Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Vi beskriver immunomagnetic isolasjon av hovedknappen på musen oligodendrocytes, som gir rask og spesifikk isolering av celler for i vitro kultur.

Abstract

Effektiv og robust isolasjon og kultur av primære oligodendrocytes (OLs) er et verdifullt verktøy for i vitro studier av utviklingen av oligodendroglia i tillegg til biologi av demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose og Pelizaeus-Merzbacher-lignende sykdom (PMLD). Her presenterer vi en enkel og effektiv utvalg metode for immunomagnetic isolasjon av fase tre O4+ preoligodendrocytes celler fra neonatal mus pups. Siden umodne OL utgjør mer enn 80% av gnager-hjerne hvit saken i postnatal dag 7 (P7) denne isolasjon metoden ikke bare sikrer høy mobil ytelse, men også spesifikke isolasjon OLS allerede forpliktet til oligodendroglial slektslinje, redusere den muligheten for å isolere forurensende cellene som astrocyttene og andre fra musen hjernen. Denne metoden er en modifikasjon av teknikkene rapportert tidligere, og gir oligodendrocyte forberedelse renhet over 80% på omtrent 4 h.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) er de myelinating cellene i sentralnervesystemet (CNS)1. Isolasjon og kultur av primære oligodendrocytes i et strengt regulert miljø er et verdifullt verktøy for i vitro studier av utviklingen av oligodendroglia i tillegg til biologi av demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose2 . Dette krever en effektiv og robust oligodendrocyte isolasjon og kultur metode3. I denne studien tok vi fordel av uttrykk for en særegen oligodendrocyte celle overflaten markør å implementere en modifisert isolasjon teknikk som er rask og spesifikk.

Fire forskjellige stadier av oligodendrocyte modning har blitt identifisert, hver preget av uttrykk for karakteristiske celle overflate markører for hver utviklingsstadiet (figur 1). Stikkordmerker cellen overflaten kan bli gjenkjent av spesifikke antistoffer4,5, og kan brukes til å isolere OLs på bestemte stadier. I den første fasen har oligodendrocyte forløper celler (OPCs) kapasitet til å spre, overføre og spesielt Ekspress blodplater-avledet vekst faktor reseptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG27,8 , polysialic syre-nevrale celle vedheft molekyl9 og fatty-acid-bindende protein 7 (FABP7)10. OPCs har bipolar morfologi med noen korte prosesser kommer fra de motsatte polakkene av celle som er karakteristisk for neural forløper celler11.

Figure 1
Figur 1: uttrykk for cellen overflate markører under musen oligodendrocyte utviklingen. OLs celle overflate markører som A2B5, GalC (O1), NG2, O4 og PDGF-Rα kan brukes til å isolere spesielt oligodendrocytes på bestemte utviklingsstadiet ved hjelp av spesifikke antistoffer.   Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I den andre fasen, OPCs gi opphav til preoligodendrocytes og express på cellemembranen ikke bare OPC markører, men også sulfatide (en sulfated galactolipid) anerkjent av O4 antistoff12,13, og i GPR17 protein14, som vedvarer til umodne oligodendrocyte (OL) scenen. På dette stadiet utvide preoligodendrocytes multipolar kort prosesser. Preoligodendrocytes er den store OL-scenen postnatal dag 2 (P2) i cerebral hvit saken rotte og mus med en liten befolkning umodne OLs15.

I den tredje fasen fortsatt umodne OLs å uttrykke O4, mister uttrykk for A2B5 og NG2 og begynne å uttrykke galactocerebroside C16. På dette stadiet, OLs er forpliktet til oligodendroglial slektslinje og bli etter mitotisk celler med lang ramified grener17,18. Umodne OL utgjør mer enn 80% av gnager hvit saken på P7 og nå første MBP+ cellene er observert15,19,20,21. Derfor kunne isolasjon OLS på P7 sikre høy mobil ytelse.

I den siste og fjerde fasen av OL utvikling uttrykke modne OLs myelinating proteiner (myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelin forbundet glykoprotein (MAG) og myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. På dette stadiet, modne OLs utvide membraner som skjemaet kompakt enwrapping hylser rundt axons og kan myelinate. Dette sammenfaller med observasjon at i rotte og mus hjernen, MBP+ celler blir stadig rike på P1419,20,21.

Siden første isolering av oligodendrocyte av Fewster og kolleger i 196727, har flere metoder for isolering av OLs fra gnagere CNS implementert inkludert immunopanning28,29,30, fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) utnytte cellen overflaten-spesifikke antigener28,31, differensial gradient sentrifugering32,33,34,35 og risting metode basert på differensial etterlevelse av ulike CNS glia36,37. Eksisterende kultur metoder har imidlertid begrensninger, særlig i forhold til renhet, avkastning og tiden det tar å utføre prosedyrer38. Mer effektiv isolasjon metoder for oligodendrocytes er derfor nødvendig.

I dette papiret, presenterer vi en enkel og effektiv utvalg metode for immunomagnetic isolasjon av scene tre O4+ preoligodendrocytes celler fra neonatal mus pups. Denne metoden er en modifikasjon av teknikkene rapportert av Emery et al. 39 og Dincman et al. 40 og gir en oligodendrocyte forberedelse renhet over 80% på omtrent 4 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musene som brukes i denne studien var stelt i henhold til retningslinjene i protokollnummeret SUNY Downstate Medical Center divisjon av laboratoriet dyr ressurser (DLAR) 15-10492.

Merk: Primære oligodendrocytes ble isolert fra neonatal (P5-P7 vill-type C57Bl/6N) mus. På dette stadiet utgjør umodne OLs mer enn 80% av gnager hvit saken sikrer høy mobil ytelse. Alle buffer og reagens komposisjoner er tilgjengelig på slutten av Tabellen for materiale.

1. Coverslips forberedelse

Merk: Poly-D-lysine (PDL) / laminin belagt coverslips bør være forberedt før OL isolasjon.

  1. Sted #1 tysk glass coverslips til en 50-mL konisk rør og legge 35 mL av 70% EtOH å rense dem.
  2. Lukk røret, plasserer den i en nutating mikser og ruge ved romtemperatur for minst 30 min mens forsiktig rocking. Coverslips kan være ruges over natten.
  3. Kast 70% EtOH.
  4. Vask coverslips 3 ganger med deionisert vann, fjerne vann hver gang med vakuum aspirasjon.
  5. Legge til 30-35 mL PDL 50 µg/mL coverslips i 50-mL tube, nok til å dekke coverslips.
  6. Plasser den 50-mL tuben som inneholder coverslips på en nutating mikser og ruge ved romtemperatur for minst 30 min mens rock forsiktig.
  7. Vask coverslips 3 ganger med deionisert vann, fjerner vannet hver gang med vakuum aspirasjon.
  8. Overfør coverslips til 60 mm Petri retter som inneholder deionisert vann.
  9. Bruk et P200 pipette tips for å arrangere coverslips som et lag dekker hele overflaten av Petriskål.
  10. Nøye, fjerne vannet fra retter med vakuum aspirasjon.
  11. Fjerne overflødig vann på coverslips og la dem tørke over natten med lokk åpent og under UV-lys i panseret.
    Merk: PDL belagt glass coverslips kan lagres på 4 ° C i sterilt Petri retter i opptil tre måneder.
  12. Plass coverslips i 24-vel plater, ett per Vel, hjelp fine tang.
  13. Flytt coverslips til midten av det også gjør at kantene ikke berør veggen av brønnen.
  14. Legge til 100 µL av 10 µg/mL laminin fortynnet i B27NBMA (se Tabell for materiale) starter i midten av hver dekkglassvæske og flytte på en sirkulær måte mot kantene å dekke alle området.
    Merk: Siden laminin er involvert i OL vedlikehold og fremmer differensiering inn modne OLs, er det en viktig OL overlevelse faktor for i vitro kultur41,42,43,44.
  15. Inkuber platen i en 37 ° C inkubator på 5% CO2 i minst 1 time eller til OLs er klar for plating.

2. musen hjerne Cortex dissosiasjon

  1. Ofre postnatal 5-7-dag gamle C57Bl/6N musen pups ved rask halshogging med saks tidligere rengjort i 70% etanol.
    Merk: Cerebral halvdelene fra 5-6 neonatal mus pups ble brukt for hvert preparat. Gjennomsnittlig gir én mus hjerne 1-1,5 x 106 OLs.
  2. Skjær hodebunnen huden langs midtlinjen med liten dissecting saks og trekke for å avsløre skallen.
  3. Kuttet skallen nøye langs midtlinjen fra åpningen på baksiden av skallen mot frontal området, løfte opp med saksen å unngå å skade hjernen. Deretter bruker åpningen på baksiden av skallen klippet mot minnekontakt øye langs bunnen av skallen.
  4. Bruke fine tang forsiktig erte halvdelene fra mellomhjernen og overføre dem til en 60 mm vev kultur parabol med 7 mL av B27NBMA. Gjenta 2.2 gjennom 2.4 for hver hjernen, pooling dissekert halvdelene.
  5. Overføre halvdelene til en ny 60 mm vev kultur parabol med 5 mL av dissosiasjon buffer (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain og 2500 U DNase jeg).
  6. Terninger av halvdelene i små biter av ca 1 mm3 med et #15 skalpell blad og ruge for 20 min i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  7. Legg 1 mL av bovin vekst serum (BGS) for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
  8. Overføre halvdelene sammen med dissosiasjon media til en 15-mL konisk rør med en 10 mL serologisk pipetter.
  9. Begynne forsiktig å distansere hjernevev av sakte pipettering opp og ned 6 - 8 ganger bruker en 10-mL serologisk Pipetter, benytter seg å minimere bobler.
  10. Kan vev biter å betale for 2-3 minutter og overføre nedbryting til en frisk rør.
  11. Legge 3 mL B27NBMA inneholder 10% BGS/2500 U DNase jeg til vev pellets.
  12. Bruk en 5 mL serologisk Pipetter forsiktig ta avstand hjernevev mens pipettering opp og ned 6 - 8 ganger. Pass på å minimere bobler.
  13. Kan vev biter betale for 2-3 minutter.
  14. Overføre nedbryting slik frisk. Legge 3 mL B27NBMA inneholder 10% BGS/DNase jeg til vev pellets.
  15. Forsiktig dissociate hjernevev ved hjelp av en P1000 Pipetter tips, mens pipettering blanding av medier og hjernen vev opp og ned. Gjenta trinnene 2.13 og 2.14 gjenstår ingen store biter av vev eller til B27NBMA som inneholder 10% BGS/DNase er oppbrukt, hva som kommer først. Pass på å minimere bobler.
  16. Bassenget celle hjuloppheng med tidligere supernatants.
  17. Sett 70-µm celle sil i en 50-mL tube. Bruker en 10-mL serologisk Pipetter, passere gruppert celle suspensjon forsiktig over 70-µm celle silen.
  18. Vask celle silen ved å legge til 1 mL av B27NBMA som inneholder 10% BGS/DNase jeg.
  19. Kast celle silen. Bringe volumet til 30-mL med B27NBMA som inneholder 10% BGS/DNase jeg.
  20. Overføre celle suspensjon til to 15-mL konisk rør. Sentrifuge celle suspensjon i 10 min 200 x g.
  21. Fjerne nedbryting uten å forlate cellene eksponert for luft. Nedbryting blir uklar på grunn av celle rusk. Legge 3 mL B27NBMA inneholder 10% BGS til pellet.
  22. Nøye distansere celle pellet bruker en P1000 pipetter. Bringe volumet til 15 mL med B27NBMA som inneholder 10% BGS.
  23. Passere cellen suspensjon over en fersk 40 µm celle sil.
  24. Vask celle silen ved å legge til 1mL av B27NBMA som inneholder 10% BGS. Kast celle silen.
  25. Bringe volumet til 30 mL med B27NBMA som inneholder 10% BGS.
  26. Overføre celle suspensjon til 2 x 15-mL konisk rør. Sentrifuge celle suspensjon i 10 min 200 x g.
  27. Fjerne det meste av nedbryting uten å forlate cellene eksponert for luft. Resuspend celle pellets i 5 mL av is kaldt magnetiske celle sortering (MCS) buffer.

3. fastsettelse av celletall og levedyktighet

  1. Fortynne 100 µL av cellen suspensjon med 400 µL Trypan blå løsning i en 1.5-mL microcentrifuge tube å oppnå en 1:5 fortynning 0,4% (w/v).
  2. Midtstille et cover glass over en hemocytometer kammer og fyll kinesere med 10 µL av cellen fortynning bruker en P10 pipette og unngå overfylle. Løsningen vil passere under cover glasset kapillær handling.
  3. Plasser hemocytometer på mikroskopet scenen og justerer fokus bruke 40 X forstørrelse.
    Merk: Celletall registreres ved hjelp av en håndholdt teller i hver av de fem rutene (fire hjørner og en senter). Bare ikke-levedyktige celler absorbere fargestoff og blå, mens levende og friske celler vises rundt og refraktiv og ikke absorberer blå-farget fargestoff, tillater for fastsettelse av antall levedyktig og totale celler per milliliter.

4. isolering av O4+ Oligodendrocytes

  1. Sentrifuge celle suspensjon 200 x g i 10 min.
  2. Forsiktig kaste nedbryting ved hjelp av vakuum aspirasjon, unngå eksponering av cellene til luft.
  3. Resuspend pellet i 90 µL av MCS buffer per 1 x 107 totalt celler etterfulgt av tillegg av 10 µL av anti-O4 perler per 1 x 107 celler.
  4. Bland celle suspensjon og perler av forsiktig flicking 15-mL konisk røret fingeren 4 - 5 ganger.
  5. Inkuber blandingen i 15 min ved 4 ° C, flicking 15-mL konisk røret fingeren 4-5 timesevery 5 min.
  6. Vask blandingen ved forsiktig å legge 2 mL MCS buffer per 1 x 107 celler til røret. Virvel i blandingen på 200 x g i 10 min.
  7. Kast nedbryting av forsiktig med vakuum aspirasjon, unngå eksponering av cellene til luft. Resuspend celle pellet i 500 µL MCS bufferen for hver 1 x 107 celler.
  8. Fest magnetiske skilletegn til en magnetisk skilletegn stand. Knytte en valg-kolonne til magnetisk skilletegnet og plassere en 40 µm celle sil over kolonnen. Plasser to 15-mL eller en 50-mL konisk tube under kolonnen separasjon samle flyten gjennom.
  9. Pre-skylling 40-µm celle sil og separasjon kolonnen med 3 mL MCS buffer og la bufferen kjøre gjennom kolonnen uten utleie den tørr.
  10. Legge til blandingen av cellen suspensjon og perler celle silen og i kolonnen utvalg.
  11. Vask 40 µm celle silen med 1 mL av MCS buffer.
  12. Forkaste celle sil og la blanding av celler, perler og buffer kjøre gjennom kolonnen uten utleie den tørr.
  13. Vask kolonnen separasjon 3 ganger med 3 mL MCS buffer og 1 gang med OL spredning media.
  14. Fjerne kolonnen separasjon fra magnetiske skilletegnet, raskt plassere det i en 15-mL konisk rør og umiddelbart legge 5 mL OL spredning medier.
  15. Plass en stempelholderen på toppen av kolonnen og fast push å skylle ut merket cellene i 15-mL konisk røret.
  16. Fjerne 100 µL av cellen suspensjon å bestemme celletall og levedyktighet ved hjelp Trypan blå og hemocytometer som angitt i del 3.
    Merk: Cellen levedyktighet 80% anses akseptabelt å fortsette med kulturen i OLs, men levedyktighet større enn 90% er optimal.

5. plating av isolerte O4+ Oligodendrocytes

  1. Fortynne celle suspensjon å ønske plating tetthet (5 x 105 celler per dekkglassvæske) bruke OL spredning medier.
    Merk: OL seeding tetthet er svært viktig, så aktuelle cellen tetthet skal bekreftes ved hjelp av vev kultur mikroskop før du fortsetter. Såing tetthet under 10 000 celler/coverslips kan føre til dårlig celle overlevelse. Kontaktflate tetthet på 10.000 til 25000, OL er morfologiske differensiering treg45. Vi plate OLs på en seeding tetthet av minst 50 000 celler/coverslips å sikre celle overlevelse.
  2. Flytte 24-vel platene som inneholder coverslips belagt med laminin fra inkubator til vev kultur panseret.
  3. Fjern laminin fra hver dekkglassvæske og erstatte den med 100 µL av OL suspensjon.
  4. Inkuber OLs i 37 °C/5% CO2 inkubator maksimum 45 min å promotere OL festing av coverslips.
  5. Etter inkubasjon fjerne 24-vel platene settefiskanlegg. Flom hver brønn av 24-vel platen med 500 µL av OL spredning media.
  6. Plass OLs tilbake i 37 °C/5% CO2 inkubator for ekstra 24 timer.
  7. 24 timer etter plating OLS, fjerne spredning media og erstatning med OL differensiering media å indusere differensiering.
  8. Plasser OLs tilbake i inkubator og fjerner ikke til cellene er klar for fiksering.
    Merk: Endringer i pH er skadelig for OLs og redusere celle levedyktighet, derfor unødvendig fjerning av OLs kulturer settefiskanlegg bør unngås.

6. immunofluorescence flekker

  1. For påvisning av cellen fjerne overflate markører (NG2, O1 og O4) mediet fra brønnene.
  2. Legge til 250 µL av musen hybridoma supernatants som inneholder primære antistoffer mot O1 (ufortynnet)13 og O4 (ufortynnet)13 og kanin polyklonale mot NG2 (1:150 fortynnet i B27NBMA).
    Merk: Hvis kommersielt tilgjengelig anti-O1 og anti-O4 antistoffer som skal brukes, er det tilrådelig å bruke fortynninger foreslått av produsenten.
  3. Inkuber cellene med primære antistoff for 45 min maks i en 37 °C/5% CO2 inkubator.
  4. Vask to ganger med 0,05% Tween-20/1 X PBS. Fastsette cellene med 4% paraformaldehyde (4% PFA) i 10 min ved romtemperatur.
  5. Vask tre ganger i 5 min hver 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Fortynne Alexa 488-konjugerte geit anti-mus IgM eller anti-kanin IgG sekundære antistoff (1:400) i B27NBMA.
  7. Fjern 0,05% Tween-20/1 X PBS fra coverslips. Inkuber cellene med sekundær antistoff 1t ved romtemperatur i mørket.
  8. Vask tre ganger i 5 min hver 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  9. Dobbel flekker for påvisning av interne markører (GFAP), fjerne 0,05% Tween-20/1 X PBS og blokk/permeabilize cellene med blokk/permeabilization buffer i 15 min ved romtemperatur. Ellers går du til trinn 6.17.
  10. Fjern blokk/permeabilization buffer og legge 250 µL kylling anti-GFAP (1: 100) fortynnet i blokk/permeabilization buffer.
  11. Inkuber cellene med anti-GFAP 1t ved romtemperatur. Vask tre ganger i 5 min hver 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Fortynne Alexa 594-konjugerte geit anti-kylling IgG sekundære antistoff (1:400) i B27NBMA.
  13. Fjern 0,05% Tween-20/1 X PBS fra coverslips. Inkuber cellene med sekundær antistoff 1t ved romtemperatur i mørket.
  14. Vask tre ganger i 5 min hver 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Counterstain med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og montere cellene med antifade montering mediet som inneholder DAPI.
  16. La coverslips herdes natten i mørket ved romtemperatur.
  17. Bilde farget cellene med en epifluorescence mikroskop.
    Merk: I denne protokollen, cellene ble fotografert på 40 X forstørrelse bruker en uniform eksponeringstid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne studien var å etablere en økt isolering metode for O4+ hovedknappen på musen oligodendrocytes som krever minst mulig manipulering av målcellene. Hele prosedyren fra eutanasi av valpene til plating cellene i coverslips tar ca 4 h og dataene som vises her representerer tre uavhengige eksperimenter. Etter vev dissosiasjon var gjennomsnittlig 4,3 ± 0.46 x 107 celler isolert for hver uavhengige eksperimentet med en levedyktigheten til 91% ± 5.6. Etter immunomagnetic isolasjon med anti-O4 merket magnetiske microbeads gjennomsnittlig 6,9 ± 0,38 x 106 OLs ble innhentet (1-1,5 x 106 per mus) som er 16.2% ± 1,6% totalt cellene først dissosiert; levedyktighet var 96.3% ± 3,5%.

Figure 2
Figur 2: Immunomagnetically isolert OLs uttrykke umodne markører på 1DIV. (A) OLs under fase kontrast mikroskop Vis og tri-bipolare morfologi. OLs express NG2 (B), O4 (C), og O1 (D). Svært få astrocyttene var tilstede på 1DIV (C, rød), skala bar = 50 µm. Data samlet inn fra 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å undersøke den antigen fenotypen immunomagnetically isolert cellene, ble immunofluorescence flekker utført 24 timer (1DIV) og 72 h (3DIV) etter plating cellene. På 1DIV, cellen syntes å være bi- eller tripolar under fase kontrast mikroskopet (figur 2A-B), karakteristisk for funksjon i tidlig stadium proliferating OLs (OPCs og preoligodendrocytes). 66,1 ± 8.4% av disse cellene var NG2-merket (figur 2B), og 58% ± 9,4% av cellene var O4-merket (figur 2C). O1 (GalC)-merking, en markør for mer modent celler i oligodendrocyte avstamning, var mye mindre vanlig (7,4% ± 6.0%, figur 2D). Markør profilen antyder at fleste cellene på dette punktet er pre oligodendrocytes med mindre prosenter umodne eller eldre oligos og muligens noen oligodendrocyte stamfar celler (OPCs). Astrocyttene, som dokumentert av GFAP flekk, består av 0.57 ± 1,0% (figur 2C). Disse data tyder på at oligodendrocytes isolert med endrede teknikken er svært renset og fleste viser uttrykksmønster for en typisk for umodne oligodendrocytes.

Figure 3
Figur 3: uttrykk for eldre OLs markører på 3DIV. (A) OLs under fase kontrast mikroskop Vis mer kompleks morfologi. På 3DIV, uttrykk for NG2 (B) reduserer dramatisk, mens O4 (C) og O1 (D) øke. Noen astrocyttene vises på 3DIV (C, rød), skala bar = 50 µm. Data samlet inn fra 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

På 3DIV, oligodendrocyte morfologi dukket opp mer komplekse enn cellene på 1DIV (figur 3A). På dette tidspunkt, hyppigheten av celler positiv for tidlig oligodendrocyte markøren NG2 var mye lavere i forhold til 1DIV. NG2-merket cellene består 31.2 ± 17,1% (versus 66,1 ± 8,4% på 1DIV, t-test p < 0,0001, figur 3B, Figur 4A). Selv om ikke analysert her, ble gjennomsnittlig intensiteten av flekker i celler anses for å være positivt for NG2 redusert på 3DIV forhold til 1DIV. De fleste celler (81.9% ± 4.884%, Figur 3 c) viste O4-merking, som var høyere enn ved 1DIV (58% ± 9,4%, t-test p < 0.0001, figur 4B). Også, nesten halvparten cellene (47,2% ± 16.4%, figur 3D) viste flekker for O1 (GalC), en markør for mer moden oligodendrocyte avstamning, antyder at cellene er differensiere til en mer moden fenotypen. Økningen av O1+ cellene på 3DIV var også betydelig i forhold til 1DIV (7,4% ± 6.0%, t-test p < 0.0001, figur 4C). Tilstedeværelsen av astrocyttene på denne tid punkt var ekstremt lav (0,8% ± 1,5%, Figur 3 c) og det var ikke signifikant forskjellig i forhold til 1DIV (0.57 ± 1,0%, ikke signifikant (ns), Figur 4 d). Disse resultatene indikerer at over tid, immunomagnetically isolert oligodendrocytes skal kunne skille i vitro i trinn tre i modning med lite forurensning av andre celletyper som astrocyttene.

Figure 4
Figur 4: kvantifisering av uttrykk for OL markører på 1DIV og 3DIV (A-D). 1DIV, 66% av cellene var NG2+, 58% av cellene var O4+, 7% av cellene var O1+ og 0,5% av cellene var GFAP+. 3DIV, 31% av cellene var NG2+, 81% av cellene var O4+, 47% av cellene var O1+ og 0,7% av cellene var GFAP+. Mean verdier ± SD presenteres her, *** angir p < 0.0001, ns = ikke betydelig. Dataene ble samlet fra 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette innlegget presenterer vi en metode for effektiv isolasjon av høyrenset umodne musen oligodendrocyte kulturer. I forhold til tidligere publiserte protokoller39,40, gitt denne metoden en høyere renhet med et mye lavere nivå av GFAP-positive astrocyttene og en svært lav prosentandel av andre ikke-preget celler. Det er viktig å påpeke at disse er umodne OLs allerede forpliktet seg til den oligodendroglial avstamning. Dermed ville disse cellene ikke være nyttig for studiet av tidlige fasene av differensiering.

En av modifikasjonene Dincman protokollen40 var fjerning av grunnleggende fibroblast vekst faktor (bFGF) fra våre spredning medier. Det har blitt rapportert at i vitro, bFGF som en sterk mitogenic faktor ikke bare hemmer OPCs fra differensiering, men også reduserer antallet prosesser46,47. Videre øker bFGF oligodendrocyte dedifferentiation og spredning i passaged celler oligodendroglial avstamning 48. Derfor er det sannsynlig at redusert antall O4+ celler og økte antallet A2B5+ og NG2+ celler i Dincman studie40 kan skyldes effekten av bFGF i kultur.

Til tross bruker O4 binding som metode for å isolere cellene, bare 59% av cellene er O4+ på 1DIV. Disse resultatene er kvalitativt ligner Dincman og kolleger40 som fant at bruker O4 binding for isolasjon, litt mindre enn 50% av cellene var O4+ på 1DIV. Det har vist at PDGF forsinkelser etter mitotisk utvikling av transiently tilbakestilling O4+GalC- progenitors til A2B5+O4- pre-progenitor-lignende celler som senere skille selv i fortsatt tilstedeværelse av PDGF 49. det er derfor sannsynlig at under prosessen med spredning i første dag i vitro noen umodne OLs kan oppleve en reversering av O4+NG2+ å O4-NG2+, mens fortsatt forpliktet i oligodendrocyte arverekken. Denne hypotesen er støttet av Dincmans finne40 som umiddelbart etter isolasjon rundt 80% av cellene var O4+.

På 3DIV, denne protokollen gir en noe høyere OL renhet enn beskrevet av andre39,40 selv om vi ikke gjorde en head-to-head sammenligning med deres metoder. Sammenlignet med protokollen Dincman et al. 40, lavere antall GFAP-positive celler i våre kulturer kan skyldes mangel på FGF i spredning media. Emery og Dugas protokollen39 avhenger av sekvensiell passering av celler gjennom kultur retter; astrocyttene kan festes enkelt til kultur retter50 og kan bæres etter hvert sekvensiell tidens celler under immunopanning protokollen. Metoden presentert risikerer ikke innføre forurensende astrocyttene i våre rensing brøkdel.

Våre endret metoden er raskere i forhold til de to andre tar ca 4 timer utføre. Vi oppnå dette ved å fjerne unødvendige trinn og reagenser innlemmet ved de andre protokollene. For eksempel utelatt sammenlignet Dincman protokollen40, som tar 5-6 h, vi både bruk av et kit for neural vev dissosiasjon og inkubasjonstiden for OL celle suspensjon med rotte anti-musen IgM perler å fjerne døde celler. I stedet utført vi av musen hjernen halvdelene med papain og døde celler ble fjernet ved å utføre lav hastighet centrifugations (200 x g).

En større ombygging av Emery protokollen39, som tar ca 9 h, var fjerning av immunopanning valg og fjerning av kravet om en O2/CO2 direktelinje til pre equilibrate Papain bufferen under vev fordøyelsen. I stedet brukte vi immunomagnetic utvalg og direkte inkubasjonstiden for blanding av musen hjernen halvdelene og Papain buffer i CO2 inkubator.

Selv om ikke direkte testet i denne studien, kan anti-O4-microbeads også brukes til å isolere OLs fra rotte, menneskelige og transgene musen hjernevev. Dette understreker allsidighet av teknikken å bruke flere vev kilder OLs isolering med potensial til fordel forskningslaboratorier interessert i å jobbe med OLs fra andre kilder enn musen.

Avslutningsvis gir endret OPC isolasjon metoden beskrevet i denne studien en rask og spesifikk alternativ for å få hovedknappen på musen oligodendrocytes som kan brukes i studier av myelination og demyeliniserende sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tilskudd fra det nasjonal multippel sklerose samfunnet (RG4591A1/2) og National Institutes of Health (R03NS06740402). Forfatterne takker Dr. Ivan Hernandez og hans lab medlemmer for å gi laboratoriet plass, utstyr og råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Tags

Nevrovitenskap problemet 135 oligodendrocytes i vitro primær celler mus nevrovitenskap oligodendrocyte rensing immunomagnetic isolasjon
Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M.… More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter