Summary
Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.
Abstract
Gabaérgica interneurônios (INs) são componentes críticos de redes neuronais que orientam o comportamento e cognição. INs, destinado a preencher o córtex tangencialmente migrar do seu local de origem no telencéfalo ventral (incluindo das Eminências medial e caudais ganglionar (MGE, CGE)) para a placa cortical dorsal em resposta a uma variedade de intrínsecos e extrínsecos sugestões. Diferentes metodologias foram desenvolvidas ao longo dos anos geneticamente manipular percursos específicos e investigar como eles regulam as alterações do citoesqueleto dinâmicas necessárias para adequado em migração. No utero electroporation tem sido extensivamente usado para estudar o efeito da repressão do gene ou superexpressão no específico em subtipos durante a avaliação do impacto sobre a morfologia e a posição final. No entanto, enquanto essa abordagem é facilmente usada para modificar radialmente migração células piramidais, é mais tecnicamente desafiador quando direcionamento ins no utero electroporation gera um baixo rendimento, tendo em conta as taxas de sobrevivência diminuída dos filhotes quando eletroporação é realizada antes de e14.5, como é habitual quando estudando MGE-derivado INs. Em uma abordagem alternativa, MGE explantes proporcionam fácil acesso para o MGE em facilitam a imagem de INs geneticamente modificados. No entanto, nesses explantes, INs migrar para uma matriz artificial, desprovida de pistas de orientação endógena e entradas talâmicos. Isto nos levou a otimizar um método onde INs pode migrar em um ambiente mais naturalista, ao contornar os desafios técnicos das abordagens no útero . Neste trabalho, descrevemos a combinação de ex utero electroporation do cérebro embrionário do mouse seguido de culturas de fatia organotypic facilmente rastrear, imagem e reconstruir geneticamente modificados INs migrando ao longo de seus caminhos naturais em resposta a cues endógenas. Esta abordagem permite tanto a quantificação dos aspectos dinâmicos na migração com imagem latente confocal lapso de tempo, bem como a análise pormenorizada dos vários parâmetros morfológicos usando reconstruções neuronais no tecido fixo immunolabeled.
Introduction
Cortical gabaérgica interneurônios (INs) são diversos em relação a suas propriedades bioquímicas, propriedades fisiológicas e conectividade, e eles medeiam funções diferentes em redes maduro1,2,3 ,4,5. A especificação de diferentes subtipos de INs cortical é fortemente regulamentada através de cascatas genéticas que têm sido extensivamente estudados1,2. A maioria (70%) cortical gabaérgica INs originam progenitores em medial Eminência ganglionar (MGE), uma estrutura embrionária localizada ventralmente e deve migrar através de distâncias relativamente longas para alcançar a placa cortical1, 2 , 6. enquanto células piramidais corticais radialmente migram da zona ventricular (VZ) para a placa cortical ao longo do andaime glia radial, a migração tangencial do INs, que não estão conectados para tal um andaime, requer uma variedade de intrínsecos e extrínsecas pistas para atrair os neurônios migrando em direção a placa cortical, enquanto orientando-os longe de estruturas não-cortical2,7,8. Depois de sair do ciclo celular, INs são repelidos desde a MGE por quimioterapia-repulsivo pistas expressas dentro o VZ da MGE, que desencadeia a migração tangencial em direção a placa cortical9,10. Migrando INs evitar o striatum com o auxílio de diferentes pistas repulsivo11 e, depois de atingir a placa cortical, eles alternar de um tangencial para um modo de migração radial e atingir a posição final laminar, em parte em resposta às sugestões do piramidal células12 e outras populações celulares13. A migração do INs, quanto a outras populações neuronais, envolve várias mudanças morfológicas dinâmicas para permitir o movimento real do neurônio. Este so-called locomoção neuronal é caracterizada por ciclos repetitivos de três etapas sucessivas: o alongamento de um processo principal, um movimento ativo anterógrada do núcleo (nucleocinese) e a retração do processo à direita14. EM migração é regulada por numerosas pistas intrínsecas e extrínsecas que impulsionam a ramificação e remodelação ativo do processo principal para guiar o INs na direção correta, determinando tanto a orientação e a velocidade de migração14,15 ,16.
Os determinantes de regulação cortical em migração têm sido muito estudados nos últimos anos1,2,7,17,18,19,20, e perturbação em alguns desses atores molecular tem sido postulada para levar a distúrbios de desenvolvimento neurológico, como pediátrica refratário epilepsia ou autismo espectro transtornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por conseguinte, o desenvolvimento de diversas abordagens in vitro e in vivo tem sido exercido para avançar significativamente a nossa capacidade de estudar este processo dinâmico, como anteriormente analisados25. Em vitro métodos, incluindo o ensaio de câmara Boyden e o ensaio de escolha de listra, fornecem os meios mais rápidos e mais reprodutíveis de avaliar a exigência e o impacto célula autónomos de genes específicos ou proteínas durante a migração neuronal, sem a influência de outros fatores,25. Estes ensaios são particularmente úteis quando combinados com imagens live8,26,27. Com estas técnicas, INs são facilmente obtido e13.5 MGE e isolado por dissociação enzimática e mecânica, após o qual podem ser investigados diferentes vias de sinalização e sinais de orientação, como ilustrado anteriormente8,28 . No entanto, estes ensaios ocorrem em uma matriz extracellular artificial na ausência de arquitetura de tecido tridimensional, que pode alterar as propriedades de comportamento e célula neuronais, potencialmente afetando25, de migração e/ou sobrevivência celular. Para contornar essas limitações, ex vivo MGE explantes foram desenvolvidos como uma ferramenta alternativa para quantificar as mudanças morfológicas dinâmicas que ocorrem durante a migração, juntamente com parâmetros como velocidade e orientação14, 29. Geração de explantes MGE é relativamente simples e tem sido extensivamente descrito em outro lugar30. Implica o chapeamento de um pequeno extracto da MGE em uma monocamada de células corticais mistas ou em uma mistura de matrigel e colágeno na presença de sinais atraente ou repulsivo25, embora este último é opcionais31. MGE explantes permitem alta resolução de imagem de células escassamente rotuladas, simplificando o estudo de processos intracelulares, tais como a remodelação do citoesqueleto durante processo líder de ramificação, conforme mostrado anteriormente,32,33 ,34 e no presente estudo. MGE explantes foram usados com sucesso para avaliar alterações do citoesqueleto dinâmicas durante na migração em um ambiente 2D, por exemplo após manipulações farmacológicas ou Quimiotáticos específicas (ver, por exemplo, Tielens et al . 201633) . No entanto, com esta abordagem, INs migrar dentro de uma matriz artificial, e isso pode alterar no comportamento e a reprodutibilidade e o significado dos resultados experimentais.
Por outro lado, no utero electroporation permite a manipulação genética de INs no seu ambiente nativo e é um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a avaliar o impacto do ganho e perda de função dos genes ao contornar as limitações de knockout dispendioso e demorado e bater-se em estratégias de25,35. Electroporation no utero pode ser inclinado para em progenitores utilizando factores específicos de tipo de célula e posicionamento dos eléctrodos para estruturas ventromedial, incluindo o MGE36. Além disso, no utero electroporation permite a expressão oportuna de construções experimentais dentro de 1-2 dias, em comparação com os 7-10 dias necessários para construir a expressão usando viral vectores25. No entanto, no utero eletroporação de em progenitores tende a ser baixo rendimento. Com efeito, apesar de progenitores de célula piramidal localizados na zona dorsal ventricular podem ser eficientemente transfectadas usando no utero electroporation, alvo localizadas ventralmente mais estruturas, tais como o MGE, é mais tecnicamente desafiador, especialmente em pequenas e13.5 embriões e a alta taxa de letalidade embrionária mais reduz o rendimento experimental25.
Para contornar algumas das limitações técnicas associadas com in vitro MGE explant experimentos e na vivo no útero electroporation, ex vivo organotypic fatia culturas foram desenvolvidos8,37,, 38,39. Cérebro organotypic fatia culturas oferta condições a vantagem de imitar em vivo , apesar de ser menos caro e demorado do que animal gerando modelos25. Com efeito, estas preparações permitem um fácil acesso para o MGE, juntamente com a visualização específica de INs e podem ser combinadas com eletroporação focal para investigar as vias moleculares específicas no INs migrando em um mais fisiológica de ambiente8 , 39 , 40 , 41. otimizamos, portanto, uma abordagem por organotypic culturas38, que nós combinamos com ex utero electroporation e imagem latente confocal lapso de tempo, ainda mais, avaliar o processo dinâmico e morfológico ocorrem durante a migração tangencial do MGE-INs. O presente protocolo foi adaptado e otimizado de outros que usaram para estudar a migração de células piramidais42,43 ex utero ou no utero cérebro electroporation e organotypic fatia culturas e cortical INs36,39,44. Especificamente, embriões do rato são decapitados e a MGE é electroporated ex vivo após a injeção intraventricular dos Plasmideos experimentais, permitindo mais eficientes e precisos segmentação dos progenitores MGE do que o que pode ser conseguido com electroporation no útero . O cérebro então é extraído e seccionados em fatias coronais do cérebro inteiro que podem ser cultivadas por alguns dias, permitindo assim contínuo monitoramento e imagem da INs transfectadas. Essa abordagem normalmente rotula INs tangencialmente migrando 5-20 por fatia do cérebro, minimizando o número de iterações experimentais necessária para alcançar significância estatística, enquanto rotular uma população neuronal suficientemente escassa para garantir a fácil separação de neurônios individuais para a reconstrução e a avaliação morfológica bem. Além disso, comparado a MGE explantes, culturas de organotypic garantir que migrando INs estão expostos a um ambiente mais natural, incluindo quimiocinas secretadas localmente e entradas de afferents talâmica. Esta abordagem é, portanto, adequada para quantificar a direcionalidade e migratório caminho adotado pelo INs transfectadas, oferecendo detalhes anatômicos suficientes para permitir a caracterização dos processos dinâmicos mais finas tais como principal processo de ramificação, nucleocinese e retração de processo à direita.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) no centro de pesquisa de Sainte-Justine CHU e foram conduzidos de acordo com o Conselho canadense no guia do cuidado do Animal para o cuidado e o uso de animais experimentais (Ed. 2).
O protocolo descrito aqui foi otimizado para eletroporação de embriões no dia embrionário (e) 13,5, em um momento quando MGE-derivado INs ativamente são gerados, antes do pico da CGE-derivado INs produção45,46. Além disso, para influenciar a eletroporação para gabaérgica INs, usamos um promotor seletivamente expressado em INs (por exemplo, o promotor de Dlx5/6 com sua mínima enhancer)47.
1. preparação de soluções para eletroporação e culturas Organotypic fatia
- Prepare a 125 mL de meio de cultura estéril.
- Medir 125 mL do meio de cultura regular neurônio-específico (ver Tabela de materiais para formulação) em um frasco esterilizado em um armário de biossegurança UV-esterilizados previamente pulverizadas com etanol a 70%. Adicione 2,25 mL de 50 x suplemento isento de soro neurônio específico, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentração final de 0,5 mM) e 6,25 mL de soro de cavalo inactivadas pelo calor anteriormente aliquotado sob condições estéreis. Misture bem, alíquota de 15 mL estéril tubos cônicos e armazenar a 4 ° C.
Nota: O meio de cultura preparado pode ser armazenado por até 3 semanas a 4 ° C. - Dividir uma 100 X solução stock de N-2 formulação48 do Botteinstein em 150 alíquotas µ l em condições estéreis e congelar a-20 ° C até o uso.
- Medir 125 mL do meio de cultura regular neurônio-específico (ver Tabela de materiais para formulação) em um frasco esterilizado em um armário de biossegurança UV-esterilizados previamente pulverizadas com etanol a 70%. Adicione 2,25 mL de 50 x suplemento isento de soro neurônio específico, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentração final de 0,5 mM) e 6,25 mL de soro de cavalo inactivadas pelo calor anteriormente aliquotado sob condições estéreis. Misture bem, alíquota de 15 mL estéril tubos cônicos e armazenar a 4 ° C.
- Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano estéril (ACSF) artificial.
- Medir a 800 mL de água destilada num copo de 1 L. Adicionar 25,67 g de sacarose, 5,08 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,18 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 1,80 g de glicose, 0,19 g de cloreto de potássio (KCl), 0,15 g de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), 1 mL de estoque 1 M CaCl2 .2H2O e 2 mL de 1m estoque MgSO4.7h2O. mexa para dissolver à temperatura ambiente. Adicionar água destilada para alcançar um volume total de 1 L.
- Usando um filtro de 0,22 µm, filtrar a solução em um frasco estéril em um armário de biossegurança esterilizado e armazenar a 4 ° C por até 1 mês.
- Prepare uma solução fresca de 4% de agarose em ACSF antes de cada experimento.
- Medir 25 mL de ACSF previamente preparado em um tubo cônico estéril de 50 mL e adicionar 1 g de agarose de ponto baixo ponto de fusão.
- Calor para 45 s em um forno de microondas. Para evitar derramamento, interromper a cada 3-4 s de aquecimento, quando começa a ferver, abrir o tubo para que deixe a pressão sair, fechá-la novamente e agitar manualmente para misturar o agarose. Repita até que a solução de agarose é homogênea. Manter a solução de agarose a 42 ° C durante o restante do experimento para evitar a solidificação.
Nota: Temperaturas mais altas irão danificar tecidos cerebrais.
2. preparação de plasmídeos para injeção
- Puxe uma pipeta de microinjeção de vidro
- Definir o extrator de micropipeta com os parâmetros adequados, garantir o capilar de vidro no espaço fornecido e verifique se que está centrado com o filamento.
- Pressione o botão de puxar.
- Retire cuidadosamente as pipetas recém-feitos microinjeção do extrator de calor e coloque em uma caixa ou um prato de petri limpo até mais uso para não danificar a ponta.
- Set-up a biossegurança do armário com todos os instrumentos necessários para este experimento (ver figura 1A), pulverize generosamente todos os instrumentos no armário a biossegurança com etanol a 70% e esterilizar os instrumentos e o ambiente com luz UV de 15-20 min.
- Durante a etapa de esterilização, descongele plasmídeos no gelo (4 ° C).
- Medir 10 µ l do plasmídeo de uma solução stock (4 µ g / µ l) para um tubo de centrifugação limpa 1,5 mL. Adicione 0,01% de verde rápido FCF. Misture delicadamente, girar rapidamente e manter no gelo até o uso.
Nota: Maxi-prep DNA deve ser preparado de acordo com o protocolo do fabricante através do kit livre de endotoxinas maxi-prep. DNA pode ser solubilizado em tampão TE ou livre de nuclease H2O e a elaboração do plasmídeo com tintura solução pode, mas não precisam ser realizadas em condições assépticas. Plasmídeos de Maxi-prep devem ser aliquotados para evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento. Plasmídeos aliquotados devem ser misturados com o corante não mais que 2 h antes da utilização e não devem ser recongelados para utilização posterior. - Após a esterilização, prepare o nano-injector como segue.
- Escolha um da pipeta de microinjeção de vidro previamente preparada armazenada em uma caixa limpa ou placa de Petri e uso uma pinça pequena cortar a ponta da pipeta de forma chanfrada para atingir um diâmetro externo de aproximadamente 15 µm.
Nota: O diâmetro exterior dado aqui é uma medida aproximada, para dar ao usuário uma ideia do que usamos em nossas experiências e foi otimizado para facilitar a perfuração do crânio para a injeção do plasmídeo sem danificar o cérebro, permitindo que o fluido carregamento e liberação do DNA. O diâmetro exterior pode ser medido por olhar para a ponta de corte da pipeta vidro microinjeção apposed a uma barra de escala micrométrica sob um microscópio de campo claro. - Use uma seringa para encher a micropipeta com óleo mineral de sua extremidade unpulled (para expelir o ar).
- Inserir a micropipeta de vidro preenchida em nano-injector, seguindo as instruções do fabricante.
- 2/3rds vazio da micropipeta de vidro (mantendo o óleo suficiente para impedir a entrada de ar).
- Escolha um da pipeta de microinjeção de vidro previamente preparada armazenada em uma caixa limpa ou placa de Petri e uso uma pinça pequena cortar a ponta da pipeta de forma chanfrada para atingir um diâmetro externo de aproximadamente 15 µm.
- Cuidadosamente Introduza a micropipeta preparada no tubo que contém a solução de tintura/plasmídeo e encher a micropipeta de vidro com a solução de tintura/plasmídeo.
3. coleta de embriões de rato de fêmeas grávidas
- Monitorar fêmeas reprodutoras diariamente para avaliar plugging vaginal, de preferência ao mesmo tempo diariamente (no início da tarde). Dia e0.5 corresponde ao primeiro dia quando um plugue vaginal é observado.
Nota: Os experimentos descritos aqui podem ser conduzidos em ratos do selvagem-tipo. No entanto, para facilitar a identificação da MGE e rotular todos gabaérgica INs (ou sub-conjuntos específicos tais como MGE-derivado INs), animais transgénicos podem ser usados (por exemplo: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre com um alelo de Cre-repórter, de47,etc.49). Nesta situação, o plasmídeo experimental injetado deve expressar fluoróforo outro (por exemplo mCherry ou TdTomato) para permitir a visualização do INs transfectadas (amarelo) que podem ser comparados com não-transfectadas INs (verde). - Sacrifica a fêmea no e13.5 dia embrionário, pela luxação do pescoço.
Nota: Dados no momento do sacrifício de agentes anestésicos podem impactar na migração e sobrevivência de50,51 e devem ser evitados. - Colete embriões por cesariana como segue.
- Pulverize generosamente o abdômen feminino com etanol a 70%. Puxe a pele abdominal com um par de Pinças esterilizadas e, com a outra mão, use tesoura cirúrgica esterilizada para cortar a pele do abdômen.
- Com um segundo par de Pinças esterilizadas e tesoura, puxe a fáscia abdominal e cortá-la, cuidadosamente, evitando o útero.
- Usando um terceiro par de Pinças esterilizadas e tesoura, puxe os cornos uterinos e cortá-los fora da cavidade pélvica. Coloque os cornos uterinos dissecados em um prato de petri estéril-60mm repleto de neural com base em meio de cultura suplementado com aminoácidos, vitaminas e sais inorgânicos (consulte Tabela de materiais para produto comercialmente disponível).
- Em uma armário de biossegurança estéril, use dois pares de pinças bem (um em cada mão) para dissecar os embriões fora da placenta e isolar as cabeças por decapitação.
- Bisel-corte a ponta de uma pipeta de transferência plástico estéril mL 3, aspirar as cabeças e transferência-los em uma nova 60mm Petri estéril em camadas com cera preta solidificada e preenchido com a mesma base neural completado meio de cultura como acima.
Nota: Este passo minimiza a transferência de contaminantes (cabelo de rato, sangue). A cera preta é usada para estabilizar a cabeça durante a dissecção. Meios de cultura não precisa ser oxigenado durante estes procedimentos.
4. intraventricular plasmídeo injeções e eletroporação Ex Vivo do MGE
Nota: As seguintes etapas devem ser executadas sob condições estéreis na armário de biossegurança previamente preparada.
- Lugar de Petri 60mm em camadas com cera preta... e contendo as cabeças decapitadas em neural baseado complementada meio de cultura sob o binóculo no armário a biossegurança.
- Estabilizar a cabeça, a parte rostral virado para a direita, com uma pinça bem com a mão esquerda e use o nano-injector na mão direita para injetar 1-2 µ l da solução de tintura/plasmídeo no ventrículo lateral direito.
Nota: As experiências de expressão co podem ser conduzida por co-electroporating um plasmídeo de resgate e um plasmídeo expressando de shRNA misturando ambos Plasmideos em concentrações equimolar. - Electroporate o cérebro injetado.
- Coloque a cabeça entre os eléctrodos com o elétrodo negativo posicionado dorsalmente e paralelo à cabeça e o eletrodo positivo para o lado ventral da cabeça para direcionar a MGE.
- Uma vez que os eléctrodos estão bem posicionados, entrega 4 pulsos quadrados de 40 V de 50 ms a ms 500 intervalos inter pulso.
- Remova qualquer tecido residual de eletrodos usando uma pinça já colocada na biossegurança do armário.
Nota: Estes parâmetros foram otimizados especificamente para o electroporator usado em nossos experimentos. Recomendamos que os usuários executam testes otimizando previamente se usando um tipo diferente de electroporator. - Repita as etapas 4.1 a 4.3 para todos os cérebros restantes.
Nota: Embora este protocolo descreve as manipulações necessárias para um cérebro, é possível injetar até 4 cérebros sequencialmente antes electroporating cada cérebro, aumentando assim o rendimento. Esta estratégia é especialmente vantajosa quando 2 ou mais diferentes plasmídeos são injetados em sequência (por exemplo, controle ou plasmídeo experimental) durante o mesmo experimento (permitindo a comparação entre littermates). Além disso, é possível injetar e electroporate simultaneamente ambos os lados do cérebro para aumentar o rendimento, pelo posicionamento dos eléctrodos completamente paralelo à superfície do cérebro.
5. cérebro dissecção e culturas Organotypic fatia
- Enquanto ainda manipular no ambiente estéril do armário a biossegurança, disseca o cérebro o crânio.
- Estabilize a cabeça sobre a camada de cera preta, inserindo uma agulha em cada olho, evitando cuidadosamente o cérebro.
- Use um par de pinças bem para manter o lado esquerdo do pescoço e um segundo par de pinças bem para rasgar a pele do crânio, de trás para frente.
- Mantendo a cabeça lateralmente com uma pinça em uma mão, use outro par de pinças na outra mão para corte cuidadosamente o crânio ao nível do tronco cerebral e gentilmente puxe o crânio. Com cada pinça, cortar o crânio no plano sagital (linha média) para a frente e então entalha lateralmente para liberar os fragmentos do crânio.
- Levante o tronco cerebral e corte cuidadosamente as meninges e nervos cranianos até que o cérebro está completamente fora do crânio.
Nota: Todos os passos descritos em 5.1 devem ser realizados em condições assépticas rigorosas em uma armário de biossegurança.
- Incorpore o cérebro em 4% baixo ponto de fusão ponto de agarose para corte.
- Encha um prato de petri 35mm com a solução de agarose preparada acima (mantido líquido a 42 ° C).
- Transferi rapidamente um cérebro de electroporated para o prato cheio de agarose utilizando a pipeta de transferência previamente cortados. Mantenha o prato à temperatura ambiente.
- Misture o agarose com uma vara de metal para manter o cérebro no meio do poço (para evitar o afundamento) e posicionar o cérebro em um avião rostro-caudal paralelo ao prato. Pare de mexer quando a agarose começa a solidificar, para evitar danos cerebrais.
- Use uma lâmina de barbear para cortar o agarose que envolvem o cérebro a fim de formar um bloco retangular, deixando uma margem de 1-2 milímetros ao redor do cérebro. Certifique-se de que a parte rostral do cérebro é perpendicular ao limite anterior do bloco para facilitar a orientação para as etapas subsequentes de corte.
- Repita para cada cérebro.
Nota: É possível cortar mais do que um cérebro de cada vez (máximo 3) por moldar blocos separados de agarose ao definir cada cérebro em alturas diferentes.
- Vibratome secções coronais e cultura de fatia.
- Descongelar uma alíquota de 100 X N-2 complementar (150 µ l) no gelo e adicionar 15 mL meio de cultura aliquotadas sob condições estéreis.
- Transferi 750 µ l de meio de cultura (com 1 suplemento de X N2) para cada poço de uma placa de cultura de 6-poços.
- Com uma pinça curvada, coloque um insert de cultura celular (30 mm de diâmetro, tamanho de poro 0,4 µm, PTFE) em cada meio-cheio bem.
- Encha a banheira de vibratome com ACSF continuamente oxigenado. Refrigerar a 4 ° C com gelo em torno da banheira, ou usar um vibratome refrigerado.
- Defina a velocidade de vibratome para 0,150 mm/s e a frequência de 80 Hertz.
- Cole o bloco de agarose na plataforma vibratome, borda rostral virado para baixo e ventral borda voltada para o usuário.
- Corte o cérebro em secções coronais para obter 250 µm de espessura seções (a 4 ° C).
- Com espátulas esterilizadas, recolha seções de 2-3 que contém a MGE e lugar de inserir todas as seções do cérebro de um animal em uma única membrana de 30 mm, cuidadosamente evitando sobreposição entre seções. Coloque a inserção em um poço de uma placa de cultura de 6-bem (contendo 750 µ l de meio de cultura complementado, como descrito acima). Alternativamente, cada seção pode ser colocada em uma membrana separadas-13 mm de diâmetro em uma placa de cultura 12-bem preenchida com 500 µ l completado meio de cultura. A quantidade de meio de cultura recomendado para cada poço permite que as seções do cérebro para ser alimentada pelos meios de comunicação, sem estar submerso.
Nota: Os passos descritos em 5.3.6 e 5.3.7 não se realizam em condições estéreis completas, a menos que o vibratome pode ser esterilizado e usado em uma armário de biossegurança. Portanto, é crucial realizar estes passos cuidadosamente para evitar qualquer contaminação. Equipamentos de proteção adequado (máscara de limpeza, luvas cirúrgicas e jaleco) devem ser usado em todos os momentos e partes do corpo, mesmo coberto, tais como cabelo, rosto e mãos, nunca deve passar sobre placas de cultura (com ou sem meio de cultura). Também é recomendável para pulverizar o etanol a 70% com frequência nas luvas e espátulas usadas para coletar as seções do cérebro. - Coloque a placa de cultura numa incubadora estéril ventilada a 37 ° C, com 60% de umidade e 5% de CO2 por 48 ou 72 h.
Nota: Nestes tempos de incubação foram otimizados para Time-Lapse imaging da MGE-derivado INs e imagem latente confocal de fatias fixas, respectivamente. Tempos de incubação ideal devem ser testados previamente para cada desenho experimental. Além disso, se a incubação escolhida é 72 h e sob, não há nenhuma necessidade de mudar o meio de cultura. Para tempos mais longos de incubação, o meio de cultura deve ser mudado a cada 2-3 dias. - Após o tempo de incubação desejado, transferir as seções de interesse para uma lamela 8-septadas e adicionar 3 a 5 µ l de meio de cultura. Lugar da lamela em uma câmara ambiental (37 ° C, umidade de 60%, 5% CO2) conectada a um invertido girando o disco confocal, equipado com um software de aquisição assistida por computador para a configuração da sessão de imagens lapso de tempo.
Nota: Como alternativa, seções podem ser corrigidas com paraformaldeído 4% (durante a noite a 4 ° C ou 2 h à temperatura ambiente) e, posteriormente, immunostained com anticorpos diferentes para visualização das características morfológicas do electroporated INs sob um confocal microscópio. Embora eGFP e mCherry podem ser visualizados por microscopia confocal sem qualquer procedimento contra-coloração, recomendamos a realização de imuno-histoquímica contra GFP e mCherry para melhorar o sinal, desde que o processo de fixação pode reduzir fluorescência, reduzindo a detecção de componentes mais finos dos neurônios embrionários, tais como galhos menores nos processos à direita ou à esquerda.
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Representative Results
Nesta seção, nós fornecemos resultados representativos obtidos seguindo o electroporation ex utero de um plasmídeo de controle, ou um plasmídeo experimental visando um gene de interesse, a MGE de embriões de rato e13.5 seguido por organotypic fatia de culturas incubadas a 37 ° C por 48 h (para a imagem latente de lapso de tempo) ou 72 h (para fixação e rotulação de imuno-histoquímica) (ver figura 1B para protocolo esquemático). Exemplos representativos de INs migrando de um explante MGE também são ilustrado (ver Figura 1 para protocolo esquemático) como uma comparação com o método descrito aqui. A eletroporação de um plasmídeo em progenitores MGE parece retardar a saída do INs do MGE e tempo de cultura deve ser ajustado em conformidade.
Em uma experiência bem sucedida, fatias de organotypic aparecem saudáveis sob o microscópio confocal, camadas corticais ou seja, são facilmente distinguíveis usando o modo de campo brilhante e não há nenhuma contaminação visível na superfície de fatia (reconhecíveis pela intensa autofluorescência e a presença de filamentos fluorescentes visíveis sob epifluorescência). Em fatias organotypic crônica saudável, aproximadamente 20% das células sofrem apoptose após 72 h na cultura (Figura 2), como descrito anteriormente na crônica organotypic culturas (por exemplo, pós-natal culturas)52. Apesar disso, estrutura do cérebro cytoarchitectural bruto continua bem definida, como ilustrado aqui usando DAPI coloração (Figura 2A). Nosso protocolo para o electroporation ex vivo do MGE produz uma média de 50-100 células transfectadas por fatia (Figura 3AB), dos quais 5-20 células serão vistas migrando dorsalmente após 72 h na cultura. Após fixação e coloração imuno-histoquímica, INs migrando tangencialmente em direção a placa cortical pode ser facilmente identificado com microscopia confocal como eles apresentam um corpo de célula/oval alongado, o processo ocasional à direita e um processo principal orientados tangencialmente. O processo de liderança normalmente dá origem a um ou dois ramos e é reconhecido pela presença de um inchaço ocasional em frente ao núcleo (habitação a centrossoma antes nucleocinese) e cones de crescimento no final de cada ramo. (Figura 3-G).
Este protocolo foi projetado para observação da migração MGE-derivado INs a nível de célula única utilizando imagens de lapso de tempo. Para este experimento específico (Figura 4), fatias de cérebro organotypic coronal foram geradas de Dlx5/6Cre; RCEEGFP electroporated de embriões em e13.5 com um plasmídeo expressando um Plasmideo experimental (visando um gene de interesse) e a fita de TdTomato . As fatias foram incubadas durante 48 h, transferidas para um prato de 8 poços septadas lamela (1 fatia por câmara flutuando sobre uma fina camada de meio de cultura completada) e fotografaram cada 3 minutos para 6-8 h, usando um objectivo de ar (0,70 NA) 20 x em um microscópio invertido equipado com uma cabeça confocal de disco girando, um software de aquisição assistida por computador e uma câmara de palco-top ambiental. Durante a imagem latente, as fatias foram mantidas a 37 ° C e foram continuamente oxigenadas e umedecidas na câmara ambiental (5% de CO2 e 60% H2O). INs electroporated MGE-derivados foram identificadas como tal por sua expressão de eGFP, confirmando sua identidade em gabaérgica e sua expressão de TdTomato, confirmando que eles expressam o plasmídeo experimental (Figura 4AB). Electroporated INs são facilmente identificáveis e bem isolado, como pode ser visto na Figura 4, permitindo a análise mais fina dos parâmetros dinâmicos de migração, tais como a velocidade e a distância percorrida. Além disso, INs etiquetados são vistos migrando tangencialmente em direção a placa cortical, enquanto no seu ambiente natural, permitindo a identificação de alterações morfológicas dinâmicas como ramificação do processo principal e nucleocinese (Figura 4 -F).
A eletroporação ex vivo da MGE-derivado INs também pode ser combinada com MGE explantes para permitir que imagens de alta resolução de processos dinâmicos do citoesqueleto, ocorrendo durante a migração, como um complemento para o estudo das dinâmicas migratórias e direcionalidade em culturas de organotypic. Como exemplo, podem-se observar as diferentes fases da locomoção neuronal relembram os que ocorrem durante a migração tangencial do INs em culturas de fatia de organotypic em electroporated INs migrando de uma MGE explant 48 h após electroporation, tais como líder extensão do axônio e nucleocinese (Figura 5B-E). Vários processos do citoesqueleto, então podem ser estudados em alta resolução em células isoladas, migrando de um explante MGE, por exemplo, pela coloração estruturas F-Actina com faloidina (figura 6A), que não podem ser alcançados de forma otimizada em fatias organotypic dada a elevada densidade celular (e, portanto, de elementos do citoesqueleto) em um ambiente nativo. Estes processos do citoesqueleto, e em especial F-Actina remodelação, podem mais ser estudados dinamicamente combinando Lifeact expressão com imagem latente de lapso de tempo. Por exemplo, mostramos um exemplo de alta resolução de imagem de lapso de tempo de um em derivado de um explante MGE obtido de um Nkx2.1Cre; RCEEGFP cérebro de rato carregando uma deleção específica de um gene de interesse no INs. Esta IN foi transfectada com o plasmídeo mCherry-Lifeact-7 sob o controle do promotor CMV (presente de Michael Davidson), usando o método esquematizado na Figura 1, permitindo o rastreamento de remodelação que ocorrem em tempo real (Figura F-Actina 6B). assim, enquanto culturas de organotypic são necessárias para avaliar correctamente o caminho direcionalidade ou migração de INs geneticamente modificados, MGE explantes podem complementar esses estudos, proporcionando melhor acesso às células isoladas para geração de imagens de alta resolução de processos dinâmicos do citoesqueleto.
Armadilhas de técnicas podem resultar em falha dos experimentos descritos acima. Por exemplo, incorporando o cérebro em uma solução de agarose mais quente que a 42 ° C pode resultar em destruição tecidual e morte neuronal, revelada por uma perda da translucidez do cérebro ou fatias, que tornar-se opaca. No entanto, a temperatura não deve ser mantida muito baixa, como uma solução de agarose a solidificação pode destruir o frágil cérebro embrionário durante o processo de incorporação. Em segundo lugar, a contaminação pode reduzir significativamente o rendimento das abordagens experimentais descritos aqui. Assim, todas as etapas devem ser efectuadas com cuidado, em condições assépticas rigorosas, tanto quanto possíveis. Todas as soluções e equipamentos devem ser esterilizados antes da utilização e equipamentos devem ser aspergidos com frequência com etanol a 70% para evitar a contaminação de bactérias ou mofo. Contaminação pode ser visível diretamente em poços de cultura, como meio de cultura torna-se amarela ou opaco. Contaminação pode passar despercebida quando o meio de cultura continua a ser claro e fluido. No entanto, uma camada de bolor na superfície de fatia geralmente pode ser observada ou as fatias se tornar excessivamente frágil durante a fixação e coloração de passos. Quando tais fatias são visualizadas no microscópio, contaminação pode se manifestar como uma camada de autofluorescência sobre neurônios rotulados ou revelada pela presença de filamentos fluorescentes há muito tempo. Fatias de organotypic mantidas em poços contaminados devem ser jogadas fora, mas as fatias cultivadas em outros poços da placa a mesma podem ser mantidas por mais etapas. Contaminação bacteriana é bastante rara, mas deve ser levada a sério, significa que todos os equipamentos, incluindo incubadoras compartilhadas e sala de cultura devem ser manualmente limpos e esterilizados.
Figura 1: Representações esquemáticas dos protocolos para ex utero electroporation seguiram por organotypic fatia de cultura ou MGE explants. R. exemplo de uma configuração de biossegurança do armário com todos os instrumentos esterilizados necessários para o protocolo descrito aqui. B. representação esquemática do protocolo utilizado para as culturas de fatia de ex utero electroporation e organotypic. Brevemente, os embriões são decapitados, o plasmídeo experimental é injetado no ventrículo lateral (1) e electroporated no MGE (2). O cérebro é microdissected do crânio (3) e incorporado em agarose (4). Organotypic seções são geradas em um vibratome (5) e colocadas em cultura em °C(6) 37 para 48 h para microscopia de lapso de tempo (7.1) ou 72 h para reconstruções de célula (7.2). C. representação esquemática do protocolo adaptado de Myers et al . 201353 e usado para a geração de MGE explants. Brevemente, córtices dorsolateral primeiro são dissecados fora de e12.5 de embriões de rato selvagem-tipo e14.5 (1) e dissociados mecanicamente em meio de cultura completado (2). Células corticais são banhadas em uma densidade de 5,25 x 105 células corticais/cm2 e cultivadas por 2 h a 37 ° C em uma lamela de 8-septadas colágeno/poli-L-lisina-revestido (3). Então, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embriões são processados por ex utero eletroporação da MGE (4, 5), e a MGE manualmente é isolado do cérebro e corta em 100 fragmentos de2 µm (6). Esses explantes são então colocados em cima da camada de alimentador cortical previamente preparado, cobertos com meio de cultura e co cultivados por 48 h antes do tempo-lapso de imagem (7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: preservada cytoarchitecture em fatias saudável organotypic. A geração de organotypic fatia culturas após ex vivo eletroporação de Nkx2.1Cre; RCEEGFP embriões do rato (A) não resulta em danos nos tecidos significativa, como revelado por cytoarchitecture preservado (DAPI (azul) e Cre-repórter (GFP)), quando comparado com um 18 µm de espessura cryosection de um Nkx2.1Cre; RCEEGFP transcardially embrião perfundido com 4% PFA em e15.5. D e M indicam eixos dorso-ventral e latero-medial, respectivamente. (B). imagens de alta ampliação, tiradas com um microscópio confocal invertido equipado com um x 63 / 1.4 objetivo de óleo após coloração com um anticorpo anticlivada-Caspase 3 (Cl-cas3) revelam que cerca de 20% das células da placa cortical de submeter-se apoptose (setas brancas) após 72 h em cultura, enquanto a GFP-positivo INs estadia saudável (seta branca), como exemplificado nas fotomicrografias em C-C ' '. Por comparação, apoptose celular é quase completamente ausentes do fino cryosection de um animal perfundido (D-D ' '). Barras de escala: 250 µm (A-B) e 15 µm (C-D ' '). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Organotypic fatias de ratos no cérebro embriões e fotomicrografias de alta magnificação de interneurônios electroporated (INs). R. uma cultura de fatia de organotypic de um Dlx5/6Cre; RCEEGFP cérebro de rato (no qual todos os INs são verdes) electroporated com um Dlx5/6::shRNAmexidos-IRES-TdTomato plasmídeo. A fatia foi fixada com 4% PFA após 72 h em cultura e immunostained para as boas práticas agrícolas e mCherry. Electroporated INs foram fotografada em 3D (50-60 µm de espessura z-pilhas com seções óticas tomadas cada 0,5 µm) usando um microscópio confocal, equipado com um x 63 / 1,3 objetivo de óleo at. INs migrando tangencialmente na zona sub ventricular do pálio dorsal são facilmente identificável (seta vermelha, aberta). D e M indicam eixos dorso-ventral e latero-medial, respectivamente. B. uma cultura de fatia de representante organotypic de um electoporated de embrião de sua (WT) com um controle Dlx5/6::shRNAmexidos-IRES-TdTomato plasmídeo, fixado em 72 h e immunostained para mCherry apenas. INs electroporated (vermelho) são vistos dorsalmente migrando em direção a placa cortical. Electroporated INs são identificados por sua expressão co de TdTomato e EGFP em Dlx5/6Cre; RCEEGFP ratos (C-D), ou pela sua expressão de TdTomato apenas em camundongos WT (E-H) e pela sua morfologia típica, ou seja, um oval celular corpo, um processo principal ramificado (setas brancas, D-H), um ocasionais no final de processo (seta branca, C-D) e um inchaço ocasional do processo principal, abrigando a centrossoma antes nucleocinese (estrela branca em C-C' e G). Barras de escala: 250 µm (A-B) e 25 µm (C-H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Time-Lapse imagens ao vivo de electroporated INs em fatias organotypic cultivadas por 48 h. INs electroporated no e13.5 com um plasmídeo experimental expressando um shRNA alvo um gene de interesse e a gaveta de TdTomato são vistos em migração tangencial em uma fatia do cérebro organotypic Obtida de um Dlx5/6Cre; RCEEGFP embrião de rato após 48 h de cultura (PraçaA, branco). Em B, o mesmo electroporated em (quadrado branco) é visto no processo de nucleocinese, durante a migração tangencialmente no córtex, ou seja, paralelo à superfície pial e é seguido no lapso de tempo de imagem a cada 3 minutos para 8 h, usando um 20 x / 0,85 ar at objectivo (caixas alargadas, C-F). O neurônio inicialmente exibe corpo celular alongado (seta aberta) no processo de nucleocinese (C), bem como um processo à direita (seta branca) e um processo principal ramificado (setas brancas). Após 3 h de geração de imagens ao vivo, o nucleocinese é concluído, o processo à direita tem retraído e o processo principal está ampliando duas ramificações longas (D, pontas de seta brancas). Após 5 h 30 min, dentre o ramo principal do processo tem retraído (setas brancas) e o corpo celular de neurônio (seta aberta) mudou-se para a frente cerca de 10 µm (E). Finalmente, após 8 h de imagem, migração tem uma pausa, o neurônio ampliou seu processo principal novamente e aparece um processo à direita (seta branca), mas o núcleo (seta aberta), ainda não se mudou para a frente (F). Barras de escala: 250 µm (A), 70 µm (B) e 30 µm (C-F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagem de lapso de tempo de INs derivado de um explante MGE cultivada por 48 h. INs são vistos migrando de um explante MGE obtidos de um Nkx2.1Cre; RCEEGFP mouse (no qual eGFP expressa tudo MGE-derivado INs) electroporated com o plasmídeo CMV::mCherry-LifeAct-7 em e13.5, usando o método adaptado de Myers et al . 201353 e esquematizada na Figura 1, e cultivados por 48 h (A). INs foram visualizadas usando imagens ao vivo de lapso de tempo por 5h (B-E). Neste exemplo, um em expressar co eGFP e LifeAct é visto inicialmente no processo de nucleocinese (seta aberta) e estende-se dois principais ramos de processo (pontas de seta brancas; B). IN This conclui nucleocinese após 1 h (ver seta aberta), como o corpo celular mudou-se para a frente e um processo à direita tem aparecido na parte traseira do corpo celular (seta branca) e ainda exibe um processo principal com dois ramos (pontas de seta brancas; C). uma segunda nucleocinese está em andamento, depois de 2 h 30 min (setas abertas) e o IN agora é dotado de dois processos principais provenientes do corpo celular e um processo mais à direita (seta branca; D). finalmente, depois de 5h, IN retrai um axônio enquanto se o centrossoma no ramo restantes de processo principal (seta branca) em preparação para um terceiro nucleocinese, com um processo à direita (seta branca) ainda presente na parte traseira o corpo celular (E). Barras de escala: (A) de 70 µm e 20 µm (B-E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: High-Resolution lapso de tempo por imagem da actina a remodelação INs de um explante MGE cultivados por 48 h. r. Uma fatia de organotypic de um Nkx2.1Cre; RCEEGFP cérebro de rato é fixado em e15.5, manchado com Alexa-594 faloidina, permitindo a visualização de actina filamentosa. INs é fotografada usando um x 63 / 1,3 objetivo de óleo at em um microscópio confocal. No INs saudável, actina filamentosa é vista colocando a parte de trás do corpo da célula após a retração do processo à direita após a conclusão de nucleocinese (seta branca, A'-A ' '). B. explante An MGE é obtido como acima de um Nkx2.1Cre; RCEEGFP cérebro de rato carregando uma deleção específica de um gene de interesse e electroporated com um plasmídeo expressando mCherry-Lifeact-7, sob o controle do promotor CMV . Imagens ao vivo de lapso de tempo é realizada após 48 h de cultura e electroporated INs são seguidas a cada 3 minutos para 3 h, usando um 40 x / 0,85 objetivo de ar. Remodelação ativo do citoesqueleto de actina ocorre em IN transfectada com LifeAct, como exemplificado pelo movimento do vermelho (branco em imagens a preto e branco), fluorescentes pontos dentro dos cones principais de processo e crescimento (setas brancas) e na parte traseira do corpo celular durante nucleocinese (B-B ' ', branco de setas). Barras de escala: 7 µm (um ' ') e 10 µm (B-B ' '). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, nós fornecemos um método confiável para a realização de ex utero electroporation do mouse MGE no e13.5 e para a geração de organotypic culturas de fatias do cérebro embrionário. Embora em vitro métodos, tais como o ensaio de câmara de Boyden, são relativamente fáceis de executar e podem ser usados para avaliar as funções específicas de diferentes genes e proteínas, sem a interferência de outros fatores, eles impedem a investigação de IN dinâmica de migração em relação à direcionalidade e migração de caminho25. MGE explantes fornecem um meio útil para estudar as mudanças dinâmicas do citoesqueleto ocorrem durante na migração, como mostramos aqui, mas eles são desprovidos de pistas mais endógenas e muitas vezes requerem a adição de pistas de orientação para promover a migração neuronal (embora isto seja melhorou significativamente quando MGE explantes são cultivados em camadas corticais alimentador)25,,54. No entanto, ensaios com base em explantes MGE podem falhar detectar a implicação de pistas moleculares envolvidas em mecanismos mais sutis como os guiando o caminho específico de direcionalidade ou migração de INs29. Este problema foi contornado eventualmente no utero electroporation25, que permite a rotulagem específica do MGE-derivado INs migrando em seu ambiente nativo13,29,41. No entanto, essa técnica é a habilidade-desafiador, devido os procedimentos cirúrgicos envolvidos, e seu rendimento é limitado pela taxa baixa sobrevivência de embriões e o fato de que o MGE é difícil alvo no utero, muitas vezes exigindo o uso de várias ninhadas para alcançar o significado de55. Daí, ex utero eletroporação da MGE seguido por organotypic cultura de embriões de cérebro de ratos fornece um método de baixo custo, tempo-eficiente e confiável para investigar a dinâmica da migração e a morfologia da MGE-derivado INs no seu natural ambiente, enquanto contornando os procedimentos cirúrgicos de eletroporação no utero e a necessidade de orientação sugestões em explantes MGE. Além disso, esta técnica permite um acesso mais fácil para o MGE, que pode ser alvo diretamente, há o elétrodo positivo sob o pescoço e o negativo no topo da cabeça, uma configuração mais difícil adoptar no utero. Alternativamente, o MGE pode ser injetado focally e electroporated diretamente após gerar organotypic fatias13,25,29, mas essa técnica revelou-se mais difícil e menos eficaz em nossas mãos do que o protocolo descrito aqui. Seguindo os passos descritos neste artigo, um irá obter 50-100 electroporated INs MGE derivado por fatia organotypic, 5-20 dos quais será visto migrando tangencialmente fora o MGE após 72 h. Transfected INs pode ser visualizada ao vivo com imagem latente de lapso de tempo ou imagem e reconstruída após a fixação e rotulação de imuno-histoquímica.
O protocolo descrito aqui foi otimizado para estudar na migração ex vivo e foi inspirado por vários protocolos publicados descrevendo no utero electroporation da MGE-derivado INs, ex vivo injeção MGE e eletroporação, ou o geração de organotypic crônica cérebro fatia culturas36,38,39,42,,43,56,57,58. Nossa abordagem limita os danos potenciais progenitores MGE usando menor intensidade de pulso (40 V) e injeções de plasmídeo intraventricular, ao invés de injeções de MGE intra com pulsos de alta tensão (100 V), conforme descrito em outro lugar39,56 ,57,58. Além disso, enquanto outros usam uma combinação de penicilina, estreptomicina e gentamicina para evitar contaminação bacteriana39,56,57,58, optámos para evitar antibióticos em nosso meio de cultura, desde que eles teoricamente podem afetar na migração. Em particular, penicilina é um antagonista dos receptores GABAA 59,60, e ativação de receptores GABAA ativa e depois para em migração dependendo gradientes intracelulares cloreto e KCC2 expressão em várias fases de migração61. No entanto, usando as várias precauções constantes o protocolo atual, pode efetivamente evitar contaminação mesmo na ausência de antibióticos.
Apesar da eficiência desta abordagem em nossas mãos, ex utero electroporation também tem suas desvantagens. Enquanto fornecendo um ambiente natural e tridimensional para células de migrar, pode ser difícil de executar ensaios farmacológicos em fatias organotypic no contexto de migração. Na verdade, a migração do MGE-derivado INs depende na maior parte sinais extracelulares2,13,19 e a aplicação de inibidores farmacológicos ou ativadores em fatias organotypic não permite a precisão dissociação dos efeitos autónoma de célula de efeitos globais sobre a saúde geral da fatia ou atividade. Para tais experimentos, explantes MGE crescidos ao longo de células corticais dissociadas mistas podem ser preferíveis para culturas de fatia de organotypic, desde que INs migrando fora o explante pode ser mais facilmente isolado e seletivamente expostos a compostos específicos62. Além disso, embora ex utero eletroporação é mais fácil de realizar do que no útero electroporation, pode ainda ser tecnicamente desafiador nas idades embrionárias ilustradas aqui, dado o tamanho pequeno e frágil estado do cérebro embrionário em E13.5. os investigadores vai precisar de alguns ensaios para extrair eficientemente os cérebros de electroporated no e13.5 sem danificar a superfície do cérebro. Além disso, ao contrário de fatias pós-natal, organotypic embrionárias fatias não podem ser mantidas em cultura durante longos períodos de tempo. Embora embrionárias organotypic fatia de culturas podem ser mantidas pelo menos 7 dias em vitro63, isto não foi combinado com eletroporação e tem os experimentos descritos aqui foram testados para até 3 dias em vitro com resultados confiáveis em nossas mãos. Portanto, os investigadores devem realizar testes de otimização previamente se tempos de incubação mais longos são necessários. Além disso, a investigação do desenvolvimento em estágios finais embrionários ou início pós-Natal não é recomendada com esta técnica quando usando e13.5 embriões25, mas pode ser conseguido com eletroporação no útero , onde com sucesso electroporated os embriões são colocados de volta na cavidade uterina e podem ser deixados para nascer e analisados em posteriores etapas21,64. Finalmente, ex utero electroporation seguido por organotypic fatia culturas permite a análise de tanto a morfologia e a dinâmica da migração do INs em desenvolvimento. No entanto, como foi anteriormente sublinhado para fora para no utero electroporation técnica36, ex utero electroporations produzir células de electoporated 50-100 por fatia do cérebro e, portanto, não são adequados para análise de população. Tais investigações são melhor realizadas em modelos animais, carregando um completo ou condicional exclusão (ou bater-nos) do gene de interesse. Quando disponível, tais modelos então podem ser usados com eficiência para gerar organotypic fatia de culturas ou MGE explants para visualizar a dinâmica real de migração, como demonstrado aqui (consulte a Figura 5 e Figura 6).
Muitas etapas neste protocolo devem proceder com cuidado, a fim de obter resultados óptimos. Por exemplo, é primordial que todas as etapas são executadas em condições assépticas rigorosas, como a contaminação pode ocorrer facilmente. Luvas e instrumentos utilizados fora da armário de biossegurança devem ser aspergidos com etanol 70% frequentemente durante todo o procedimento. Além disso, soluções como meios de cultura e artificial líquido cefalorraquidiano devem ser mantidas estéril e frio (4 ° C) e feito fresco cada 2-3 semanas. Para rotular MGE-derivado INs, mais especificamente, plasmídeos que serão usados em tais experiências devem ser clonados sob o controle de um promotor de IN-específico (ex: Dlx5/649, Lhx6,65), em vez de simplesmente depender a anatômica direcionamento da MGE. A geração de organotypic fatias requer o cérebro para se manter vivo. Assim, para preservar a sobrevivência e a saúde celular, esta experiência deve ser realizada em menos de 3 horas a partir do momento que os embriões são recuperados até que as fatias de organotypic são colocadas em cultura. Para tempo-eficiência, placas de cultura podem ser preenchidas com meio de cultura caseiro, pouco antes de iniciar o experimento e colocar na incubadora de cultura celular 37 ° C até o uso. Além disso, o cérebro deve ser dissecado cuidadosamente do crânio sem qualquer dano à superfície cortical para atingir a incorporação adequada na solução de agarose e vibratome-seccionamento subsequente. Por exemplo, danos na superfície cortical, mesmo mínima, podem resultar no desprendimento das 250 µm de espessura seções do gel do agarose circundante ou na degradação das seções durante o corte de vibratome. Pela sobrevivência neuronal, é também fundamental que a temperatura da solução de agarose permanece perto de 42 ° C, como temperaturas mais altas levam a morte de danos e células do tecido, Considerando que a temperaturas mais baixas irão impedir a incorporação adequada do cérebro (ou danificá-la durante o incorporação de processo). Uma vez na cultura, para evitar outras fontes de contaminação, as fatias não devem ser manipuladas até que eles são transferidos para o microscópio para a imagem latente. Estes passos devem ser efectuados num ambiente esterilizado e prestar atenção para não contaminar as placas após estas manipulações, especialmente se eles precisam ser colocados de volta na cultura para posterior re-imaging. Finalmente, não é recomendável se recuperando de uma alíquota de DNA misturado com corante de carregamento de experiências anteriores para uso futuro como observamos uma redução considerável no rendimento dos neurônios electroporated com tal material.
Em conclusão, o ex utero electroporation e organotypic fatia cultura protocolo descrito acima permite a rotulagem específica do MGE-derivado INs a nível de célula única e pode ser usado para manipular geneticamente vias moleculares específicas para estudar o seu papel na regulação as mudanças morfológicas e dinâmicas da migração de INs tangencialmente migrando. Este método permite a investigação funcional precoce rápida e baixo custo de genes candidatos romance identificado por meio de sequenciamento de RNA única célula de migratórias INs66,67 ou próxima geração de sequenciamento de pacientes com 68,69,70distúrbios do desenvolvimento neurológico. Esta técnica tem sido extensivamente usada para estudar a migração em outras populações de células, incluindo células piramidais no córtex e hipocampo70,,71,72,73. Uma vez dominado, potencialmente poderia ser usado para a imagem, a reciclagem e o tráfico de proteínas de membrana, como receptores e canais usando proteínas GFP-etiquetado; a ativação de cascatas de sinalização celulares específicas usando biosensores74; ou até mesmo o acompanhamento e a manipulação da atividade celular, utilizando imagens de cálcio acoplada ao optogenetics no INs cortical, mas também em outras áreas do cérebro, tais como o hipocampo, a amígdala ou até mesmo o corpo estriado.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar. As opiniões aqui expressadas não representam necessariamente as opiniões do Ministro da saúde ou o governo do Canadá.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fundação Savoy e a Fundação de epilepsia de cura de funcionamento e pelo equipamento concede da Fundação Canadense para a inovação de urgência (microscópio confocal) e G.H (microscópio confocal de disco girando). PS. recebe um prémio de carreira do de Fonds recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award), bem como dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR; Prêmio jovem investigador). G.H. é uma professora sênior do FRQ-S. L.E é o destinatário do prêmio Steriade-Savoy formação pós-doutoral da Fundação Savoy, o prêmio de treinamento pós-doutorado de CHU Sainte-Justine Foundation e o prêmio de formação pós-doutoral FRQ-S, em parceria com a Fundação de estrelas. Este projeto foi tornado possível pelo cérebro Canadá através do fundo de investigação do cérebro de Canadá, com o apoio financeiro da saúde do Canadá, atribuído a L.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
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