Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Vestibular और श्रवण संवेदी अंगों की तीन आयामी Organotypic संस्कृतियों

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57527
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Department of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2Caruso Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 3Howard Hughes Medical Institute and Laboratory of Sensory Neuroscience, The Rockefeller University

Summary

murine utricle और कोक्लीअ के तीन आयामी organotypic संस्कृतियों ऑप्टिकली स्पष्ट कोलेजन में मैं सहज ऊतक आकृति विज्ञान की रक्षा, मैट्रिक्स कठोरता के समायोजन के माध्यम से यांत्रिक उत्तेजना के लिए अनुमति देते हैं, और वायरस की मध्यस्थता जीन वितरण की अनुमति.

Abstract

भीतरी कान के संवेदी अंगों प्रयोगात्मक हेरफेर और ऑप्टिकल अवलोकन के लिए उनके अप्राप्यता के कारण स्तनधारियों में अध्ययन करने के लिए चुनौती दे रहे हैं । इसके अलावा, हालांकि मौजूदा संस्कृति तकनीक जैव रासायनिक perturbations की अनुमति देते हैं, इन तरीकों को भीतरी कान संवेदी अंगों के विकास के दौरान यांत्रिक बल और ऊतक जकड़न के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक साधन प्रदान नहीं करते । यहां हम तीन के लिए एक विधि का वर्णन बरकरार murine utricle और कोक्लीअ है कि इन सीमाओं पर काबू के आयामी organotypic संस्कृति । एक तीन आयामी मैट्रिक्स कठोरता के समायोजन के लिए तकनीक यहां वर्णित लोचदार बल ऊतक विकास का विरोध के हेरफेर परमिट । इस विधि इसलिए भीतरी कान के विकास के दौरान यांत्रिक बलों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, संस्कृतियों वायरस मध्यस्थता जीन वितरण, जो लाभ और हानि के समारोह प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अनुमति देते हैं । इस संस्कृति विधि जंमजात बाल कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं को बरकरार रखता है और पारंपरिक दो vestibular और श्रवण संवेदी अंगों की आयामी संस्कृति के लिए एक संभावित बेहतर विकल्प के रूप में कार्य करता है ।

Introduction

स्तनधारी अंग विकास के अधिकांश पहलुओं के अध्ययन के द्वारा इन विट्रो प्रणालियों में सुविधा दी गई है. दो प्रमुख तरीकों अब vestibular संवेदी अंगों की संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है: मुक्त फ्लोटिंग1 और अनुयाई2 तैयारी । दोनों तरीकों बाल कोशिका कमजोरियों की जांच की अनुमति3 और पुनर्जनन1,4 इन विट्रो में। इसके अलावा, पायदान की विकासात्मक भूमिकाओं5,6, Wnt7,8, और एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR)9,10 संकेतन झरने भीतरी कान में है की स्थापना की गई, भाग में, के उपयोग के माध्यम से इन विट्रो संस्कृतियों संवेदी epithelia. हालांकि, सेल विकास और भेदभाव नियंत्रित कर रहे हैं, न केवल morphogens द्वारा संकेत के माध्यम से, लेकिन यह भी सेलुलर संपर्क के रूप में भौतिक और यांत्रिक संकेतों के माध्यम से, extracellular मैट्रिक्स की कठोरता, और यांत्रिक खींच या कसना. ऐसे यांत्रिक उत्तेजनाओं की भूमिका vivo मेंविकासशील भीतरी कान में जांच के लिए चुनौती दे रहा है । इसके अलावा, मौजूदा फ्री-फ्लोटिंग और अनुयाई कल्चर के तरीके इन विट्रो मेंऐसे अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं हैं । यहां हम तीन के लिए एक विधि का वर्णन आयामी organotypic संस्कृति कोलेजन मैं कठोरता बदलती के जैल में । इस विधि vivo में vestibular और कॉकलियर संवेदी अंगों की वास्तुकला को बरकरार रखता है और विकास और भेदभाव11पर यांत्रिक बल के प्रभाव की जांच की अनुमति देता है ।

यांत्रिक उत्तेजनाओं के बहाव के रूप में आणविक घटनाओं को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है, क्योंकि इस तरह के मार्ग12,13,14,15, यह यांत्रिक उत्तेजना गठबंधन करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है जैव रासायनिक और आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ । संस्कृति विधि यहां वर्णित वायरस मध्यस्थता जीन वितरण परमिट और इसलिए भीतरी कान विकास के दौरान दोनों यांत्रिक और आणविक संकेतन11अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित पशु देखभाल और रॉकफेलर विश्वविद्यालय के उपयोग समितियों और दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. (वैकल्पिक) की तैयारी कोलेजन मैं समाधान से माउस पूंछ tendons

नोट: कोलेजन मैं समाधान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । जेल तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।

  1. Euthanize 5-10 युवा वयस्क (3-5 सप्ताह पुरानी) प्रासंगिक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड के साथ किसी भी जंगली प्रकारकेतनाव के 16 । पूंछ ले लीजिए और उंहें कमरे के तापमान पर 4 ज की एक ंयूनतम के लिए ७०% इथेनॉल में विलय द्वारा संक्रमित ।
    नोट: ४८ से अधिक एच के लिए गर्मी से बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह अत्यधिक ऊतक निर्जलीकरण में परिणाम और पट्टा निष्कर्षण प्रक्रिया में बाधा उत्पंन ।
  2. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ एक अनुदैर्ध्य कटौती शुरू करने और संदंश के साथ पूरी त्वचा को वापस लेने के द्वारा प्रत्येक पूंछ से त्वचा को हटा दें । एक १०० मिमी पेट्री साफ ७०% इथेनॉल से भरा पकवान और उंहें 10 मिमी क्षेत्रों में कटौती करने के लिए चमड़ी पूंछ हस्तांतरण ।
    नोट: पूंछ के पतले भागों, जो हेरफेर करने के लिए मुश्किल है त्यागें ।
  3. संदंश का प्रयोग, पेट्री डिश के नीचे करने के लिए पूंछ के प्रत्येक खंड को सुरक्षित और ठीक संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करने के लिए एक समय में पूंछ एक से tendons निकालने । व्यक्तिगत पट्टा फाइबर ंयूनतम प्रतिरोध के साथ उभरने चाहिए ।
    नोट: पुराने, सुस्त #5 संदंश इस कदम के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं ।
  4. एक ०.१% समाधान की १०० मिलीलीटर तैयार (मात्रा से) बाँझ में एसिटिक एसिड की, आणविक ग्रेड पानी और एक बाँझ १०० मिमी पेट्री डिश के लिए है कि समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें. पेट्री डिश के लिए tendons स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए छोड़ कोलेजन मैं स्वभाव ।
  5. कुंद, घुमावदार युक्तियों के साथ एक बाँझ स्केलपेल या iridectomy कैंची का प्रयोग करें 1-2 mm टुकड़ों में पट्टा कीमा बनाना । एक बाँझ ५०-एमएल ट्यूब करने के लिए कीमा बनाया हुआ tendons स्थानांतरण और ०.१% एसिटिक एसिड जोड़ने के लिए मात्रा को लाने के लिए ५० मिलीलीटर.
    नोट: एसिड की एक ५० मिलीलीटर के लिए चार या पांच पूंछ का प्रयोग करें एक कोलेजन मैं २.० की एकाग्रता-२.५ मिलीग्राम/एमएल प्राप्त करने के लिए ।
  6. प्रशीतन 4 ° c में कोलेजन मैं समाधान ४८ एच की एक ंयूनतम के लिए पूरा प्रोटीन विकार की सुविधा के लिए । एक दिन में दो बार 1 मिनट के लिए अधिक से अधिक गति के लिए सेट एक तालिका भंवर के साथ भंवर ।
  7. उपाय bicinchoninic एसिड परख का उपयोग कर समाधान के प्रोटीन एकाग्रता, २.० के लिए कोलेजन मैं एकाग्रता को समायोजित-२.५ मिलीग्राम/एमएल एसिटिक एसिड के ०.१% समाधान जोड़कर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    नोट: कोलेजन मैं समाधान के लिए एक दो साल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  8. वैकल्पिक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए २,००० x g पर कोलेजन मैं समाधान केंद्रापसारक और पारदर्शी शीर्ष अंश (मात्रा के लगभग आधे) का उपयोग करें, 4 धारा में ऑप्टिकली स्पष्ट कोलेजन जैल प्राप्त करने के लिए ।

2. Vestibular और श्रवण अंगों का विच्छेदन

  1. Euthanize प्रासंगिक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड के साथ किसी भी तनाव के गर्भवती चूहों16। भ्रूण को निकालने और decapitate ।
    नोट: Lfng-CreERटी 2/tdTomato चूहों 4-hydroxytamoxifen17के लिए जोखिम पर समर्थन कोशिकाओं के स्थायी लेबलिंग की अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. सभी काम सतहों और विच्छेदन उपकरणों, #5 संदंश के दो जोड़े और एक बाल चाकू18सहित, उंहें ७०% इथेनॉल के साथ सफाई से निष्फल ।
  3. एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ एक अनुदैर्ध्य कटौती शुरू करने या #5 संदंश के दो जोड़े का उपयोग करके दो हिस्सों में प्रत्येक सिर भाजित. लौकिक हड्डियों, जो भीतरी कान19होते है निकालें, और उंहें बर्फ के 15 मिलीलीटर में जगह ठंड है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) में एक ६० मिमी पेट्री डिश । डिश को बर्फ पर रखें ।
    नोट: e 13.5 से ई 18.5 तक के चरणों की श्रेणी में भ्रूण सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है ।
  4. वैकल्पिक भीतरी कानों को धीरे से धो कर एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मिलाकर 30 मिलीलीटर बर्फ ठंडा HBSS और HBSS की जगह तीन या चार बार । बर्फ पर ट्यूब रखें ।
    नोट: यह कदम ऊतक संस्कृति के संभावित संदूषण को सीमित करता है और जल्दी से 4 डिग्री सेल्सियस तक तापमान लाता है, जो ऊतक क्षरण और कोशिका मृत्यु को रोकता है ।
  5. ठीक #5 संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, अस्थाई हड्डी से भीतरी कान अलग और एक समय में कान, तीन या चार हस्तांतरण, एक ६० मिमी पेट्री बर्फ से भरा पकवान में ठंडा HBSS ।
  6. vestibular संवेदी अंगों को काटना ।
    1. ओरिएंट कान औसत दर्जे का पक्ष ऊपर और utricle का पता लगाने । #5 संदंश के दो जोड़े के साथ, vestibular अंगों आसपास उपास्थि निकालें. धीरे vestibular तंत्रिका तोड़, utricle और saccule के बीच संबंध है, और semicircular नहरों, के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया । धीरे से utricle और कान से बेहतर और क्षैतिज semicircular नहरों के संलग्न ampullae खींचो ।
      नोट: इस विधि के चरणों के भीतरी कानों पर इस्तेमाल किया जा सकता है e 16.5-e 18.5 । नीचे अनुभाग 3 के लिए उपास्थि टुकड़ों को संरक्षित ।
  7. काटना कोक्लीअ ।
    1. उपास्थि #5 संदंश के दो जोड़े के साथ श्रवण अंग आसपास के ऊतक निकालें । कॉकलियर आधार और saccule के बीच कनेक्शन को धीरे से तोड़े जैसा आरेख 1में दिखाया गया है ।
      नोट: चरणों के लिए 13.5 ई-14.5 ई, उपास्थि नरम ०.२५% collagenase के साथ भीतरी कानों के इलाज से विच्छेदन से पहले मैं फास्फेट में बफर (पंजाब) समाधान 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर । नीचे अनुभाग 3 के लिए उपास्थि टुकड़ों को संरक्षित ।
  8. एक २००-µ एल प्लास्टिक एक व्यापक छड़ी टिप के साथ सज्जित का प्रयोग, utricles और cochleae एक 30 मिमी पेट्री विकास माध्यम से भर डिश के लिए स्थानांतरण DMEM/F12 ३३ mm Dglucose, 19 मिमी सोडियम बिकारबोनिट, 15 मिमी 4 (2hydroxyethyl) के साथ पूरक शामिल- 1piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 1 मिमी glutamine, 1 मिमी nicotinamide, 20 mg/l एपिडर्मल वृद्धि कारक, 20 mg/l fibroblast वृद्धि कारक, 10 mg/l इंसुलिन, ५.५ mg/l कैल्सीटोनिन, और 5 µ g/l सोडियम selenite.
  9. 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक ऊतक में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 ज के लिए utricle तैयारियों को बनाए रखने के लिए विच्छेदन के दौरान शुरू उपकला में कटौती के उपचार की अनुमति । कोक्लीअ तैयारी विच्छेदन के बाद कोलेजन जेल 10 मिनट के लिए हस्तांतरित किया जाना चाहिए ।
    नोट: क्योंकि विच्छेदन बर्फ-शीत HBSS में किया जाता है, वहां से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए विकास के माध्यम गर्म करने की आवश्यकता नहीं है ।

3. (वैकल्पिक) Chondrocytes के अलग सांद्रता जोड़कर कोलेजन मैं जेल कठोरता को समायोजित

नोट: chondrocyte अलगाव के लिए विधि गोससेट एट अल से संशोधित किया गया था । 20

  1. collagenase मैं बाँझ 1x पंजाबियों और स्टोर १००-२०० µ l aliquots पर-८० ° c में 1% समाधान तैयार करें । बर्फ पर ठंढ जब जरूरत, कई फ्रीज-गल चक्र से परहेज ।
  2. 10-12 कान से vestibular और श्रवण अंगों के विच्छेदन से अधिक छोड़ उपास्थि के टुकड़ों को इकट्ठा करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें. उपास्थि से अलग संयोजी और भीतरी कान के ऊतकों । एक 30 मिमी पेट्री डिश के लिए उपास्थि हस्तांतरण और बाँझ विकास माध्यम के ३०० µ एल जोड़ें ।
  3. एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड या iridectomy कैंची कुंद घुमावदार युक्तियों के साथ उपास्थि टुकड़े को प्राप्त करने के लिए लंबाई में लगभग ०.५
  4. collagenase मैं उपास्थि के साथ मध्यम करने के लिए ०.२५% की एक अंतिम एंजाइम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए जोड़ें । 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस मार डाला पर एक ऊतक-संस्कृति मशीन के लिए पकवान स्थानांतरण । प्लास्टिक जोरदार एक १,००० µ एल प्लास्टिक उपास्थि अलग कर देना के टुकड़े तक हर 20 मिनट का उपयोग कर रहे है और अब समाधान में भेद नहीं है, तो एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए गर्मी ।
    नोट: utricle तैयारी के मामले में, chondrocyte आइसोलेशन चरण २.९ के दौरान किया जा सकता है; यह लगभग 2 एच लेता है (3-4 pipetting राउंड) ।
  5. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए और बाँझ 1x पंजाबियों के साथ 10 मिलीलीटर के लिए मात्रा को समायोजित । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ८०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और बाँझ 1x पंजाबियों के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant हटा दें ।
    नोट: यह कोशिकाओं को दो बार धोने के लिए महत्वपूर्ण है; किसी भी शेष collagenase मैं कोलेजन मैं जेल पचा जाएगा ।
  6. एक २००-µ l प्लास्टिक का उपयोग करना, संस्कृति माध्यम के १०० µ एल जोड़ने के लिए सेल गोली और धीरे से reसस्पैंड करने के लिए प्लास्टिक. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और बर्फ पर उन्हें बनाए रखने से पहले का उपयोग करें.
  7. जेल कठोरता को बढ़ाने के लिए, बेअसर कोलेजन मैं जेल समाधान (खंड 1) के लिए chondrocytes जोड़ने और तेजी से मिश्रण करने के लिए जेल भर में कोशिकाओं को वितरित करने से पहले solidification ।
    नोट: मैं कोलेजन जेल (कठोरता का एक उपाय) के लोचदार मापांक, chondrocytes की संख्या के साथ रैखिक बढ़ जाती है11जोड़ा गया । संबंध का वर्णन प्रयोग द्वारा निर्धारित रेखीय कार्य E = २०६ · नेकां + 15, जिसमें ई पास्कल में लोचदार मापांक है और नेकां chondrocytes की संख्या लाखों में है । जेल कठोरता माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए कृपया मूल लेख11को देखें ।

4. एक कोलेजन मैं जेल में Vestibular या श्रवण संवेदी अंग प्लेस

  1. एक बाँझ १.५-एमएल ट्यूब में, phenol लाल पीएच संकेतक के साथ 10x पंजाब के १६० µ एल मिश्रण से कोलेजन मैं बहुलकीकरण समाधान तैयार, ०.३४ एम सोडियम हीड्राकसीड के १३३ µ एल, ७० एम सोडियम µ के ०.९ बिकारबोनिट एल, और 1 एम µ के ४० HEPES एल. बर्फ पर ट्यूब रखें ।
    नोट: यह नुस्खा बहुलकीकरण कोलेजन मैं जेल के 2 मिलीलीटर तैयार करने की जरूरत समाधान प्रदान करता है, लेकिन जरूरत के रूप में बढ़ाया जा सकता है ।
  2. मिश्रण १०० µ बहुलकीकरण समाधान के एल और ४०० µ एल के कोलेजन मैं समाधान द्वारा बर्फ पर धीरे से pipetting ऊपर और नीचे एक ठंडा १.५-एमएल ट्यूब में । जेल कठोरता बढ़ाने के लिए, chondrocytes युक्त विकास माध्यम के ५० µ एल जोड़ें और धीरे के रूप में धारा 3 में वर्णित मिश्रण ।
  3. स्थानांतरण ५०० µ बेअसर कोलेजन के एल मैं एक 10 मिमी गिलास के साथ एक ठंडा 30 मिमी पेट्री डिश के लिए समाधान-नीचे डालने के लिए या एक अच्छी तरह से एक चार अच्छी थाली का एक कुआं ।
    नोट: यह करने के लिए बर्फ पर सभी रिएजेंट रखने के लिए महत्वपूर्ण है तेजी से और कोलेजन मैं की असमान बहुलकीकरण को रोकने के लिए ।
  4. जल्दी से बेअसर कोलेजन मैं समाधान के लिए cochleae या utricles हस्तांतरण और एक बाँझ बाल चाकू के साथ अपने वांछित पदों के लिए अंगों को समायोजित18 या ठीक संदंश की जोड़ी ।
    नोट: कोलेजन मैं बहुलकीकरण के बाद ध्यान देने योग्य हो जाता है 1-2 मिनट के रूप में समाधान पंकिल हो जाता है ।
  5. ऊतक के आसपास समाधान के बाद, बहुलक है पेट्री पकवान या 20 मिनट के लिए चार अच्छी तरह से थाली ३७ ° c में एक ऊतक-संस्कृति मशीन मार डाला 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ पूरा बहुलकीकरण सुनिश्चित करने के लिए जगह है ।
  6. ०.५% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) प्रति पेट्री डिश या ५०० µ एल के साथ पूरक वृद्धि मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें एक चार अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक ही माध्यम के । एक ऊतक में ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को बनाए रखने-संस्कृति मशीन मार डाला 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ । यदि चाहें, तो 10 µ m 5-ethynyl-2 ´-deoxyuridine (EdU) के साथ विकास माध्यम को proliferating कोशिकाओं को लेबल करने के लिए पूरक करें ।
    नोट: उच्च FBS सांद्रता अगर वांछित इस्तेमाल किया जा सकता है ।

5. Vestibular और श्रवण संवेदी अंगों की तीन आयामी संस्कृतियों में वायरल इंजेक्शन

  1. एक ०.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में trypan नीले समाधान के साथ बर्फ और मिश्रण पर वांछित वायरस को ठंढ ०.०५% की एक अंतिम डाई एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए । वायरस के पर्याप्त कमजोर पड़ने से बचने के लिए 10-20x डाई का प्रयोग करें । बर्फ पर रखो ।
    नोट: एडीनोवायरस सीरोटाइप 5 utricle में सहायक कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए सबसे अच्छा काम करता है19, जबकि adeno-संबद्ध वायरस Anc80 दोनों बालों की कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं और utricle और कोक्लीअ21में कोशिकाओं का समर्थन करते हैं ।
  2. एक गिलास साफ ठीक संदंश के साथ एक micropipette खींचने पर तैयार सुई की नोक तोड़ जबकि यह एक दूरबीन विदारक माइक्रोस्कोप के उच्चतम इज़ाफ़ा पर देख ।
    नोट: यह सुई खींचने पर सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । 9-12 मिमी टांगों और 20-30 के साथ सुई-µm उद्घाटन सबसे अच्छा काम करते हैं ।
  3. एक संवेदी-अंग संस्कृति को मशीन से निकालें । microinjector के लिए सुई देते हैं और यह डाई और वायरस के मिश्रण के 2-3 µ एल के साथ भरें । दूरबीन विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह देख जबकि संवेदी अंग में सुई अग्रिम । ।
  4. धीरे mesenchymal और एक तीन आयामी utricular संस्कृति की छत के उपकला परतों के माध्यम से सुई टिप ड्राइव । वायरल मिश्रण सुई जब तक utricle और ampullae की गुहाओं नीले रंग के साथ भरें ।
    नोट: क्योंकि यह संवेदी अंगों के लिए आसान पहुंच की अनुमति देता है, एक 10 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश इंजेक्शन के लिए इष्टतम है ।
  5. 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक ऊतक-संस्कृति मशीन मार डाला में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    नोट: जब हरे या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन वायरल निर्माण में प्रयोग किया जाता है, प्रतिदीप्ति स्पष्ट है 24 एच वायरल transduction के बाद ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

भ्रूण कान से Vestibular और श्रवण संवेदी अंगों, ४० में प्रसंस्कृत-Pa कोलेजन मैं कम कठोरता भ्रूण शर्तों11नकल उतार, अपेक्षाकृत सामांय तीन आयामी संरचनाओं बनाए रखने (चित्रा 1) और बालों की कोशिकाओं को बनाए रखने और सहायक कक्ष (चित्र 2 और चित्र 3) । हालांकि सेल घनत्व का समर्थन 30% से कम हो जाता है (छात्र का टी-टेस्ट: n = 4, p < 0.004) और बाल कोशिका घनत्व ६०% तक घट जाता है (छात्र का t-test: n = 5, p < 0.0001) utricular संस्कृतियों में 3 दिनों के बाद (चित्रा 2 ), मैक्युला के क्षेत्र में समय की समान अवधि से अधिक युगल11 (n = 3, p = ०.०००२) । यह दर्शाता है कि तीन आयामी संस्कृति के लिए विधि यहां वर्णित कोशिकाओं के समर्थन की संख्या में एक महत्वपूर्ण वृद्धि के लिए अनुमति देता है11, जबकि एक 3 दिन की अवधि में utricle में मौजूदा बाल कोशिकाओं के ८०% को बनाए रखने । तीन आयामी ई से स्थापित की संस्कृतियों में 14.5 कोक्लीअ, Sox2-सकारात्मक जनक कोशिकाओं के रूप में अंतर आकृति विज्ञान भीतरी और बाहरी बाल कोशिकाओं की विशिष्ठ पंक्तियों के बाद संस्कृति में 3 दिन (चित्रा3) ।

जीन अभिव्यक्ति वायरल संक्रमण के माध्यम से vestibular और श्रवण संवेदी अंगों के तीन आयामी संस्कृतियों में हेरफेर किया जा सकता है । 4hydroxytamoxifen संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया है कॉकलियर explants ई Lfng के 15.5 भ्रूण-CreERटी 2/tdTomato चूहों17से स्थापित में समर्थन कोशिकाओं लेबल । अंग के आधार पर सहायक कोशिकाओं के संक्रमण में संस्कृति परिणाम के लुमेन में एडीनोवायरस प्रकार 5 के इंजेक्शन (चित्रा 4). utricular संस्कृति के लुमेन में एक ही वायरस के इंजेक्शन ई 17.5 भ्रूण से स्थापित, संवेदी उपकला भर में समर्थन कोशिकाओं के संक्रमण में मुख्य रूप से परिणाम (चित्रा 4बी).

Figure 1
चित्र 1। वि च्छेदन और utricle और कोक्लीअ की तीन आयामी कोलेजन मैं जैल में प्रतिनिधि संस्कृतियों के प्रकाश सूक्ष्म छवियों के योजनाबद्ध आरेख । (क) एक योजनाबद्ध ड्राइंग murine भीतरी कान के छह रिसेप्टर अंगों के संवेदी epithelia (हरा) चित्रित. लाल लाइनों एक utricle और कोक्लीअ के विच्छेदन के दौरान शुरू की कटौती चित्रित । (ख) प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों ई 17.5 utricle (ऊपरी पैनल) और ई 14.5 कोक्लीअ (निचले पैनल) कोलेजन मैं जेल में एंबेडेड और ४८ ज के लिए संस्कृति चित्रण । स्केल पट्टियां १०० µm का प्रतिनिधित्व करती हैं । यह आंकड़ा Gnedeva एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2। बाल कोशिकाओं और तीन आयामी utricular संस्कृतियों में सहायक कोशिकाओं । (A) फोकल-सूक्ष्म चित्र एक ई 18.5 utricle चित्रित explantation से पहले (शीर्ष पैनलों) और 3 दिनों के बाद ४० में एक तीन आयामी संस्कृति में-Pa कोलेजन मैं जेल (नीचे पैनलों) । बाल कोशिकाओं Myo7A (हरा) और Sox2 (लाल) के लिए समर्थन कोशिकाओं के लिए लेबल कर रहे हैं । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५० µm. (B) कक्ष घनत्व (लाल पट्टियां), हेयर सेल घनत्व (हरी पट्टियां), और धब्बेदार क्षेत्र (ग्रे बार्स) ई 18.5 utricles में explantation से पहले और 3 दिनों के बाद तीन आयामी अंग संस्कृति में अर्थ के रूप में दर्शाए गए ± SEMs (p < 0.001 को * * और p < 0.0001 के रूप में * * * के रूप में निरूपित किया जाता है । यह आंकड़ा Gnedeva एट अल से संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3। बाल कोशिकाओं और तीन आयामी कॉकलियर संस्कृतियों में सहायक कोशिकाओं । फोकल-सूक्ष्म छवियों को चित्रित एक ई 14.5 कोक्लीअ से पहले explantation (शीर्ष पैनलों) और 3 दिनों के बाद ४० में एक तीन आयामी संस्कृति में-Pa कोलेजन मैं जेल (नीचे पैनलों) । Myo7A-और Sox2-सकारात्मक भीतरी बाल कोशिकाओं (आइएचसी) और बाहरी बाल कोशिकाओं (OHC) 4-5 पंक्तियों में संस्कृति में 3 दिनों के बाद दिखाई देते हैं । सहायक कोशिकाओं को भी Sox2 (लाल) के लिए लेबल कर रहे हैं । स्केल बार 25 µm का प्रतिनिधित्व करता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4। कोक्लीअ और utricle के तीन आयामी अंग संस्कृतियों में वायरल संक्रमण के प्रतिनिधि परिणाम । (एक) एडीनोवायरस सीरोटाइप 5 के तीन आयामी कॉकलियर Lfng से स्थापित संस्कृतियों में इंजेक्शन-CreERटी 2/tdTomato26 ई के संक्रमण में 15.5 भ्रूण परिणाम (GFP, सहायक कोशिकाओं के समर्थन (टमाटर, लाल) के आधार पर अंग । संवेदी उपकला ग्रे में delineated है. पैमाने पर बार का प्रतिनिधित्व करता है १०० µm. (ख) एक तीन आयामी utricular संस्कृति में एक समान इंजेक्शन एक ई 17.5 भ्रूण के संक्रमण में परिणाम (GFP, हरे) कोशिकाओं के समर्थन (Sox2, लाल) अंग भर में की स्थापना की । संवेदी उपकला ग्रे में delineated है. स्केल बार १०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । यह आंकड़ा Gnedeva एट अल से संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

विकास के दौरान भीतरी कान में विकास और भेदभाव की मध्यस्थता करने वाले आणविक संकेतों को बड़े पैमाने पर5,6,7,8,9,10का अध्ययन किया गया है । हालांकि, सबूत utricular मॉडल प्रणाली से प्राप्त पता चलता है कि यांत्रिक cues, सेल जंक्शनों और सिग्नलिंग हिप्पो के सक्रियकरण के माध्यम से महसूस किया, भी इन प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं2,11, 22. इसके अलावा, दोनों संवेदी उपकला से मरने बाल कोशिकाओं के बाहर निकालना और transdifferentiation के माध्यम से नए संवेदी रिसेप्टर्स के बाद गठन अवशिष्ट समर्थन कोशिकाओं द्वारा महसूस यांत्रिक शक्ति को प्रभावित कर सकते हैं, जिसके कारण उन्हें पुनर्जनन के दौरान सेल चक्र को फिर से दर्ज करना । यहां वर्णित तीन आयामी संस्कृति प्रणाली भीतरी कान के विकास के दौरान विकास नियंत्रण में यांत्रिक शक्ति की दोनों भूमिका की जांच करने का एक प्रायोगिक साधन प्रदान करता है11 और, संभावित रूप से, बाल कोशिका के दौरान एक ही बल की भूमिका पुनर्जनन. इसके अलावा, दृष्टिकोण वायरल संक्रमण है कि संवेदी उपकला में जीन अभिव्यक्ति में फेरबदल की एक विधि प्रदान करता है की सुविधा, इस प्रकार के विकास और उत्थान की जांच के लिए यांत्रिक और आणविक जोड़तोड़ का एक संयोजन की अनुमति कान के संवेदी अंगों11।

विधि की सीमाएं भीतरी कान embryogenesis के दौरान अंतर्जात बलों और यांत्रिक उत्तेजनाओं पर उपलब्ध न्यूनतम जानकारी से संबंधित हैं । भीतरी कान के विकास में ऊतक कठोरता की माप हमारे ज्ञान के लिए मौजूद नहीं है; इसलिए यह अनुमान है कि कोलेजन मैं जेल की कठोरता vivo में शर्तों से मेल खाती है मुश्किल है । हमारी टिप्पणियों और मॉडल का सुझाव है कि बल utricle के विकास का विरोध कम शुरू में और बढ़ जाती है के रूप में अंग अपने अंतिम आकार11दृष्टिकोण । इसलिए हम परिकल्पना कि एक कोलेजन chondrocytes बिना मैं जेल एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट जिसमें संस्कृति भ्रूण vestibular और श्रवण संवेदी अंगों के लिए है ।

तीन आयामी संस्कृति विधि यहां वर्णित utricular मैक्युला11में नए सहायक कोशिकाओं के गठन लाती है, जबकि भी बाल कोशिकाओं के ८०% से अधिक संस्कृति में 3 दिनों के बाद बनाए रखने (चित्रा 2) । विधि, इसलिए, utricle के दो आयामी संस्कृतियों के लिए एक बेहतर विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें केवल ४०-बाल कोशिकाओं के ५०% संस्कृति में पहले 24 घंटे के बाद जीवित रहते हैं5,8, और बाल कोशिका कमजोरियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इन विट्रो मेंपुनर्जनन ।

यद्यपि हम anatomically के गठन का प्रदर्शन आंतरिक और बाह्य बाल कोशिकाओं के Corti के कल्चरल अंग में भेद करने वाला संगठित पंक्तियों, और अधिक काम के लिए निर्धारित है कि तीन आयामी संस्कृति विधि यहां वर्णित सामांय समर्थन करता है की आवश्यकता है अभिसरण विस्तार की प्रक्रिया के दौरान कॉकलियर वाहिनी बढ़ाव (सीई)23,24,25. CE एक अत्यधिक गतिशील सेल प्रवास, पुनर्व्यवस्था, और सेल सेल संपर्क परिवर्तन26 है कि बाहरी बल विकासशील कॉकलियर नलिका के आसपास के ऊतकों द्वारा उत्पादित द्वारा प्रभावित होने की संभावना है शामिल प्रक्रिया है । इस विधि अपेक्षाकृत सामांय तीन आयामी ऊतक वास्तुकला की रक्षा करता है, और संभवतः इन विट्रो मेंCE के अध्ययन के लिए फायदेमंद हो सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ ए. Jacobo, डॉ जे सालवी, और एक Petelski मूल अनुसंधान जिस पर इस प्रोटोकॉल पर आधारित है उनके योगदान के लिए धंयवाद । हम तकनीकी सहायता और पशुपालन के लिए जे Llamas और डब्ल्यू Makmura का भी धन्यवाद करते हैं । हम NIDCD प्रशिक्षण ग्रांट T32 DC009975, NIDCD ग्रांट R01DC015530, Robertson चिकित्सीय विकास निधि, और Caruso परिवार फाउंडेशन को फंडिंग के लिए स्वीकार करते हैं । अंत में, हम हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान, जिनमें से डॉ Hudspeth एक अंवेषक है से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#10 Surgical Blades Miltex 4-110
#5 Forceps Dumont 11252-20
100 mm Petri dish Sigma P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips USA Scientific 1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish Matsunami Glass USA Corporation D35-14-1.5-U
4 well plate Thermo Fisher Scientific 176740
4-Hydroxytamoxifen  Sigma H7904
60 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific 123TS1
Acetic acid  Sigma 537020
Ad-GFP Vector Biolabs 1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction Invitrogen A10262 
Anti-Myo7A Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17) Santa Cruz sc-17320
Bicinchoninic acid assay Thermo Fisher Scientific 23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10340
Collagenase I Gibco 17100017
D-glucose Sigma G8270
DMEM/F12  Gibco 11320033
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16140063
Fibroblast growth factor Sigma F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Glutamine Sigma G8540
HBSS Gibco 14025092
Hemocytometer  Daigger EF16034F
HEPES Sigma H4034
Insulin Sigma I3536
Iridectomy scissors  Zepf Medical Instruments 08-1201-10  
Microinjector Narishige IM-6
Nicotinamide Sigma N0636
PBS (10X), pH 7.4 Gibco 70011044
PBS (1X), pH 7.4 Gibco 10010023
Phenol Red pH indicator  Sigma P4633 
Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs  2716
RFP antibody ChromoTek  5F8
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium hydroxide Sigma S8045
Sodium selenite Sigma S5261
Tabletop vortex  VWR 97043-562
Transferrin Sigma T8158
Trypan blue  Sigma T6146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
  2. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  3. Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
  4. Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
  5. Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
  6. Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
  7. Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
  8. Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
  9. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
  10. White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
  11. Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
  12. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  13. Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
  14. Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
  15. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  16. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
  17. Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
  18. Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
  19. Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
  20. Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
  21. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  22. Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
  23. Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
  24. Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
  25. Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
  26. Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक १३६ Utricle कोक्लीअ भीतरी कान बाल कोशिका organotypic संस्कृति तीन आयामी संस्कृति संवेदी उपकला वायरल संक्रमण यांत्रिक बल हिप्पो संकेतन याप
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, … More

Gnedeva, K., Hudspeth, A. J., Segil, N. Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs. J. Vis. Exp. (136), e57527, doi:10.3791/57527 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter