Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Vi beskriver immunomagnetic isolation af primære mus oligodendrocytes, som giver mulighed for hurtig og specifik isolering af celler til in vitro- kultur.

Abstract

Effektiv og robust isolation og kultur af primære oligodendrocytes (OLs) er et værdifuldt redskab til in vitro- undersøgelse af udviklingen af oligodendroglia samt biologi demyeliniserende sygdomme som sclerose og Pelizaeus-Merzbacher-lignende sygdom (PMLD). Her præsenterer vi en enkel og effektiv udvælgelsesmetode til immunomagnetic isolering af fase tre O4+ preoligodendrocytes celler fra neonatal mus unger. Eftersom umodne OL udgør mere end 80% af gnaver-hjernens hvide substans på postnatal dag 7 (P7) denne isolation metode ikke kun sikrer høj cellulære udbytte, men også de specifikke isolering af OLs allerede forpligtet til oligodendroglial slægt, faldende de mulighed for at isolere kontaminerende celler såsom astrocytter og andre celler fra mus hjernen. Denne metode er en ændring af de teknikker, der rapporterede tidligere, og giver oligodendrocyte forberedelse renhed over 80% i ca 4 h.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) er myelinating cellerne i centralnervesystemet (CNS)1. Isolation og kultur af primære oligodendrocytes i et stramt reguleret miljø er et værdifuldt redskab til in vitro- undersøgelse af udviklingen af oligodendroglia samt biologi demyeliniserende sygdomme som sklerose2 . Dette kræver en effektiv og robust oligodendrocyte-isolering og kultur metode-3. I denne undersøgelse benyttede vi sig af udtrykket af en karakteristisk oligodendrocyte celle overflade markør til at gennemføre en modificeret isolation teknik, der er hurtig og specifik.

Fire forskellige stadier af oligodendrocyte modning er blevet identificeret, hver karakteriseret ved udtryk for karakteristiske celle overflade markører for hver udviklingsstadiet (figur 1). Disse celle overflade markører kan blive genkendt af specifikke antistoffer4,5, og kan bruges til at isolere OLs på konkrete etaper. I den første fase har oligodendrocyte forløber celler (OPCs) kapacitet til at formere sig, overflytte, og specielt express Trombocyt-afledt vækst faktor receptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG27,8 , polysialic syre-neurale celle vedhæftning molekyle9 og fede-syre-bindende protein 7 (FABP7)10. OPCs har bipolar morfologi med par korte processer stammer fra de modsatte poler af cellen organ, som er karakteristisk for neurale forløber celler11.

Figure 1
Figur 1: udtryk for celle celleoverflademarkører under musen oligodendrocyte udviklingen. OLs cellens overflade markører, såsom A2B5, GalC (O1), NG2, O4 og PDGF-Rα kan bruges til specifikt isolere oligodendrocytes på specifikke udviklingsmæssige stadie ved hjælp af specifikke antistoffer.   Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I anden fase, OPCs give anledning til preoligodendrocytes og express på cellemembranen OPC markører, men også sulfatide (en sulfated galactolipid) anerkendt af O4 antistof12,13, og GPR17 protein14, som fortsætter indtil stadiet umodne oligodendrocyte (OL). På dette stadium udvide preoligodendrocytes multipolær kort processer. Preoligodendrocytes er den store OL Stadium på postnatal dag 2 (P2) i den cerebrale hvide substans i både rotter og mus med en mindre befolkning af umodne OLs15.

I den tredje fase fortsat umodne OLs express O4, mister udtryk af A2B5 og NG2 markører og begynde at udtrykke galactocerebroside C16. På dette stadium, OLs er forpligtet til oligodendroglial slægt og blive post mitotiske celler med lange forgrenet grene17,18. Umodne OL udgør mere end 80% af den gnavere hvide substans på P7 og på dette tidspunkt observeres de første MBP+ celler15,19,20,21. Derfor, isolation af OLs på P7 kunne sikre høj cellulære udbytte.

I den sidste og fjerde fase af OL udvikling express modne OLs myelinating proteiner (myelin grundlæggende protein (MBPS), proteolipid protein (PLP), myelin forbundet glycoprotein (MAG) og myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. På dette stadium, modne OLs udvide membraner denne form kompakt enwrapping skafter omkring axoner og er i stand til at myelinate. Dette falder sammen med den iagttagelse, at i rotter og mus hjerne MBP+ celler bliver mere og mere rigelige på P1419,20,21.

Siden den første dyrkning af oligodendrocyte af Fewster og kolleger i 196727, er blevet gennemført flere metoder til isolering af OLs fra gnaver CNS herunder immunopanning28,29,30, Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) at udnytte celle overflade-specifikke antigener28,31, differential gradient centrifugering32,33,34,35 og en rystende metode baseret på differentierede overholdelse af forskellige CNS glia36,37. Eksisterende kultur metoder har imidlertid begrænsninger, navnlig med hensyn til renhed, udbytte og tid, der kræves til at udføre procedurer38. Derfor er mere effektiv isolation metoder for oligodendrocytes påkrævet.

I dette papir, præsenterer vi en enkel og effektiv udvælgelsesmetode til immunomagnetic isolering af fase tre O4+ preoligodendrocytes celler fra neonatal mus unger. Denne metode er en ændring af de teknikker, der er rapporteret af smergel et al. 39 og Dincman et al. 40 og giver en oligodendrocyte forberedelse renhed over 80% i ca 4 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musene brugt i denne undersøgelse blev passet efter retningslinjerne i SUNY Downstate Medical Center Division af Laboratory Animal ressourcer (DLAR) protokolnummer 15-10492.

Bemærk: Primære oligodendrocytes blev isoleret fra neonatal (P5-P7 vildtype C57Bl/6N) mus. På dette stadium udgør umodne OLs mere end 80% af den gnavere hvide substans at sikre høj cellulære udbytte. Alle buffer og reagens kompositioner er tilgængelige for enden af Bordet af materialer.

1. Coverslips forberedelse

Bemærk: Poly-D-lysin (PDL) / laminin belagt coverslips bør forberedes inden OL isolation.

  1. Sted #1 tysk glas coverslips ind i en 50 mL konisk rør og tilsaettes 35 mL 70% EtOH at rense dem.
  2. Luk røret, placere den i en nutating mixer og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 min. mens blidt vuggende. Coverslips kan være inkuberes natten over.
  3. Kassér 70% EtOH.
  4. Vask coverslips 3 gange med deioniseret vand, fjerne vandet hver gang med vakuum aspiration.
  5. Tilføje 30-35 mL af PDL 50 µg/mL til coverslips i de 50 mL tube, nok til at dække coverslips.
  6. Anbring det 50 mL rør indeholdende coverslips på en nutating mixer og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 min. mens rocking forsigtigt.
  7. Vask coverslips 3 gange med deioniseret vand, at fjerne vandet hver gang med vakuum aspiration.
  8. Overførsel af coverslips til 60-mm petriskåle indeholdende deioniseret vand.
  9. Brug en P200 pipette tip til at arrangere coverslips som et lag, der dækker hele overfladen af petriskålen.
  10. Fjern forsigtigt, vandet fra retter med vakuum aspiration.
  11. Fjern overskydende vand omkring coverslips og lad dem tørre natten over med låg åbent og under UV-lys i hætten.
    Bemærk: PDL belagt glas coverslips kan opbevares ved 4 ° C i sterile petriskåle i op til tre måneder.
  12. Plads coverslips i 24-godt plader, en pr. brønd, ved hjælp af fine pincet.
  13. Flytte coverslips til midten af den godt at sikre kanterne ikke røre væggen i brønden.
  14. Tilsæt 100 µL af 10 µg/mL laminin fortyndet i B27NBMA (Se Tabel af materialer) starter i midten af hver coverslip og bevæger sig i en cirkulær mode mod kanterne til at dække hele området.
    Bemærk: Da laminin er involveret i OL vedligeholdelse og fremmer differentiering af modne OLs, det er en vigtig OL overlevelse faktor for in vitro- kultur41,42,43,44.
  15. Inkuber pladen i et 37 ° C inkubator på 5% CO2 i mindst 1 time eller indtil OLs er klar til plating.

2. mus hjernens Cortex Dissociation

  1. Ofre postnatal 5-7-dages gammel C57Bl/6N mus unger ved hurtig halshugning med saks tidligere rengøres i 70% ethanol.
    Bemærk: Cerebral cortex fra 5-6 neonatal mus unger blev brugt for hvert præparat. I gennemsnit, udbytter en mus hjernen 1-1.5 x 106 OLs.
  2. Skære hovedbund huden langs midterlinjen med små dissekere saks og trække sig tilbage for at eksponere kraniet.
  3. Skære kraniet forsigtigt langs midterlinjen fra åbningen i bagsiden af kraniet mod frontareal, løfte op med saks til at undgå at beskadige hjernen. Derefter, ved hjælp af åbningen i kraniet skære mod hver øjenhulen langs bunden af kraniet.
  4. Bruge bøde tang til at forsigtigt drille cortex fra midthjernen og overføre dem til en 60-mm vævskultur parabol indeholdende 7 mL af B27NBMA. Gentag trin 2.2 gennem 2.4 for hver hjerne, samle de dissekerede cortex.
  5. Overføre cortex til en ny 60-mm vævskultur parabol der indeholder 5 mL af dissociation buffer (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain og 2.500 U DNase jeg).
  6. Terninger i cortex i små stykker af ca. 1 mm3 bruger en #15 skalpel klinge og Ruger i 20 min. i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  7. Der tilsættes 1 mL af kvæg vækst serum (BGS) at stoppe den enzymatiske reaktion.
  8. Overføre cortex sammen med dissociation medier til en 15 mL konisk slange ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette.
  9. Begynde forsigtigt at adskille hjernevæv af langsomt pipettering op og ned 6 - 8 gange ved hjælp af en 10-mL serologisk pipette, ved hjælp af pleje til at minimere bobler.
  10. Tillad væv klumper at nøjes med 2-3 min. og overføre supernatanten til en frisk tube.
  11. Tilføj 3 mL af B27NBMA indeholdende 10% BGS/2500 U DNase I til vævet pellet.
  12. Brug en 5 mL serologisk pipette til forsigtigt adskille hjernevæv mens pipettering op og ned 6 - 8 gange. Vær omhyggelig med at minimere bobler.
  13. Tillad væv klumper nøjes med 2-3 min.
  14. Overføre supernatanten til en frisk tube. Tilføj 3 mL af B27NBMA indeholdende 10% BGS/DNase I til vævet pellet.
  15. Forsigtigt adskille hjernevæv ved hjælp af en P1000 afpipetteres spids, mens pipettering blanding af medier og hjernen væv op og ned. Gentag trin 2.13 og 2.14 indtil ingen store bidder af væv forbliver eller indtil B27NBMA indeholdende 10% BGS/DNase jeg er opbrugt, hvad der kommer først. Vær omhyggelig med at minimere bobler.
  16. Pool cellesuspension med tidligere supernatanter.
  17. Sted 70 µm celle si i en 50 mL tube. Ved hjælp af en 10-mL serologisk pipette, passere den poolede cellesuspension forsigtigt over 70 µm celle si.
  18. Vaske celle si ved tilsætning af 1 mL af B27NBMA indeholdende 10% BGS/DNase jeg.
  19. Kassér celle si. Bringe volumen til 30 mL med B27NBMA som indeholder 10% BGS/DNase jeg.
  20. Overføre cellesuspension til to 15 mL konisk rør. Der centrifugeres cellesuspension til 10 min på 200 x g.
  21. Fjern supernatanten uden at forlade celler udsat for luft. Supernatanten vil være uklar på grund af celle debris. Tilføj 3 mL af B27NBMA indeholdende 10% BGS til pellet.
  22. Forsigtigt adskille celle pellet ved hjælp af en P1000 pipette. Bringe volumen på 15 mL med B27NBMA som indeholder 10% BGS.
  23. Passere cellesuspension over en frisk 40 µm celle si.
  24. Vaske celle si ved tilsætning af 1mL af B27NBMA indeholdende 10% BGS. Kassér celle si.
  25. Bringe volumen til 30 mL med B27NBMA som indeholder 10% BGS.
  26. Overføre cellesuspension til 2 x 15 mL konisk rør. Der centrifugeres cellesuspension til 10 min på 200 x g.
  27. Fjerne de fleste af supernatanten uden at forlade celler udsat for luft. Resuspend celle pellets i 5 mL af is kold magnetiske celle sortering (MCS) buffer.

3. bestemmelse af celletal og levedygtighed

  1. Fortyndes 100 µL af cellesuspension med 400 µL af Trypan blå løsning i 1,5 mL microcentrifuge rør til at opnå en 1:5 fortynding i 0,4% (w/v).
  2. Centrere et cover glas over en hemocytometer kammer og fyld de to kamre med 10 µL af den celle fortynding ved hjælp af en P10 pipette og undgå for meget. Løsningen vil passere under cover glas kapillaritet.
  3. Placere hemocytometer på stadiet mikroskop og justere fokus ved hjælp af 40 X forstørrelse.
    Bemærk: Celletal registreres ved hjælp af en håndholdt tæller i hver af fem pladser (fire hjørner og et center). Kun ikke-levedygtige celler absorbere farvestoffet og synes blå, mens live og sunde celler vises runde og refraktive og ikke absorberer de blå-farvet farvestof, giver mulighed for fastsættelse af antallet af levedygtige og samlede celler pr. milliliter.

4. isolering af O4+ Oligodendrocytes

  1. Der centrifugeres cellesuspension ved 200 x g i 10 min.
  2. Omhyggeligt supernatanten ved hjælp af vakuum aspiration, at undgå eksponering af celler til luften.
  3. Resuspenderes i 90 µL af MCS buffer pr. 1 x 107 samlede celler efterfulgt af tilsætning af 10 µL af anti-O4 perler pr. 1 x 107 celler.
  4. Bland cellesuspension og perler af forsigtigt svippede 15 mL konisk slange med fingeren 4 - 5 gange.
  5. Inkuber blanding i 15 min. ved 4 ° C, svippede 15 mL konisk slange med fingeren 4-5 timesevery 5 min.
  6. Vask blandingen ved forsigtigt tilsætning 2 mL af MCS buffer pr. 1 x 107 celler til røret. Der centrifugeres blandingen på 200 x g i 10 min.
  7. Supernatanten ved omhyggeligt ved hjælp af vakuum aspiration, at undgå eksponering af celler til luften. Resuspenderes celle i 500 µL af MCS buffer for hver 1 x 107 celler.
  8. Tillægge en magnetisk separator stå en magnetisk separator. Vedhæfte en markeringskolonne til den magnetisk separator og placere en 40 µm celle si på toppen af kolonnen. Placer to 15 mL eller en 50 mL konisk rør under kolonnen adskillelse at indsamle flow gennem.
  9. Pre skylles 40-µm celle si og adskillelse kolonne med 3 mL af MCS buffer og lad bufferen, der løber gennem kolonnen uden at lade det tørre.
  10. Tilføje blandingen af cellesuspension og perler til celle sien og ind i kolonnen valg.
  11. Vask 40 µm celle sien med 1 mL af MCS buffer.
  12. Kassér celle si og lad blandingen af celler, perler og buffer køre gennem kolonnen uden at lade det tørre.
  13. Vaske kolonnen adskillelse 3 gange med 3 mL af MCS buffer og 1 gang med OL spredning medier.
  14. Fjern kolonnen adskillelse fra den magnetisk separator, hurtigt sætte det ind i en 15 mL konisk rør og straks tilsættes 5 mL af OL spredning medier.
  15. Placer en stemplet på toppen af kolonnen og fast tryk og skylle de mærket celler ind i 15 mL konisk rør.
  16. Fjerne 100 µL af cellesuspension til at bestemme celletal og levedygtighed benytter Trypan blå og hemocytometer som angivet i afsnit 3.
    Bemærk: Cellernes levedygtighed over 80% anses for acceptabelt at gå videre med kulturen af OLs, men levedygtighed større end 90% er optimal.

5. plating af isolerede O4+ Oligodendrocytes

  1. Fortyndet cellesuspension til ønsket plating tæthed (5 x 105 celler pr. coverslip) ved hjælp af OL spredning medier.
    Bemærk: OL såning tæthed er meget vigtigt, så passende celle tæthed bør bekræftes ved hjælp af en vævskultur mikroskop før proceduren. Såning tæthed under 10.000 celler/coverslips kan føre til dårlig celle overlevelse. Plating tæthed på 10.000 til 25.000, OL er morfologiske differentiering langsom45. Vi plade OLs med en seeding tæthed på mindst 50.000 celler/coverslips at sikre celle overlevelse.
  2. Flytte de 24-godt plader der indeholder coverslips belagt med laminin fra rugemaskinen vævskultur hætte.
  3. Fjern laminin fra hver coverslip og erstatte det med 100 µL af OL suspension.
  4. Inkuber OLs i 37 °C/5% CO2 rugemaskine til et maksimum på 45 min. til fremme OL vedhæftning til coverslips.
  5. Efter inkubationen fjernes 24-godt plader fra rugemaskinen. Oversvømme hver godt af 24-godt plade med 500 µL af OL spredning medier.
  6. Placer OLs tilbage i 37 °C/5% CO2 inkubator i yderligere 24 timer.
  7. 24 timer efter plating af OLs, fjerne spredning medier og erstatte med OL differentiering medier til at inducere differentiering.
  8. Placer OLs tilbage i inkubatoren og fjern ikke indtil cellerne er klar til fiksering.
    Bemærk: Ændringer i pH er til skade for OLs og nedsætte cellers levedygtighed, derfor unødvendige fjernelse af OLs kulturer fra rugemaskinen bør undgås.

6. immunofluorescens farvning

  1. Til påvisning af celle fjerne overflade markører (NG2, O1 og O4) medier fra brøndene.
  2. Tilsæt 250 µL af musen hybridom analysere indeholdende primære antistoffer mod O1 (ufortyndet)13 og O4 (ufortyndet)13 og kanin polyklonale mod NG2 (1:150 opløses i B27NBMA).
    Bemærk: Hvis kommercielt tilgængelige anti-O1 og anti-O4 antistoffer der skal anvendes, er det tilrådeligt at udnytte fortyndinger foreslået af fabrikanten.
  3. Inkuber celler med primær antistof i 45 min. maksimum i en 37 °C/5% CO2 inkubator.
  4. Vaskes to gange med 0,05% Tween-20/1 X PBS. Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD (4% PFA) i 10 min ved stuetemperatur.
  5. Vaskes tre gange i 5 min. med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Fortynd Alexa 488-konjugeret gede anti-mus IgM eller anti-kanin IgG sekundær antistof (1: 400) i B27NBMA.
  7. Fjerne 0,05% Tween-20/1 X PBS fra coverslips. Inkuber celler med sekundær antistof i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
  8. Vaskes tre gange i 5 min. med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  9. Dobbelt farvning for påvisning af interne markører (GFAP), fjerne 0,05% Tween-20/1 X PBS og blok/permeabilize celler med blok/permeabilization buffer i 15 min. ved stuetemperatur. Ellers gå videre til trin 6.17.
  10. Fjern blok/permeabilization buffer og tilsæt 250 µL kylling anti-GFAP (1: 100) fortyndet i blok/permeabilization buffer.
  11. Inkuber celler med anti-GFAP i 1 time ved stuetemperatur. Vaskes tre gange i 5 min. med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Fortynd Alexa 594-konjugeret gede anti-kylling IgG sekundær antistof (1: 400) i B27NBMA.
  13. Fjerne 0,05% Tween-20/1 X PBS fra coverslips. Inkuber celler med sekundær antistof i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
  14. Vaskes tre gange i 5 min. med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Kontrastfarve med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og montere cellerne med antifade montering medier indeholdende DAPI.
  16. Lad coverslips helbrede natten i mørke ved stuetemperatur.
  17. Billede af farvede celler med et epifluorescensmikroskop.
    Bemærk: I denne protokol, cellerne blev afbildet på 40 X forstørrelse ved hjælp af en ensartet eksponeringstid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne undersøgelse var at etablere en bedre isolering metode for O4+ primære mus oligodendrocytes kræver mindst mulig manipulation af target-cellerne. Hele proceduren fra eutanasi af hvalpene til plating celler i coverslips tager omkring 4 h og data, der vises her repræsenterer tre uafhængige forsøg. Efter væv dissociation, et gennemsnit på 4,3 ± 0,46 x 107 celler blev isoleret for hvert uafhængigt eksperiment med en levedygtighed af 91% ± 5,6%. Efter immunomagnetic isolation ved hjælp af anti-O4 markeret magnetiske microbeads et gennemsnit på 6,9 ± 0,38 x 106 OLs blev indhentet (1-1,5 x 106 per mus) som er 16,2% ± 1,6% af de samlede celler i første omgang adskilles; levedygtighed var 96,3% ± 3,5%.

Figure 2
Figur 2: Immunomagnetically isoleret OLs express umodne markører på 1DIV. (A) OLs under fase kontrast mikroskop Vis bi - og tri-polar morfologi. OLs express NG2 (B), O4 (C), og O1 (D). Meget få astrocytter var til stede på 1DIV (C, rød), skalalinjen = 50 µm. dataene blev indsamlet fra 3 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at undersøge de antigene Fænotypen af immunomagnetically isoleret celler, blev immunofluorescens farvning udført 24 timer (1DIV) og 72 h (3DIV) efter plating cellerne. På 1DIV, cellen syntes at være bi- eller trepolet under fase kontrast mikroskop (figur 2A-B), en karakteristisk funktion af tidligt prolifererende OLs (OPCs og eller preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4% af disse celler var NG2-mærket (figur 2B), og 58% ± 9,4% af cellerne var O4-mærket (figur 2 c). O1 (GalC)-mærkning, en markør af mere modne celler i oligodendrocyte slægt, var langt mindre udbredt (7,4% ± 6,0%, figur 2D). Denne markør profil tyder på, at størstedelen af celler på dette punkt er pre oligodendrocytes med mindre procenter umodne eller modne oligos og muligvis nogle oligodendrocyte stamfader celler (OPCs). Astrocytter, som det fremgår af GFAP farvning, består af 0.57 ± 1,0% (figur 2 c). Disse data tyder på at oligodendrocytes isoleret med den modificerede teknik er stærkt renset og fleste Vis udtryk mønster for en markør typisk af umodne oligodendrocytes.

Figure 3
Figur 3: udtryk for modne OLs markører på 3DIV. (A) OLs under fase kontrast mikroskop Vis mere komplekse morfologi. På 3DIV, udtryk for NG2 (B) falder drastisk, mens O4 (C) og O1 (D) stigning. Par astrocytter er synlige på 3DIV (C, rød), skalalinjen = 50 µm. dataene blev indsamlet fra 3 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

På 3DIV, oligodendrocyte morfologi syntes mere kompleks end cellerne i 1DIV (figur 3A). På dette tidspunkt, hyppigheden af celler positive for den tidlige oligodendrocyte markør NG2 var meget lavere i forhold til 1DIV. NG2-mærket celler udgjorde 31,2 ± 17.1% (versus 66,1 ± 8,4% på 1DIV, t-test p < 0,0001, figur 3B, Figur 4A). Selv om ikke analyseres her, blev den gennemsnitlige intensitet af farvning i celler anses for at være positiv for NG2 reduceret på 3DIV i forhold til 1DIV. De fleste celler (81,9% ± 4.884%, figur 3 c) viste O4-mærkning, som var højere end i 1DIV (58% ± 9,4%, t-test p < 0.0001, figur 4B). Næsten halvdelen celler (47,2% ± 16,4%, figur 3D) viste også, farvning for O1 (GalC), en markør af mere modne oligodendrocyte afstamning, tyder på, at cellerne differentiering til en mere moden fænotype. Forhøjelsen af O1+ celler på 3DIV var også signifikant i forhold til 1DIV (7,4% ± 6,0%, t-test p < 0.0001, figur 4 c). Tilstedeværelsen af astrocytter herover gang punkt været yderst lav (0,8% ± 1,5%, figur 3 c) og det var ikke signifikant forskellig i forhold til 1DIV (0,57% ± 1,0%, ikke signifikant (ns), figur 4D). Disse resultater viser, at immunomagnetically isoleret oligodendrocytes over tid, er i stand til at differentiere i vitro i tredje fase af modning med meget lidt forurening af andre celletyper såsom astrocytter.

Figure 4
Figur 4: kvantificering af udtryk for OL markører på 1DIV og 3DIV (A-D). Ved 1DIV, var 66% af celler NG2+, 58% af cellerne var O4+, 7% af cellerne var O1+ og 0,5% af cellerne var GFAP+. På 3DIV, 31% af celler blev NG2+, 81% af cellerne var O4+, 47% af cellerne var O1+ og 0,7% af cellerne var GFAP+. Gennemsnitlige værdier ± SD er præsenteret her, *** angiver p < 0.0001, ns = ikke betydelig. Data blev indsamlet fra 3 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne meddelelse præsenterer vi en metode til effektiv isolering af højtrenset umodne mus oligodendrocyte kulturer. I forhold til tidligere publicerede protokoller39,40, gav denne metode et højere renhed med et meget lavere niveau af GFAP-positive astrocytter og en meget lille procentdel af andre celler, ikke-præget. Det er vigtigt at påpege, at disse er umodne OLs allerede forpligtet til oligodendroglial slægt. Disse celler vil således ikke være nyttigt for studiet af tidlige faser af differentiering.

En af ændringerne fra Dincman protokol40 var fjernelse af basic fibroblast vækstfaktor (bFGF) fra vores spredning medier. Det er blevet rapporteret, at in vitro-, bFGF fungerer som en stærk mitogenic faktor ikke kun hæmmer OPCs fra differentiering, men også mindsker antallet af processer46,47. Desuden øger bFGF oligodendrocyte dedifferentiation og spredning i passaged celler oligodendroglial lineage 48. Derfor er det plausibelt at det reducerede antal O4+ celler og øgede antallet af A2B5+ og NG2+ celler observeret i Dincman undersøgelse40 kan være virkningen af bFGF i kultur.

Trods brug O4 bindende som metode til at isolere cellerne, kun 59% af cellerne er O4+ på 1DIV. Disse resultater er kvalitativt svarer til Dincman og kolleger40 der fandt, at bruge O4 bindende for isolation, lidt mindre end 50% af celler var O4+ på 1DIV. Det har vist sig at PDGF forsinker post mitotiske udvikling af forbigående fortrydelse O4+GalC- ophav til A2B5+O4- progenitor-lignende celler, der efterfølgende skelne selv i den fortsatte tilstedeværelse af PDGF 49. det er derfor sandsynligt, at i løbet af processen af spredning i den første dag i vitro nogle umodne OLs kan opleve en vending fra O4+NG2+ til O4-NG2+, mens stadig forbliver forpligtet til oligodendrocyte slægt. Denne hypotese understøttes af Dincmans at finde40 der umiddelbart efter isolering omkring 80% af cellerne var O4+.

På 3DIV, denne protokol producerer en noget højere OL renhed end beskrevet af andre39,40 , selvom vi ikke lave en head-to-head sammenligning med deres metoder. I forhold til protokol af Dincman et al. 40, det lavere antal GFAP-positive celler i vores kulturer kunne være på grund af manglende FGF i spredning medier. Emery og Dugas protokol39 afhænger af den sekventielle passage af celler gennem kultur retter; astrocytter kan vedhæfte nemt til kultur retter50 og kunne fremføres efter hver sekventielle passage af celler under immunopanning protokollen. Metoden præsenteres ikke risikerer at indføre kontaminerende astrocytter i vores rensning brøkdel.

Vores modificerede metode er hurtigere i forhold til de to andre tager omkring 4 timer at udføre. Vi opnå dette ved at fjerne unødvendige skridt og reagenser indarbejdet af de andre protokoller. For eksempel udeladt i forhold til den Dincman protokol40, som tager 5-6 h, vi både brugen af et kit til neurale væv dissociation og inkubation af OL cellesuspension med rotte anti-mus IgM perlerne til fjerne døde celler. I stedet, vi udførte dissociation af musen hjernens cortex med papain og døde celler blev fjernet ved at udføre lav hastighed centrifugations (200 x g).

En væsentlig ændring fra den Emery protokol39, hvilket tager omkring 9 h, var fjernelse af immunopanning udvalget og fjernelse af kravet om en direkte O2/CO2 line bruges til at pre reagensglasset Papain Buffer under væv fordøjelsen. I stedet brugte vi immunomagnetic udvalg og direkte inkubation af blanding af musen hjernens cortex og Papain buffer i CO2 inkubator.

Selv om ikke direkte afprøvet i denne undersøgelse, kan anti-O4 microbeads også bruges til at isolere OLs fra rotte, menneskelige og Transgene mus hjernevæv. Dette understreger alsidigheden af teknik til at bruge flere væv kilder for OLs isolation med potentiale til gavn for forskning labs interesseret i at arbejde med OLs fra andre kilder end mus.

Afslutningsvis giver den modificerede OPC isolation metode beskrevet i denne undersøgelse en hurtig og specifik alternativ for at få primære mus oligodendrocytes, der kunne anvendes i undersøgelser af myelination og demyeliniserende sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den National dissemineret sklerose samfundet (RG4591A1/2) og National Institutes of Health (R03NS06740402). Forfatterne takke Dr. Ivan Hernandez og hans lab medlemmer for laboratorium plads, udstyr og rådgivning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 135 oligodendrocytes in vitro- primærelementer mus neurovidenskab oligodendrocyte rensning immunomagnetic isolation
Hurtig og specifik Immunomagnetic Isolation af musen primære Oligodendrocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M.… More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter