Summary
Tre-dimensionelle organotypic kulturer af murine utricle og cochlea i optisk klare kollagen jeg geler Bevar medfødte væv morfologi, tillader mekanisk stimulering gennem tilpasning af matrix stivhed, og tillade virus-medieret gen levering.
Abstract
Sanseorganer i det indre øre er udfordrende for at studere i pattedyr på grund af deres manglende adgang til eksperimentelle manipulation og optisk observation. Desuden, selvom eksisterende kultur teknikker tillader biokemiske forstyrrelser, disse metoder ikke giver et middel til at studere virkningerne af mekanisk kraft og væv stivhed i udviklingen af de indre øre sanseorganer. Her beskriver vi en metode for tre-dimensionelle organotypic kultur intakt murine utricle og cochlea, der overvinder disse begrænsninger. Teknik til justering af en tre-dimensionel matrix stivhed beskrevet her tillader manipulation af elastisk kraft imod vækst af væv. Denne metode kan derfor bruges til at studere rollen af mekaniske styrker under indre øre udvikling. Derudover tillader kulturer virus-medieret gen levering, som kan bruges til eksperimenter med gevinst og tab-af-funktion. Denne kultur metode bevarer medfødte hårceller og støtte celler og fungerer som en potentielt bedre alternativ til den traditionelle to-dimensionelle kultur af vestibulære og auditive sanseorganer.
Introduction
Studiet af de fleste aspekter af pattedyr orgel udvikling er blevet fremmet af in vitro- systemer. To vigtigste metoder bruges nu til kulturen af vestibulære sanseorganer: frit svævende1 og vedhængende2 præparater. Begge metoder tillade undersøgelsen af hår celle sårbarheder3 og regenerering1,4 in vitro. Notch5,6, Wnt7,8og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades i det indre øre udviklingsmæssige roller har derudover blevet etableret, dels ved hjælp af in vitro- kulturer af sensoriske epitheler. Dog er cellevækst og differentiering kontrolleret, ikke kun gennem signalering af morphogens, men også gennem fysiske og mekaniske stikord såsom intercellulære kontakter, stivhed af ekstracellulære matrix, og mekanisk strække eller konstriktion. Rollen som sådan mekaniske stimuli er udfordrende at undersøge i den tredje indre øre in vivo. Derudover er eksisterende frit svævende og vedhængende kultur metoder ikke egnet til sådanne undersøgelser in vitro. Her vi beskrive en metode for tre-dimensionelle organotypic kultur i kollagen jeg geler af varierende stivhed. Denne metode i høj grad bevarer de vestibulære og cochlear sanseorganer i vivo arkitektur og giver mulighed for undersøgelse af virkningerne af mekaniske kraft på vækst og differentiering11.
Fordi mekaniske stimuli er kendt for at aktivere downstream molekylære begivenheder, såsom Hippo signalering vej12,13,14,15, er det vigtigt at være i stand til at kombinere mekaniske stimulation med biokemiske og genetiske manipulationer. Kultur metoden her tillader virus-medieret gen levering og kan derfor bruges til at studere både mekanisk og molekylær signalering under indre øre udvikling11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg af Rockefeller University og af University of Southern California.
1. (valgfrit) forberedelse af kollagen jeg løsning fra Mouse-tail sener
Bemærk: Kollagen jeg løsninger findes i handelen. Følg producentens anvisninger for gel forberedelse.
- Aflive 5-10 unge voksne (3-5 uger gamle) mus af enhver vildtype stamme med kuldioxid i overensstemmelse med den protokol, der er godkendt af de relevante institutionelle Animal Care og brug Udvalget16. Indsamle haler og desinficere dem ved nedsænkning i 70% ethanol i mindst 4 timer ved stuetemperatur.
Bemærk: Inkubation i over 48 timer bør undgås, da det resulterer i overdreven væv dehydrering og hindrer senen udpakningsprocessen. - Fjern skindet fra hver hale ved at indføre et langsgående snit med en skalpel klinge og tilbagetrækningskraften hele huden med pincet. Overføre de flået haler til en 100-mm petriskål fyldt med ren 70% ethanol og skær dem i 10-mm segmenter.
Bemærk: Kassér de tyndeste dele af haler, der er vanskelige at manipulere. - Brug af pincet, sikre hvert segment af halen til bunden af petriskålen og bruge et andet par af fine pincet til at udtrække sener fra halen, en ad gangen. Enkelte senen fibre skal fremstå med minimal modstand.
Bemærk: Gamle, kedelige #5 pincet fungerer godt for dette trin. - Forberede 100 mL af en 0,1% opløsning (volumenprocent) af eddikesyre i sterile, Molekylær-grade vand og der tilsættes 10 mL af denne opløsning til en steril petriskål 100-mm. Overføre sener til petriskålen og henstår i 1 time ved stuetemperatur til at denaturere kollagen.
- Bruge en steril skalpel eller iridectomy saks med stumpe, buede tips til hakkekød senen i 1-2 mm fragmenter. Overføre hakket sener til en steril 50 mL tube og tilføje 0,1% eddikesyre til at bringe lydstyrken til 50 mL.
Bemærk: Bruge fire eller fem haler for hver 50 mL af syre til at opnå en kollagen jeg koncentration på 2,0-2,5 mg/mL. - Opbevares i køleskab kollagen jeg løsning ved 4 ° C i mindst 48 timer at lette komplet protein denaturering. Vortex med en bordplade vortex indstillet til maksimal hastighed i 1 minut to gange om dagen.
- Måle proteinkoncentration af løsningen ved hjælp af bicinchoninic syre assay, justere kollagen jeg koncentration til 2,0-2,5 mg/mL ved at tilføje 0,1% opløsning af eddikesyre, og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Kollagen jeg løsning kan lagres i et til to år. - (Valgfrit) Centrifugeres kollagen jeg løsning på 2.000 x g i 1 time ved 4 ° C og brug den gennemsigtig top brøkdel, (cirka halvdelen af mængden), at opnår optisk klare kollagen geler i afsnit 4.
2. dissektion af vestibulære og auditive organer
- Aflive gravide mus af enhver stamme med kuldioxid i overensstemmelse med den protokol, der er godkendt af de relevante institutionelle Animal Care og brug Udvalget16. Uddrag og Hug hovedet af embryoner.
Bemærk: Lfng-CreERT2/tdTomato mus kan bruges til at tillade permanent mærkning af støtte celler ved udsættelse for 4-hydroxytamoxifen17. - Sterilisere alle arbejdsflader og dissektion instrumenter, herunder to par #5 pincet og en hår kniv18, ved at rense dem med 70% ethanol.
- Opdele hver leder i to halvdele ved at indføre et langsgående snit med en steril skalpel blade eller ved hjælp af to par af #5 pincet. Uddrag de tidsmæssige knogler, der indeholder indre ører19, og placere dem i 15 mL iskold Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS) i en 60-mm petriskål. Holde parabol på is.
Bemærk: Embryoner på en række faser fra E13.5 til E18.5 har været anvendt med succes. - (Valgfrit) Vaske indre ører ved forsigtigt at ryste dem i en 50 mL konisk rør indeholdende 30 mL iskold HBSS og erstatte HBSS tre eller fire gange. Hold røret på is.
Bemærk: Dette trin begrænser risikoen for forurening af vævskultur og bringer hurtigt temperaturen til 4 ° C, som forhindrer væv nedbrydning og celle død. - Ved hjælp af to par af fine #5 pincet, adskille de indre ører fra den tidsmæssige knoglen og overføre ørerne, tre eller fire ad gangen, ind i en 60-mm petriskål fyldt med iskolde HBSS.
- Dissekere de vestibulære sanseorganer.
- Orientere den ører mediale side op og Find utricle. Med to par af #5 pincet, fjerne brusk omkring de vestibulære organer. Forsigtigt sever det vestibulære nerve, forbindelsen mellem utricle og saccule og halvrunde kanaler, som vist i figur 1. Træk forsigtigt utricle og de vedlagte ampullae af den overlegne og vandrette halvrunde kanaler fra øret.
Bemærk: Denne metode kan anvendes på indre ører af stadier E16.5 - E18.5. Bevare brusk fragmenter for afsnit 3 nedenfor.
- Orientere den ører mediale side op og Find utricle. Med to par af #5 pincet, fjerne brusk omkring de vestibulære organer. Forsigtigt sever det vestibulære nerve, forbindelsen mellem utricle og saccule og halvrunde kanaler, som vist i figur 1. Træk forsigtigt utricle og de vedlagte ampullae af den overlegne og vandrette halvrunde kanaler fra øret.
- Dissekere cochlea.
- Fjerne bruskspidserne vævet omkring høringen orgel med to par af #5 pincet. Forsigtigt afbryde forbindelsen mellem den cochlear base og saccule som vist i figur 1.
Bemærk: For stadier E13.5 - E14.5, blødgøre brusk før dissektion af behandling af inderste ører med 0,25% collagenase jeg i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) løsning for 5 min ved stuetemperatur. Bevare brusk fragmenter for afsnit 3 nedenfor.
- Fjerne bruskspidserne vævet omkring høringen orgel med to par af #5 pincet. Forsigtigt afbryde forbindelsen mellem den cochlear base og saccule som vist i figur 1.
- Ved hjælp af en 200-µL afpipetteres udstyret med en bred nonstick tip, overføre utricles og cochleae til en 30-mm petriskål fyldt med vækstmediet bestående af DMEM/F12 suppleret med 33 mM Dglucose, 19 mM natriumbikarbonat, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 1 mM glutamin, 1 mM nicotinamid, 20 mg/L epidermal vækstfaktor, 20 mg/L fibroblast vækstfaktor, 10 mg/L insulin, 5,5 mg/L transferrin, og 5 µg/L natrium selenite.
- Opretholde utricle præparater i op til 3 timer ved 37 ° C i en cellekultur inkubator gasset med 5% kuldioxid tillade heling af nedskæringer i epitel indført under dissektion. Cochlea præparater bør overføres til kollagen gel 10 min efter dissektion.
Bemærk: Fordi dissektion er udført i iskold HBSS, er der ingen grund til at pre varme vækstmediet til 37 ° C.
3. (valgfrit) tilpasse kollagen jeg Gel stivhed ved at tilføje varierende koncentrationer af chondrocytter
Bemærk: Metoden for Chondrocyt isolation blev ændret fra Gosset et al. 20
- Der fremstilles en 1% opløsning af collagenase I sterile 1 x PBS og store 100-200 µL alikvoter ved-80 ° C. Afrimning på is, når det er nødvendigt, at undgå flere fryse-tø cykler.
- Brug fine pincet til at indsamle stykkerne af brusk fra dissektion af de vestibulære og auditive organer fra 10-12 ører til overs. Separat bindevæv og indre øre væv fra brusk. Overføre brusk til en 30-mm petriskål og tilsæt 300 µL i sterile vækstmediet.
- Bruge en steril skalpel blade eller iridectomy saks med stumpe buede tips til hakkekød væv for at opnå brusk stykker ca 0.5 mm i længden.
- Tilføje collagenase I til medium med brusk til at opnå en endelig enzym koncentration af 0,25%. Overføre skålen til en cellekultur inkubator ved 37 ° C gasset med 5% kuldioxid. Med pipette overfoeres kraftigt ved hjælp af en 1.000 µL afpipetteres hvert 20 min, indtil stykker af brusk tager afstand og ikke længere kan skelnes i opløsningen, derefter inkuberes i en yderligere 20 min.
Bemærk: I tilfælde af utricle præparater, kan Chondrocyt isolation udføres under trin 2.9; det tager ca 2 h (3-4 pipettering runder). - Indsamle cellesuspension i en 15 mL konisk slange og justere lydstyrken til 10 mL sterilt 1 x PBS. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspend celler i 10 mL sterilt 1 x PBS. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
Bemærk: Det er afgørende for at cellerne vaskes to gange; eventuelle resterende collagenase jeg vil fordøje kollagen jeg gel. - Bruger en 200 µL pipette, Tilsæt 100 µL af næringssubstratet til celle pellet og afpipetteres forsigtigt til resuspend. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og vedligeholde dem på is før brug.
- For at øge gel stivhed, tilføje chondrocytter til neutraliseret kollagen jeg gel løsning (afsnit 1) og bland hurtigt at distribuere celler i hele gel før størkning.
Bemærk: Den elasticitetsmodul af kollagen jeg gel (et mål for stivhed), stiger lineært med antallet af chondrocytter tilføjet11. Forholdet er beskrevet af den eksperimentelt bestemte lineær funktion E = 206· NC + 15, hvor E er elasticitetsmodul i PA og Nc er antallet af chondrocytter i millioner. For en detaljeret protokol for gel henvises stivhed målinger til den oprindelige artikel11.
4. Placer den vestibulær eller auditiv sanseorgan i en kollagen jeg Gel
- I sterile 1,5 mL rør, forberede kollagen jeg polymerisering løsning ved at blande 160 µL 10 x PBS med phenol rød pH indikator, 133 µL 0,34 M natriumhydroxidopløsning, 70 µL af 0,9 M natriumbikarbonat og 40 µL 1 M HEPES. Hold røret på is.
Bemærk: Denne opskrift giver polymerisering løsning nødvendig for at forberede 2 mL af kollagen jeg gel, men kan skaleres efter behov. - Mix 100 µL af polymerisering løsning og 400 µL af kollagen jeg løsning på isen ved forsigtigt pipettering op og ned i en kølet 1,5 mL tube. For at øge gel stivhed, tilsæt 50 µL af vækstmediet indeholdende chondrocytter og bland forsigtigt som beskrevet i afsnit 3.
- Overføre 500 µL af neutraliseret kollagen jeg løsning til en kølet 30-mm petriskål med en 10 mm glas-bund indsætte eller et godt af en fire-godt plade.
Bemærk: Det er afgørende at holde alle reagenser på isen for at forhindre hurtig og ujævn polymerisering af kollagen jeg. - Hurtigt overføre cochleae eller utricles til de neutraliseret kollagen jeg løsning og justere organer til deres ønskede positioner med en steril hår kniv18 eller et par fine pincet.
Bemærk: Kollagen jeg polymerisering bliver mærkbar efter 1-2 min, da løsningen bliver grumset. - Efter løsning omkring væv har polymeriserede, placere petriskål eller fire-godt plade i 20 min. ved 37 ° C i en cellekultur inkubator gasset med 5% kuldioxid til sikrer komplet polymerisering.
- Tilføj 3 mL af vækstmediet suppleret med 0,5% føtal bovint serum (FBS) pr. petriskål eller 500 µL af den samme medium pr. brønd af et fire-godt plade. Bevare kultur ved 37 ° C i en cellekultur inkubator gasset med 5% kuldioxid. Hvis det ønskes, supplere vækstmediet med 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) til at etikettere prolifererende celler.
Bemærk: Højere FBS koncentrationer kan bruges, hvis det ønskes.
5. viral injektioner i tre-dimensionelle kulturer af vestibulære og auditive sanseorganer
- Optø den ønskede virus på is og bland med trypan blå løsning i en 0,5 mL konisk slange til at opnå en endelig farvestof koncentration på 0,05%. Brug 10-20 x farvestof til at undgå betydelig udvanding af virus. Holde på is.
Bemærk: Adenovirus serotype 5 virker bedst for at inficere støtte celler i utricle19, hvorimod adeno-associeret virus Anc80 kan inficere både hårceller og støtte celler i utricle og cochlea21. - Bryde spidsen af et glas nål tilberedt på en mikropipette aftrækker med rene fine pincet mens observere det med den højeste forstørrelse af en binokular dissekere mikroskop.
Bemærk: Det er vigtigt at optimere indstillingerne på nål puller. Nåle med 9 - 12-mm shanks og 20 - 30 µm åbninger fungerer bedst. - Fjerne et sanseorgan kultur fra rugemaskinen. Tillægger microinjector nålen og fyld den med 2-3 µL af farvestof og virus blanding. Rykke nålen ind i den sanseorgan mens observere det under den kikkert dissekere mikroskop.
- Forsigtigt drive nål spidsen gennem mesenchymale og epitel lag af taget af en tre-dimensionel utricular kultur. Injicere viral blandingen, indtil hulrum af utricle og ampullae fylde med det blå farvestof.
Bemærk: Fordi det giver mulighed for nem adgang til sanseorganer, er en 10-mm glas-bund petriskål optimal for injektioner. - Der inkuberes ved 37 ° C i en cellekultur inkubator gasset med 5% kuldioxid.
Bemærk: Når grønt eller rødt fluorescerende protein bruges i den virale konstruktion, er fluorescens tilsyneladende 24 h efter viral transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vestibulære og auditive sanseorganer fra embryonale ører, kulturperler i 40-Pa kollagen geler efterligne lav stivhed embryonale betingelser11, bevare relativt normale tredimensionale strukturer (figur 1) og vedligeholde hårceller og støtte celler (figur 2 og figur 3). Selv om støtte celle tæthed mindskes med over 30% (Students t -test: n = 4, p < 0,004) og hår celle tæthed falder med 60% (Students t -test: n = 5, p < 0,0001) efter 3 dage i utricular kulturer (figur 2 ), området i den gule plet mere end fordobler i samme periode af tid11 (n = 3, p = 0.0002). Dette viser, at metoden for tre-dimensionelle kultur beskrevet her giver mulighed for en betydelig stigning i antallet af støtte celler11, samtidig med at 80% af eksisterende hårcellerne i utricle over en 3 dag periode. I de tre-dimensionelle kulturer etableret fra E14.5 cochlea, differentiere Sox2-positive stamceller som Morfologisk adskiller rækker af indre og ydre hårceller efter 3 dage i kultur (figur 3).
Genekspression kan manipuleres i tre-dimensionelle kulturer af vestibulære og auditive sanseorganer gennem viral infektion. 4hydroxytamoxifen er tilføjet til næringssubstratet til etiketten støtte celler i de cochlear explants etableret fra E15.5 embryoner fra Lfng-CreERT2/tdTomato mus17. Injektion af adenovirus skrive 5 i lumen af kultur resulterer i infektion af støtte celler på orglet base (figur 4A). Indsprøjtning af det samme virus i lumen af utricular kultur etableret fra E17.5 Foster, resultater primært i infektion af støtte celler i sensoriske epitel (fig. 4B).
Figur 1. Skematiske diagrammer af dissektioner og lys-mikroskopiske billeder af repræsentative kulturer af utricle og cochlea i tre-dimensionelle kollagen jeg geler. (A) A skematisk tegning skildrer de sensoriske epitheler (grønne) af seks receptor organer i det murine indre øre. De røde linjer at afgrænse de nedskæringer, der er indført under dissektion af en utricle og cochlea. (B) lysmikroskopi billeder skildrer E17.5 utricle (øverste panel) og E14.5 cochlea (nederste panel) indlejret i kollagen jeg gel og kulturperler for 48 h. Skala søjler repræsenterer 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Gnedeva mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Hårceller og støtte celler i tre-dimensionelle utricular kulturer. (A) Confocal-mikroskopiske billeder skildrer en E18.5 utricle inden explantation (top paneler) og efter 3 dage i en tre-dimensionel kultur i 40-Pa kollagen jeg gel (bunden paneler). Hår celler er mærket for Myo7A (grøn) og støtte celler til Sox2 (rød). Skalalinjen repræsenterer 50 µm. (B) kvantificeringer støtte celle tætheder (røde søjler), hår celle tætheder (grønne barer) og makulært områder (grå søjler) i E18.5 utricles explantation og efter 3 dage i tre-dimensionelle orgel kultur er repræsenteret som middel ± SEMs (p < 0,001 er repræsenteret som ** og p < 0.0001 som ***). Dette tal er blevet ændret fra Gnedeva et al. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Hårceller og støtte celler i tre-dimensionelle cochlear kulturer. Konfokal-mikroskopiske billeder skildrer en E14.5 cochlea inden explantation (top paneler) og efter 3 dage i en tre-dimensionel kultur i 40-Pa kollagen jeg gel (bunden paneler). Myo7A - og Sox2-positive indre hårceller (IHC) og ydre hårceller (OHC) vises i 4-5 rækker efter 3 dage i kultur. Støtte celler er også mærket for Sox2 (rød). Skalalinjen repræsenterer 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative resultater af virale infektioner i tre-dimensionelle orgel kulturer i cochlea og utricle. (A) injektion af adenovirus serotype 5 i tre-dimensionelle cochlear kulturer etableret fra Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 embryoner resultater i infektion (NGL, grønne) af støtte celler (tomat, rød) i bunden af orglet. Den sensoriske epitel er afgrænset i grå. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. (B) en identisk injektion i en tre-dimensionel utricular kultur etableret fra embryonet E17.5 resulterer i infektion (normal god landbrugspraksis, grøn) af støtte celler (Sox2, red) i hele orglet. Den sensoriske epitel er afgrænset i grå. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Gnedeva et al. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De molekylære signaler, der mægle vækst og differentiering i det indre øre under udvikling er blevet studeret grundigt5,6,7,8,9,10. Dog tyder fremstillet af utricular modelsystem på, at mekanisk stikord, fornemmede gennem celle vejkryds og aktivering af Hippo signalering, også spille en vigtig rolle i disse processer2,11, 22. desuden både ekstrudering af døende hår celler fra sensoriske epitel og efterfølgende dannelse af nye sensoriske receptorer gennem transdifferentiation kan påvirke den mekaniske styrke sanses af den resterende støtte celler, der forårsager dem. til at genindtaste cellecyklus under regenerering. Tre-dimensionelle kultur systemet beskrevet her giver et eksperimenterende middel til at undersøge både mekanisk kraft i vækst kontrol under indre øre udvikling11 rolle og potentielt, rolle af samme kraft under hår celle regenerering. Derudover metoden letter virusinfektion, der giver en metode til at ændre genekspression i sensoriske epitel, dermed tillade en kombination af mekanisk og molekylær manipulationer til efterforskning af vækst og regeneration i den ørets sanseorganer11.
Begrænsningerne af metoden, der vedrører den minimale oplysninger tilgængelige på endogene styrker og mekaniske stimuli under indre øre embryogenese. Målinger af væv stivhed i den tredje indre øre findes ikke til vores viden; Det er derfor vanskeligt at vurdere, hvilke stivhed af kollagen jeg gel svarer til i vivo betingelser. Vores observationer og model foreslår, at den kraft imod vækst af utricle er lav i første omgang og øger som orglet nærmer sig sit endelige størrelse11. Vi hypotesen derfor, at en kollagen jeg gel uden chondrocytter er en fysiologisk relevante substrat i at kultur embryonale vestibulære og auditive sanseorganer.
De tre-dimensionelle kultur metode beskrevet her inducerer dannelsen af ny støtte celler i utricular gule plet11, mens også opretholde over 80% af hårcellerne efter 3 dage i kultur (figur 2). Metoden, derfor repræsenterer et bedre alternativ til to-dimensionelle kulturer af utricle, i hvilken kun 40-50% af hårcellerne overleve efter de første 24 h i kultur5,8, og kan bruges til at studere hår celle sårbarheder og regenerering in vitro.
Selv om vi påvise dannelsen af anatomisk adskilte organiseret rækker af indre og ydre hårceller i kulturperler organ under Corti, er mere arbejde påkrævet for at afgøre, om de tre-dimensionelle kultur metode beskrevet her understøtter normal cochlear ventilationskanal brudforlængelse under processen af konvergerende extension (CE)23,24,25. CE er en yderst dynamisk proces, der involverer celle migration, omlægning og cell-celle kontakt ændringer26 , der sandsynligvis vil blive berørt af den ydre kraft produceret af væv omkring udviklende cochlear ventilationskanal. Denne metode bevarer relativt normale tre-dimensionelle væv arkitektur, og kunne potentielt være til gavn for studiet af CE i vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi og A. Petelski for deres bidrag til den oprindelige forskning som denne protokol er baseret. Vi takker også J. lamaer og W. Makmura for teknisk bistand og husdyrhold. Vi anerkender NIDCD uddannelse grant T32 DC009975, NIDCD give R01DC015530, Robertson terapeutiske Udviklingsfond og Caruso Family Foundation for finansiering. Endelig, vi anerkender støtte fra Howard Hughes Medical Institute, som Dr. Hudspeth er en Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
