Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

يصف لنا عزلة إيمونوماجنيتيك oligodendrocytes الماوس الأساسي، الذي يسمح لعزل الخلايا في المختبر الثقافة سريعة ومحددة.

Abstract

عزلة فعالة وقوية وثقافة oligodendrocytes الأولية (عملية شريان الحياة) أداة قيمة للدراسة في المختبر لتطوير أوليجوديندروجليا، فضلا عن بيولوجيا دملينتينغ الأمراض مثل التصلب المتعدد و بليزايوس-ميرتسباخر-مثل مرض (PMLD). هنا، فإننا نقدم بسيطة وتحقيق الكفاءة في اختيار الأسلوب لعزل إيمونوماجنيتيك المرحلة O4 ثلاث+ الخلايا بريوليجوديندروسيتيس من الجراء الفئران حديثي الولادة. منذ را غير ناضجة تشكل أكثر من 80% من هذه المسألة الأبيض القوارض في الدماغ عند الولادة يوم 7 (P7) لا يضمن هذا الأسلوب عزل عالية الغلة الخلوية، ولكن أيضا عزلة محددة من شريان الحياة للسودان ملتزمة بالفعل النسب أوليجوديندروجليال، تناقص إمكانية عزل الخلايا تلويث مثل أستروسيتيس والخلايا الأخرى من الدماغ الماوس. هذا الأسلوب هو تعديل التقنيات التي ذكرت سابقا، ويوفر oligodendrocyte إعداد نقاوة أعلى من 80% في حوالي 4 ح.

Introduction

Oligodendrocytes (عملية شريان الحياة) هي خلايا ميليناتينج الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. بالعزلة وثقافة oligodendrocytes الأولية في بيئة محكم تنظيم أداة قيمة للدراسة في المختبر لتطوير أوليجوديندروجليا، فضلا عن بيولوجيا دملينتينغ الأمراض مثل التصلب المتعدد2 . وهذا يتطلب oligodendrocyte فعالة وقوية العزلة وثقافة أسلوب3. في هذه الدراسة، ونحن استغل للتعبير عن علامة سطح الخلية oligodendrocyte المميزة لتنفيذ تقنية عزل معدلة التي سريعة ومحددة.

وقد تم التعرف على أربع مراحل متميزة من النضج أوليجوديندروسيتي، بعضها يتسم بالتعبير عن علامات سطح الخلية المميزة لكل مرحلة من مراحل النمو (الشكل 1). هذه العلامات السطحية الخلية يمكن التعرف عليه بواسطة أجسام مضادة محددة4،5، ويمكن استخدامها لعزل عملية شريان الحياة في مراحل محددة. وفي المرحلة الأولى، oligodendrocyte خلايا السلائف (OPCs) لديها القدرة على تتكاثر وتهاجر، وتحديداً التعبير عن عامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات (بدجف-Rα)6، جانجليوسيدي A2B5، وبروتيوغليكان NG27،8 ، بوليسياليك حمض العصبية خلية التصاق جزيء9 والأحماض الدهنية-ملزمة البروتين 7 (FABP7)10. وقد المعاونة مورفولوجيا القطبين مع بعض العمليات قصيرة النابعة من أقطاب المعارضة لخلايا الجسم، والتي من سمات الخلايا العصبية السلائف11.

Figure 1
رقم 1: التعبير عن علامات سطح الخلية أثناء وضع الماوس أوليجوديندروسيتي. عملية شريان الحياة الخلية السطحية علامات مثل A2B5، GalC (O1)، NG2، O4، وبدجف-Rα يمكن استخدامها لعزل oligodendrocytes على وجه التحديد في مرحلة إنمائية محددة باستخدام أجسام مضادة محددة.   الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وفي المرحلة الثانية، تثير بريوليجوديندروسيتيس المعاونة ويعرب في غشاء الخلية علامات حزب مؤتمر اودوا الشعبي، ليس فقط، بل أيضا سولفاتيدي (جالاكتوليبيد مسلفت) المعترف بها من قبل ال12،جسم O413، بروتين GPR1714، التي استمرت حتى المرحلة oligodendrocyte غير ناضجة (الرتب الأخرى). وفي هذه المرحلة، تمديد بريوليجوديندروسيتيس العمليات قصيرة متعدد الأقطاب. بريوليجوديندروسيتيس هي مرحلة را رئيسيا في يوم الولادة 2 (P2) في هذا الشأن الأبيض الدماغي الجرذ والفأر مع سكان صغيرة غير ناضجة عملية شريان الحياة15.

خلال المرحلة الثالثة، وتواصل غير ناضجة عملية شريان الحياة التعبير عن O4 وتفقد التعبير عن علامات A2B5 وفي NG2 ويبدأ بالتعبير عن جالاكتوسيريبروسيدي ج16. في هذه المرحلة، ملتزمون بنسب أوليجوديندروجليال عملية شريان الحياة وتصبح الخلايا الانقسامية اللاحقة مع فروع متشعب طويل17،18. را غير ناضجة تشكل أكثر من 80 في المائة من هذه المسألة الأبيض القوارض في P7 وتحترم الخلايا MBP+ الأولى في هذا الوقت15،19،،من2021. ولذلك، يمكن ضمان عزل عملية شريان الحياة في P7 عالية الغلة الخلوية.

في المرحلة الرابعة والنهائية من التنمية را، أعرب شريان ناضج ميليناتينج البروتينات (البروتين الأساسية المايلين (MBP) والبروتين بروتيوليبيد (حزب العمال التقدمي) وبروتين سكري المايلين المرتبطة (ماج) والمايلين أوليجوديندروسيتي بروتين سكري (موج)22،23 ،24،،من2526. في هذه المرحلة، تمديد هذا الاتفاق شكل انورابينج مانعات حول محاور عصبية الأغشية شريان ناضج وقادرون على ميلينت. ويتزامن هذا مع ملاحظة أن الخلايا MBP+ في الدماغ الفئران والفأر، تصبح وفرة متزايدة في P1419،،من2021.

منذ عزل أول oligodendrocyte فوستر والزملاء في عام 196727، نفذت عدة طرق لعزل عملية شريان الحياة من القوارض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك إيمونوبانينج28،،من2930، الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) استغلال الخلية الخاصة بسطح المستضدات28،31، الطرد المركزي التدرج التفاضلية32،،من3334،35 وأسلوب هز على أساس الانضمام التفاضلية لإطلاق الجهاز العصبي المركزي مختلفة36،37. ومع ذلك، أساليب الثقافة القائمة قد القيود، لا سيما من حيث النقاء والغلة والوقت المطلوب لتنفيذ إجراءات38. ولذلك، أكثر كفاءة أساليب معزل oligodendrocytes المطلوبة.

في هذه الورقة، نقدم بسيطة وتحقيق الكفاءة في اختيار الأسلوب لعزل إيمونوماجنيتيك المرحلة O4 ثلاث+ الخلايا بريوليجوديندروسيتيس من الجراء الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب تعديل التقنيات التي ذكرت باميرى et al. 39 ودينكمان et al. 40 ويوفر نقاء إعداد oligodendrocyte أكثر من 80 في المائة في حوالي 4 ح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة يعتني بهم وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة ولاية نيويورك الولاية الطبي مركز الشعبة من مختبر الحيوان الموارد (دلار) البروتوكول عدد 15-10492.

ملاحظة: أوليجوديندروسيتيس الأولية كانت معزولة من حديثي الولادة (P5-P7 البرية من نوع C57Bl/6N) الفئران. وفي هذه المرحلة، تشكل شريان الحياة للسودان غير ناضجة أكثر من 80 في المائة من هذه المسألة الأبيض القوارض كفالة عالية الغلة الخلوية. تتوفر كافة المخزن المؤقت والتراكيب الكاشف في نهاية الجدول للمواد.

1-إعداد كوفيرسليبس

ملاحظة: بولي-د-يسين (PDL)/كوفيرسليبس لامينين المغلفة ينبغي أن تعد قبل عزلة الرتب الأخرى.

  1. مكان #1 الألمانية الزجاج كوفيرسليبس في أنبوب 50 مل مخروطية وإضافة 35 مل من 70% EtOH لتنظيفها.
  2. إغلاق الأنبوب ووضعه في خلاط نوتاتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل في حين تعصف بلطف. يمكن المحتضنة كوفيرسليبس بين عشية وضحاها.
  3. تجاهل EtOH 70%.
  4. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع المياه، وإزالة الماء كل مرة مع الشفط بالتخلية.
  5. إضافة 30-35 مل PDL 50 ميكروغرام/مل كوفيرسليبس في 50 مل الأنبوب، ما يكفي لتغطية كوفيرسليبس.
  6. ضع 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على كوفيرسليبس في خلاط نوتاتينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل في حين تعصف بلطف.
  7. أغسل كوفيرسليبس 3 مرات مع المياه، إزالة الماء كل مرة مع الشفط بالتخلية.
  8. نقل كوفيرسليبس إلى 60 ملم بيتري الأطباق التي تحتوي على المياه.
  9. استخدام تلميح ماصة P200 لترتيب كوفيرسليبس كطبقة تغطي كامل سطح طبق بيتري.
  10. بعناية، إزالة الماء من الأطباق مع الشفط بالتخلية.
  11. إزالة فائض المياه في جميع أنحاء كوفيرسليبس والسماح لهم الجافة بين عشية وضحاها مع غطاء مفتوحة وتحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: يمكن تخزين PDL مغلفة الزجاج كوفيرسليبس في 4 درجات مئوية في أطباق بتري معقمة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
  12. مكان كوفيرسليبس في لوحات 24-حسنا، واحد لكل بئر، باستخدام الملقط غرامة.
  13. الانتقال كوفيرسليبس إلى مركز جيدا مع التأكد من الحواف لا تلمس جدار البئر.
  14. إضافة 100 ميليلتر من 10 ميكروغرام/مل laminin المخفف في B27NBMA (انظر الجدول للمواد) ابتداء من وسط كل ساترة وتتحرك بطريقة دائرية نحو الحواف لتغطية كل منطقة.
    ملاحظة: نظراً لتشارك في صيانة را laminin ويعزز التمايز في شريان الناضجة، أنها عاملاً هاما في بقاء را43،،من42 في المختبر الثقافة41،44.
  15. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية في 5% CO2 ح 1 على الأقل أو حتى شريان الحياة للسودان على استعداد للطلاء.

2. الماوس تفارق قشرة الدماغ

  1. التضحية الجراء الماوس C57Bl/6N 5-7 أيام القديمة بعد الولادة بقطع الرأس السريع مع مقص تنظيفها مسبقاً في الإيثانول 70%.
    ملاحظة: استخدمت كورتيسيس الدماغي من الجراء الفئران حديثي الولادة 5-6 لكل إعداد. وفي المتوسط، غلة واحد الماوس الدماغ 1-1.5 × 106 عملية شريان الحياة.
  2. قطع الجلد فروة الرأس على طول خط الوسط مع مقص تشريح الصغيرة، وسحب لفضح الجمجمة.
  3. قطع الجمجمة بعناية على طول خط الوسط ابتداء من فتح في الجزء الخلفي من الجمجمة نحو منطقة أمامي، حتى رفع مع مقص لتفادي تلف الدماغ. بعد ذلك، فتح في الجزء الخلفي من الجمجمة باستخدام قطع تجاه كل محجر العين على طول قاعدة الجمجمة.
  4. استخدام الملقط غرامة بلطف ندف كورتيسيس بعيداً عن midbrain ونقلها إلى طبق استنبات الأنسجة 60 ملم تحتوي على 7 مل B27NBMA. كرر الخطوات من 2.2 عن طريق 2.4 لكل الدماغ، وتجميع كورتيسيس تشريح.
  5. نقل كورتيسيس إلى طبق استنبات الأنسجة 60 ملم جديدة تحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت للانفصال (B27NBMA و 20-30 U/mL غراء 2,500 يو الدناز أنا).
  6. الزهر في كورتيسيس إلى قطع صغيرة من حوالي 1 ملم3 باستخدام شفرة المبضع #15 واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
  7. أضف 1 مل مصل النمو البقري (BGS) لوقف رد الفعل الأنزيمي.
  8. نقل كورتيسيس جنبا إلى جنب مع وسائط الإعلام الانفصال إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام بيبيت مصلية 10 مل.
  9. تبدأ بلطف أن تنأى بأنسجة المخ ببطء بيبيتينج أعلى وأسفل باستخدام 6-8 مرات من 10 مل بيبيت مصلية، واستخدام الرعاية لتصغير الفقاعات.
  10. السماح لقطع الأنسجة تسوية لمدة 2-3 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.
  11. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/2500 "ش الدناز" أنا للأنسجة بيليه.
  12. استخدام ماصة مصلية 5 مل أن تنأى بلطف بأنسجة المخ بينما بيبيتينج صعودا وهبوطاً 6-8 مرات. كن حذراً للتقليل من الفقاعات.
  13. السماح لقطع الأنسجة تسوية لمدة 2-3 دقائق.
  14. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا للأنسجة بيليه.
  15. بلطف ننأى بأنسجة المخ باستخدام تلميح بيبيت P1000، بينما بيبيتينج المزيج من وسائل الإعلام والدماغ الأنسجة صعودا وهبوطاً. كرر الخطوات 2.13 و 2.14 حتى تبقى لا أجزاء كبيرة من الأنسجة أو حتى B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا استنفدت، أيهما يأتي أولاً. كن حذراً للتقليل من الفقاعات.
  16. تعليق خلية تجمع مع سوبيرناتانتس السابقة.
  17. مكان 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب 50 مل. استخدام بيبيت مصلية 10 مل، تمرير تعليق خلية المجمعة بلطف عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
  18. أغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا.
  19. تجاهل مصفاة الخلية. إحضار وحدة التخزين إلى 30 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS/الدناز أنا.
  20. نقل تعليق الخلية إلى اثنين من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقائق في 200 x ز.
  21. إزالة المادة طافية دون ترك الخلايا المعرضة للهواء. وستكون المادة طافية غائم بسبب الحطام خلية. أضف 3 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS لبيليه.
  22. ننأى بعناية بيليه الخلية باستخدام بيبيت P1000. إحضار وحدة التخزين إلى 15 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS.
  23. تمرير تعليق خلية عبر مصفاة خلية جديدة 40 ميكرومتر.
  24. أغسل مصفاة الخلية بإضافة 1 مل B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS. تجاهل مصفاة الخلية.
  25. إحضار وحدة التخزين إلى 30 مل مع B27NBMA التي تحتوي على 10% BGS.
  26. نقل تعليق خلية لأنابيب مخروطية 2 × 15 مل. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقائق في 200 x ز.
  27. إزالة معظم المادة طافية دون ترك الخلايا المعرضة للهواء. ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل من الجليد الباردة المغناطيسي الخلية الفرز المخزن المؤقت (MCS).

3-تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء

  1. تمييع 100 ميليلتر من تعليق خلية مع 400 ميليلتر "حل تريبان الأزرق" في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لتحقيق تخفيف 1:5 في 0.4% (w/v).
  2. مركز زجاج تغطي أكثر من دائرة هيموسيتوميتير والتعبئة دائرتي مع 10 ميليلتر لتمييع الخلية باستخدام ماصة P10 وتجنب أوفيرفيل. سيتم تمرير الحل تحت غطاء الزجاج بعمل شعري.
  3. وضع في هيموسيتوميتير في مرحلة مجهر وضبط التركيز باستخدام 40 X التكبير.
    ملاحظة: يتم تسجيل عدد خلايا استخدام عداد اليد في كل من المربعات الخمسة (أربعة أركان ومركز واحد). الخلايا غير قادرة على البقاء فقط امتصاص الصبغة وتظهر زرقاء، بينما يعيش وخلايا صحية تظهر جولة والانكسار ولا تستوعب صبغة زرقاء اللون، مما يسمح لتحديد عدد من خلايا قابلة للحياة، ومجموع في المليلتر.

4-عزل O4+ أوليجوديندروسيتيس

  1. الطرد المركزي بتعليق خلية في 200 غ س لمدة 10 دقائق.
  2. تجاهل المادة طافية بعناية باستخدام الشفط بالتخلية، تجنب التعرض للخلايا في الهواء.
  3. ريسوسبيند بيليه في 90 ميليلتر من المخزن المؤقت MCS الواحدة 1 × 107 مجموع الخلايا متبوعاً بإضافة 10 ميليلتر لمكافحة O4 الخرز الواحدة 1 × 107 الخلايا.
  4. مزيج تعليق خلية والخرز بالتحريك بلطف الأنبوبة المخروطية 15 مل مع الإصبع 4-5 مرات.
  5. احتضان هذا المزيج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، يسددها الأنبوبة المخروطية 15 مل مع الإصبع تيميسيفيري 4-5 5 دقيقة.
  6. أغسل هذا المزيج بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت MCS الواحدة 1 × 107 خلايا الأنبوب بلطف. الطرد المركزي ميكس في 200 غ س لمدة 10 دقائق.
  7. تجاهل المادة طافية بعناية استخدام الشفط بالتخلية، تجنب التعرض للخلايا في الهواء. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة لكل الخلايا7 1 × 10.
  8. إرفاق فاصل مغناطيسي لموقف فاصل مغناطيسي. إرفاق عمود اختيار الفاصل المغناطيسي ومصفاة خلية 40 ميكرومتر على رأس العمود. مكان اثنين 15 مل أو أنبوب مخروطي 50 مل واحد أسفل عمود فصل للتدفق من خلال جمع.
  9. قبل شطف 40 ميكرومتر خلية العمود مصفاة وفصل مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة وترك المخزن المؤقت من خلال العمود تشغيل دون السماح لها الجافة.
  10. إضافة هذا المزيج من تعليق خلية والخرز إلى مصفاة الخلية وفي العمود الاختيار.
  11. أغسل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
  12. تجاهل مصفاة الخلية والسماح المزيج من الخلايا والخرز والمخزن المؤقت من خلال العمود تشغيل دون السماح لها الجافة.
  13. أغسل العمود فصل 3 مرات مع 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف والوقت 1 مع را انتشار وسائط الإعلام.
  14. إزالة العمود فصل من الفاصل المغناطيسي ووضعها بسرعة في أنبوب مخروطي 15 مل فورا إضافة 5 مل من الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
  15. وضع المكبس على رأس العمود ودفع لطرد الخلايا المسماة في أنبوب مخروطي 15 مل بشدة.
  16. إزالة 100 ميليلتر من تعليق خلية لتحديد عدد الخلايا وجدوى استخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير كما هو مبين في الباب 3.
    ملاحظة: صلاحية خلية فوق 80% يعتبر مقبولاً المضي قدما مع ثقافة عملية شريان الحياة، ولكن صلاحية أكبر من 90% الأمثل.

5-الطلاء O4 المعزولة+ أوليجوديندروسيتيس

  1. تمييع تعليق خلية لرغبة تصفيح الكثافة (5 × 105 خلايا كل ساترة) استخدام الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
    ملاحظة: را البذر كثافة مهم جداً، حيث ينبغي تأكيد كثافة الخلية المناسبة استخدام مجهر زراعة الأنسجة قبل المتابعة. بذر الكثافة أدناه خلايا 10,000/كوفيرسليبس قد يؤدي إلى بقاء الخلية الفقراء. في تصفيح الكثافة في الرتب الأخرى 10,000 إلى 25,000، هو التمايز المورفولوجي بطيئة45. نحن لوحة عملية شريان الحياة في كثافة بذر لخلايا/كوفيرسليبس 50,000 على الأقل لضمان بقاء الخلية.
  2. نقل 24-جيدا لوحات تحتوي على كوفيرسليبس المغلفة مع laminin من حاضنة هود زراعة الأنسجة.
  3. إزالة لامينين من كل ساترة واستبدله مع 100 ميليلتر من تعليق الرتب الأخرى.
  4. تبني عملية شريان الحياة في 37 °C/5% CO2 الحاضنة لمدة أقصاها 45 دقيقة لتعزيز التصاق را إلى كوفيرسليبس.
  5. بعد الحضانة، إزالة لوحات 24-جيدا من الحاضنة. الفيضانات كل جيدا لصفيحة 24-جيدا مع 500 ميليلتر من الرتب الأخرى انتشار وسائط الإعلام.
  6. مكان عملية شريان الحياة مرة أخرى في 37 °C/5% CO2 الحاضنة ل 24 ساعة إضافية.
  7. 24 ساعة بعد عملية شريان الحياة، والطلاء إزالة انتشار وسائط الإعلام واستبدال مع را التمايز وسائل الإعلام للحث على التفرقة.
  8. عملية شريان الحياة مرة أخرى في الحاضنة ولا تقم بإزالة حتى الخلايا جاهزة للتثبيت.
    ملاحظة: التغيرات في درجة الحموضة الضارة لعملية شريان الحياة وتقليل بقاء الخلية، ولذا ينبغي تجنب إزالة لا لزوم لها من الثقافات شريان الحياة للسودان من الحاضنة.

6-الفلورة تلطيخ

  1. للكشف عن الخلية علامات السطحية (NG2 O1 و O4)، قم بإزالة الوسائط من الآبار.
  2. إضافة 250 ميليلتر من الماوس هيبريدوما supernatants تحتوي على الأجسام المضادة الأولية ضد O1 (مخفف)13 و O4 (مخفف)13 وارنب [بولكلونل] ضد NG2 (1:150 المخفف في B27NBMA).
    ملاحظة: إذا كانت الأجسام المضادة O1 المضادة ومكافحة O4 المتاحة تجارياً لاستخدامها، من المستصوب الاستفادة من تخفيف اقترحتها الشركة المصنعة.
  3. احتضان الخلايا بجسم الابتدائي لمدة 45 دقيقة كحد أقصى في 37 °C/5% CO2 حاضنة.
  4. تغسل مرتين مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (4% منهاج العمل) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
  6. تمييع الماعز مترافق 488 أليكسا الماوس المضادة IgM أو أرنب المضادة مفتش الثانوي جسم (1: 400) في B27NBMA.
  7. إزالة برنامج تلفزيوني العاشر توين-20/1 0.05% من كوفيرسليبس. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  8. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
  9. لتلطيخ مزدوجة للكشف عن علامات الداخلية (توصيني)، إزالة توين-20/1 0.05% الخلايا X برنامج تلفزيوني وكتلة/بيرميبيليزي مع المخزن المؤقت كتلة/بيرميبيليزيشن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وإلا انتقل إلى الخطوة 6.17.
  10. إزالة كتلة/permeabilization المخزن المؤقت وإضافة 250 ميليلتر الدجاج مكافحة--توصيني (1: 100) المخفف في المخزن المؤقت لكتلة/بيرميبيليزيشن.
  11. احتضان الخلايا مع توصيني المناهضة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
  12. تمييع الماعز مترافق 594 أليكسا الدجاج المضادة مفتش الثانوي جسم (1: 400) في B27NBMA.
  13. إزالة برنامج تلفزيوني العاشر توين-20/1 0.05% من كوفيرسليبس. احتضان الخلايا مع الجسم المضاد الثانوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  14. تغسل ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق مع 0.05% توين-20/1 X برنامج تلفزيوني.
  15. كونتيرستين مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وجبل الخلايا مع تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI أنتيفادي.
  16. كوفيرسليبس علاج بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  17. صورة الخلايا الملون مع مجهر ابيفلوريسسينسي.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم تصويرها في الخلايا في 40 X التكبير باستخدام وقت تعرض موحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان الغرض من هذه الدراسة لإنشاء أسلوب عزل محسنة ل O4+ أوليجوديندروسيتيس الماوس الأساسية التي تتطلب أقل قدر ممكن التلاعب بالخلايا الهدف. يأخذ الإجراء بأكمله من القتل الرحيم الجراء لطلاء الخلايا في كوفيرسليبس حوالي 4 ح والبيانات الموضحة هنا تمثل ثلاث تجارب مستقلة. بعد تفكك النسيج، كان متوسط 4.3 ± 0.46 × 107 خلايا معزولة لكل تجربة مستقلة، مع بقاء 91% ± 5.6%. بعد عزل إيمونوماجنيتيك باستخدام O4 مكافحة معلم ميكروبيدس المغناطيسي في متوسط 6.9 ± 0.38 × 106 شريان الحياة للسودان وتم الحصول على (1-1.5 × 106 كل الماوس) وهي 16.2% ± 1.6% من مجموع الخلايا في البداية فصل؛ كان بقاء ± 96.3 في المائة نسبة 3.5 في المائة.

Figure 2
رقم 2: إيمونوماجنيتيكالي معزولة علامات صريحة غير ناضجة عملية شريان الحياة في 1DIV- (أ) عملية شريان الحياة تحت المجهر الطوري إظهار مورفولوجيا القطبية الثنائية والثلاثية. شريان الحياة للسودان أعرب في NG2 (ب)، O4 (ج)، و O1 (د). أستروسيتيس قليلة جداً كانت موجودة في 1DIV (ج، أحمر)، مقياس بار = 50 ميكرومتر. جمعت المعطيات من التجارب المستقلة 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

دراسة النمط الظاهري مولده للخلايا إيمونوماجنيتيكالي معزولة، الفلورة تلطيخ كان المنجز ح 24 (1DIV) وح 72 (3DIV) بعد طلاء الخلايا. في 1DIV، ظهرت الخلية لتكون ثنائية-أو الأقطاب تحت المجهر الطوري (الشكل 2 أ-ب)، سمة من سمات ميزة مرحلة مبكرة تنتشر عملية شريان الحياة (المعاونة واو بريوليجوديندروسيتيس). 8.4 ± 66.1 في المائة من هذه الخلايا المسمى في NG2 (الشكل 2)، وكانت 58% ± 9.4% من الخلايا المسماة O4 (الشكل 2). O1 (GalC)--وضع العلامات، وعلامة على خلايا أكثر نضجاً في النسب أوليجوديندروسيتي، كان أقل شيوعاً بكثير (± 7.4% 6.0%، الشكل 2D). هذه الشخصية علامة تشير إلى أن غالبية الخلايا عند هذه النقطة oligodendrocytes السابقة بنسب أصغر أوليجوس ناضجة أو غير ناضجة وربما بعض oligodendrocyte السلف الخلايا (OPCs). أستروسيتيس، ما يؤكده توصيني تلطيخ، وتتألف من 0.57 ± 1.0% (الشكل 2). تشير هذه البيانات إلى أن الغاية هي تنقية oligodendrocytes معزولة مع تقنية معدلة والغالبية إظهار نمط التعبير لعلامة نموذجية من أوليجوديندروسيتيس غير ناضجة.

Figure 3
الشكل 3: التعبير عن علامات عملية شريان الحياة الناضجة في 3DIV- (أ) عملية شريان الحياة في إطار المرحلة مجهر تباين إظهار مورفولوجيا أكثر تعقيداً. في 3DIV، تعبير NG2 (ب) انخفاض كبير، بينما O4 (ج) و O1 (د) زيادة. أستروسيتيس القليلة مرئية في 3DIV (ج، أحمر)، مقياس بار = 50 ميكرومتر. جمعت المعطيات من التجارب المستقلة 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

في 3DIV، مورفولوجيا oligodendrocyte يبدو أكثر تعقيداً من الخلايا في 1DIV (الشكل 3A). عند هذه النقطة الزمنية، وتواتر الخلايا إيجابية لعلامة oligodendrocyte المبكر في NG2 كان أقل بكثير بالمقارنة مع 1DIV-الخلايا المسماة في NG2 تتألف 31.2 ± 17.1% (مقابل 8.4 ± 66.1 في المائة في 1DIV، تي-اختبار ف < 0.0001، الشكل 3B، الشكل 4A). على الرغم من أن لم يتم تحليلها هنا، تم تخفيض متوسط كثافة تلطيخ في الخلايا التي تعتبر إيجابية بالنسبة NG2 في 3DIV مقابل 1DIV. معظم الخلايا (81.9% ± 4.884%، الشكل 3) أظهرت العلامات O4، الذي كان أعلى في 1DIV (± 58% 9.4%، t-اختبار ف < 0.0001، الشكل 4B). وأظهرت أيضا، ما يقرب من نصف الخلايا (47.2% ± 16.4%، الشكل 3D) تلطيخ ل O1 (GalC)، علامة على النسب oligodendrocyte أكثر نضجاً، مما يوحي بأن يتم التفريق بين الخلايا بالنمط الظاهري أكثر نضجاً. زيادة O1+ الخلايا في 3DIV كان أيضا هامة بالمقارنة مع 1DIV (± 7.4% 6.0%، t-اختبار ف < 0.0001، الرقم 4). الوجود أستروسيتيس في هذا الوقت نقطة ما زال منخفضا للغاية (0.8% ± 1.5 ٪، الشكل 3) ولم يكن يختلف كثيرا بالمقارنة مع 1DIV (0.57 ± 1.0 ٪، لا يعتد (ns)، الرقم 4). تشير هذه النتائج إلى أن أوليجوديندروسيتيس إيمونوماجنيتيكالي معزولة على مر الزمن، قادرين على التفريق في المختبر في المرحلة الثالثة من النضج مع التلوث القليل جداً من أنواع الخلايا الأخرى مثل أستروسيتيس.

Figure 4
الشكل 4: القياس الكمي للتعبير عن علامات الرتب الأخرى في 1DIV و 3DIV (أ-د)- في 1DIV، كانت نسبة 66 في المائة خلايا NG2+, 58 في المائة الخلايا من O4+، كانت 7% الخلايا O1+ و 0.5% الخلايا كانت توصيني+. في 3DIV، كانت 31 في المائة خلايا NG2+, 81 في المائة الخلايا من O4+، 47% الخلايا كانت O1+ ونسبة 0.7 في المائة الخلايا كانت توصيني+. يعني القيم ± SD ترد هنا، * * * يشير إلى ف < 0.0001، ns = ليس كبيرا. جمعت المعطيات من التجارب المستقلة 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الرسالة، نقدم طريقة لعزل الماوس غير ناضجة جداً المنقي oligodendrocyte الثقافات تتسم بالكفاءة. بالمقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا39،40، أثمر هذا الأسلوب درجة نقاء أعلى بمستوى أقل بكثير من الإيجابية توصيني astrocytes ونسبة منخفضة جداً من الخلايا الأخرى غير تتميز. من المهم أن نشير إلى أن هذه هي شريان الحياة للسودان غير ناضجة التزمت بالفعل بنسب أوليجوديندروجليال. وهكذا، لا سيكون مفيداً لدراسة مراحل الأولى من التمايز هذه الخلايا.

وكان من التعديلات من بروتوكول دينكمان40 إزالة عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (بفجف) من أن انتشار وسائل الإعلام. وأفيد أن في المختبر، بفجف بوصفها عاملاً ميتوجينيك قوية ليس فقط يمنع المعاونة من التمايز، ولكن أيضا يقلل من عدد عمليات46،47. وعلاوة على ذلك، يزيد بفجف ديديفيرينتييشن أوليجوديندروسيتي والانتشار في الخلايا باساجيد من النسب أوليجوديندروجليال 48. ولذلك، فمن المعقول أن انخفاض أرقام O4+ الخلايا وزيادة في إعداد A2B5+ وفي NG2+ الخلايا لوحظ في دراسة دينكمان40 قد يكون راجعا إلى تأثير بفجف في الثقافة.

وعلى الرغم من استخدام ربط O4 كأسلوب لعزل الخلايا، هي 59 في المائة فقط من الخلايا O4+ في 1DIV. هذه النتائج نوعيا مشابهة لتلك التي دينكمان وزملاء العمل40 الذين وجدوا أن استخدام ربط O4 للعزلة، كانت أقل بقليل من 50 في المائة خلايا O4+ في 1DIV. وقد ثبت أن PDGF يؤخر التنمية بعد الانقسامية التي O4 عابر العودة+GalC– فروعه إلى A2B5+O4– قبل بروجينيتور تشبه الخلايا التي تميز فيما بعد حتى في استمرار وجود PDGF 49-ولذلك، فمن المحتمل أن بعض شريان غير ناضجة قد يتعرض أثناء عملية الانتشار في أول يوم في المختبر تحولاً من O4+NG2+ إلى O4–NG2+، في حين لا تزال متبقية ارتكبت لنسب أوليجوديندروسيتي. ويدعم هذه الفرضية دينكمان لإيجاد40 التي كانت O4 فورا بعد عزل حوالي 80% من الخلايا+.

في 3DIV، ينتج هذا البروتوكول درجة نقاء را أعلى إلى حد ما مما هو وصف آخرون39،40 على الرغم من أننا لم يجعل مقارنة وجها لوجه مع أساليبها. مقارنة ببروتوكول دينكمان et al. 40، يمكن أن يكون انخفاض عدد الخلايا إيجابية توصيني في ثقافاتنا بسبب عدم وجود صندوق الأجيال القادمة في انتشار وسائط الإعلام. بروتوكول أميري ودوغاز39 يعتمد على مرور متسلسلة من الخلايا عن طريق أطباق الثقافة؛ يمكن إرفاق بسهولة إلى ثقافة الأطباق50 astrocytes ويمكن أن تتم على بعد مرور كل متسلسلة من الخلايا من خلال بروتوكول إيمونوبانينج. طريقة عرض خطر إدخال astrocytes تلويث في كسر تنقية لدينا.

لدينا طريقة تعديله هو أسرع مقارنة اثنين آخرين مع حوالي 4 ح لأداء. يمكننا تحقيق ذلك بإزالة الخطوات غير الضرورية والمواد الكاشفة التي أدخلها البروتوكولات الأخرى. على سبيل المثال، دينكمان بروتوكول40، الذي يأخذ ح 5-6، بالمقارنة مع أننا حذف كلا من استخدام مجموعة أدوات لتفكك الأنسجة العصبية وفي الحضانة من تعليق خلية را مع الفئران الماوس المضادة IgM الخرز لإزالة الخلايا الميتة. بدلاً من ذلك، أجرينا تفارق الدماغ الماوس وأزيلت كورتيسيس مع غراء والخلايا الميتة بأداء منخفض السرعة سينتريفوجيشنز (200 س ز).

تعديلاً رئيسيا من أميري البروتوكول39، التي تستغرق حوالي 9 ح، تمت إزالة التحديد إيمونوبانينج وإزالة الحاجة إلى س2/CO2 خط مباشر يستخدم لحجته قبل "المخزن المؤقت غراء" خلال الأنسجة الهضم. بدلاً من ذلك، استخدمنا الاختيار إيمونوماجنيتيك والحضانة مباشرة للمزيج من الماوس كورتيسيس الدماغ وغراء المخزن المؤقت في الحاضنة2 CO.

على الرغم من أن اختبار غير مباشرة في هذه الدراسة، يمكن استخدام ميكروبيدس O4 المضادة أيضا لعزل عملية شريان الحياة من الفئران، أنسجة المخ الماوس البشري والمعدلة وراثيا. وهذا يسلط الضوء على براعة أسلوب لاستخدام مصادر متعددة الأنسجة لعزل عملية شريان الحياة مع إمكانية الاستفادة من مختبرات الأبحاث مهتمة بالعمل مع عملية شريان الحياة من مصادر أخرى بخلاف الماوس.

وفي الختام، يوفر طريقة العزل OPC المعدلة المبينة في هذه الدراسة بديلاً سريعة ومحددة للحصول على أوليجوديندروسيتيس الماوس الأساسي الذي يمكن تطبيقه في الدراسات مييلينيشن ودملينتينغ المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا الكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا الدراسة المنح المقدمة من الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد (RG4591A1/2)، والمعاهد الوطنية للصحة (R03NS06740402). يشكر المؤلفون الدكتور إيفان هيرنانديز وأفراد المعمل لتوفير مساحة المختبرات والمعدات والمشورة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Tags

علم الأعصاب، 135 قضية، oligodendrocytes، في المختبر، الخلايا الأولية، الماوس، وعلم الأعصاب، وتنقية أوليجوديندروسيتي، العزلة إيمونوماجنيتيك
عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M.… More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter