Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Мы описываем иммуномагнитная изоляции первичных мыши олигодендроциты, который позволяет быстрый и конкретный изоляции клеток в vitro культуры.

Abstract

Эффективная и надежная изоляция и культуре первичных Олигодендроциты (МЖС) является ценным инструментом для изучения в vitro развития oligodendroglia, а также биологии демиелинизирующих заболеваний, как рассеянный склероз и Как Пелицэуса Мерцбахера болезнь (ПМЛД). Здесь, мы представляем простой и эффективный выбор метода для изоляции иммуномагнитная этап три О4+ preoligodendrocytes клетки от новорожденных мышей щенков. Так как незрелых OL составляют более 80% грызунов мозг белого вещества на послеродовой день 7 (P7) Этот метод изоляции не только гарантирует Высокодоходные клеточной, но и конкретные изоляции МЖС уже привержены линии oligodendroglial, снижение возможность изолировать загрязняющих клетки, такие как астроциты и другие клетки мозга мыши. Этот метод представляет собой модификацию методов, о которых сообщалось ранее и обеспечивает чистоту подготовка Олигодендроциты выше 80% в около 4 ч.

Introduction

Олигодендроциты (МЖС) являются myelinating клетки центральной нервной системы (ЦНС)1. Изоляции и культуры первичной Олигодендроциты в жестко регулируемой среде является ценным инструментом для изучения в vitro развития oligodendroglia, а также биологии демиелинизирующих заболеваний, как рассеянный склероз2 . Это требует эффективной и надежной Олигодендроциты изоляции и культуры метод3. В этом исследовании мы воспользовались выражения отличительной Олигодендроциты клеток поверхности маркер осуществить изменение изоляции техника, которая является быстрое и конкретным.

Были определены четыре различные стадии созревания олигодендроциты, каждый характеризуется выражением отличительные клеток поверхностных маркеров для каждой стадии развития (рис. 1). Эти клетки поверхностных маркеров могут быть признаны особые антитела4,5и может использоваться для изоляции Судана на определенных этапах. На первом этапе Олигодендроциты клетки-предшественники (OPCs) имеют способность размножаться, миграции и конкретно выражать тромбоцитарный фактор роста рецепторов (PDGF-Rα)6, Ганглиозиды A2B5, протеогликана NG27,8 , polysialic кислота нейронных клеток молекулы адгезии9 и белок, связывающий жирные кислоты 7 (FABP7)10. OPCs у биполярной морфологией с нескольких коротких процессов, вытекающих из противоположных полюсов клетки тела, которая является характеристикой нейронных прекурсоров клетки11.

Figure 1
Рисунок 1: выражение клеток поверхностных маркеров во время разработки мыши олигодендроциты. ОМЖС ячейки поверхностных маркеров, такие как A2B5, GalC (O1), NG2, O4 и PDGF-Rα может использоваться для специально изолировать Олигодендроциты на конкретной стадии развития с помощью специфических антител.   Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

На втором этапе, OPCs породить preoligodendrocytes и выразить в клеточной мембраны не только маркеры OPC, но и sulfatide (сульфатированных galactolipid) признана O4 антитела12,13и GPR17 белков14, которая продолжается до стадии незрелых Олигодендроциты (OL). На данном этапе preoligodendrocytes продлить многополярного короткие процессов. Preoligodendrocytes в стадии крупнейших пр на послеродовой день 2 (P2) мозгового белого вещества крысы и мыши с незначительными населением незрелых мост15.

На третьем этапе незрелых Судана продолжают выражать O4, теряют выражение A2B5 и NG2 маркеров и начинают выражать galactocerebroside C16. На данном этапе МЖС привержены линии oligodendroglial и стать после митотическая клетки с давно разветвленной ветви17,18. В это время первые клетки MBP+ наблюдаются15,19,,2021и незрелых OL составляют более 80% грызунов белого вещества на P7. Таким образом изоляция операции МЖС в P7 может обеспечить Высокодоходные клеточной.

В окончательный и четвертой стадии развития OL Зрелые Мост Экспресс myelinating белки (основной белок миелина (MBP), proteolipid белка (ПЛП), миелина связанные гликопротеина (МАГ) и миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG)22,23 ,24,25,26. На данном этапе Зрелые МЖС продлить мембраны что компактная форма обертыванием влагалищ вокруг аксоны и способны myelinate. Это совпадает с замечанием о том, что в мозге крысы и мыши, MBP+ клетки становятся все более обильные P1419,,2021.

Начиная с первой изоляции Олигодендроциты Fewster и его коллеги в 1967 году27включая immunopanning28,29,30, были осуществлены несколько методов для изоляции Судана от грызунов ЦНС активирован флуоресценции клеток сортируя (FACS) эксплуатации клеток поверхности специфичные антигены28,31, дифференциальной градиентного центрифугирования32,33,34,35 и покачивая метод, основанный на дифференциальных соблюдения различных ЦНС глии36,-37. Однако существующие методы культуры имеют ограничения, особенно с точки зрения чистоты, урожайность и времени, необходимого для выполнения процедуры38. Таким образом необходимы более эффективные методы изоляции олигодендроциты.

В этой статье, мы представляем простой и эффективный выбор метода для изоляции иммуномагнитная этап три О4+ preoligodendrocytes клетки от новорожденных мышей щенков. Этот метод является модификацией техники, сообщает Эмери et al. 39 и Dincman и др. 40 и обеспечивает подготовку чистоту Олигодендроциты выше 80% в около 4 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мышей, используемые в данном исследовании были заботятся согласно указаниям номер протокола SUNY Downstate медицинский центр Отдела о лабораторных животных ресурсов (DLAR) 15-10492.

Примечание: Основная Олигодендроциты были изолированы от новорожденных (P5-P7 одичал тип C57Bl/6Н) мышах. На данном этапе незрелых МЖС составляют более 80% грызунов белого вещества, обеспечение высокой доходности сотовых. Все буфера и реагента композиций доступны в конце Таблицы материалов.

1. Coverslips подготовка

Примечание: Поли-D-Лизин (PDL) / Ламинин покрытием coverslips должен быть подготовлен до OL изоляции.

  1. Место #1 Немецкий стекло coverslips в 50-мл Конические трубки и добавить 35 мл 70% EtOH, чтобы очистить их.
  2. Закройте трубку, поместите его в миксер nutating и инкубации при комнатной температуре по крайней мере 30 минут во время нежно покачиваясь. Coverslips может быть инкубированы всю ночь.
  3. Выбросите EtOH 70%.
  4. Мыть coverslips 3 раза с дейонизированной водой, удалить воду каждый раз с вакуум-аспирацией.
  5. Добавьте coverslips в 50-мл пробирку, достаточно для покрытия coverslips 30-35 мл PDL 50 мкг/мл.
  6. Место 50-мл пробирку, содержащую coverslips на nutating смеситель и инкубации при комнатной температуре по крайней мере 30 минут во время нежно покачиваясь.
  7. Мыть coverslips 3 раза с дейонизированной водой, удаляя воду каждый раз с вакуум-аспирацией.
  8. Перевод coverslips на Петри 60-мм, содержащие деионизированную воду.
  9. Используете наконечник пипетки Р200 организовать coverslips слой, покрывающий всю поверхность Петри.
  10. Тщательно удалите воду из блюд с вакуум-аспирацией.
  11. Удалите избыток воды вокруг coverslips и дайте им высохнуть на ночь с открытой крышкой и под УФ света в капюшоне.
    Примечание: PDL покрытием стекла coverslips могут храниться на 4 ° C в стерильные чашки Петри на срок до трех месяцев.
  12. Поместите coverslips в 24-ну пластины, один на колодец, с помощью тонкой щипцами.
  13. Перемещение coverslips к центру также убедившись, что края не прикасайтесь к стенке скважины.
  14. 100 мкл 10 мкг/мл Ламинин, разбавленных в B27NBMA (см. Таблицу материалов) начиная в центре каждого coverslip и перемещение в циркуляре моды к краям, чтобы охватить все области.
    Примечание: Поскольку Ламинин участвует в ПР обслуживания и способствует дифференциации в зрелых ОМЖС, это является важным фактором выживания OL в vitro культуры41,42,,4344.
  15. Инкубируйте пластину в инкубатор 37 ° C на 5% CO2 для по крайней мере 1 час или до тех пор, пока OLs готовы для обшивки.

2. диссоциация коры мозга мыши

  1. Пожертвуйте послеродовой 5-7-дневный старые C57Bl/6Н мыши щенков быстро обезглавливание с ножницами, ранее мыть в 70% этиловом спирте.
    Примечание: коре головного мозга от 5-6 щенков новорожденных мышей были использованы для каждого приготовления. В среднем один мозг мыши дает 1-1,5 х 106 ОМЖС.
  2. Вырезать ножницами мелких рассечения кожи головы вдоль средней линии и отозвать подвергать черепа.
  3. Вырежьте черепа внимательно вдоль средней линии, начиная с открытия в задней части черепа к фронтального области, подняв с ножницами, чтобы избежать повреждения мозга. Затем используя открытия задней части черепа режут к каждой глазницы вдоль основания черепа.
  4. Использование тонкой щипцами осторожно дразнить коре от мозга и передавать их на блюдо культуры ткани 60-мм, содержащие 7 мл B27NBMA. Повторите шаги 2.2 через 2.4 для каждого мозга, объединение расчлененных коре.
  5. Передать новое блюдо культуры ткани 60-мм, содержащие 5 мл буфера диссоциации коре (B27NBMA, 20-30 ед/мл папаин и 2500 U DNase I).
  6. Нарезать на мелкие кусочки около 1 мм3 с помощью лезвием скальпеля #15 коре и проинкубируйте втечение 20 мин в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора.
  7. Добавьте 1 мл сыворотки роста крупного рогатого скота (BGS), чтобы остановить ферментативной реакции.
  8. Коре наряду с диссоциации СМИ передать 15 мл Конические трубки с помощью Серологические Пипетки 10 мл.
  9. Нежно начинают отделить ткани мозга, медленно закупорить вверх и вниз 6 - 8 раз с помощью 10-мл Серологические Пипетки, используя уход для сведения к минимуму пузыри.
  10. Разрешить куски ткани соглашаться на 2-3 мин и передать свежие трубки супернатант.
  11. Добавить 3 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/2500 U DNase I к ткани Пелле.
  12. Используйте 5 мл Серологические Пипетки для осторожно отделить ткани мозга во время закупорить вверх и вниз 6 - 8 раз. Будьте осторожны, чтобы минимизировать пузыри.
  13. Разрешить куски ткани соглашаться на 2-3 мин.
  14. Супернатант передать свежие трубки. Добавить 3 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/DNase I к ткани Пелле.
  15. Аккуратно отделить ткани мозга, используя кончик накапайте P1000, пока дозирование смеси СМИ и мозг ткани вверх и вниз. Повторите шаги 2.13 и 2,14 до тех пор, пока не большие куски ткани остаются или до B27NBMA содержащий 10% Кортикальной/DNase I в исчерпаны, что наступит раньше. Будьте осторожны, чтобы минимизировать пузыри.
  16. Суспензию клеток в бассейн с предыдущим supernatants.
  17. Место 70 мкм ячейки сита в 50-мл. С помощью 10-мл Серологические Пипетки, передайте суспензию пула клеток нежно ситечко ячейки 70 мкм.
  18. Промойте ситечко ячейки, добавив 1 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/DNase I.
  19. Отменить фильтр ячейки. Довести объем до 30-мл с B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной/DNase I.
  20. Суспензию клеток передавать два 15-мл конические трубы. Центрифуга суспензию клеток в течение 10 минут при 200 x g.
  21. Удалите супернатант не выходя из клетки, подвергается в воздухе. Супернатант будет ясно из-за мусора клеток. Добавить 3 мл B27NBMA, содержащие 10% Кортикальной Пелле.
  22. Осторожно отделить Пелле клетки, с помощью пипетки P1000. Довести объем до 15 мл с B27NBMA, содержащие 10% BGS.
  23. Передайте суспензию клеток через стрейнер клеток свежие 40 мкм.
  24. Промойте ситечко ячейки, добавив 1 мл B27NBMA, содержащие 10% BGS. Отменить фильтр ячейки.
  25. Довести объем до 30 мл с B27NBMA, содержащие 10% BGS.
  26. Суспензию клеток передавать 2 x 15 мл конические трубы. Центрифуга суспензию клеток в течение 10 минут при 200 x g.
  27. Удалите большую часть супернатант не выходя из клетки, подвергается в воздухе. Ресуспензируйте клетки окатышей в 5 мл, лед холодной магнитные ячейки, сортировка (MCS) буфера.

3. Определение клеток и жизнеспособности

  1. Разбавляют 100 мкл суспензии клеток с 400 мкл раствора Трипановый синий в 1,5 мл microcentrifuge трубки для достижения разбавления 1:5 в 0,4% (w/v).
  2. Центр Стекло покровное над камеры Горяева и заполнения двух камер с 10 мкл ячейки разрежения с помощью пипетки P10 и во избежание переполнения. Решение будет проходить под покровным стеклом капиллярность.
  3. Поместите Горяева на микроскопа и отрегулировать фокус с помощью 40 кратном.
    Примечание: Клеток записываются с помощью ручной счетчик в каждом из пяти квадратов (четырех углов и один центр). Только нежизнеспособных клеток поглощать красителя и синее, хотя живой и здоровые клетки появляются круглые и рефракционной и не впитывают краска синего цвета, позволяя для определения числа жизнеспособных и общая клеток на миллилитр.

4. изоляция О4+ Олигодендроциты

  1. Центрифуга суспензию клеток на 200 g x 10 мин.
  2. Тщательно отбросить супернатант с помощью вакуум-аспирации, избегая воздействия клеток в воздух.
  3. Ресуспензируйте гранулы в 90 мкл буфера MCS за 1 x 107 всего клетки с последующим добавлением 10 мкл анти О4 бусы на 1 x 10-7 клеток.
  4. Смешайте суспензию клеток и бусы, нежно стряхивая 15 мл конические с палец 4 - 5 раз.
  5. Инкубировать смесь для 15 мин при температуре 4 ° C, стряхивая 15 мл конические с палец 4-5 timesevery 5 мин.
  6. Вымойте смесь осторожно добавив 2 мл буфера MCS за 1 x 10-7 клеток к трубе. Центрифуга смесь на 200 g x 10 мин.
  7. Отказаться от супернатанта, тщательно с использованием вакуумной аспирации, избегая воздействия клеток в воздух. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл буфера МКН для каждого 1 x 107 клеток.
  8. Прикрепите магнитный сепаратор магнитный сепаратор стенда. Прикрепить столбец выделения к магнитным сепаратором и место стрейнер клеток 40 мкм на колонне. Место два 15-мл или один 50-мл Конические трубки ниже разделения столбцов для сбора через поток.
  9. Предварительно промыть 40 мкм фильтром и разделения столбца ячейки с 3 мл буфера MCS и пусть буфере запустить через колонку, не давая ему высохнуть.
  10. Добавьте смесь суспензии клеток и бусы ситечко клеток и в столбце выбора.
  11. Вымойте 40 мкм клеток ситечко с 1 мл раствора MCS буфера.
  12. Отменить ячейки сита и пусть смесь клеток, бусы и буфера, запустить через колонку, не давая ему высохнуть.
  13. Вымойте разделения столбцов 3 раза с 3 мл буфера MCS и 1 раз с OL распространения средствами массовой информации.
  14. Удалите столбец разделение из магнитный сепаратор, быстро поместить его в 15 мл конические пробки и сразу же добавить 5 мл OL распространения средств массовой информации.
  15. Место поршень в верхней части столбца и твердо толчок для промывки помечены клетки в 15 мл Конические трубки.
  16. Удаление 100 мкл суспензии клеток для определения клеток и жизнеспособности, используя Трипановый синий и Горяева, как указано в разделе 3.
    Примечание: Жизнеспособность клеток выше 80% считается приемлемым приступить к культуре ОМЖС, однако жизнеспособность более чем на 90% является оптимальным.

5. покрытие изолированных О4+ Олигодендроциты

  1. Разбавления суспензии клеток на желание, покрытие плотность (5 x 105 ячеек на coverslip) с помощью OL распространения средств массовой информации.
    Примечание: OL, плотность посева очень важно, поэтому плотность соответствующей ячейки должны быть подтверждены с помощью микроскопа культуры ткани перед. Посева плотность ниже 10 000 клеток/coverslips может привести к плохой ячейку выживания. На покрытие плотность при 10000 до 25000, OL морфологической дифференцировки является медленным45. Мы пластины МЖС на посевной плотности по крайней мере 50 000 клеток/coverslips обеспечить выживание клетки.
  2. Перемещение пластин 24-Ну, содержащие coverslips, покрытые Ламинин от инкубатора на культуре ткани капот.
  3. Удаление Ламинин от каждого coverslip и замените его с 100 мкл суспензии OL.
  4. Инкубируйте ОМЖС в 37 °C/5% CO2 инкубатора для максимум 45 мин содействовать OL адгезии к coverslips.
  5. После инкубации удалите 24-ну пластины из инкубатора. Наводнение каждый хорошо из 24-ну пластины с 500 мкл OL распространения средств массовой информации.
  6. Место операции МЖС обратно в 37 °C/5% CO2 инкубатора для дополнительных 24 h.
  7. 24 ч после покрытия операции МЖС, удалите распространения средств массовой информации и заменить OL дифференциация СМИ побудить дифференциации.
  8. Место операции МЖС обратно в инкубаторе и не удалять до тех пор, пока клетки готовы к фиксации.
    Примечание: Изменения в pH вредны для Судана и снижение жизнеспособности клеток, поэтому следует избегать ненужных удаления операции МЖС культур из инкубатора.

6. иммунофлюоресценции пятнать

  1. Для обнаружения ячейки поверхностных маркеров (NG2, O1 и O4) удалить медиафайл из скважин.
  2. 250 мкл мыши гибридомной supernatants содержащие первичных антител против O1 (неразбавленный)13 и O4 (неразбавленный)13 и кролика polyclonal против NG2 (1: 150, разбавленных в B27NBMA).
    Примечание: Если коммерчески доступных антитела анти О1 и анти О4 должны использоваться, это целесообразно использовать разведений, предложил заводом-изготовителем.
  3. Инкубируйте клетки с основное антитело для 45 мин Максимальная в 37 °C/5% CO2 инкубатора.
  4. Мыть дважды с 0,05% анимации-20/1 X PBS. Исправить клетки с параформальдегида 4% (4% PFA) для 10 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  6. Разбавьте Alexa 488-конъюгированных коза анти мыши IgM или вторичного антитела анти кролик IgG (1: 400), в B27NBMA.
  7. Удаление ПБС 0,05% анимации-20/1 от coverslips. Инкубируйте клетки с вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  8. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  9. Для двойной окрашивания для выявления внутренних маркеров (СВМС), удалите 0,05% анимации-20/1 X PBS и блок/разрушения клеток с буфера блока/permeabilization 15 мин при комнатной температуре. В противном случае перейдите к шагу 6.17.
  10. Удаление буфера блока/permeabilization и добавить 250 мкл курица анти СВМС (1: 100) разводят в буфер блок/permeabilization.
  11. Инкубируйте клетки с анти СВМС для 1 ч при комнатной температуре. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  12. Разбавьте конъюгированных Alexa 594 коза анти курица IgG вторичное антитело (1: 400) в B27NBMA.
  13. Удаление ПБС 0,05% анимации-20/1 от coverslips. Инкубируйте клетки с вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  14. Вымойте три раза за 5 мин с 0,05% анимации-20/1 X PBS.
  15. Изображение с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и смонтировать клетки с antifade монтаж средств массовой информации, содержащие DAPI.
  16. Пусть coverslips лечения на ночь в темноте при комнатной температуре.
  17. Изображения окрашенных клеток с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
    Примечание: В настоящем Протоколе, клетки были образы на 40 кратном увеличении с помощью единообразного выдержка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целью данного исследования было установить метод улучшения изоляции для О4+ мыши олигодендроциты, требуя наименьшего манипулирования клеток-мишеней. Вся процедура от эвтаназии щенков для обшивки клеток в coverslips занимает около 4 часов, и данных, показанный здесь представляют три независимых экспериментов. После диссоциации ткани в среднем 4,3 ± 0.46 x 107 клеток были изолированы для каждой независимой эксперимент с жизнеспособности 91% ± 5,6%. После того, как иммуномагнитная изоляции с помощью анти О4 меткой магнитные микрошарики в среднем 6,9 ± 0,38 х 106 МЖС были получены (1-1,5 x 106 процентов мыши) составляет 16,2% ± 1,6% клеток всего первоначально отделить; жизнеспособность был 96,3% ± 3,5%.

Figure 2
Рисунок 2: магнитными изолированный мост Экспресс незрелых маркеры на 1DIV. (A) операции МЖС в фазе контраста Микроскоп шоу Би - и tri-polar морфологии. Мост Экспресс NG2 (B), O4 (C) и O1 (D). Очень немногие астроциты присутствовали на 1DIV (C, красный), шкалы бар = 50 µm. были собраны данные от 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для изучения антигенной фенотип магнитными изолированных клеток, иммунофлюоресценции пятнать был 24 ч (1DIV) и 72 h (3DIV) после покрытия клетки. В 1DIV, клетки, как представляется, би - или трехполюсные под микроскопом контраст фазы (рисунок 2A-B), характерной особенностью ранней стадии пролиферирующих ОМЖС (OPCs и или preoligodendrocytes). 66.1 ± 8,4% этих клеток были помечены NG2 (рис. 2B), и 58% ± 9,4% клеток были помечены O4 (рис. 2 c). O1 (GalC)-маркировки, маркер более зрелых клеток в линии олигодендроциты, был гораздо реже (7,4% ± 6.0%, Рисунок 2D). Этот маркер профиль свидетельствует о том, что большинство клеток на данный момент являются предварительно Олигодендроциты с меньший процент незрелых или Зрелые oligos и возможно некоторые Олигодендроциты клетки-предшественники (OPCs). Астроциты, о чем свидетельствует СВМС окрашивание, состоящая из 0,57 ± 1,0% (рис. 2 c). Эти данные свидетельствуют, что олигодендроциты, изолированные с модифицированных техника высоко очищенной и большинство Показать шаблон выражения для маркера типичной незрелых олигодендроциты.

Figure 3
Рисунок 3: выражение зрелых МЖС маркеров в 3DIV. (A) операции МЖС стадии контраста Микроскоп Показать более сложную морфологию. В 3DIV, выражение NG2 (B) снижается резко, хотя O4 (C) и O1 (D) повышение. Несколько астроциты являются видимыми в 3DIV (C, красный), шкалы бар = 50 µm. были собраны данные от 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В 3DIV, олигодендроциты морфология появились более сложным, чем клетки на 1DIV (рис. 3A). В этот момент времени, частота положительных для раннего Олигодендроциты маркер NG2 был гораздо ниже по сравнению с 1DIV. NG2-меченых клетки клетки составляют 31,2 ± 17,1% (по сравнению с 66.1 ± 8,4% в 1DIV, т-тест p < 0,0001, рисунок 3B, Рисунок 4A). Хотя здесь не анализируются, средняя интенсивность окрашивания в клетках, считается положительным для NG2 было сокращено в 3DIV, по сравнению с 1DIV. Большинство клеток (81,9% ± 4.884%, рис. 3 c) показал О4 маркировки, которая была выше, чем на 1DIV (58% ± 9,4%, т-тест p < 0,0001, рис. 4B). Кроме того, почти половина клетки (47,2% ± 16,4%, рис. 3D) показал пятная для O1 (GalC), маркер более зрелой линии олигодендроциты, предполагая, что клетки дифференцируя к более зрелой фенотип. Увеличение O1+ клетки в 3DIV был также значительным по сравнению с 1DIV (7,4% ± 6.0%, т-тест p < 0,0001, рис. 4 c). Присутствие астроциты в это время оставалась чрезвычайно низкой точкой (0,8% ± 1,5%, рис. 3 c), и он не был существенно отличается по сравнению с 1DIV (0,57% ± 1,0%, не значительные (ns), Рисунок 4 d). Эти результаты показывают, что со временем, магнитными изолированные Олигодендроциты способны дифференцироваться в пробирке в третий этап созревания с очень мало загрязнения других типов клеток, таких как астроциты.

Figure 4
Рисунок 4: количественная оценка выражения маркеров OL 1DIV и 3DIV (A-D). В 1DIV, 66% клеток были NG2+, 58% из клеток были О4+, 7% из клеток были O1+ и 0,5% клеток были СВМС+. На 3DIV, 31% из клеток были NG2+, 81% клеток были О4+, 47% клеток были O1+ и 0,7% клеток были СВМС+. Значения среднее ± SD представлены здесь, *** указывает p < 0,0001, НС = не значительные. Данные были собраны из 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой связи мы представляем метод для эффективной изоляции высокоочищенных незрелых мыши Олигодендроциты культур. По сравнению с ранее опубликованные протоколы39,40, этот метод принесли более высокой чистоты с гораздо более низком уровне астроциты СВМС положительные и очень низкий процент других клеток, не характерны. Важно отметить, что эти незрелые МЖС уже совершенных в линии oligodendroglial. Таким образом эти клетки не будет полезным для изучения ранних стадиях дифференцировки.

Одна из модификаций от Dincman протокола40 было устранение основных фибробластический фактор роста (bFGF) от нашего распространения средств массовой информации. Было сообщено, что в пробирке, bFGF, действуя как фактор сильного митогенный не только подавляет OPCs от дифференциации, но также уменьшает количество процессов46,47. Кроме того bFGF увеличивает Олигодендроциты дифференцировке и распространения в пассированный клеток oligodendroglial линии 48. Таким образом, это правдоподобным, сокращение числа О4+ клеток и увеличение числа A2B5+ и NG2+ клетки, наблюдается в Dincman исследования40 может быть связано с эффектом bFGF в культуре.

Несмотря на использование привязки O4 как метод для изоляции клетки, только 59% клеток являются О4+ в 1DIV. Эти результаты аналогичны качественно Dincman и coworkers40 , который обнаружил, что использование O4 привязки для изоляции, чуть менее 50% клеток были О4+ в 1DIV. Было показано, что PDGF задержки после митотическая развития временно возврат O4 GalC– прародителями A2B5++О4– предварительного progenitor как клетки, которые впоследствии дифференцировать даже в дальнейшее присутствие PDGF 49. Таким образом, вполне вероятно, что во время процесса распространения в первый день в vitro некоторые незрелые МЖС могут испытывать вспять от O4+NG2+ до О4–NG2+, в то время как все еще оставаясь совершенные для линии олигодендроциты. Эта гипотеза поддерживается вывод Dincman40 , что сразу же после изоляции около 80% клеток были О4+.

В 3DIV, этот протокол производит несколько выше OL чистоты, чем это описано другими39,40 , хотя мы не делали голова к голове сравнения с их методами. По сравнению с протоколом Dincman et al. 40, меньшее количество СВМС положительных клеток в наших культурах может быть связано с отсутствием ФБП в средствах распространения. Эмери и Дагас протокол39 опирается на последовательное прохождение клеток через культуру блюда; Астроциты можно легко прикрепить к культуре блюда50 и может быть перенесено после каждого последовательного прохождения клеток во время immunopanning протокола. Представленный метод не рисковать, представляя загрязняющих астроциты в нашей очистки фракции.

Наш модифицированный метод быстрее по сравнению с принимая около 4 ч. для выполнения двух других. Мы добиться этого путем устранения ненужных этапов и реагентов включены другие протоколы. Например по сравнению с Dincman протокола40, который занимает 5-6 ч, мы опустили как использование комплекта для диссоциации нервной ткани и инкубации суспензию клеток OL с крыса анти мыши IgM бусы для удаления мертвых клеток. Вместо этого мы провели диссоциации мозга мыши, коре с папаин и мертвые клетки были удалены, выполняя низкая скорость centrifugations (200 x g).

Основные модификации от Эмери протокола39, который занимает около 9 часов, был удаление immunopanning выбор и удаление требования прямой O2/CO2 линии используется для предварительно сбалансировать папаин буфера во время ткани пищеварение. Вместо этого мы использовали выбор иммуномагнитная и прямой инкубации смеси коре мозга мыши и папаин буфера в инкубаторе CO2 .

Хотя не непосредственно в этом исследовании, анти О4 микрошарики может использоваться также для изоляции Судана от крыс, ткани мозга человека и трансгенные мыши. Это подчеркивает универсальность техники использовать несколько источников тканей для изоляции Судана с потенциалом в интересах научно-исследовательских лабораторий, заинтересованы в работе с МЖС от источников, отличных от мыши.

В заключение модифицированный метод изоляции OPC, описанный в настоящем исследовании предоставляет быстрые и конкретные альтернативы для получения первичного мыши олигодендроциты, которые могут применяться в исследованиях миелинизации и демиелинизирующих заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не раскрытия.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантов от Национальное общество рассеянного склероза (RG4591A1/2) и национальных институтов здравоохранения (R03NS06740402). Авторы благодарят д-р Иван Эрнандес и его члены лаборатории за предоставление лабораторных помещений, оборудования и консультации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Tags

Нейробиологии выпуск 135 олигодендроциты в пробирке Главные ячейки мышь неврологии олигодендроциты очистки иммуномагнитная изоляции
Быстрые и конкретные иммуномагнитная изоляция первичной Олигодендроциты мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M.… More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter