Summary
Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.
Abstract
İç kulak duyu organları deneysel manipülasyon ve optik gözlem için onların erişilememesi nedeniyle memelilerde çalışmaya zorlu. Ayrıca, mevcut kültür teknikleri biyokimyasal tedirginlikler olanak, ancak bu yöntemler mekanik kuvvet ve doku sertlik iç kulak duyu organları geliştirilmesi sırasında çalışması için bir yol sağlamaz. Burada olduğu gibi fare utricle ve bu sınırlamaların üstesinden koklea üç boyutlu organotypic kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan üç boyutlu matris sertlik düzeltilmesi için teknik manipülasyon doku büyüme karşı elastik kuvvet verir. Bu yöntem bu nedenle iç kulak geliştirme sırasında mekanik Kuvvetleri rolü eğitim için kullanılabilir. Ayrıca, kültürler kazanç ve kayıp-in-fonksiyonlu deneyler için kullanılan virüs-aracılı gen teslim izin verir. Bu kültür yöntemi doğuştan gelen saç hücreleri koruyan ve destekleyen hücreleri ve vestibüler ve işitme duyu organları geleneksel iki boyutlu kültür potansiyel olarak üstün bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Introduction
Pek çok yönden memeli organ gelişiminin incelenmesi, vitro sistemleri tarafından kolaylaştırılmış. İki temel yöntem şimdi vestibüler duyu organları kültürü için kullanılan: serbest yüzer1 ve yapışık2 hazırlıkları. Her iki yöntem saç hücre güvenlik açıkları3 ve rejenerasyon1,4 içinde vitrosoruşturma izni. Buna ek olarak, çentik5,6, Wnt7,8ve iç kulak Cascade'lerde sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR)9,10 gelişimsel rollere sahip , kısmen, duyu epiteli vitro kültürleri kullanımı ile kurulmuştur. Ancak, hücre büyümesi ve farklılaşma, değil sadece morfojenlerdeki, ama aynı zamanda aracılığıyla gibi hücreler arası kişiler, fiziksel ve mekanik yardımlar tarafından hücre dışı matriks, sertliği sinyal ve mekanik germe veya daralma ile kontrol edilir. Böyle mekanik uyaranlara içinde gelişmekte olan iç kulak içinde vivoaraştırmak için zorlu bir roldür. Ayrıca, varolan serbest yüzer ve yapışık kültür yöntemleri için bu tür çalışmalar içinde vitrouygun değildir. Burada bir yöntemi açıklamak için kollajen kültüründe üç boyutlu organotypic ben jelleri değişen sertlik. Bu yöntem büyük ölçüde vestibüler ve koklear duyu organları içinde vivo mimarisini korur ve mekanik kuvvet etkisi büyüme ve farklılaşma11incelenmesi sağlar.
Mekanik stimülasyon birleştirmek önemli çünkü mekanik uyaranlara yolu12,13,14,15, sinyal su aygırı gibi aşağı akım moleküler olayları etkinleştirmek bilinmektedir biyokimyasal ve genetik manipülasyon ile. Burada anlatılan kültür yöntemi virüs-aracılı gen teslim izin verir ve bu nedenle mekanik ve moleküler iç kulak geliştirme11sırasında sinyal eğitim için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada Güney Kaliforniya Üniversitesi ve hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. (isteğe bağlı) kolajen hazırlanması ben eriyik--dan Mouse-tail tendonlar
Not: Kollajen ben ticari olarak kullanılabilir çözümlerdir. Jel hazırlık için üreticinin yönergelerini izleyin.
- 5-10 Genç Yetişkin (3-5 hafta eski) fare ile karbon dioksit ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi16tarafından onaylanmış protokol uyarınca herhangi bir vahşi türü baskı ötenazi. Kuyrukları toplamak ve onları 4 h, oda sıcaklığında en az % 70 etanol içinde batış tarafından dezenfekte.
Not: O aşırı doku dehydration içinde sonuçları ve tendon ayıklama işlemi engellemektedir kuluçka için 48 h üzerinden kaçınılmalıdır. - Cilt her kuyruk boyuna kesilmiş bir neşter bıçakla tanıtan ve tüm cilt forseps ile geri çeker çıkarın. Derisi yüzülmüş kuyrukları temiz % 70 etanol ile dolu ve 10 mm parça halinde kesin 100-mm Petri kabına aktarın.
Not: İşlemek zor olan kuyrukları, en ince parçalarını atın. - Forseps kullanarak, her kesimi Petri kabına altına kuyruk güvenli ve iyi forseps ikinci bir çifti tendonlar kuyruk bir teker teker ayıklamak için kullanın. Bireysel tendon lifleri ile en az direnç ortaya.
Not: Eski, sıkıcı #5 forseps iş de bu adım için. - 100 mL steril, moleküler düzeyde su asetik asit (cilt tarafından) bir % 0,1 çözeltisi hazırlamak ve bu çözüm 10 mL steril 100-mm Petri kabına için ekleyin. Tendon Petri kabına aktarın ve ben bırakın kollajen denatüre için oda sıcaklığında 1 h için.
- Steril neşter ya da iridectomy makas künt, kavisli ipuçları ile 1-2 mm parçalara tendon kıyma için kullanın. Steril bir 50 mL tüp kıyılmış tendon transferi ve birim için 50 mL getirmek için % 0,1 asetik asit ekleyin.
Not: Dört kullanın veya beş kuyrukları için her 50 mL asit bir kollajen ulaşmak için de ben 2.0-2.5 mg/mL konsantrasyonu. - Kollajen soğutmak ben çözüm tam protein denatürasyon kolaylaştırmak için 48 saat en az 4 ° C'de. Girdap masa üstü bir girdap ile günde iki kez 1 dk. için maksimal hıza ayarlayın.
- Bicinchoninic asit tahlil kullanarak çözüm protein konsantrasyonu ölçmek, kollajen ayarlamak ben 4 ° C'de % 0,1 çözüm, asetik asit, mağaza ekleyerek 2.0-2.5 mg/ml konsantrasyonu
Not: Kollajen ben çözüm bir iki yıl boyunca saklanabilir. - (İsteğe bağlı) Kollajen santrifüj kapasitesi ben 2.000 x g 1 h 4 ° C ve optik net kollajen ulaşmak için yarı saydam üst kesir (yaklaşık yarısı birimin), Bölüm 4'te jelleri kullanım için bir çözüm.
2. diseksiyon vestibüler ve işitme organları
- Herhangi bir baskı ile ilgili kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi16tarafından onaylanmış protokol uyarınca karbon dioksit hamile fareler ötenazi. Hulâsa ve embriyoların başını kesmek.
Not: Lfng-CreERT2/tdTomato fareler kalıcı hücreleri maruz 4-hydroxytamoxifen17üzerine destekleme etiketleme izin vermek için kullanılabilir. - Tüm çalışma yüzeyleri ve diseksiyon aletleri, % 70 etanol ile temizleyerek #5 forseps ve bir saç bıçak18, iki çift de dahil olmak üzere sterilize.
- İki yarım bir boyuna kesim bir steril neşter bıçakla tanıtan veya iki çift #5 forseps kullanarak her kafasından bölün. İç kulak19içeren, temporal kemik ayıklamak ve buz gibi Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 60 mm Petri kabına içinde 15 mL içine koyun. Buz üzerinde çanak tutmak.
Not: Embriyo aşamalara E13.5 gelen E18.5 bir mesafeden başarıyla kullanılmaktadır. - (İsteğe bağlı) Yavaşça onları 30 mL içeren 50 mL konik tüp içinde sallayarak iç kulak yıkama buz gibi HBSS ve HBSS üç ya da dört kez değiştirme. Tüp buz üzerinde tutun.
Not: Bu adım doku kültürü olası bulaşma sınırlar ve hızlı sıcaklık 4 ° C, doku bozulması ve hücre ölüm önleyen getiriyor. - İki çift iyi #5 forseps kullanarak, iç kulak şakak kemiğinden ayrı ve kulaklar, üç veya dört teker, 60 mm Petri kabına buz gibi HBSS ile dolu içine transfer.
- Vestibüler duyu organları incelemek.
- Kadar kulakları medial tarafa yönlendirmek ve utricle bulun. #5 forseps iki çift ile vestibüler organları çevreleyen kıkırdak kaldırın. Yavaşça vestibular sinir, utricle ve saccule ve semisirküler kanallar arasında bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever. Utricle ve üstün ve yatay semisirküler kanallar kulağından ekli ampullae yavaşça çekin.
Not: Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış iç kulaklara Etap E16.5 - E18.5. Kıkırdak parçaları aşağıda bölüm 3 için korumak.
- Kadar kulakları medial tarafa yönlendirmek ve utricle bulun. #5 forseps iki çift ile vestibüler organları çevreleyen kıkırdak kaldırın. Yavaşça vestibular sinir, utricle ve saccule ve semisirküler kanallar arasında bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever. Utricle ve üstün ve yatay semisirküler kanallar kulağından ekli ampullae yavaşça çekin.
- Koklea incelemek.
- #5 forseps iki çift ile işitme organı çevreleyen kıkırdak dokuyu. Yavaşça koklear Bankası ve saccule arasındaki bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever.
Not: İç davranarak aşamaları E13.5 - E14.5, kıkırdak diseksiyon önce yumuşatmak için kulaklar %0.25 collagenase ile ben fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm için oda sıcaklığında 5 dk içinde. Kıkırdak parçaları aşağıda bölüm 3 için korumak.
- #5 forseps iki çift ile işitme organı çevreleyen kıkırdak dokuyu. Yavaşça koklear Bankası ve saccule arasındaki bağlantı Şekil 1' de gösterildiği gibi sever.
- 200-µL damlalıklı kullanarak geniş yapışmaz bir ucu ile donatılmış, utricles ve cochleae DMEM/F12 33 mM Dglucose, 19 mM sodyum bikarbonat, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - ile desteklenmiş oluşan büyüme orta dolu 30 mm Petri kabına aktarın 1piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM glutamin, 1 mM nikotinamid, 20 mg/L epidermal büyüme faktörü, 20 mg/L fibroblast büyüme faktörü, 10 mg/L insülin, 5.5 mg/L transferrin ve 5 µg/L Sodyum selenit.
- Kesim sırasında diseksiyon tanıttı epitel içinde şifa izin vermek için en fazla 3 saat % 5 karbon dioksit ile benzin bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de utricle hazırlıkları korumak. Koklea hazırlıklar kollajen jel 10 dk sonra diseksiyon aktarılmalıdır.
Not: Diseksiyon buz gibi HBSS gerçekleştirildiğinden, 37 ° c büyüme ortamına önceden ısıtmak için gerek yoktur
3. (isteğe bağlı) kolajen ayarlamak değişen kondrosit konsantrasyonları ekleyerek sertlik jel
Not: Kondrosit yalıtım için yöntem Gosset vd. güncellenmiştir 20
- Collagenase % 1 çözeltisi hazırlamak ben PBS ve mağaza 100-200 µL aliquots-80 ° C'de x steril 1 Gerektiğinde buza defrost, birden çok donma-çözülme çevrimleri kaçınarak.
- Kullanım iyi forseps 10-12 kulakları vestibüler ve işitsel organ diseksiyon üzerinden kalan kıkırdak parçaları toplamak için. Ayrı bağ ve iç kulak dokulardan kıkırdak. Kıkırdak için 30 mm Petri kabına aktarmak ve steril büyüme ortamının 300 µL ekleyin.
- Steril neşter bıçak veya iridectomy makas künt eğri ipuçları ile doku kıkırdak parçaları yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda ulaşmak için bin dereden su getirmek için kullanın.
- Collagenase ekleyin ben son enzim konsantrasyonu % 0.25 ulaşmak için kıkırdak ile orta. Çanak doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de aktarın. Kıkırdak parçaları ayırmak ve artık çözümde ayırdedilebilir kadar şiddetle 1.000 µL damlalıklı her 20 dk kullanarak damlalıklı sonra bir ek 20 dk için kuluçkaya.
Not: Utricle hazırlıkları durumunda, kondrosit yalıtım adım sırasında 2,9 gerçekleştirilebilir; yaklaşık 2 saat (3-4 pipetting mermi) alır. - 15 mL konik tüp hücre süspansiyon toplamak ve 10 ml steril 1 x PBS ile ses seviyesini. 4 ° C'de 5 min için 800 x g, santrifüj Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril 1 x PBS hücrelerde resuspend. Vasıl 800 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
Not: Hücreleri iki kez yıkamak için önemlidir; kalan herhangi bir collagenase ben jel kollajen sindirmek. - 200-µL damlalıklı kullanarak, kültür ortamının 100 µL hücre Pelet ve damlalıklı yavaşça resuspend ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve kullanmadan buz önce üzerinde proje.
- Jel sertlik artırmak için kondrosit jel çözüm (Bölüm 1) ve hızla karıştırın etkisiz kollajen için eklemek hücreleri katılaşma önce jel boyunca dağıtmak için.
Not: Elastik modül kollajen (sertlik ölçümü) jel, kondrosit sayısı ile doğrusal olarak artar ekledi11. İlişkinin deneysel olarak kararlı doğrusal fonksiyon E tarafından anlatılan 206· = NC + 15 E paskal ve Nc elastik modül olan, milyonlarca kondrosit sayısıdır. Jel için detaylı bir protokol sertlik ölçümleri lütfen Orijinal Makale11' e bakın.
4. ben jel bir kollajen vestibüler veya işitme duyu organı yerleştirin
- Steril bir 1.5 mL tüp içinde kollajen hazırlamak ben 10 x PBS fenol red pH göstergesi, 133 µL 0,34 M sodyum hidroksit, 70 µL 0.9 M sodyum bikarbonat ve 1 M HEPES 40 µL 160 µL karıştırma tarafından polimerizasyon çözüm. Tüp buz üzerinde tutun.
Not: Bu tarifi 2 mL jel, ama gerektiği gibi ölçeklendirilebilir kollajen hazırlamak için gerekli olan polimerizasyon çözüm sağlar. - Mix 100 µL polimerizasyon çözüm ve kollajen 400 µL ben çözüm yavaşça yukarı ve aşağı bir soğutulmuş 1.5 mL tüp içinde pipetting tarafından buz üzerinde. Jel sertlik artırmak için büyüme ortamının kondrosit içeren 50 µL ve Bölüm 3'te açıklandığı gibi hafifçe karıştırın.
- Etkisiz kollajen 500 µL aktarım ben çözüm soğutulmuş 30 mm Petri kabına 10 mm cam alt eklemek veya bir dört-şey plaka bir kuyu.
Not: Hızlı ve düzensiz polimerizasyon kollajen önlemek için buz üzerinde tüm reaktifler tutmak için önemlidir ben. - Hızlı bir şekilde cochleae veya utricles etkisiz kollajen transfer ben çözüm ve istenen konumlarını bir steril saç bıçak18 ya da iyi forseps çifti ile organları ayarlayın.
Not: Kollajen ben çözüm bulanık hale geldikçe polimerizasyon 1-2 dakika sonra fark olur. - Sonra doku etrafında çözüm polimerli, Petri kabına veya dört-şey plaka 20 min için bir doku kültürü kuluçka eksiksiz polimerizasyon sağlamak için % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de yerleştirin.
- Petri kabına veya aynı orta iyi bir dört-şey plaka başına 500 µL % 0.5 fetal Sığır serum ile (FBS) takıma büyüme orta 3 mL ekleyin. Kültür bir doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de korumak. İstenirse, büyüme orta ile 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) Proliferasyona hücreleri etiketlemek için ek.
Not: Daha yüksek FBS konsantrasyonları istenirse kullanılabilir.
5. viral enjeksiyonları vestibüler ve işitme duyu organları üç boyutlu kültürleri
- Buz üzerinde istenen virüs defrost ve trypan mavi çözüm % 0.05 son boya konsantrasyon elde etmek için bir 0.5 mL konik tüp ile karıştırın. 10-20 x boya önemli seyreltme virüs önlemek için kullanın. Buz üstünde tutun.
Not: Adenovirus serotip 5 işleri en iyi virüs Anc80 adeno ilişkili her iki saç hücreleri enfekte olabilir, ancak utricle19, destek hücreleri bulaşmasını ve utricle ve koklea21hücreleri desteklemek. - Bir micropipette çektirmenin bir binoküler mikroskop dissekan en yüksek büyütme oranında kesilmediğini gözleyerek temiz iyi forseps ile hazırlanan cam iğne ucu kır.
Not: İğne çektirme ayarları optimize etmek önemlidir. 9 - 12 mm shanks iğne ve 20 - 30 µm açıklıklar en iyi çalışır. - Bir organ duyusal kültür kuluçka makinesi kaldırın. İğne için microinjector ekleyin ve 2-3 µL boya ve virüs karışımı ile doldurun. İğne duyusal organ binoküler mikroskop dissekan altında kesilmediğini gözleyerek ilerlemek.
- Yavaşça iğne ucu üç boyutlu bir utricular kültür çatı epitelyal ve mezenkimal katmanı üzerinden götürmek. Mavi boya ile utricle ve ampullae boşluklar doldurana kadar viral karışımı enjekte et.
Not: Çünkü duyu organları kolay erişim sağlar, 10 mm cam alt Petri kabına enjeksiyonlar için en iyi yöntemdir. - Bir doku kültürü kuluçka % 5 karbon dioksit ile gazla 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: Kırmızı veya yeşil flüoresan protein viral yapı içinde kullanıldığında, floresans belirgin 24 saat sonra virüs iletim var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vestibüler ve işitme duyu organları embriyonik kulaklar, gelen kültürlü 40-Pa kolajen ben düşük sertlik embriyonik koşulları11taklit jelleri, nispeten normal üç boyutlu yapılar (Şekil 1) korumak ve saç hücreleri korumak ve Destek hücreleri (Şekil 2 ve Şekil 3). Her ne kadar hücre yoğunluğu destekleyen üzerinden % 30 oranında azaltır (öğrenci t -testi: n 4, p = < 0,004) ve saç hücre yoğunluğu 60 oranında azalır (öğrenci t -testi: n 5, p = < 0,0001) utricular kültürlerde (Şekil 2 3 gün sonra ), daha fazla saat11 aynı süre içinde iki katına makula alanını (n = 3, p 0.0002 =). Bu sayısını destekleyen önemli bir artış11, 3 gün boyunca utricle mevcut saç hücrelerinin % 80'i koruyarak hücreleri için burada açıklanan üç boyutlu kültür için yöntem sağlar gösterir. E14.5 koklea kurulan üç boyutlu kültürlerde Sox2 pozitif progenitör hücre kültürü (Şekil 3) 3 gün sonra iç ve dış saç hücreleri morfolojik ayırt satırlar olarak ayırt etmek.
Gen ifadesinin vestibüler ve işitme duyu organları üç boyutlu kültürlerde viral enfeksiyon aracılığıyla manipüle edilebilir. 4hydroxytamoxifen hücre Lfng-CreERT2/tdTomato fareler17E15.5 embriyo kurulan koklear explants destekleyici etiket kültür ortamına eklenir. Adenovirus enjeksiyon enfeksiyon hücreleri organ'ın üssü (Şekil 4A) destekleyen kültür sonuçlarında lümen içine 5 yazın. Utricular kültür E17.5 embriyo, öncelikle enfeksiyon hücreleri duyu epiteli (Şekil 4B) boyunca destek sonuçlarında kurulan lümen içine enjeksiyon aynı şunun.
Şekil 1. Şematik diyagramları diseksiyonu ve utricle ve koklea içinde üç boyutlu kollajen temsilcisi kültürleri ışık mikroskobik görüntülerini ben jelleri. (A) A şematik çizim duyu epiteli fare iç kulak altı reseptör organlarının (yeşil) canlandırıyor. Kırmızı çizgiler bir utricle ve koklea diseksiyon sırasında tanıttı kesim betimlemek. (B) ışık mikroskobu görüntüleri E17.5 utricle (üst paneli) ve jel ve 48 h için kültürlü kollajen gömülü E14.5 koklea (alt paneli) tasvir. Ölçek çubuklar 100 µm gösterir. Bu rakam Gnedeva ve arkdeğiştirildi. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Saç hücreleri ve üç boyutlu utricular kültürler destek hücrelerinin. (A)Confocal mikroskobik görüntüleri tasvir bir E18.5 utricle explantation (en iyi panelleri) önce ve sonra 3 gün içinde 40-Pa kollajen üç boyutlu bir kültürde (alt paneller) jel. Saç hücreleri için Myo7A (yeşil) etiketlenir ve destek hücreleri Sox2 (kırmızı). Ölçek çubuğu hücre yoğunluğu (kırmızı bar), saç hücre yoğunluğu (yeşil bar) ve yaşa bağlı makula alanları (gri bar) E18.5 utricles explantation önce ve sonra 3 gün içinde üç boyutlu organ kültür içinde destek 50 µm. (B) Quantifications temsil eder. ± SEM aracı olarak temsil (p < 0.001 olarak temsil edilir ** ve p < 0.0001 gibi ***). Bu rakam Gnedeva ve ark. değiştirildi 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Saç hücreleri ve destek hücreleri üç boyutlu koklear kültürlerde. Confocal mikroskobik görüntüleri tasvir bir E14.5 koklea explantation (en iyi panelleri) önce ve sonra 3 gün içinde 40-Pa kollajen üç boyutlu bir kültürde (alt paneller) jel. Myo7A ve Sox2 pozitif iç saç hücreleri (IHC) ve dış saç hücreleri (OHC) kültür 3 gün sonra 4-5 satır görünür. Destek hücreleri de Sox2 için (kırmızı) etiketlenir. Ölçek çubuğu 25 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Koklea ve utricle üç boyutlu organ kültürlerde viral enfeksiyonların temsilcisi sonuçları. (A)hücreleri organ Bankası (domates, kırmızı) destekleyen enfeksiyon (GFP, yeşil) Lfng-CreERT2/tdTomato26 E15.5 embriyo sonuçlarından yılında adenovirus serotip 5 üç boyutlu koklear kültürleri içine enjeksiyon. Duyu epiteli gri olarak belirlendi. Ölçek çubuğu 100 µm üzerinden kurulan. (B) aynı iğne içine üç boyutlu bir utricular kültürü temsil eden bir E17.5 embriyo hücreleri (Sox2, kırmızı) organ destekleyici enfeksiyon (GFP, yeşil) sonuçlanır. Duyu epiteli gri olarak belirlendi. Ölçek çubuğu 100 µm temsil eder. Bu rakam Gnedeva ve ark. değiştirildi 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aracılık büyüme ve iç kulak farklılaşma Geliştirme sırasında olmuştur moleküler sinyaller kapsamlı5,6,7,8,9,10okudu. Ancak, hücre kavşaklar ve su aygırı sinyal, harekete geçirmek ile hissedilen, mekanik yardımlar bu işlemleri2,11', de önemli bir rol oynamak utricular modeli sistemden elde edilen kanıtlar gösteriyor 22. Ayrıca, her iki duyu epiteli ölen saç hücrelerinden ekstrüzyon ve transdifferentiation aracılığıyla yeni duyu reseptörleri sonraki oluşumunu destekleyen hücreler, bunları neden artık tarafından hissedilen mekanik kuvvet etkileyebilir hücre döngüsü yeniden oluşturma işlemi sırasında yeniden girmek için. Burada açıklanan üç boyutlu kültür sistemi hem iç kulak geliştirme11 sırasında büyüme denetimindeki mekanik gücün rolü, büyük olasılıkla, saç hücre sırasında aynı gücün rolü araştırma ve deneysel bir yol sunan rejenerasyon. Ayrıca, böylece büyüme ve yeniden oluşturma işlemi içinde soruşturma için mekanik ve moleküler manipülasyonlar bir arada erişimine izin verme duyu epiteli gen ifadesinde değiştirme yöntemi sağlar viral enfeksiyon yaklaşım kolaylaştırır kulak'ın duyu organları11.
Yöntemi sınırlamaları olan bilgiler kullanılabilir endojen kuvvetler ve mekanik uyaranlara iç kulak embriyogenez sırasında ilgili. Gelişmekte olan iç kulak doku sertlik ölçümleri bilgimizi bulunmaz; Bu nedenle ben jel kollajen ne sertliği vivo içinde koşullar için karşılık gelen tahmin etmek zordur. Gözlemlerimiz ve modeli utricle büyüme opposing force başlangıçta düşüktür ve organ son boyutu11yaklaştıkça artar öneririz. Biz bu nedenle kondrosit jel bir kollajen embriyonik vestibüler ve işitme duyu organları kültür hangi fizyolojik ilgili bir substrat olduğunu öngörmekteyiz.
Burada açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi korurken aynı zamanda üzerinde saç hücreleri % 80'i kültür (Şekil 2) 3 gün sonra utricular makula11, yeni destek hücrelerinin oluşumu neden olmaktadır. Yöntem, bu nedenle, iki boyutlu utricle kültürleri üstün bir alternatif temsil eder, hangi sadece saç hücreleri 40-50 %'kültür5,8ilk 24 saat sonra hayatta kalmak ve saç hücre güvenlik açıkları incelemek için kullanılan ve yenilenme içinde vitro.
Her ne kadar biz anatomik olarak ayırt organize satır kültürlü organ of Corti iç ve dış saç hücrelerinin oluşumu göstermek, daha fazla iş burada açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi normal destekleyip desteklemediğini belirlemek için gereklidir yakınsak uzantısı (CE)23,24,25koklear kanal uzama sürecinde. CE gelişmekte olan koklear kanalı çevreleyen dokular tarafından üretilen dış kuvvet tarafından etkilenme olasılığı olan hücre göç, düzenlenmesi ve hücre-hücre iletişim değişiklikleri26 içeren son derece dinamik bir süreçtir. Bu yöntem üç boyutlu dokusu nispeten normal mimari korumak ve potansiyel olarak CE vitroçalışma için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr A. Jacobo, Dr. J. Salvi ve A. Petelski bu protokolü dayandığı orijinal araştırma katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Biz ayrıca J. Llamas ve W. Makmura teknik yardım ve Hayvancılık için teşekkür ederiz. NIDCD eğitim grant T32 DC009975, NIDCD R01DC015530, Robertson terapötik Geliştirme Fonu ve finansmanı için Caruso Aile Vakfı Hibe etmiş oluyorsunuz. Son olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Dr. Hudspeth bir araştırmacı olduğu, desteğinden anıyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
References
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).
- Wu, J., et al. Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles. Sci Rep. 6, 29418 (2016).
- Chai, R., et al. Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).
- Wang, T., et al. Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle. Nat Commun. 6, 6613 (2015).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals. Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).
- Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. Elastic force restricts growth of the murine utricle. eLife. 6, (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Dong, J., et al. Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals. Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).
- Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth. FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , (2013).
- Semerci, F., et al. Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance. eLife. 6, (2017).
- Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. Methods in molecular biology. , Humana Press. Totowa, N.J. 137 (2000).
- Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection. J Vis Exp JoVE. (61), (2012).
- Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes. Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Burns, J. C., et al. Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds. J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).
- Wang, J., et al. Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway. Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).
- Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin. Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).
- Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct. Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).
- Tada, M., Heisenberg, C. -P. Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos. Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).
