Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ サイトの免疫隔離について述べる。

Abstract

効率的で堅牢な分離とプライマリ オリゴデンドロ サイト (OLs) の文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、多発性硬化症などの疾患を脱髄の生物学の生体外で研究のための貴重なツールとPelizaeus メルツバッハー様疾患 (PMLD)。ここでは、単純な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。未熟な OL が、80% 以上の生後 7 日目で齧歯動物脳白質 (P7) この分離方法だけでなく細胞高利回りを保証も既に別個の系統にコミット OLs の特定の分離を構成するので減少、アストロ サイトなど汚染細胞とマウスの脳から他の細胞を分離することの可能性。このメソッドは、以前、報告方法の変更です、オリゴデンドロ サイト準備純度約 4 時間で 80% 以上を提供します。

Introduction

オリゴデンドロ サイト (OLs) は、中枢神経系 (CNS)1の髄の細胞です。分離と規制の厳しい環境でプライマリ オリゴデンドロ サイトの文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、脱髄疾患多発性硬化症2 などの生物の生体外で研究のための貴重なツール.これは、効率的で堅牢なオリゴデンドロ サイト分離と培養法3を必要があります。本研究では迅速かつ具体的変更された分離手法を実装する、特徴的なオリゴデンドロ サイト細胞の表面マーカーの発現を利用をしました。

成熟オリゴデンドロ サイトの 4 つの明瞭な段階を識別されている、各各発育ステージ (図 1) 特徴的な細胞表面マーカーの発現が特徴します。これらの細胞の表面のマーカー抗体4、5、によって認識することができます、特定の段階で最小二乗法を分離する使用ことができます。最初の段階では、オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) は増殖、移行、および具体的にはエクスプレス ・血小板由来成長因子受容体 (PDGF-Rα)6, ガングリオシド A2B5, プロテオグリカン NG27,8 能力を持っています。、ポリシアル酸神経細胞接着分子9および脂肪酸酸結合タンパク質 7 (FABP7)10。Opc 神経前駆細胞11の特徴である細胞体の反対の極から発せられるいくつかの短いプロセスとバイポーラの形態があります。

Figure 1
図 1: マウス オリゴデンドロ サイト開発時にセル表面のマーカーの表現。A2B5、GalC (O1)、NG2、O4、PDGF Rα は具体的には特定の抗体を使用して、特定の発達段階でオリゴデンドロ サイトを分離する使用ことができますよう、OLs セル表面のマーカーです。  この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

第二段階で Opc preoligodendrocytes に上昇を与えるし、細胞膜で OPC マーカーだけでなく、O4 抗体12,13、14GPR17 蛋白質によって認識されるスルファチド (硫酸化 galactolipid)未熟なオリゴデンドロ サイト (OL) 段階まで主張します。この段階では、preoligodendrocytes は、多極短いプロセスを拡張します。Preoligodendrocytes 生後 2 (P2) で主要な段階の OL は未熟な最小二乗法15のマイナーな人口を持つラットおよびマウスの大脳白質します。

第 3 段階では、未熟な OLs 続行 O4 を表現し A2B5 と NG2 マーカーの発現を失う、galactocerebroside C16を表現し始めます。この段階で OLs は別個の系統にコミットしているし、長い分岐し枝17,18と分裂後の細胞になります。未熟な OL が P7 で齧歯動物の白質の 80% 以上を構成して、この時点で最初の MBP+細胞は15,19,20,21が観察されます。したがって、P7 で OLs の分離は、高細胞収量を確保できます。

OL 開発の最後、第 4 段階で成熟した OLs エクスプレス髄蛋白質 (ミエリン塩基性タンパク質 (MBP)、ミエリンプロテオリピドタンパク質 (PLP)、関連付けられているミエリン糖タンパク質 (MAG) とミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ)22,23 ,24,25,26。この段階で成熟した最小二乗法は、軸索の周り鞘を enwrapping フォーム最適化される膜を拡張し、脳内を活性化することができます。これは、ラットやマウスの脳で MBP+細胞なる P1419,20,21ますます豊富な観察と一致します。

Immunopanning28,29,30, を含む Fewster と 1967年27で同僚のオリゴデンドロ サイトの最初の分離後 OLs の齧歯動物の中枢神経系からの分離のためのいくつかの方法を実施しています蛍光活性化細胞は、細胞表面抗原28,31, 微分勾配遠心法32,33,34,35 を利用 (FACS) を選別と異なる中枢神経系グリア36,37の差分の遵守に基づく振動法。ただし、現行の培養法には、純度、収量、38の手順の実行に要する時間の観点から特に制限があります。したがって、オリゴデンドロ サイトの効率的分離法が必要です。

本稿で提案する簡単な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。このメソッドは、エメリーらによって報告される技術の変更39と Dincmanら40し約 4 時間で 80% 以上のオリゴデンドロ サイト準備純度を提供します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

本研究で使用されるマウスは、SUNY ダウンステート医療センター部門の研究室動物資源 (DLAR) プロトコル番号 15 10492 のガイドラインに従って介抱され。

注: プライマリ オリゴデンドロ サイトが新生児 (P5 P7 野生型 C57Bl/6 n) から分離されたマウス。この段階では、未熟な最小二乗法は、高細胞収量を確保する齧歯動物の白質の 80% 以上を構成します。すべてのバッファーと試薬組成材料のテーブルの末尾にあります。

1. Coverslips 準備

注: ポリ D リジン (PDL)/ラミニン コート coverslips OL 分離前に準備されるべきです。

  1. 場所 #1 ドイツ語 50 mL の円錐管に coverslips をガラスし、70% の 35 mL を追加しそれらをきれいに江藤。
  2. 管を閉じてならびにミキサーに軽くロッキングしながら少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。Coverslips は夜通し孵化することができます。
  3. 70 %etoh を破棄します。
  4. 脱イオン水で 3 回 coverslips を洗浄、真空吸引で毎回水を削除します。
  5. PDL 50 μ g/mL の 30-35 mL を 50 mL チューブに十分な coverslips をカバーする coverslips に追加します。
  6. ならびにミキサーに coverslips を含む 50 mL チューブを置き、穏やかに揺れる中、少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。
  7. Coverslips 真空吸引で毎回水を除去、脱イオン水で 3 回洗います。
  8. 脱イオン水を含む 60 mm のペトリ皿に、coverslips を転送します。
  9. P200 ピペット チップを使用すると、ペトリ皿の全体の表面を覆う層として、coverslips を配置できます。
  10. 慎重に、真空吸引で皿から水を削除します。
  11. Coverslips 周りの水の過剰を削除し、蓋が開いたとフードの UV 光の下で一晩乾燥させます。
    注: 歯根膜コーティング ガラス coverslips は滅菌シャーレに 4 ° C で最大 3 カ月保存できます。
  12. 場所 1 つ好評につき、24 ウェル プレートに coverslips 微細鉗子を使用して。
  13. よく作るエッジは井戸の壁を触れないでくださいセンター、coverslips に移動します。
  14. B27NBMA で希釈した 10 μ G/ml ラミニンの 100 μ L を追加 (材料表参照) 各 coverslip の中心から開始し、すべての領域をカバーする円形のエッジに向かってファッションで移動します。
    メモ: ラミニンが OL の保守に関係するが、成熟した最小二乗法への分化を促進するので、重要な OL 生存因子の in vitro培養41,42,43,44は。
  15. プレート 5% CO2で少なくとも 1 時間または、OLs はめっきの準備が整うまでの 37 ° C をインキュベーターで孵化させなさい。

2. マウス脳皮質解離

  1. 以前、70% エタノールで洗浄ハサミでクイック斬首で生後 5-7 日の古い C57Bl/6 n マウスの子犬を犠牲に。
    注: 5-6 新生児マウス子犬から大脳皮質のそれぞれの準備のため使用されました。平均すると、1 つのマウス脳 1 〜 1.5 x 106最小二乗法が得られます。
  2. 小さな解剖はさみで正中線に沿って頭皮皮膚をカットし、頭蓋骨を公開する撤回します。
  3. 前頭葉は、脳の損傷を避けるためにハサミを持ち上げに向かって頭の後ろに開口部から正中線に沿って慎重に頭蓋骨をカットします。その後、頭蓋骨の後ろに開口部を使用して各眼窩、頭蓋底に沿ってに向かってカット。
  4. 優しく B27NBMA 7 mL を含んでいる 60 mm 培養皿に移して中脳から皮質をいじめるし微細鉗子を使用します。切り裂かれた野のプール、それぞれの脳の 2.4 から 2.2 の手順を繰り返します。
  5. 5 mL の解離バッファーを含んでいる新しい 60 mm 培養皿に皮質を転送 (B27NBMA、20-30 U/mL パパインおよび 2,500 U DNase 私)。
  6. 約 1 mm3 #15 メス刃を使用しての小さな断片に皮質をダイスし、37 ° C、5% CO2インキュベーターで 20 分間インキュベートします。
  7. 牛の成長血清酵素反応を停止する (BGS) の 1 つの mL を追加します。
  8. 解離メディアと一緒に野を 10 mL の血清ピペットを使用して 15 mL の円錐管に転送します。
  9. 優しくゆっくりをピペッティングによる脳組織を分離する開始し、気泡を最小限に抑えるように注意 6-8 回は、10 mL の血清ピペットを使用して、ダウン。
  10. 2 〜 3 分のために解決し新鮮なチューブに上清を転送組織塊を許可します。
  11. 10% を含む B27NBMA の 3 mL を加える BGS/2500 U DNase I 組織ペレットします。
  12. 5 mL の血清ピペットを使用して、優しく上下にピペッティングしながら脳組織を分離するに 6 〜 8 回。気泡を最小限に抑えるように注意します。
  13. 2-3 分のために解決する組織塊を許可します。
  14. 新鮮なチューブに上清を転送します。10% を含む B27NBMA の 3 mL を加える BGS/dn 組織にペレットします。
  15. 優しくメディア ミックスをピペッティングしながら P1000 のピペット チップを使用して脳組織を切り離して、脳組織の上下。組織の大きな塊がなくなるまで、または B27NBMA までの手順 2.13 と 2.14 を繰り返します 10% を含む BGS/DNase 私は疲れている、いずれか早い方。気泡を最小限に抑えるように注意します。
  16. セル サスペンションはプール前の培養上清に。
  17. 50 mL チューブに 70 μ m の細胞のストレーナーを配置します。70 μ m の細胞のストレーナーをそっとプールされた細胞懸濁液を通過 10 mL の血清ピペットを使用して。
  18. B27NBMA の 1 mL の 10% を含むを追加することによってセル ストレーナーを洗浄 BGS/DNase 私。
  19. セル ストレーナーを破棄します。30 - ml B27NBMA で 10% を含むボリュームをもたらす BGS/DNase 私。
  20. 2 つの 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送します。200 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。
  21. 空気にさらされるセルを離れることがなく上澄みを削除します。上清は細胞の残骸により曇りでしょう。10% を含む B27NBMA の 3 mL を追加しペレットに BGS。
  22. 慎重に P1000 ピペットを使用して細胞ペレットを切り離して考えます。10% を含む B27NBMA と 15 の mL にボリュームをもたらす BGS.
  23. 細胞懸濁液を 40 μ m の新鮮な細胞のストレーナー通過します。
  24. B27NBMA の 1 mL の 10% を含むを追加することによって細胞のストレーナーを洗う BGS.セル ストレーナーを破棄します。
  25. 10% を含む B27NBMA と 30 の mL にボリュームをもたらす BGS.
  26. 2 x 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送します。200 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。
  27. 空気にさらされるセルを離れることがなく上澄みのほとんどを削除します。5 ml の氷冷磁気細胞 (MCS) バッファーの並べ替えの細胞ペレットを再懸濁します。

3. 細胞数と生存率の定量

  1. 0.4% (w/v) で 1:5 希釈を達成するために 1.5 mL 遠心チューブにトリパン ブルー溶液 400 μ L での細胞懸濁液 100 μ L を希釈します。
  2. セル希釈 P10 ピペットを使用して、回避 10 μ L で 2 つの部屋いっぱいになる商工会議所検定と塗りつぶしの上カバー ガラスの中心します。ソリューションを毛管作用によってカバー ガラスの下通ります。
  3. 顕微鏡ステージ上、検定を置き、40 倍の倍率を使用して、フォーカスを調整します。
    注: セル数はそれぞれ 5 つの正方形 (4 つの角と一つの中心) の手持ちのカウンターを使用して記録されます。非実行可能なセルだけ染料を吸収し、ながらライブ、青で表示され、健康な細胞のラウンドと屈折を表示され、1 ミリリットルあたり現実的で総細胞数の決定を可能にする青色の色素を吸収しません。

4. O4 の分離+オリゴデンドロ サイト

  1. 10 分間 200 x g で細胞懸濁液を遠心します。
  2. 慎重に空気への細胞の露出を避け、真空吸引を使用して上澄みを廃棄します。
  3. MCS バッファー反 O4 ビーズ 1 x 10 の7セルごとの 10 μ l を添加した 1 x 107合計セルごとの 90 μ L でペレットを再懸濁します。
  4. 優しく指で 15 mL の円錐管 4-5 回をフリックで細胞懸濁液やビーズをミックスします。
  5. 素早く指で 15 mL の円錐管 4-5 timesevery、4 ° C で 15 分のミックスを孵化させなさい 5 分。
  6. 優しくチューブに MCS バッファー 1 x 10 の7セルあたり 2 mL を追加してミックスを洗います。10 分間 200 x g でミックスを遠心します。
  7. 慎重に空気への細胞の露出を避け、真空吸引を使用して上澄みを廃棄します。7すべて 1 x 10 のセルの MCS バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。
  8. 磁気セパレーターを磁選機スタンドに取り付けます。磁選機付ける選択列、列の上に 40 μ m の細胞のストレーナーを配置します。15 mL の 2 つまたは 1 つ 50 mL の円錐管を通して流れを収集する分離カラムの下に配置します。
  9. プレ MCS バッファーの 3 mL で 40 μ m セル ストレーナーと分離列をすすぎ、乾燥させることがなく列を介して実行バッファー。
  10. セル ストレーナーと選択した列には、細胞懸濁液とビーズのミックスを追加します。
  11. 1 mL の MCS バッファーと 40 μ m セル ストレーナーを洗浄します。
  12. セル ストレーナーを破棄し、セル、ビーズ、乾燥させることがなく列を介して実行バッファーのミックスを聞かせてください。
  13. 3 mL の MCS バッファーで 3 回分離カラムと OL 増殖メディアで 1 回洗います。
  14. 磁選機から分離カラムを削除、すぐに 15 mL の円錐管に配置し、すぐに 5 mL の OL 増殖培を追加します。
  15. 15 mL の円錐管にラベル付きセルをフラッシュするプッシュしっかりと列の上にピストンを配置します。
  16. 細胞数と 3 のセクションで示されているように、トリパン ブルーと検定を使用しての生存率を決定する細胞を懸濁液 100 μ L を削除します。
    注: 細胞生存率 80% 以上が、OLs の文化を進める許容が、90% 以上の生存率は最適。

5. 分離 O4 のめっき+オリゴデンドロ サイト

  1. 密度 (coverslip あたり 5 x 10 の5セル) をめっき欲求に細胞懸濁液を希釈 OL 増殖メディアを使用しています。
    注: OL 播種密度は非常に重要なので、始める前に培養顕微鏡を用いた適切な細胞密度を確認すべき。播種密度 10,000 細胞/coverslips 以下悪い細胞の生存可能性があります。10,000、25,000、OL で密度をめっき形態分化は遅い45 です。我々 は細胞の生存を確保するため、少なくとも 50,000 セル/coverslips の播種密度最小二乗法をプレートします。
  2. Coverslips ティッシュ文化フードにインキュベーターからラミニンとコーティングを含む 24 ウェル プレートを移動します。
  3. 各 coverslip からラミニンを削除し、OL 懸濁液 100 μ L でそれを置き換えます。
  4. 最小二乗法を最大、coverslips に OL の接着を促進するために 45 分の 37 °C/5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
  5. インキュベーション後、インキュベーターから 24 ウェル プレートを削除します。それぞれの洪水 OL 増殖メディアの 500 μ L で 24 ウェル プレートのも。
  6. さらに 24 時間の 37 °C/5% CO2インキュベーターに Ol を配置します。
  7. 最小二乗法のめっき後 24 h は増殖メディアを取り出し、分化誘導 OL 分化メディアで代用します。
  8. インキュベーターに Ol を置き、セルは固定のため準備ができているまでは削除しないでください。
    注: pH 変化は最小二乗法の有害なセル実行可能性の減少、従ってインキュベーターから OLs 文化の不必要な除去を避けるべき。

6. 蛍光抗体染色

  1. 細胞の検出のため表面マーカー (NG2、O1、O4) は井戸からメディアを削除します。
  2. O1 (原液)13 O4 (原液)13に対する主な抗体を含むマウス ハイブリドーマ培養上清の 250 μ L を追加し、ウサギの NG2 に対するポリクローナル (B27NBMA で希釈 1: 150)。
    注: 市販アンチ O1 とアンチ O4 抗体を使用する場合は、製造元が推奨希釈液を利用することをお勧めです。
  3. 37 °C/5% CO2インキュベーターで最大 45 分間一次抗体と細胞を孵化させなさい。
  4. トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で二回洗います。4% のパラホルムアルデヒドとセルを修正 (4 %pfa) 室温で 10 分間。
  5. トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。
  6. アレクサ 488 標識ヤギ抗マウス igm 抗体または抗うさぎ igg 抗体二次抗体 (1: 400) B27NBMA で希釈します。
  7. Coverslips から 0.05% Tween 20/1 × PBS を削除します。暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞を孵化させなさい。
  8. トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。
  9. 二重染色の内部マーカー (GFAP) の検出、室温で 15 分間ブロック/透過バッファーと 0.05% Tween 20/1 X PBS とブロック/permeabilize セルを削除します。それ以外の場合 6.17 の手順に進みます。
  10. ブロック/透過バッファーを削除し、250 μ L 鶏抗 GFAP (1: 100) ブロック/透過バッファーで希釈を追加します。
  11. 室温で 1 時間抗 GFAP とセルを孵化させなさい。トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。
  12. Alexa 594 共役ヤギ抗にわとり igg 抗体二次抗体 (1: 400) B27NBMA で希釈します。
  13. Coverslips から 0.05% Tween 20/1 × PBS を削除します。暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞を孵化させなさい。
  14. トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。
  15. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と対比染色とセルを DAPI を含むメディアのマウント antifade マウントします。
  16. Coverslips が一晩室温で暗闇の中で硬化させてください。
  17. 落射蛍光顕微鏡による染色の細胞をイメージします。
    注: このプロトコルでセルは均一露光時間を使用して 40 倍の倍率でイメージしました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

本研究の目的は O4 の改善の分離法を確立、+プライマリ マウス オリゴデンドロ サイト ターゲット細胞の最低限の操作を必要とします。Coverslips のセルのめっきに子犬の安楽死から全体のプロシージャは約 4 時間、ここで表示されるデータを表す 3 つの独立した実験。組織解離後 4.3 ± 0.46 × 107セルの平均値が 91% ± 5.6% の生存率をそれぞれ独立した実験のため分離されました。アンチ O4 を使用して免疫隔離タグ マイクロ磁気ビーズ後 6.9 ± 0.38 x 106の平均最小二乗法が得られた (10 x 1 1.5 マウスあたり6 ) 16.2% である最初解離; 合計セルの ± 1.6%生存率 96.3% ± 3.5% であった。

Figure 2
図 2: Immunomagnetically 分離 1DIV で OLs エクスプレス未熟なマーカー 。位相差顕微鏡を bi とトライ ポーラー形態の下には、最小二乗法を (A)。OLs エクスプレス NG2 (B) O4 (C) と O1 (D)。非常に少数のアストロ サイト 1DIV に存在していた (C、赤)、スケールバー = 50 μ m。 3 の独立した実験からデータが収集されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Immunomagnetically 分離した細胞の抗原の表現型を調べる免疫蛍光染色され実行 24 h (1DIV) 72 h (3DIV) 細胞をメッキした後。1DIV、セル登場双や位相差顕微鏡 (図 2 aB) の下で三極 OLs (Opc または preoligodendrocytes) の増殖初期段階の特徴の特徴。NG2 ラベル (図 2 b)、これらの細胞の 66.1 ± 8.4%、58% ± 9.4% の細胞が O4 ラベル (図 2)。O1 (GalC)-ラベリング、オリゴデンドロ サイト系列のより成熟した細胞のマーカーははるかに少ない共通 (図 2 D7.4% ± 6.0%)。このマーカーのプロファイルは細胞の大半がこの時点で小さい割合未熟か成熟した oligos とおそらくいくつかオリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) 前オリゴデンドロ サイトを示唆しています。アストロ サイト, GFAP 染色、0.57 ± 1.0% (図 2) の構成によって証明されます。これらのデータは、修正技術で分離されたオリゴデンドロ サイトが高度に精製し、大半が未熟なオリゴデンドロ サイトの典型的なマーカーの表現パターンを表示をお勧めします。

Figure 3
図 3: 3DIV で成熟した OLs マーカーの発現します。段階の対照の顕微鏡より複雑な形態を表示の下には、最小二乗法を (A)。3DIV、NG2 の式に (B) 減り、劇的に O4 (C) と O1 (D) 増加します。いくつかアストロ サイトが 3DIV で表示されます (C、赤)、スケールバー = 50 μ m。 3 の独立した実験からデータが収集されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

3DIV、オリゴデンドロ サイト形態登場 1DIV の細胞よりも複雑 (図 3 a)。この時点で初期のオリゴデンドロ サイト マーカー NG2 は NG2 ラベル セル 1 に比較してはるかに低い陽性細胞の頻度構成 31.2 ± 17.1% (対 1DIV、 tで 66.1 ± 8.4%-p をテスト < 0.0001、図 3 b、 図 4 a)。ここでは分析されません、1DIV と比較して 3DIV で NG2 陽性とみなされる細胞内染色の平均強度は低下しました。ほとんどの細胞 (81.9% ± 4.884%図 3) O4-ラベル、1DIV でより高く示した (58% ± 9.4%、 t-テスト p < 0.0001、図 4 b)。また、ほぼ半分の細胞 (47.2% ± 16.4%図 3 D) を示した O1 の染色 (GalC) セルはより成熟した表現に差別化を示唆より成熟オリゴデンドロ サイト系統のマーカー。O1 の増加+細胞 3DIV で、1DIV と比較しても有意 (7.4% ± 6.0%、 t-テスト p < 0.0001、図 4)。存在このアストロ サイト時間点極めて低い水準 (0.8% ± 1.5%図 3) と 1DIV と比較して有意差はなかった (0.57% ± 1.0%、重要ではない (ns)、図 4)。時間をかけて分離 immunomagnetically オリゴデンドロ サイトがアストロ サイトなど他の細胞型の汚染は極めて少ないと成熟の段階 3 に体外を区別することが示唆されました。

Figure 4
図 4: 1DIV と 3DIV で OL マーカーの発現の定量化 (A-D).1DIV、細胞の 66% あった NG2+、58% の細胞が O4+、7% の細胞が O1+ 、0.5% の細胞 GFAP+。3DIV、細胞の 31% あった NG2+、81% の細胞が O4+、47% の細胞が O1+ 、0.7% の細胞 GFAP+。平均値 ± SD をご紹介、* * * p を示します < 0.0001、ns = 重要ではないです。3 の独立した実験からデータが収集されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

この通信は、高純度の未熟なマウス オリゴデンドロ サイト文化の効率的な分離法を提案する.以前に公開されたプロトコル39,40に比べると、このメソッドは、GFAP 陽性アストロ サイトの非常に低いレベルと他の非特徴の細胞の割合が非常に低い高い純度を得られました。オリゴデンドロ サイトの血統に既にコミット未熟な最小二乗法であることを指摘することが重要です。したがって、これらの細胞は、分化の初期段階の研究の役に立たないでしょう。

Dincman プロトコル40から変更の 1 つは、私たちの拡散メディアから塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) の除去だった。報告されているその体外bFGF の強い細胞増殖因子として機能分化から Opc を阻害するだけでなく、またプロセス46,47の数が減少します。さらに、bFGF はオリゴデンドロ サイト分化とオリゴデンドロ サイト系列48の継代細胞増殖を増加します。したがって、それは説得力のある、O4 の数が減少+細胞、増加数 A2B5+と NG2+文化の bFGF の効果による Dincman 研究40にみられる細胞があります。

O4 のバインディングを使用して、セルを分離するための方法として、にもかかわらずだけ 59% の細胞が O4+ 1DIV で。これらの結果、Dincman や同僚40分かった分離の O4 のバインディングを使用して、セルの 50% 弱 O4 人つー+ 1DIV で。PDGF 遅延によるポスト mitotic の開発で、示されている一過性に戻す O4+GalC- A2B5 の祖先+O4 PDGF の継続的な存在にもその後区別するため-前 progenitor のような細胞49したがって、それは、最初の日の in vitroにおける増殖プロセス中にいくつかの未熟な OLs は O4 から逆転を発生ことがあります可能性があります+NG2+ O4 に-NG2+、コミットまだ残り。オリゴデンドロ サイトの系譜。この仮説は、細胞の約 80% の分離後すぐに O4 をされた Dincman の検索40でサポートされて+。

3DIV でこのプロトコルはそれよりもやや高い OL 純度を生成する我々 は彼らの方法で頭に頭の比較を行っていないが、39,40を他人に説明。Dincmanらのプロトコルと比較してください。40、FGF 増殖メディアの不足のため、我々 の文化の GFAP 陽性細胞の数を減らす可能性があります。エメリーと Dugas のプロトコル39文化料理を通して細胞の連続通路に依存しています。アストロ サイトは文化料理50に簡単に接続することができます、immunopanning プロトコルの中にセルの各連続通過後引き継がれます可能性があります。提案手法はない私たちの浄化の画分に汚染アストロ サイトを紹介危険にさらします。

私たちの修正法を実行する約 4 時間を取って他の 2 つに比べて高速です。私たちは不必要なステップおよびその他のプロトコルによって組み込まれて試薬を排除することによってこれを達成します。たとえば、私たち両方の神経組織の解離のキットの使用と死んだ細胞を除去するラット抗マウス igm 抗体ビーズ OL 細胞懸濁液の培養を省略した 5 〜 6 時間を取る、Dincman プロトコル40と比較しています。代わりに、マウスの脳皮質パパインと死んだ細胞では低速遠心 (200 x g) を実行することによって削除されたの解離を行った。

約 9 時間を取る、エメリー プロトコル39からの主要な変更は immunopanning 選択の除去と使用済みティッシュの中にパパイン バッファーを平衡に直接 O2/CO2行の要件の削除消化。代わりに、CO2インキュベーターで免疫選択と直接培養マウス脳皮質とパパイン バッファーのミックスを使用しました。

本研究では直接ではなくテストがアンチ O4 マイクロ ビーズもラット、人間および遺伝子改変マウスの脳組織から最小二乗法を分離する使用できます。これはマウス以外のソースから最小二乗法での作業に興味がある研究所の恩恵を受ける可能性のある最小二乗法の分離のため複数のティッシュ ソースを使用する技法の多様性を強調表示します。

結論として、本研究で説明されている修正の OPC 分離法は、髄鞘形成と脱髄疾患の研究に適用でき、プライマリ マウス オリゴデンドロ サイトを取得迅速かつ特定の代替を提供します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者の開示があります。

Acknowledgments

本研究は、国民の多数硬化の社会 (RG4591A1/2) および健康の国民の協会 (R03NS06740402) からの助成金によって支えられました。著者は、実験スペース、機器やアドバイスを提供するため博士イバン エルナンデスと彼の研究室のメンバーをありがとうございます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Tags

神経科学問題 135、オリゴデンドロ サイト、体外、初代培養細胞、マウス、神経科学、オリゴデンドロ サイト浄化、免疫分離
マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M.… More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter