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Neuroscience

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Abstract

O isolamento eficiente e robusto e a cultura de oligodendrócitos primários (OLs) é uma ferramenta valiosa para o estudo em vitro de desenvolvimento de oligodendróglias, bem como a biologia do desmielinizantes doenças como a esclerose múltipla e Doença de Pelizaeus-Merzbacher-como (PMLD). Aqui, apresentamos um simples e método de seleção eficiente para o isolamento de Fima da fase três O4+ preoligodendrocytes as células de filhotes de ratos neonatal. Desde que o imaturo OL constituem mais de 80% da matéria branca de cérebro de roedor no 7º dia pós-natal (P7) este método de isolamento não só garante alto rendimento celular, mas também o isolamento específico de OLs já se comprometeu a linhagem oligodendroglial, diminuindo o possibilidade de isolar células contaminantes como astrócitos e outras células do cérebro do rato. Este método é uma modificação das técnicas relatado anteriormente e fornece a pureza de preparação oligodendrocyte acima de 80% em cerca de 4 h.

Introduction

Oligodendrócitos (OLs) são células do sistema nervoso central (SNC)1microambiental. O isolamento e a cultura de oligodendrócitos primários em um ambiente fortemente regulamentado é uma ferramenta valiosa para o estudo em vitro de desenvolvimento de oligodendróglias, bem como a biologia do desmielinizantes doenças como a esclerose múltipla2 . Isso requer um eficiente e robusto oligodendrocyte isolamento e cultura método3. Neste estudo, aproveitamos a expressão de um marcador de superfície de célula oligodendrocyte distintivo para implementar uma técnica de isolamento modificado que é rápida e específica.

Identificaram-se quatro fases distintas de maturação oligodendrocyte, cada um caracterizado pela expressão de marcadores de superfície celular distinto para cada estágio do desenvolvimento (Figura 1). Estes marcadores de superfície celular podem ser reconhecidos por anticorpos específicos4,5e podem ser usados para isolar OLs em estágios específicos. Na primeira fase, as células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) têm a capacidade de proliferar, migrar e especificamente expresso de fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor (PDGF-Rα)6, gangliosídeos A2B5 proteoglycan NG27,8 , polysialic ácido-neural celular adesão molécula9 e graxos-ácido-proteína obrigatória 7 (FABP7)10. OPCs têm morfologia bipolar com alguns processos curtos emanando os polos opostos do corpo celular, que é característica de células precursoras neurais11.

Figure 1
Figura 1: expressão de marcadores de superfície celular durante o desenvolvimento do oligodendrocyte rato. OLs célula marcadores de superfície tais como A2B5 GalC (O1), NG2, O4 e PDGF-Rα podem ser usado para isolar especificamente oligodendrócitos no estágio de desenvolvimento específico usando anticorpos específicos.   Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na segunda etapa, OPCs dão origem a preoligodendrocytes em expresso na membrana da célula não apenas marcadores OPC, mas também o sulfatide (um galactolipid sulfatado) reconhecido pelo anticorpo O412,13e a proteína GPR1714, que persiste até o estágio imaturo oligodendrocyte (OL). Nesta fase, preoligodendrocytes estender processos curtos multipolares. Preoligodendrocytes são o grande palco OL em dia pós-Natal 2 (P2) na substância branca cerebral, do rato e do rato com uma pequena população de imaturos OLs15.

Durante a terceira fase, OLs imaturos continuam a expressar O4, perder a expressão de marcadores A2B5 e NG2 e expressar galactocerebroside C16. Nesta fase, OLs estão empenhados a linhagem oligodendroglial e tornar-se células pós mitóticas com ramos muito ramificado17,18. OL imaturo constituem mais de 80% da matéria branca roedor no P7... e neste momento as primeiras células MBP+ são observadas15,19,20,21. Portanto, o isolamento de OLs no P7 poderia garantir celulares de alto rendimento.

Na quarta e última fase de desenvolvimento de OL, maduros OLs expressam microambiental proteínas (proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), glicoproteína mielina associada (MAG) e mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG)22,23 ,24,25,26. Nesta fase, maduros OLs estendem as membranas que compacta de forma enwrapping bainhas em torno dos axônios e são capazes de myelinate. Isso coincide com a observação de que, no cérebro do rato e do rato, MBP+ células tornam-se cada vez mais abundantes em P1419,20,21.

Desde o primeiro isolamento do oligodendrocyte por Fewster e colegas em 196727, foram implementados diversos métodos para isolamento de OLs o roedor CNS incluindo immunopanning28,29,30, fluorescência-ativado da pilha de classificação (FACS) explorando a célula antígenos de superfície específicos28,31, centrifugação gradiente diferencial32,33,34,35 e agitação método baseado na aderência diferencial de diferentes CNS glia36,37. No entanto, os métodos de cultura existentes têm limitações, particularmente em termos de pureza, rendimento e tempo necessário para executar os procedimentos de38. Portanto, mais eficientes métodos de isolamento de oligodendrócitos são necessários.

Neste trabalho, apresentamos um simples e método de seleção eficiente para o isolamento de Fima da fase três O4+ preoligodendrocytes as células de filhotes de ratos neonatal. Este método é uma modificação das técnicas relatado por Emery et al 39 e Dincman et al . 40 e fornece uma pureza de preparação do oligodendrocyte acima de 80% em cerca de 4 h.

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Protocol

Os ratos utilizados neste estudo foram tratados de acordo com as diretrizes do número de protocolo de SUNY Downstate Medical Center divisão de laboratório Animal recursos (DLAR) 15-10492.

Nota: Oligodendrócitos primários foram isolados de neonatal (P5-P7 selvagem-tipo C57Bl/6N) ratos. Nesta fase, o imaturos OLs constituem mais de 80% da matéria branca roedor, garantindo alto rendimento celular. Todo buffer e composições de reagente estão disponíveis no final da Tabela de materiais.

1. preparação lamelas

Nota: Poli-D-lisina (PDL) / lamelas laminina revestida devem ser preparadas antes do isolamento de OL.

  1. Lugar #1 alemão lamelas de vidro em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 35 mL de 70% EtOH para limpá-los.
  2. Fechar o tubo, coloque-o em um misturador de oscilador e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min enquanto balançando suavemente. As lamelas podem ser incubadas durante a noite.
  3. Descarte o EtOH 70%.
  4. Lave as lamelas 3 vezes com água desionizada, remover a água com vácuo aspiração sempre.
  5. Adicione 30-35 mL de PDL 50 µ g/mL para as lamelas do tubo de 50 mL, suficiente para cobrir as lamelas.
  6. Coloque o tubo de 50 mL contendo as lamelas em um misturador de oscilador e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min enquanto balançando suavemente.
  7. Lave as lamelas 3 vezes com água desionizada, removendo a água cada vez com vácuo aspiração.
  8. Transferi as lamelas em 60mm placas de Petri contendo água desionizada.
  9. Use uma ponta de pipeta P200 para organizar as lamelas como uma camada cobrindo toda a superfície da caixa de Petri.
  10. Cuidadosamente, remova os pratos com vácuo aspiração da água.
  11. Remova o excesso de água em torno de lamelas e deixe-os secar durante a noite, com a tampa aberta e sob a luz do bairro UV.
    Nota: As lamelas de vidro revestido de PDL podem ser armazenadas a 4 ° C em placas de Petri estéreis por até três meses.
  12. Lugar de lamelas em placas de 24-bem, uma por bem, usando a pinça fina.
  13. Mova as lamelas para o centro do bem fazer com que as bordas não tocar a parede do poço.
  14. Adicione 100 µ l de 10 µ g/mL laminina diluído em B27NBMA (ver a Tabela de materiais) começando no centro de cada lamela e movendo-se em uma forma circular para as bordas para cobrir toda a área.
    Nota: Desde laminina está envolvida na manutenção OL e promove a diferenciação em OLs maduros, é um importante fator de sobrevivência de OL para em vitro cultura41,42,,43,.44.
  15. Incube a placa em uma incubadora de 37 ° C em 5% de CO2 pelo menos 1 h ou até as OLs estão prontos para o chapeamento.

2. Mouse dissociação de córtex cerebral

  1. Sacrifique pós-natal filhotes de rato C57Bl/6N velhos 5-7 dias por decapitação rápida com uma tesoura previamente limpada em etanol a 70%.
    Nota: córtices Cerebral de 5-6 filhotes de ratos neonatal foram utilizados para cada preparação. Em média, um cérebro de rato rende 1-1.5 x 106 OLs.
  2. Cortar a pele do couro cabeludo ao longo da linha mediana com tesouras pequenas de dissecação e retrair para expor a caveira.
  3. Corte o crânio cuidadosamente ao longo da linha mediana a partir da abertura na parte de trás do crânio em direção a área frontal, levantando-a com a tesoura para não danificar o cérebro. Em seguida, usando a abertura na parte de trás do crânio corte para cada soquete do olho ao longo da base do crânio.
  4. Use a pinça fina suavemente arreliar os córtices longe do mesencéfalo e transferi-los para um prato de cultura de tecidos de 60mm contendo 7 mL de B27NBMA. Repita as etapas 2.2 através de 2.4 para cada cérebro, reunindo os córtices dissecados.
  5. Transferir os córtices para um prato de cultura de tecidos de 60mm novo contendo 5 mL de tampão de dissociação (B27NBMA, 20-30 U/mL papaína e 2.500 U DNase eu).
  6. Os córtices com dados em pedaços pequenos, de cerca de 1 mm3 usando uma lâmina de bisturi 15 # e incubar durante 20 min em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
  7. Adicione 1 mL de soro de crescimento bovino (BGS) para parar a reação enzimática.
  8. Transferi os córtices juntamente com os meios de comunicação de dissociação para um tubo cônico de 15 mL, usando uma pipeta sorológica 10ml.
  9. Delicadamente começa a dissociar o tecido cerebral pipetando lentamente acima e para baixo, 6 - 8 vezes usando uma pipeta de 10 mL serológica, usando cuidado para minimizar as bolhas.
  10. Permitir que os pedaços de tecido de contentar com 2-3 min e transferir o sobrenadante para um tubo de fresco.
  11. Adicionar 3 mL de B27NBMA contendo 10% BGS/2500 U DNase eu no tecido da pelota.
  12. Usar uma pipeta sorológica 5ml para dissociar suavemente o tecido cerebral durante a pipetagem para cima e para baixo 6 - 8 vezes. Tenha cuidado para minimizar as bolhas.
  13. Permitir que os pedaços de tecido de contentar com 2-3 min.
  14. Transferi o sobrenadante para um tubo de fresco. Adicionar 3 mL de B27NBMA contendo 10% BGS/DNase eu no tecido da pelota.
  15. Delicadamente, dissociar o tecido cerebral usando a ponta da pipeta P1000, enquanto pipetagem o mix de mídia e tecido do cérebro acima e para baixo. Repita as etapas 2.13 e 2.14 até permanecem sem grandes pedaços de tecido ou até B27NBMA contendo 10% BGS/DNase, está esgotado, o que vier primeiro. Tenha cuidado para minimizar as bolhas.
  16. Suspensão de células de piscina com sobrenadantes anteriores.
  17. Coloque o filtro de célula de 70 µm em um tubo de 50 mL. Usando uma pipeta de 10 mL serológica, passe a suspensão de eritrócitos em pool suavemente sobre o filtro de célula de 70 µm.
  18. Lavar o filtro célula adicionando 1 mL de B27NBMA contendo 10% BGS/DNase eu.
  19. Descarte o filtro da célula. Trazer o volume de 30 mL com B27NBMA contendo 10% BGS/DNase eu.
  20. Transferi a suspensão de eritrócitos para dois tubos cônicos de 15 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 200 g de x.
  21. Remova o sobrenadante sem deixar as células expostas ao ar. O sobrenadante será nublado devido a detritos celulares. Adicionar 3 mL de B27NBMA contendo 10% BGS para a pelota.
  22. Cuidadosamente se dissociam o centrifugado usando uma pipeta P1000. Trazer o volume para 15 mL com B27NBMA contendo 10% BGS.
  23. Passe um coador de célula fresco 40 µm, a suspensão de eritrócitos.
  24. Lavar o filtro célula adicionando 1mL de B27NBMA contendo 10% BGS. Descarte o filtro da célula.
  25. Trazer o volume de 30 mL com B27NBMA contendo 10% BGS.
  26. Transferi a suspensão de eritrócitos para tubos cônicos de 2 x 15 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 200 g de x.
  27. Remova a maioria do líquido sobrenadante sem deixar as células expostas ao ar. Resuspenda as pelotas de célula em 5 mL de célula de magnético frio gelo, classificando o tampão (MCS).

3. a determinação da contagem de células e viabilidade

  1. Dilua 100 µ l de suspensão de células com 400 µ l de solução de azul de Tripan em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga para obter uma diluição de 1:5 em 0,4% (p/v).
  2. Centralize um vidro de tampa sobre uma câmara de hemocytometer e preencher as duas câmaras com 10 µ l da diluição celular usando uma pipeta de P10 e evitando encher em demasia. A solução passará sob o tampa de vidro por ação capilar.
  3. Coloque o hemocytometer na fase de microscópio e ajustar o foco usando 40 ampliação de X.
    Nota: A contagem de células é registradas usando um contador à mão em cada um dos cinco quadrados (quatro cantos e um centro). Apenas as células não-viáveis absorvem o corante e aparecem em azuis, enquanto vivo e células saudáveis aparecem redondos e refração e não absorvem o corante de cor azul, permitindo a determinação do número de células viáveis e totais por mililitro.

4. isolamento de O4+ oligodendrócitos

  1. Centrifugar a suspensão de célula 200 x g durante 10 minutos.
  2. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante usando vácuo aspiração, evitando a exposição das células ao ar.
  3. Resuspenda o pellet em 90 µ l de tampão MCS por 1 x 107 células total seguido pela adição de 10 µ l de anti-O4 grânulos por 1 x 107 células.
  4. Misture a suspensão de células e grânulos suavemente, passando rapidamente o tubo cônico de 15 mL, com o dedo 4 - 5 vezes.
  5. Incubar a mistura por 15 min a 4 ° C, passando rapidamente o tubo cônico de 15 mL, com o dedo 4-5 timesevery 5 min.
  6. Lave a mistura delicadamente adicionando 2 mL de tampão MCS por 1 x 107 células ao tubo. Centrifugue a mistura em 200 x g durante 10 minutos.
  7. Desprezar o sobrenadante, cuidadosamente usando vácuo aspiração, evitando a exposição das células ao ar. Ressuspender as células em 500 µ l de tampão MCS para cada 1 x 107 células.
  8. Anexe um separador magnético para um stand de separador magnético. Anexar uma coluna de seleção para o separador magnético e coloque um coador de célula de 40 µm em cima da coluna. Coloque dois 15 mL ou um tubo cónico de 50 mL abaixo da coluna de separação para coletar o fluxo através de.
  9. Pré-enxágue a coluna 40 µm de filtro e separação de célula com 3 mL de tampão MCS e deixe o buffer através da coluna sem deixá-lo secar.
  10. Adicione a mistura de suspensão de células e grânulos para o filtro de célula e na coluna de seleção.
  11. Lave o filtro de célula 40 µm com 1 mL de tampão MCS.
  12. Descartar o filtro célula e deixe a mistura de células, grânulos e buffer de correr através da coluna sem deixá-lo secar.
  13. Lave a coluna de separação 3 vezes com 3 mL de tampão MCS e 1 vez com mídia de proliferação de OL.
  14. Remover a coluna de separação do separador magnético, rapidamente, coloque-o em um tubo cônico de 15 mL e imediatamente adicionar 5 mL de mídia de proliferação de OL.
  15. Coloque um êmbolo na parte superior da coluna e firme impulso para expulsar as pilhas etiquetadas no tubo cônico de 15 mL.
  16. Remova 100 µ l de suspensão de células para determinar a contagem de células e viabilidade usando Trypan azul e hemocytometer, conforme indicado no ponto 3.
    Nota: Viabilidade celular acima de 80% é considerada aceitável para prosseguir com a cultura de OLs, mas viabilidade maior que 90% é o ideal.

5. chapeamento de O4 isolado+ oligodendrócitos

  1. Diluir a suspensão de células para o desejo do chapeamento a densidade (5 x 105 células por lamela) usando a mídia de proliferação de OL.
    Nota: OL densidade de semeadura é muito importante, então a densidade de célula apropriada deve ser confirmada usando um microscópio de cultura do tecido antes de prosseguir. Semeando a densidade abaixo de 10.000 células/lamelas pode levar a sobrevivência da pilha pobre. No chapeamento de densidade de 10.000 a 25.000, OL diferenciação morfológica é lenta45. Nós da placa OLs em uma densidade de semeadura de no mínimo 50.000 células/lamelas para garantir a sobrevivência da pilha.
  2. Mova as placas de 24 poços contendo lamelas revestidas com laminina da incubadora para o bairro de cultura de tecidos.
  3. Remova cada lamela laminina e substituí-lo com 100 µ l de suspensão OL.
  4. Incube OLs em 37 °C/5% CO2 incubadora para um máximo de 45 min para promover a adesão OL para as lamelas.
  5. Após a incubação, remova as placas de 24 poços da incubadora. Inundar-nos bem da placa de 24 poços com 500 µ l de mídia de proliferação de OL.
  6. Coloque os OLs em 37 °C/5% CO2 incubadora para adicional 24h.
  7. 24 h após o chapeamento de OLs, remova a mídia de proliferação e substituir com mídia de diferenciação OL para induzir a diferenciação.
  8. Coloque os OLs volta na incubadora e não remova até que as células estão prontas para fixação.
    Nota: Mudanças no pH são prejudicial para OLs e diminuir a viabilidade celular, portanto a remoção desnecessária de OLs culturas da incubadora deve ser evitada.

6. mancha da imunofluorescência

  1. Para a detecção de células marcadores de superfície (NG2, O1 e O4) Remova a mídia dos poços.
  2. Adicionar 250 µ l de sobrenadantes de hibridoma rato contendo anticorpos primários O1 (sem diluir)13 e O4 (sem diluir)13 e policlonais contra NG2 de coelho (1:150 diluído em B27NBMA).
    Nota: Se os anticorpos anti-O1 e anti-O4 comercialmente disponíveis devem ser utilizados, é aconselhável utilizar diluições sugeridas pelo fabricante.
  3. Incube as celulas com anticorpo primário por 45 min máximo numa incubadora 37 °C/5% CO2 .
  4. Lave duas vezes com 0,05% Tween-20/1 X PBS. Consertar as células com paraformaldeído 4% (4% PFA) por 10 min à temperatura ambiente.
  5. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Dilua anti-rato cabra Alexa 488-conjugado IgM ou anti-coelho IgG anticorpo secundário (1: 400) em B27NBMA.
  7. Remova a 0,05% Tween-20/1 X PBS as lamelas. Incube as celulas com anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.
  8. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  9. Para a dupla coloração para a detecção de marcadores internos (GFAP), remova as células 0,05% de Tween-20/1 X PBS e bloco/permeabilize com buffer de bloco/permeabilização durante 15 minutos à temperatura ambiente. Caso contrário, prossiga para a etapa 6.17.
  10. Retire o tampão do bloco/permeabilizacao e adicionar 250 µ l frango anti-GFAP (1: 100) diluído em tampão de bloco/permeabilização.
  11. Incube as celulas com anti-GFAP por 1h à temperatura ambiente. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Dilua a cabra Alexa 594-conjugados anti-frango IgG anticorpo secundário (1: 400) em B27NBMA.
  13. Remova a 0,05% Tween-20/1 X PBS as lamelas. Incube as celulas com anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.
  14. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Counterstain com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e montar as células com media mídia contendo DAPI de montagem.
  16. Deixe as lamelas curar durante a noite, no escuro à temperatura ambiente.
  17. Imagem das células coradas com um microscópio de epifluorescência.
    Nota: No presente protocolo, as células foram fotografadas na ampliação de X 40 usando um tempo de exposição uniforme.

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Representative Results

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de isolamento melhorada para O4+ oligodendrócitos mouse principal, exigindo a mínimo possível manipulação das células alvo. Todo o procedimento de eutanásia dos filhotes para chapeamento das células em lamelas leva cerca de 4 h e dados mostrados aqui representam três experimentos independentes. Após a dissociação do tecido, uma média de 4,3 ± 0,46 x 107 células foram isolados para cada experimento independente, com uma viabilidade de 91% ± 5,6%. Depois Fima isolamento usando anti-O4 marcados microbeads magnéticos uma média de 6,9 ± 0,38 x 106 OLs foram obtidos (1-1,5 x 106 por rato) que é de 16,2% ± 1,6% das células totais inicialmente dissociada; viabilidade foi de 96,3% ± 3,5%.

Figure 2
Figura 2: Immunomagnetically isolado OLs imaturas expressam marcadores no 1DIV. (A) OLs sob microscópio de contraste de fase Visualizar morfologia bi - e tri-polar. OLs expressam NG2 (B), O4 (C) e O1 (D). Muito poucos astrócitos estiveram presentes no 1DIV (C, vermelha), barra de escala = 50 µm. os dados foram coletados de 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para examinar o fenótipo antigênico das células immunomagnetically isolado, mancha da imunofluorescência foi realizada 24 h (1DIV) e 72 h (3DIV) depois chapear as pilhas. 1DIV, a célula apareceu para ser bi - ou tripolar sob o microscópio de contraste de fase (Fig. 2A-B), uma característica da característica da fase inicial se proliferando OLs (OPCs e ou preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4% destas células foram rotulados de NG2 (Figura 2B), e 58% ± 9,4% das células foram rotulados de O4 (Figura 2). O1 (GalC)-rotulagem, um marcador de células mais maduras na linhagem oligodendrocyte, era muito menos comum (± 7,4% 6.0%, Figura 2D). Este perfil de marcador sugere que a maioria das células são neste momento pré-oligodendrócitos com menores percentagens imaturo ou maduro oligos e possivelmente algumas células de progenitoras oligodendrocyte (OPCs). Astrócitos, como evidenciado por GFAP coloração, composto a 0,57 ± 1,0% (Figura 2). Estes dados sugerem que os oligodendrócitos isolados com a técnica modificada são altamente purificados e a maioria mostra o padrão de expressão para um marcador típico de oligodendrócitos imaturos.

Figure 3
Figura 3: expressão de marcadores de OLs maduros no 3DIV. (A) OLs sob microscópio de contraste de mostrar mais complexa morfologia de fase. No 3DIV, expressão de NG2 (B) diminui drasticamente, enquanto O4 (C) e O1 (D) aumento. Alguns astrócitos são visíveis no 3DIV (C, vermelha), barra de escala = 50 µm. os dados foram coletados de 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No 3DIV, morfologia oligodendrocyte apareceu mais complexa do que as células em 1DIV (Figura 3A). Neste ponto do tempo, a frequência de células positivas para o marcador precoce do oligodendrocyte NG2 foi muito inferior em comparação com 1DIV. células NG2-rotulado composto 31,2 ± 17,1% (contra 66,1 ± 8,4% em 1DIV, t-teste p < 0,0001, Figura 3B, Figura 4A). Embora não analisadas aqui, a intensidade média de coloração em células consideradas positivas para NG2 foi reduzida em 3DIV comparado com 1DIV. A maioria das células (81,9% ± 4.884%, Figura 3) mostrou O4-rotulagem, que foi superior no 1DIV (58% ± 9,4%, t-teste p < 0,0001, Figura 4B). Além disso, quase metade das células (47,2% ± 16,4%, Figura 3D) mostraram a mancha para O1 (GalC), um marcador de linhagem de oligodendrocyte mais maduro, sugerindo que as células são diferenciando a um fenótipo mais maduro. O aumento de O1+ células em 3DIV também foi significativa em relação ao 1DIV (± 7,4% 6.0%, t-teste p < 0,0001, Figura 4). A presença de astrócitos neste tempo pontos permanecido extremamente baixa (0,8% ± 1,5%, Figura 3) e não foi significativamente diferente em comparação com 1DIV (0,57% ± 1,0%, não significativo (ns), Figura 4). Estes resultados indicam que, ao longo do tempo, immunomagnetically isolado oligodendrócitos são capazes de se diferenciarem em vitro em terceira fase de maturação com muito pouca contaminação de outros tipos de célula como astrócitos.

Figure 4
Figura 4: quantificação da expressão de marcadores OL em 1DIV e 3DIV (A-D). No 1DIV, 66% das células foram NG2+, 58% das células foram O4+, 7% das células foram O1+ e 0,5% das células foram GFAP+. No 3DIV, 31% das células foram NG2+, 81% das células foram O4+, 47% das células foram O1+ e 0,7% das células foram GFAP+. Valores de média ± SD são apresentados aqui, * * * indica p < 0,0001, ns = não significativo. Os dados foram coletados a partir de 3 experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nesta comunicação, apresentamos um método para a isolação eficiente das culturas do oligodendrocyte altamente purificada rato imaturo. Comparado com protocolos previamente publicados39,40, esse método resultou em uma maior pureza com um nível muito inferior de astrócitos GFAP positivo e uma percentagem muito baixa de outras células não-caracterizada. É importante salientar que estas são imaturos OLs já se comprometeu a linhagem oligodendroglial. Assim, estas células não seria útil para o estudo das fases iniciais da diferenciação.

Dentre as modificações do protocolo de Dincman40 foi a remoção do fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) de nossos meios de proliferação. Tem sido relatado que em vitro, bFGF, atuando como um forte fator mitogênico não só inibe OPCs de diferenciação, mas também diminui o número de processos46,47. Além disso, o bFGF aumenta quê oligodendrocyte e proliferação em células passadas do linhagem oligodendroglial 48. Portanto, é plausível que o reduzido número de O4+ células e aumento do número de A2B5+ e NG2+ células observadas no estudo de Dincman40 podem ser devido ao efeito de bFGF na cultura.

Apesar de usar vinculação O4 como o método para isolar as células, apenas 59% das células são O4+ no 1DIV. Estes resultados são qualitativamente semelhantes de Dincman e colegas de trabalho40 quem descobriu que usando vinculação de O4 para isolamento, pouco menos de 50% das células eram O4+ no 1DIV. Tem sido demonstrado que o PDGF atrasa o desenvolvimento pós mitótico por transitoriamente revertendo O4+GalC– progenitores a A2B5+O4– pre-progenitor-como células que posteriormente diferenciam mesmo em presença contínua de PDGF 49. por conseguinte, é provável que durante o processo de proliferação no primeiro dia em vitro alguns OLs imaturos podem experimentar uma inversão de O4+NG2+ para O4–NG2+, enquanto ainda restam comprometidos a linhagem do oligodendrocyte. Esta hipótese é suportada pelo achado40 que, imediatamente após o isolamento cerca de 80% das células foram O4 do Dincman+.

Em 3DIV, este protocolo produz uma pureza OL um pouco maior do que o descrito por outros39,40 , embora nós não fizemos uma comparação frente a frente com seus métodos. Em relação ao protocolo de Dincman et al . 40, do menor número de células de GFAP positivo em nossas culturas pode ser devido à falta de FGF na mídia proliferação. O protocolo de Emery e Dugas39 baseia-se na passagem sequencial das células através de pratos de cultura; astrócitos podem anexar facilmente a cultura pratos50 e poderiam ser transitados após cada passagem sequencial das células durante o protocolo de immunopanning. O método apresentado não arrisca introduzir contaminantes astrócitos em nossa fração de purificação.

Nosso método modificado é mais rápido comparado com os outros dois, levando cerca de 4 h para executar. Conseguimos isso, eliminando etapas desnecessárias e reagentes incorporados por outros protocolos. Por exemplo, em comparação com o Dincman protocolo40, que leva 5-6 h, nós omitido tanto a utilização de um kit para dissociação de tecido neural e a incubação da suspensão celular OL com grânulos de IgM antirato rato para remover as células mortas. Em vez disso, realizamos a dissociação de cérebro de rato córtices com papaína e células mortas foram removidos realizando centrifugações de baixa velocidade (200 x g).

Uma modificação importante do Emery protocolo39, que leva cerca de 9 h, foi a eliminação da seleção immunopanning e a remoção do requisito de O2/CO2 linha direta usado pre-equilibrar o Buffer de papaína durante tecido digestão. Em vez disso, usamos Fima seleção e incubação direta da mistura dos córtices de cérebro de rato e buffer de papaína a incubadora de CO2 .

Embora não diretamente testada neste estudo, o anti-O4 microbeads também pode ser usado para isolar OLs do rato, tecido de cérebro de rato humano e transgênicos. Isto ressalta a versatilidade da técnica usar múltiplas fontes de tecido para isolamento de OLs com potencial para beneficiar laboratórios interessados em trabalhar com OLs de fontes que não sejam do mouse.

Em conclusão, o método de isolamento do OPC modificado descrito neste estudo fornece uma alternativa rápida e específica para obter oligodendrócitos mouse principal que poderiam ser aplicados em estudos de mielinização e desmielinizantes doença.

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Disclosures

Os autores têm sem divulgações.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado por doações da sociedade nacional de esclerose múltipla (RG4591A1/2) e o National Institutes of Health (R03NS06740402). Os autores agradecer Dr. Ivan Hernandez e os seus membros de laboratório para fornecer conselhos, equipamentos e espaço de laboratório.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

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Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

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