Summary
Organotypic תלת מימדי התרבויות של מאתר utricle, שבלול ב שטיחות נקה קולגן אני ג ' לים שימור רקמות מולדת מורפולוגיה לאפשר גירוי מכני באמצעות התאמה של מטריקס נוקשות, אישור המסירה הגן וירוס בתיווך.
Abstract
אברי החישה של האוזן הפנימית הם מאתגרים ללמוד אצל יונקים בשל הנגישות שלהם כדי מניפולציה ניסויית והתבוננות אופטי. יתר על כן, למרות שיטות חקלאות הקיים לאפשר לפליטת הביוכימי, שיטות אלה אינם מספקים אמצעי כדי לבחון את השפעות כוח מכני וקשיחות ברקמות במהלך הפיתוח של אברי החישה באוזן הפנימית. כאן נתאר שיטת organotypic תלת מימדי התרבות של utricle מאתר ללא פגע, שבלול מתגבר על מגבלות אלה. הטכניקה עבור התאמת מנדנד מטריקס תלת מימדי המתוארים כאן מאפשר מניפולציה של כוח אלסטי מנוגדות של רקמה. שיטה זו ולכן ניתן ללמוד את התפקיד של כוחות מכני במהלך הפיתוח באוזן הפנימית. בנוסף, התרבויות אישור המסירה הגן וירוס בתיווך, אשר יכול לשמש לניסויים רווח, הפסד-של-פונקציה. שיטה זו תרבות משמרת תאים שיער מולדת של תמיכה תאים, משמש חלופה מעולה שעשוי להיות לתרבות דו-ממדית מסורתית של איברי חישה שיווי המשקל ושמיעתיים.
Introduction
כבר בהנחייתם של המחקר של רוב ההיבטים של התפתחות האיברים בתרבית של מערכות במבחנה . שתי השיטות העיקריות המשמשים כיום עבור התרבות של איברי חישה שיווי המשקל: לתרשים1 וההכנות חסיד2 . שתי השיטות היתר החקירה של תא שיער פגיעויות3 והתחדשות1,4 בתוך חוץ גופית. בנוסף, יש התפקידים התפתחותית של דרגה5,6,7,ונ ט8, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR)9,10 איתות cascades באוזן הפנימית הוקם, בין השאר, באמצעות תרבויות במבחנה של epithelia חושית. עם זאת, צמיחת תאים ובידול נשלטים, לא רק באמצעות איתות על ידי אורגניזם, אלא גם דרך רמזים הפיזי ועל מכניים כגון אנשי קשר המערכת, את הנוקשות של מטריצה חוץ-תאית, ו מכני מתיחה או כיווץ. התפקיד של גירויים מכניים כזה הוא מאתגר לחקור ב האוזן הפנימית המתפתח בתוך vivo. יתר על כן, קיימות שיטות התרבות לתרשים חסיד אינם מתאימים כגון לימודי חוץ גופית בתוך. כאן נתאר שיטת לתרבות organotypic תלת מימד של קולגן אני ג ' לים של נוקשות בדרגות שונות. בשיטה זו במידה רבה שומרת על הארכיטקטורה ויוו של אברי החישה שיווי המשקל, שבלול, מאפשר חקירה של השפעות כוח מכני בהתפתחותם11.
מאחר גירויים מכניים ידועים כדי להפעיל אירועים מולקולריים במורד הזרם, כגון ההיפופוטם איתות לשביל12,13,14,15, חשוב להיות מסוגל לשלב בין גירוי מכני עם מניפולציות גנטיות הביוכימי. שיטת תרבות המתוארים כאן אישורי המסירה הגן וירוס בתיווך, ולכן ניתן ללמוד מכני וגם מולקולרית איתות במהלך פיתוח באוזן הפנימית11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של אוניברסיטת רוקפלר, של אוניברסיטת דרום קליפורניה.
1. (אופציונלי) הכנת קולגן אני הפתרון של הגידים Mouse-tail
הערה: קולגן אני פתרונות זמינים מסחרית. בצע הוראות היצרן להכנה ג'ל.
- המתת חסד 5-10 עכברים צעירים מבוגר (בן 3-5 שבועות) של כל זן פראי סוג עם פחמן דו חמצני לפי הפרוטוקול אושר על ידי ה הרלוונטיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש16. לאסוף את הזנב ולחטא אותם על ידי השוקע אתנול 70% למשך תקופה מינימלית של 4 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: הדגירה במשך יותר מ 48 שעות יש להימנע, כפי שהוא מתבטא התייבשות יתר רקמת פוגעת תהליך החילוץ גיד. - הסר את העור כל זנב על ידי היכרות עם חתך האורך עם להב סכין היציבה העור שלם עם מלקחיים. להעביר את זנבות עור צלחת פיטרי 100-מ מ מלא עם אתנול 70% נקי וחתכו אותם לחלקים 10 מ מ.
הערה: למחוק את החלקים הדק של הזנבות, אשר קשה לתמרן. - באמצעות מלקחיים, להבטיח שכל קטע של הזנב לתחתית הפטרי ולהשתמש זוג מלקחיים בסדר השני כדי לחלץ את הגידים זנב אחד בכל פעם. סיבי הגיד הפרט צריך להגיח עם התנגדות מינימלית.
הערה: מלקחיים #5 הישן, משעמם עובד היטב עבור שלב זה. - להכין 100 מ של פתרון 0.1% (לפי נפח) של חומצה אצטית במים סטרילי, ברמה המולקולרית ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון זה צלחת פטרי סטריליות 100-מ מ. להעביר את הגידים הפטרי, להשאיר לשעה בטמפרטורת החדר כדי denature הקולגן.
- השתמש מספריים אזמל או iridectomy סטרילי עם טיפים בוטה, מעוגל כדי מינצ הגיד לחלקים 1-2 מ מ. להעביר את הגידים טחון שפופרת 50-mL סטרילי ולהוסיף 0.1% חומצה אצטית להביא את אמצעי האחסון 50 מ.
הערה: להשתמש ארבע או חמש זנבות על כל 50 מ ל חומצה כדי להשיג קולגן אני ריכוז של 2.0-2.5 מ"ג/מ"ל. - להכניס למקרר הקולגן אני הפתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 48 שעות כדי להקל על דנטורציה של חלבונים מלאה. מערבולת עם מערבולת שולחן להגדיר את מהירות מקסימאלית עבור 1 דקות פעמיים ביום.
- למדוד את ריכוז חלבון הפתרון באמצעות וזמינותו חומצה bicinchoninic, להתאים את הקולגן אני ריכוז 2.0-2.5 מ"ג/מ"ל על-ידי הוספת 0.1% תמיסת חומצה אצטית, וחנות ב 4 º C.
הערה: קולגן אני הפתרון ניתן לאחסן במשך שנה-שנתיים. - (אופציונלי) Centrifuge הקולגן אני הפתרון ב- g x 2,000 עבור h 1-4 ° C ושימוש שקוף העליון השבר (כמחצית האחסון), כדי להשיג קולגן שטיחות ברור ג ' לים בסעיף 4.
2. ניתוח אברי שיווי המשקל ושמיעתיים
- המתת חסד עכברים בהריון של כל זן עם פחמן דו חמצני לפי הפרוטוקול אושר על ידי ה הרלוונטיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש16. לחלץ, לערוף את העוברים.
הערה: Lfng-CreERT2/tdTomato עכברים יכול לשמש כדי לאפשר תיוג קבוע לתמוך תאים עם חשיפה ל 4-hydroxytamoxifen17. - לעקר כל משטחי עבודה, כלי ניתוח, כולל שני זוגות של מלקחיים #5, הסכין שיער18, על-ידי ניקוי אותם עם 70% אתנול.
- פיצול כל ראש לשני חצאים על ידי הצגת חתך האורך עם להב האזמל סטרילי או באמצעות שני זוגות #5 מלקחיים. לחלץ עצמות הרקה, להכיל את לאוזניים הפנימיות19, ומניחים ל-15 מיליליטר של האנק כקרח מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) בצלוחית 60 מ מ. שמור את המנה על קרח.
הערה: העוברים במגוון שלבים מ E13.5 כדי E18.5 שימשו בהצלחה. - (אופציונלי) לשטוף לאוזניים הפנימיות על ידי בעדינות בטילטול 50 מ ל צינור חרוטי המכיל 30 מ ל קרה כקרח HBSS והחלפה של HBSS של שלוש או ארבע פעמים. שמור את הצינורית על קרח.
הערה: שלב זה מגביל זיהום אפשרי של התרבות רקמות ומביא במהירות את הטמפרטורה עד 4 ° C, המונע מוות השפלה ותא רקמות. - באמצעות שני זוגות של מלקחיים #5 בסדר, להפריד לאוזניים הפנימיות הרקה, להעביר את האוזניים, שלושה או ארבעה בכל פעם, לתוך צלחת פטרי 60 מ מ מלא HBSS קר כקרח.
- לנתח את אברי החישה שיווי המשקל.
- אוריינט הצד המדיאלי אוזניים למעלה ואתר את utricle. עם שני זוגות של מלקחיים #5, הסר את הסחוס המקיף של אברי שיווי המשקל. בעדינות סבר העצב vestibular, הקשר בין utricle את saccule, ואת התעלות semicircular, כפי שמוצג באיור1. משוך בעדינות את utricle, את אמפולות המצורפת של התעלות semicircular מעולה ואופקיים מהאוזן.
הערה: שיטה זו יכולה לשמש על אוזניים הפנימיות של שלבי E16.5 - E18.5. לשמר את שברי סחוס בסעיף 3 להלן.
- אוריינט הצד המדיאלי אוזניים למעלה ואתר את utricle. עם שני זוגות של מלקחיים #5, הסר את הסחוס המקיף של אברי שיווי המשקל. בעדינות סבר העצב vestibular, הקשר בין utricle את saccule, ואת התעלות semicircular, כפי שמוצג באיור1. משוך בעדינות את utricle, את אמפולות המצורפת של התעלות semicircular מעולה ואופקיים מהאוזן.
- לנתח שבלול.
- הסר את רקמות הסחוס המקיפים את האיבר שמיעה עם שני זוגות #5 מלקחיים. בעדינות לנתק את הקשר בין הבסיס שבלולי saccule כפי שמוצג באיור1.
הערה: עבור שלבים E13.5 - E14.5, לרכך את הסחוס לפני ניתוח על ידי טיפול הפנימי אוזניים עם collagenase 0.25% אני בפתרון באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשמר את שברי סחוס בסעיף 3 להלן.
- הסר את רקמות הסחוס המקיפים את האיבר שמיעה עם שני זוגות #5 מלקחיים. בעדינות לנתק את הקשר בין הבסיס שבלולי saccule כפי שמוצג באיור1.
- שימוש pipet 200-µL מצויד טיפ רחב nonstick, להעביר את utricles ואת cochleae צלחת פטרי 30-מ מ מלא עם מדיום הגידול הכוללת DMEM/F12 בתוספת 33 מ מ Dglucose, 19 מ מ סודיום ביקרבונט, 15 מ מ 4(2hydroxyethyl)- חומצה 1piperazineethanesulfonic (HEPES) 1 מ"מ גלוטמין, 1 מ"מ nicotinamide, גורם הגדילה באפידרמיס 20 מ ג/ליטר, 20 מ ג/ליטר פיברובלסט גורם גידול, אינסולין 10 mg/L, transferrin 5.5 מ ג/ליטר, 5 µg/L סודיום סלניט.
- לשמור על ההכנות utricle עד 3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר ריפוי של קיצוץ האפיתל הציג במהלך הקרע. שבלול הכנות צריך להעביר את הג'ל קולגן 10 דקות לאחר הקרע.
הערה: כי הקרע מבוצע ב HBSS קר כקרח, שאין אין צורך לחמם את מדיום הגידול כדי 37 מעלות צלזיוס.
3. (אופציונלי) להתאים קולגן אני ג'ל קשיחות על-ידי הוספת ריכוזים שונים של Chondrocytes
הערה: שיטת chondrocyte בידוד שונה מ- Gosset. et al. 20
- להכין פתרון 1% של collagenase אני עקר 1 x PBS וחנות 100-200 µL aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. הפשרה על קרח בעת הצורך, הימנעות מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה.
- מלקחיים בסדר להשתמש כדי לאסוף את השברים של הסחוס נשאר ניתוח אברי שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים 10-12. נפרד רקמות החיבור ואת האוזן הפנימית של הסחוס. להעביר את הסחוס צלחת פטרי 30-מ מ ולהוסיף 300 µL של מדיום הגידול סטרילי.
- השתמש האזמל סטרילי להב או iridectomy מספריים עם טיפים מעוקל בוטה לרכך את הרקמה כדי להשיג חתיכות הסחוס כ 0.5 מ מ אורך.
- להוסיף collagenase את המדיום עם סחוס כדי להשיג ריכוז האנזים הסופי של 0.25%. להעביר את המנה חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס בגז עם 5% פחמן דו-חמצני. Pipet נמרצות באמצעות pipet 1,000 µL כל 20 דקות עד חתיכות הסחוס מביצועם הם כבר לא ניתן להבחנה בפתרון, ואז תקופת דגירה של 20 דקות נוספות.
הערה: במקרה של ההכנות utricle, בידוד chondrocyte יכול להתבצע במהלך שלב 2.9; זה לוקח כ 2 h (3-4 סיבובים pipetting). - לאסוף את התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ולכוונן את העוצמה עד 10 מ"ל עם PBS x 1 סטרילי. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של PBS x 1 סטרילי. צנטריפוגה-g x 800 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.
הערה: חשוב לשטוף את התאים פעמיים; כל collagenase הנותרים לעכל הקולגן שאני ג'ל. - שימוש pipet 200-µL, להוסיף 100 µL של תרבות בינוני ה תא גלולה ל pipet בעדינות כדי resuspend. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולשמור אותם על קרח לפני השימוש.
- כדי להגביר את ג'ל קשיחות, להוסיף chondrocytes הקולגן ינוטרלו ג'ל פתרון (סעיף 1). ומערבבים במהירות כדי להפיץ את התאים לאורך כל הג'ל לפני התמצקות.
הערה: הנפח של הקולגן אני ג'ל (מידת קשיחות), עולה באופן ליניארי עם מספר chondrocytes הוסיף11. הגומלין מתואר על ידי פונקציה לינארית השפעול נחוש E = 206· Nc + 15, שבו E הוא הנפח פסקל ומתגבר, Nc הוא המספר של chondrocytes במיליונים. עבור פרוטוקול מפורט עבור ג'ל קשיחות מדידות נא עיין במאמר המקורי11.
4. מניחים את האיבר חושית שיווי המשקל או שמיעתי ב קולגן שאני ג'ל
- צינור 1.5-mL סטרילי, להכין קולגן אני הפילמור פתרון על ידי ערבוב µL 160 ל- PBS x 10 עם מחוון ה-pH פנול אדום, 133 µL של 0.34 M נתרן הידרוקסידי, µL 70 של 0.9 M סודיום ביקרבונט µL 40 של 1 מ' HEPES. שמור את הצינורית על קרח.
הערה: המתכון הזה מספק את הפתרון הפילמור דרושים כדי להכין 2 מ"ל של קולגן ג'ל, אבל ניתן לשנות לפי הצורך. - מיקס 100 µL של פתרון פלמור, µL 400 של קולגן אני פתרון על הקרח על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה צינור 1.5-mL צוננת. כדי להגביר את ג'ל קשיחות, להוסיף 50 µL של מדיום הגידול המכיל chondrocytes ולערבב בעדינות כמתואר בסעיף 3.
- העברת µL 500 של הקולגן ינוטרלו אני הפתרון 30-מ מ פטרי צונן עם הוספת זכוכית 10 מ מהתחתון או טוב של צלחת ארבע-. טוב.
הערה: חשוב לשמור את כל ריאגנטים על קרח כדי למנוע פלמור מהירה, לא אחיד של הקולגן אני. - העבר במהירות את cochleae או utricles כדי לנטרל הקולגן אני הפתרון ולהתאים את האיברים לעמדות הרצוי שלהם עם שיער סטרילי הסכין18 או זוג מלקחיים בסדר.
הערה: קולגן אני הפילמור הופך להיות מורגש לאחר 1-2 דקות כמו הפתרון הופך עכורים. - לאחר הפתרון סביב הרקמה יש polymerized, למקם את צלחת פטרי או ארבע-ובכן לוח עבור 20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו חמצני כדי להבטיח הפילמור מלאה.
- להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת 0.5% סרום שור עוברית (FBS) לכל צלחת פטרי או 500 µL של המדיום אותו לאדם טוב של צלחת ארבע-. טוב. לשמור על התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני. אם רצונך בכך, תוספת מדיום הגידול עם 10 מיקרומטר 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) לסמן תאים מתרבים.
הערה: ריכוז FBS גבוה יכול לשמש במקרה הצורך.
5. נגיפי זריקות בתרבויות תלת מימדי של שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה
- מפשירים את הוירוס הרצוי על קרח ומערבבים עם פתרון trypan blue 0.5 mL צינור חרוטי להשגת ריכוז לצבוע הסופי של 0.05%. השתמש 10-20 x צבע כדי למנוע דילול משמעותי של הנגיף. לשמור על הקרח.
הערה: אדנו אדנו 5 עובד בצורה הטובה ביותר להדביק תאים התומכים ב- utricle19, ואילו וירוס adeno-הקשורים Anc80 יכול להדביק תאים שיער הן ותמיכה התאים את utricle ואת ה שבלול21. - לשבור את קצה מחט זכוכית שהוכנו על פולר micropipette עם מלקחיים נקי בסדר תוך התבוננות על זה ברמת ההגדלה הגבוהה ביותר של המשקפת לנתח מיקרוסקופ.
הערה: חשוב למטב את הגדרות פולר המחט. מחטים עם שאנקס 9 - 12 מ מ ו- 20 - 30-מיקרומטר פתחים פועלות בצורה הטובה ביותר. - הסר את תרבות איבר החישה של החממה. לצרף את המחט microinjector ולמלא את זה עם 2-3 µL של תערובת לצבוע ווירוסים. תוחבים את המחט לתוך איבר החישה תוך התבוננות על זה תחת התאום לנתח מיקרוסקופ.
- לנהוג בעדינות את מחט דרך שכבות mesenchymal ואפיתל של הגג של תרבות utricular תלת מימדי. להזריק את התערובת ויראלי עד החללים של utricle, אמפולות למלא הצבע הכחול.
הערה: כי זה מאפשר גישה נוחה אל איברי חישה, צלחת פטרי 10 מ מ זכוכית-התחתון היא אופטימלית על הזריקות. - דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני.
הערה: כאשר חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום נעשה שימוש הבונה ויראלי, ידי קרינה פלואורסצנטית הוא לכאורה 24 שעות לאחר התמרה חושית ויראלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אברי החישה שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים עובריים, תרבותי ב- 40-Pa קולגן אני ג'לים מחקה קשיות נמוכה תנאים עובריים11, שומרים על מבנים תלת מימדיים רגיל יחסית (איור 1) ולשמור על תאים שיער ו תומכים תאים (איור 2 , איור 3). למרות תמיכה תא צפיפות מקטין מעל 30% ( t -test של התלמיד: n = 4, p < 0.004) ומפחית את צפיפות השיער תא ב- 60% ( t -test של התלמיד: n = 5, p < 0.0001) לאחר 3 ימים בתרבויות utricular (איור 2 ), האזור של המקולה יותר מאשר זוגות מעל באותה התקופה של זמן11 (n = 3, p = 0.0002). זה מדגים כי השיטה לתרבות תלת מימדי המתוארים כאן מאפשר עבור עלייה משמעותית במספר התומכים תאים11, תוך שמירה על 80% של תאים שיער קיימים ב- utricle על פני תקופה 3 יום. בתרבויות תלת מימדי נוצרו משבלול E14.5, להבדיל Sox2-חיוביות ובתאים כשורות מורפולוגית ניתן להבחנה של תאים שיער הפנימיים והחיצוניים לאחר 3 ימים בתרבות (איור 3).
ניתן לטפל ביטוי גנים בתרבויות תלת מימדי של שיווי המשקל ושמיעתיים איברי חישה על-ידי זיהום ויראלי. 4hydroxytamoxifen נוסף המדיום תרבות לתווית ליווי תאים explants שבלול הוקמה מעוברים E15.5 של Lfng-CreERT2-/tdTomato-עכברים-17. הזרקה מסוג אדנו 5 לתוך לומן של התוצאות התרבות בזיהום של תמיכה תאים בבסיס של האיבר (איור 4א). הזרקת וירוס זהה לתוך לומן של תרבות utricular נוצרו מ- E17.5 העובר, תוצאות בעיקר זיהום של תומכים לתאים בכל חושי האפיתל (איור 4B).
איור 1. דיאגרמות סכמטית של והניתוחים ותמונות אור מיקרוסקופיים של תרבויות נציג של utricle, שבלול ב קולגן תלת מימדי אני ג ' לים- ציור סכימטי (א) A מתאר את epithelia חושית (ירוק) של שישה איברים קולטן של האוזן הפנימית מאתר. הקווים האדומים ניסחו את הקיצוצים הציג במהלך ניתוח utricle, שבלול. תמונות מיקרוסקופ אור (B) מצייר את E17.5 utricle (לוח העליון) ואת E14.5 שבלול (החלונית התחתונה) המוטבעות קולגן ג'ל ותרבותית במשך 48 שעות. פסי בקנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר. איור זה השתנה מ Gnedeva et al. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. תאים שיער, תאים התומכים תלת מימדי התרבויות utricular. (א) תמונות Confocal מיקרוסקופיים מתארים של utricle E18.5 לפני explantation (לוחות העליון), לאחר 3 ימים בתרבות תלת מימד ב- 40-Pa קולגן אני ג'ל (לוחות התחתון). תאים שיער מסומנות עבור Myo7A (ירוק), תמיכה תאים עבור Sox2 (אדום). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. (B) Quantifications לתמוך תא צפיפויות (ברים אדומה), צפיפות השיער תא (ברים ירוק) ואזורי מקולרי (ברים אפור) ב- utricles E18.5 לפני explantation, לאחר 3 ימים בתרבות איבר תלת מימדי מיוצג כפי שאומר ± SEMs (p < 0.001 מיוצגת * * ו- p < 0.0001 כמו * * *). דמות זו שונתה מ. Gnedeva et al. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תאים שיער, תאים התומכים בתרבויות תלת מימדיים בשבלול האוזן. תמונות קונאפוקלית מיקרוסקופיים מתארים של שבלול E14.5 לפני explantation (לוחות העליון), לאחר 3 ימים בתרבות תלת מימד ב- 40-Pa קולגן אני ג'ל (לוחות התחתון). תאים שיער הפנימי (IHC) Myo7A - ו Sox2-חיובית, תאים שיער החיצוני (OHC) מופיעים ב- 4-5 שורות לאחר 3 ימים בתרבות. תאים התומכים גם מסומנות עבור Sox2 (אדום). סרגל קנה מידה מייצג מיקרומטר 25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. התוצאות נציג של זיהומים נגיפיים בתרבויות איברים תלת מימדי של שבלול, utricle. (א) הזרקה של אדנו serotype 5 תרבות תלת מימדיים בשבלול האוזן שהוקמה מן Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 עוברי התוצאות זיהום (GFP, ירוק) בתמיכה תאים (אדום, עגבנייה) בבסיס איבר המין. האפיתל חושי תחום באפור. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. (B) זריקה זהים בתרבות utricular תלת מימדי הוקמה מן העובר E17.5 גורמת זיהום (GFP, ירוק) בתמיכה תאים (Sox2, אדום) לאורך איבר המין. האפיתל חושי תחום באפור. סרגל קנה מידה מייצג 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ. Gnedeva et al. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האותות מולקולרית כי הצמיחה התחלקות ובידול באוזן הפנימית במהלך הפיתוח כבר למד בהרחבה5,6,7,8,9,10. עם זאת, ראיות שהושגו ממערכת דגם utricular מרמז כי רמזים מכני, חש דרך צמתי תא והפעלה של היפו איתות, גם לשחק תפקיד חשוב אלה תהליכים2,11, 22. יתר על כן, גם ההבלטה של תאים שיער הגוסס של האפיתל חושית וגם היווצרות עוקבות של קולטני חישה חדש דרך transdifferentiation יכולה להשפיע על הכוח המכני חש מאת השארית תמיכה תאים, גורם להם להזין מחדש של מחזור התא במהלך התחדשות. מערכת תלת מימדי התרבות המתוארים כאן מספק אמצעי ניסיוני חוקרים גם את התפקיד של כוח מכני בשליטה הצמיחה במהלך פיתוח באוזן הפנימית11 וגם, באופן פוטנציאלי, תפקידו של אותו כוח במהלך תא שיער התחדשות. יתר על כן, הגישה מקלה על זיהום ויראלי מספק שיטה של שינוי גנים בתוך האפיתל חושית, וכך מאפשר שילוב של מניפולציות מכני ומולקולרית לחקירה של צמיחה והתחדשות, אברי החישה של האוזן11.
המגבלות של השיטה מתייחסים מינימלי המידע הזמין על כוחות אנדוגני ועל מכניים גירויים במהלך מופרה באוזן הפנימית. מדידות של רקמות קשיחות באוזן הפנימית המתפתח אינן קיימות לידע שלנו; ולכן קשה להעריך מה נוקשות של קולגן אני ג'ל המתאים לתנאים ויוו . התצפיות שלנו ואת המודל מציע כי הכוח מנוגדות צמיחת utricle נמוכה בתחילה, מגביר האיבר מתקרב שלה בגודל הסופי11. לכן לחזות כי קולגן שאני ג'ל ללא chondrocytes הוא מצע רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שבה תרבות עובריים שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה.
השיטה תלת מימדי התרבות המתוארים כאן גורם היווצרות של תאים חדשים התומכים utricular macula11, תוך גם שמירה מעל 80% של תאים שיער לאחר 3 ימים בתרבות (איור 2). השיטה, לכן, מייצג חלופה מעולה לתרבויות דו-ממדית של utricle % 40-50 רק אילו תאים שיער לשרוד לאחר 24 השעות הראשונות ב תרבות5,8, ניתן ללמוד נקודות תורפה תא שיער ו התחדשות בתוך חוץ גופית.
למרות נדגים היווצרות אנטומית להבדיל מאורגן שורות של תאים שיער הפנימיים והחיצוניים בתרבית איברים של קורטי, עוד עבודה נדרשת כדי לקבוע אם השיטה תלת מימדי התרבות המתוארים כאן תומכת נורמלי צינור שבלולי התארכות במהלך התהליך של הרחבת מתכנסת (CE)23,24,25. לסה נ הוא תהליך דינמי מאוד מעורבים תא העברה התמורות, תא-תא שינויים קשר26 סביר להיות מושפעת על ידי כוח חיצוני המיוצר על ידי רקמות הסובבת את צינור שבלולי המתפתח. שיטה זו לשמר אדריכלות יחסית הרקמות תלת מימדי, העלולים להיות מועיל עבור המחקר של CE במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ג'קובו א ד ר ד ר ג'יי Salvi, א Petelski על תרומתם למחקר המקורי שעליו מבוססת פרוטוקול זה. אנו מודים גם ג'יי לאמות, וו Makmura על גידול בעלי חיים וסיוע טכני. אנו להכיר מענק הכשרה NIDCD T32 DC009975, NIDCD הענק R01DC015530 רוברטסון טיפולית הקרן, הקרן המשפחתית קארוזו למימון. לבסוף, אנו להכיר תמיכה של הווארד יוז במכון הרפואי, אשר ד ר Hudspeth הוא חוקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
