivar em investigações de ferimentos ou intervenção é uma técnica experimental vital. Histologia da glândula é informativa e pode eliciar principais observações, ainda conclusões são melhor apoiadas por dados funcionais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (NIDCR) e o National Cancer Institute (NCI) do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R56 DE025098, DE027695 UG3 e CA206296 F30. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este trabalho também foi apoiado pela NSF DMR 1206219 e a inovação IADR no prêmio de cuidado Oral (2016).
Gostaríamos de agradecer o Dr. Eri Maruyama e Andrew Hollomon por sua ajuda com a coleta de saliva. Gostaríamos de agradecer sua assistência com dissecação de glândula Pei-Lun Weng. Gostaríamos de agradecer a Matthew Ingalls por sua assistência na preparação de figura. Gostaríamos de agradecer o Dr. Elaine Smolock e Emily Wu para leitura crítica deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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