Summary
Driedimensionale organotypic culturen van de lymfkliertest utricle en het slakkenhuis in optisch duidelijk collageen ik gels behouden aangeboren weefsel morfologie, toestaan voor mechanische stimulatie via aanpassing van matrix stijfheid en virus-gemedieerde gene levering toestaan.
Abstract
De zintuigen van het binnenoor zijn uitdagend om te studeren bij zoogdieren als gevolg van hun onbereikbaarheid experimentele manipulatie en optische observatie. Bovendien, hoewel bestaande cultuur technieken toestaan biochemische verstoringen, deze methoden bieden niet een middel tot het bestuderen van de effecten van mechanische kracht en weefsel stijfheid tijdens de ontwikkeling van de zintuigen van het binnenoor. Hier beschrijven we een methode voor driedimensionale organotypic cultuur van de intact lymfkliertest utricle en slakkenhuis overwint deze beperkingen. De techniek voor aanpassing van de stijfheid van een drie-dimensionale matrix hier beschreven staat manipulatie van de elastische kracht tegen weefsel groei. Deze methode kan daarom worden gebruikt om te studeren van de rol van mechanische krachten tijdens de ontwikkeling van het binnenoor. Bovendien, toestaan de culturen virus-gemedieerde gene levering, die kan worden gebruikt voor experimenten van de winst - en verlies-van-functie. Deze methode van cultuur behoudt aangeboren haarcellen en ondersteunende cellen en fungeert als een potentieel superieur alternatief voor de traditionele tweedimensionale cultuur van vestibulaire en auditieve zintuigen.
Introduction
De studie van de meeste aspecten van zoogdieren orgel ontwikkeling is bevorderd door in vitro -systemen. Twee belangrijkste methoden worden nu gebruikt voor de cultuur van vestibulaire zintuigen: vrij zwevende1 en aanhangend2 preparaten. Beide methoden toestaan dat het onderzoek van Haarcel kwetsbaarheden3 en regeneratie1,4 in vitro. Bovendien hebben de ontwikkelingstoxiciteit rollen van de inkeping5,6, Wnt7,8en epidermale groeifactor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades in het binnenoor vastgesteld, gedeeltelijk door het gebruik van in vitro culturen van sensorische epitheel. Echter celgroei en differentiatie worden beheerd, niet alleen door middel van de signalering door morphogens, maar ook door middel van fysieke en mechanische signalen zoals intercellulaire contacten, de stijfheid van de extracellulaire matrix, en mechanische uitrekken of vernauwing. De rol van dergelijke mechanische stimuli is uitdagend om te onderzoeken in de ontwikkelingslanden binnenoor in vivo. Bovendien, bestaande vrij zwevende en aanhangend cultuur methoden zijn niet geschikt voor dergelijk onderzoek in vitro. Hier beschrijven we een methode voor driedimensionale organotypic cultuur in collageen gels ik verschillende stijfheid. Deze methode grotendeels bewaart de in vivo -architectuur van de vestibulaire en cochleair zintuigen en laat onderzoek naar de gevolgen van mechanische kracht voor de groei en differentiatie11.
Omdat de mechanische prikkels zijn bekend om te activeren downstream moleculaire gebeurtenissen, zoals de Hippo signalering traject12,13,14,15, is het belangrijk om het combineren van mechanische stimulatie te kunnen met biochemische en genetische manipulaties. De hier beschreven methode van cultuur virus-gemedieerde gene levering toestaat en kan daarom gebruikt worden om te studeren zowel mechanische als moleculaire signalering tijdens binnenoor ontwikkeling11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies van de Rockefeller universiteit en van de University of Southern California.
1. (optioneel) bereiding van collageen ik oplossing van Mouse-tail pezen
Opmerking: Collageen ik oplossingen commercieel beschikbaar zijn. Volg de instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van het gel.
- 5-10 jonge volwassene (3-5 weken oud) muizen van een wild type stam met koolstofdioxide overeenkomstig het protocol goedgekeurd door de relevante institutionele Animal Care en gebruik Comité16euthanaseren. Verzamel de staarten en ontsmetten door dompelen in 70% ethanol voor een minimum van 4 uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Incubatie gedurende meer dan 48 uur moet worden voorkomen, aangezien het leidt tot buitensporige weefsel uitdroging en het extractieproces van de pees belemmert. - Verwijder de huid van elke staart door de invoering van een longitudinale knippen met een scalpel mes en intrekken van de hele huid met een tang. De gevilde staarten overbrengen in een petrischaal 100 mm gevuld met schone 70% ethanol en snij ze in 10-mm segmenten.
Opmerking: Gooi het dunste deel van de staart, die moeilijk te manipuleren. - Met behulp van Tang, beveiligen van elk segment van de staart naar de onderkant van de petrischaal en een tweede paar fijne pincet gebruiken om uit te pakken van de pezen van de staart een tegelijk. Individuele pees vezels moeten ontstaan met minimale weerstand.
Opmerking: Oude, saaie #5 pincet werken goed voor deze stap. - Bereiden van 100 mL van de oplossing van een 0,1% (volumeprocent) azijnzuur in steriele, moleculaire-grade water en voeg 10 mL van deze oplossing aan een steriele petrischaal van 100 mm. De pezen overbrengen in de petrischaal en laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te denatureren van de collageen ik.
- Gebruik een steriel scalpel of iridectomy schaar met botte, gebogen tips om gehakt van de pees in 1-2 mm fragmenten. De gehakt pezen overbrengen in een steriele buis van 50 mL en Voeg 0,1% azijnzuur om het volume op 50 mL.
Opmerking: Gebruik vier of vijf tails voor elke 50 mL zuur om een collageen ik concentratie van 2.0-2,5 mg/mL. - Koel de collageen ik oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 48 uur om complete eiwitten denatureren. Vortex met een tafelblad vortex ingesteld op de maximale snelheid voor 1 min twee keer per dag.
- Meten van de eiwitconcentratie van de oplossing met behulp van de zure test van bicinchoninic, aanpassen van de collageen ik concentratie tot 2.0-2,5 mg/mL door toevoeging van 0,1%-oplossing van azijnzuur en winkel bij 4 ° C.
Opmerking: Collageen ik oplossing voor één tot twee jaar kan worden opgeslagen. - (Optioneel) Centrifugeer het collageen ik oplossing bij 2.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C en gebruik de doorschijnende top fractie (ongeveer de helft van het volume), om te bereiken optisch duidelijk collageen gels in punt 4.
2. dissectie van vestibulaire en auditieve organen
- Zwangere muizen van elke stam met koolstofdioxide overeenkomstig het protocol goedgekeurd door de relevante institutionele Animal Care en gebruik Comité16euthanaseren. Pak en het onthoofden van de embryo's.
Opmerking: Lfng-CreERT2/tdTomato muizen kunnen worden gebruikt voor permanente labeling cellen bij blootstelling aan 4-hydroxytamoxifen17te ondersteunen. - Het steriliseren van alle werkende oppervlakken en dissectie instrumenten, met inbegrip van twee paren van #5 pincet en een haar mes18, door het reinigen met 70% ethanol.
- Splitsen elk hoofd in twee helften door de invoering van een longitudinale knippen met een steriel scalpel mes of met behulp van twee paren van #5 pincet. Pak de temporale botten, die de inner oren19 bevatten, en plaats ze in 15 mL ijskoud Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een petrischaal 60 mm. Houd de schotel op het ijs.
Opmerking: Embryo's op een aantal stadia van E13.5 tot E18.5 hebben met succes gebruikt. - (Optioneel) De inner oren wassen door zachtjes schudden ze in een conische tube van 50 mL met 30 mL ijskoud HBSS en vervangen de HBSS drie of vier keer. Houd de buis op ijs.
Opmerking: Deze stap beperkt van eventuele verontreiniging van de weefselkweek en snel brengt de temperatuur tot 4 ° C, waardoor de afbraak en cel dood weefsel. - Met behulp van twee paar fijne #5 pincet, de oren van de innerlijke scheiden van de temporale-bot en breng de oren, drie of vier tegelijk, in een 60-mm petrischaal gevuld met ijskoude HBSS.
- Ontleden de vestibulaire zintuigen.
- Oriënteren de oren mediale kant omhoog en ga naar de utricle. Met twee paren van #5 verlostang, verwijderen van het kraakbeen rondom de vestibulaire organen. Zachtjes verbreken de nervus vestibularis, de verbinding tussen de utricle en saccule en de semicircular-grachten, zoals afgebeeld in Figuur 1. Trek voorzichtig aan de utricle en de bijgevoegde ampullen van de superieure en horizontale semicircular kanalen van het oor.
Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt op inner oren van stadia E16.5 - E18.5. Behoud van het kraakbeen fragmenten voor sectie 3 hieronder.
- Oriënteren de oren mediale kant omhoog en ga naar de utricle. Met twee paren van #5 verlostang, verwijderen van het kraakbeen rondom de vestibulaire organen. Zachtjes verbreken de nervus vestibularis, de verbinding tussen de utricle en saccule en de semicircular-grachten, zoals afgebeeld in Figuur 1. Trek voorzichtig aan de utricle en de bijgevoegde ampullen van de superieure en horizontale semicircular kanalen van het oor.
- Het ontleden van het slakkenhuis.
- Verwijder de kraakbeenachtige weefsel rondom het orgel van de hoorzitting met twee paren van #5 pincet. Zachtjes het verbreken van de verbinding tussen de cochleair base en de saccule zoals aangegeven in Figuur 1.
Opmerking: Voor stadia E13.5 - E14.5, het kraakbeen vóór dissectie verzachten door de behandeling van de binnenste oren voor met 0,25% collagenase ik in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Behoud van het kraakbeen fragmenten voor sectie 3 hieronder.
- Verwijder de kraakbeenachtige weefsel rondom het orgel van de hoorzitting met twee paren van #5 pincet. Zachtjes het verbreken van de verbinding tussen de cochleair base en de saccule zoals aangegeven in Figuur 1.
- Met behulp van een 200-µL Pipetteer uitgerust met een brede nonstick tip, de utricles en cochleae overbrengen naar een 30-mm petrischaal gevuld met groeimedium, bestaande uit DMEM/F12 aangevuld met 33 mM Dglucose, natriumbicarbonaat 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 1 mM glutamine, 1 mM nicotinamide, 20 mg/L epidermale groeifactor, 20 mg/L fibroblast groeifactor, 10 mg/L insuline, 5,5 mg/L transferrine en 5 µg/L Natriumseleniet.
- De voorbereidingen van de utricle voor maximaal 3 uur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% kooldioxide dat genezing van de bezuinigingen in het epithelium geïntroduceerd tijdens de dissectie handhaven. Slakkenhuis preparaten moeten worden overgedragen aan de collageen gel 10 min na de dissectie.
Opmerking: Omdat de dissectie is uitgevoerd in ijskoude HBSS, is er geen behoefte om te warmen vooraf het groeimedium tot 37 ° C.
3. (optioneel) aanpassen van collageen ik stijfheid door toe te voegen uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van chondrocyten Gel
Opmerking: De methode voor chondrocyten isolatie werd vanaf Gosset et al. gewijzigd 20
- Bereid een 1%-oplossing van collagenase ik in steriele 1 x PBS en winkel 100-200 µL aliquots bij-80 ° C. Ontdooien op ijs wanneer nodig, het vermijden van meerdere bevriezen-ontdooien cycli.
- Gebruik fijne pincet te verzamelen de stukjes kraakbeen overgebleven uit de dissectie van de vestibulaire en auditieve organen van 10-12 oren. Aparte connective en binnenoor weefsels van het kraakbeen. Het kraakbeen overbrengen in een petrischaal 30 mm en voeg 300 µL van steriele groeimedium.
- Kunt een steriel scalpel blad of iridectomy schaar met stompe gebogen tips gehakt van het weefsel om kraakbeen stukken ongeveer 0,5 mm in lengte.
- Toevoegen van collagenase I tot en met het medium met kraakbeen aan het bereiken van een definitieve enzym concentratie van 0,25%. De schotel overbrengen in een incubator weefselkweek bij 37 ° C vergast met 5% kooldioxide. Pipetteer krachtig met een 1.000 µL Pipetteer elke 20 minuten totdat de stukjes kraakbeen distantiëren en zijn niet langer te onderscheiden in de oplossing vervolgens Incubeer gedurende een extra 20 min.
Opmerking: In het geval van de utricle voorbereidingen, kan chondrocyten isolatie worden uitgevoerd tijdens stap 2.9; het duurt ongeveer 2 h (3-4 pipetting rondes). - Verzamelen van de celsuspensie in een conische tube van 15 mL en regel het volume op 10 mL met steriele 1 x PBS. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL steriele 1 x PBS. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.
Opmerking: Het is van cruciaal belang om te wassen de cellen tweemaal; eventuele resterende collagenase zal ik de collageen die ik gel verteren. - Met behulp van een pipet 200-µL, 100 µL cultuurmedium aan de cel pellet en pipet zachtjes aan resuspendeer toevoegen. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en handhaven op ijs vóór gebruik.
- Om stijfheid van de gel, chondrocyten aan de geneutraliseerde collageen ik gel oplossing (afdeling 1) en meng snel toevoegen voor het distribueren van de cellen in de hele de gel vóór stollen.
Opmerking: De elasticiteitsmodulus van de collageen ik gel (een maatregel van stijfheid), stijgt lineair met het aantal chondrocyten11toegevoegd. De relatie wordt beschreven door de experimenteel bepaalde lineaire functie E = 206· NC + 15, waarin E de elasticiteitsmodulus in luchtdruk en Nc is is het aantal chondrocyten in miljoenen. Voor een gedetailleerd protocol voor gel Raadpleeg stijfheid metingen het oorspronkelijke artikel11.
4. plaats de vestibulaire en/of akoestisch zintuiglijke orgel in een collageen die ik Gel
- In een steriele 1.5-mL-buis, bereiden collageen ik polymerisatie oplossing door het mengen van 160 µL van 10 x PBS met fenol rood pH-indicator, 133 µL van 0,34 M natriumhydroxide-oplossing, 70 µL van 0,9 M natriumbicarbonaat en 40 µL van 1 M HEPES. Houd de buis op ijs.
Opmerking: Dit recept biedt de polymerisatie-oplossing die nodig zijn voor het bereiden van 2 mL van collageen ik gel, maar kunnen zo nodig worden aangepast. - Mix 100 µL van de polymerisatie oplossing en 400 µL van collageen ik oplossing op ijs door pipetteren zachtjes op en neer in een gekoeld 1.5-mL-buis. Het vergroten van gel stijfheid, voeg 50 µL van met chondrocyten groeimedium en meng voorzichtig zoals beschreven in sectie 3.
- Breng 500 µL van de geneutraliseerde collageen ik oplossing een gekoeld 30-mm petrischaal met een 10 mm glas-onder invoegen of een putje van de plaat van een vier-well.
Opmerking: Het is van cruciaal belang dat alle reagentia op ijs om te voorkomen dat snelle en ongelijke polymerisatie van het collageen ik. - Snel overbrengen in de cochleae of utricles de geneutraliseerde collageen ik oplossing en aanpassen van de organen naar de gewenste positie met een steriele haar mes18 of paar fijne pincet.
Opmerking: Collageen ik polymerisatie wordt merkbaar na 1-2 minuten, als de oplossing troebel wordt. - Nadat de oplossing rond het weefsel heeft polymeervorm, plaats de petrischaal of vier-well plaat gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% koolstofdioxide om ervoor te zorgen volledige polymerisatie.
- Voeg 3 mL groeimedium aangevuld met 0,5% foetale runderserum (FBS) per petrischaal of 500 µL van hetzelfde medium per putje van de plaat van een vier-well. Het behouden van de cultuur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% kooldioxide. Indien gewenst, vullen het groeimedium met 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) op het etiket van de delende cellen.
Opmerking: Hogere FBS concentraties kunnen worden gebruikt indien gewenst.
5. virale injecties in driedimensionale culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen
- Ontdooi de gewenste virus op ijs en meng met trypan blauwe oplossing in een conische buis van 0,5 mL tot een concentratie van de uiteindelijke kleurstof van 0,05%. 10-20 x kleurstof gebruiken om te voorkomen dat aanzienlijke verdunning van het virus. Houd op ijs.
Opmerking: Adenovirus serotype 5 werken beste voor infecteren ondersteunende cellen in de utricle19, overwegende dat adeno-associated virus Anc80 beide haarcellen kan infecteren en ondersteuning van de cellen in de utricle en het slakkenhuis21. - Breken de tip van een glas naald bereid op een micropipet trekker met schone fijne pincet met inachtneming van het bij het hoogste vergrotingsniveau van een verrekijker ontrafeling van Microscoop.
Opmerking: Het is belangrijk voor het optimaliseren van de instellingen op de trekker van de naald. Naalden met 9 - 12 mm shanks en 20 - 30-µm openingen werken het beste. - Verwijder een cultuur van sensorische-orgel uit de incubator. Bevestig de naald aan de microinjector en vul het met 2-3 µL van het mengsel van kleurstof en virus. Vooraf de naald in de sensorische organen met inachtneming van het onder de binoculair ontrafeling van Microscoop.
- Voorzichtig rijden de naald tip door mesenchymale en epitheliale lagen van het dak van een driedimensionale utricular cultuur. Injecteer het virale mengsel totdat de holten van de utricle en de ampullen met de blauwe kleurstof vullen.
Opmerking: Omdat het biedt gemakkelijk toegang tot de zintuigen, is een 10 mm glas-onderkant petrischaal optimaal voor de injecties. - Incubeer bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% kooldioxide.
Opmerking: Als groen of rood fluorescerende eiwit wordt gebruikt in de virale constructie, is de fluorescentie blijkt 24u na virale transductie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vestibulaire en auditieve zintuigen uit embryonale oren, gekweekt in 40-Pa collageen ik gels nabootsen van lage stijfheid embryonale voorwaarden11, relatief normale driedimensionale structuren (Figuur 1) behouden en onderhouden van haarcellen en ondersteunende cellen (Figuur 2 en Figuur 3). Hoewel de ondersteuning van de celdichtheid daalt met meer dan 30% (Student t -test: n = 4, p < 0.004) en haar celdichtheid daalt met 60% (Student t -test: n = 5, p < 0.0001) na 3 dagen in utricular culturen (Figuur 2 ), het gebied van de macula meer dan verdubbeld in dezelfde periode van tijd11 (n = 3, p = 0.0002). Dit toont aan dat de methode voor driedimensionale cultuur hier beschreven maakt het mogelijk voor een aanzienlijke toename van het aantal ondersteunende11, cellen met behoud van 80% van de bestaande haarcellen in de utricle over een periode van 3 dagen. In de driedimensionale culturen opgericht met ingang van E14.5 slakkenhuis, onderscheiden Sox2-positieve voorlopercellen als morfologisch onderscheidbaar rijen van binnenste en buitenste haarcellen na 3 dagen in cultuur (Figuur 3).
Genexpressie kan worden gemanipuleerd in driedimensionale culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen door middel van virale infectie. 4hydroxytamoxifen wordt toegevoegd aan het kweekmedium aan ondersteuning van de cellen in het cochleair explantaten opgericht met ingang van E15.5 embryo's van Lfng-CreERT2/tdTomato muizen17-label. Injectie van adenovirus type 5 in het lumen van de resultaten van de cultuur in infectie van cellen op het orgel van honk (Figuur 4A) ondersteunen. Injectie van hetzelfde virus in het lumen van de utricular cultuur opgericht met ingang van E17.5 embryo, leidt voornamelijk tot infectie van cellen in de hele de sensorische epitheel (Figuur 4B) ondersteunen.
Figuur 1. Schema's voor ontledingen en licht-microscopische afbeeldingen van representatieve culturen van utricle en slakkenhuis in driedimensionale collageen ik gels. (A) A schematische tekening portretteert de sensorische epitheel (groen) van de zes organen van de receptor van de lymfkliertest binnenoor. De rode lijnen bakenen de bezuinigingen geïntroduceerd tijdens de dissectie van een utricle en het slakkenhuis. (B) de lichte microscopie van beelden portretteren de E17.5 utricle (bovenste deelvenster) en E14.5 slakkenhuis (lagere paneel) ingebed in collageen ik gel en gekweekte gedurende 48 uur. De schaal staven 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Gnedeva et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Haarcellen en ondersteunende cellen in driedimensionale utricular culturen. (A) Confocal-microscopische beelden portretteren de utricle van een E18.5 vóór explantatie (bovenste panelen) en na 3 dagen in een driedimensionale cultuur in 40-Pa collageen ik gel (onderste panelen). Haarcellen zijn gelabeld voor Myo7A (groen) en ondersteunende cellen voor Sox2 (rood). De schaal staaf vertegenwoordigt 50 µm. (B) ondermeer cel dichtheden (rode balken), Haarcel dichtheden (groene balken) en Macula gebieden (grijze balken) in E18.5 utricles vóór explantatie en na 3 dagen in driedimensionale orgel cultuur zijn te ondersteunen vertegenwoordigd als middel van ± SEMs (p < 0.001 wordt vertegenwoordigd als ** en p < 0.0001 zoals ***). Dit cijfer is gewijzigd van Gnedeva et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Haarcellen en ondersteunende cellen in driedimensionale cochleair culturen. Confocale-microscopische beelden portretteren een slakkenhuis E14.5 vóór explantatie (bovenste panelen) en na 3 dagen in een driedimensionale cultuur in 40-Pa collageen ik gel (onderste panelen). Myo7A - en Sox2-positieve binnenste haarcellen (IHC) en buitenste haarcellen (Kopklep) verschijnen in 4-5 rijen na 3 dagen in cultuur. Ondersteunende cellen hebben ook het label voor Sox2 (rood). De schaal staaf vertegenwoordigt 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Representatieve resultaten van virale infecties in driedimensionale orgel culturen van het slakkenhuis en utricle. (A) injectie van adenovirus serotype 5 in driedimensionale cochleair culturen opgericht met ingang van Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 embryo's resultaten in infectie (GFP, groene) cellen (tomaat, rode) aan de voet van het orgel te ondersteunen. De sensorische epitheel is afgebakend in grijs. De schaal staaf vertegenwoordigt 100 µm. (B) een identieke injectie in een driedimensionale utricular cultuur opgericht met ingang van het embryo van een E17.5 resulteert in een infectie (GFP, groen) cellen (Sox2, rood) te ondersteunen in het orgel. De sensorische epitheel is afgebakend in grijs. De schaal staaf vertegenwoordigt 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Gnedeva et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De moleculaire signalen die bemiddelen groei en differentiatie in het binnenoor tijdens de ontwikkeling geweest bestudeerde uitvoerig5,6,7,8,9,10. Echter aanwijzingen het utricular modelsysteem verkregen dat mechanische signalen, voelde door cel kruispunten en de activering van Hippo signalering, ook een belangrijke rol in deze processen2,11,, 22. Bovendien zowel de extrusie van stervende haarcellen van de sensorische epitheel en de daaropvolgende vorming van nieuwe sensorische receptoren via transdifferentiatie kunnen invloed hebben op de mechanische kracht gevoeld door de resterende cellen, waardoor ze ondersteunen opnieuw invoeren van de celcyclus tijdens regeneratie. Het systeem van de driedimensionale cultuur hier beschreven biedt een experimenteel middel van het onderzoeken van zowel de rol van mechanische kracht in groei bediening tijdens binnenoor ontwikkeling11 en, potentieel, de rol van dezelfde kracht tijdens Haarcel regeneratie weer gecontroleerd. Bovendien vergemakkelijkt de aanpak virale infectie die een methode biedt voor het wijzigen van de genexpressie in de sensorische epitheel, dus een combinatie van mechanische en moleculaire manipulaties voor het onderzoek van groei en regeneratie van het toelaat de oor de zintuigen11.
De beperkingen van de methode hebben betrekking op de minimale informatie beschikbaar op de endogene krachten en mechanische stimuli tijdens de embryogenese binnenoor. Metingen van de stijfheid van het weefsel in de ontwikkelingslanden binnenoor bestaan niet aan onze kennis; Vandaar is het moeilijk om te schatten wat stijfheid van collageen ik gel correspondeert in vivo voorwaarden. Onze observaties en het model suggereren dat de kracht die tegen de groei van de utricle aanvankelijk slinkt en neemt toe naarmate het orgel haar uiteindelijke grootte11 nadert. We veronderstellen daarom dat een collageen die ik gel zonder chondrocyten is een fysiologisch relevante substraat waarin cultuur embryonale vestibulaire en auditieve zintuigen.
De hier beschreven methode van drie-dimensionale cultuur induceert de vorming van nieuwe ondersteunende cellen in de macula utricular11, terwijl ook de handhaving van meer dan 80% van de haarcellen na 3 dagen in cultuur (Figuur 2). De methode, dus, vertegenwoordigt een superieur alternatief voor tweedimensionale culturen van de utricle, waarin slechts 40-50% van de haarcellen overleven na de eerste 24 uur in cultuur5,8, en kan worden gebruikt voor het bestuderen van Haarcel kwetsbaarheden en regeneratie in vitro.
Hoewel we aantonen de vorming van anatomisch herkenbaar georganiseerde rijen van binnenste en buitenste haarcellen in de gekweekte orgaan van Corti dat, is meer werk nodig om te bepalen of de hier beschreven methode van drie-dimensionale cultuur normale ondersteunt de rek van het cochleair buis tijdens het proces van convergente extensie (CE)23,24,25. CE is een zeer dynamisch proces waarbij cel migratie, omlegging en cel-cel contact wijzigingen26 die dreigt te worden beïnvloed door de externe kracht geproduceerd door de weefsels rondom de ontwikkelende cochleair buis. Deze methode het behoud van relatief normale drie-dimensionale weefsel het platform, en mogelijk gunstig voor de studie van CE in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij bedanken Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi, en A. Petelski voor hun bijdragen aan het oorspronkelijke onderzoek waarop dit protocol is gebaseerd. Wij danken ook J. Llamas en W. Makmura voor technische bijstand en de veehouderij. Wij erkennen NIDCD Training subsidie T32 DC009975, NIDCD verlenen R01DC015530, Robertson therapeutische Ontwikkelingsfonds en de Caruso Family Foundation voor financiering. Tot slot, wij erkennen steun van Howard Hughes Medical Institute, waarvan Dr. Hudspeth een onderzoeker is.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
