Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Vi beskriver den immunmagnetisk isolering av primära mus oligodendrocyter, som tillåter en snabb och specifik isolering av cellerna för in vitro- kultur.

Abstract

Effektiva och robusta isolering och kultur av primära oligodendrocyter (OLs) är ett värdefullt verktyg för in vitro- studier av utvecklingen av oligodendroglia samt biologi demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros och Pelizaeus-Merzbacher-liknande sjukdom (PMLD). Här presenterar vi en enkel och effektiv urvalsmetod för immunmagnetisk isolering av etapp tre O4+ preoligodendrocytes celler från neonatala möss pups. Eftersom omogna OL utgör mer än 80% av den gnagare-hjärn vita substansen postnatal dag 7 (P7) som denna isolering metod garanterar inte bara cellernas kickavkastning, men också specifika isolering av OLs redan åtagit sig att oligodendroglial härstamning, minskar den möjligheten att isolera kontaminerande såsom astrocyter och andra celler från mus hjärnan. Denna metod är en modifiering av de tekniker som tidigare rapporterats, och ger oligodendrocyte förberedelse renhet över 80% i ca 4 h.

Introduction

Oligodendrocyter (OLs) är myelinating celler i det centrala nervsystem (CNS)1. Isolering och kultur av primära oligodendrocyter i en hårt reglerad miljö är ett värdefullt verktyg för in vitro- studier av utvecklingen av oligodendroglia samt biologi demyeliniserande sjukdomar såsom multipel skleros2 . Detta kräver en effektiv och robust oligodendrocyte isolering och kultur metod3. I denna studie tog vi fördel av uttrycket av en distinkt oligodendrocyte cell surface markör att genomföra en modifierad isolering teknik som är snabb och specifika.

Fyra olika faser av oligodendrocyte mognad har identifierats, var och en kännetecknas av uttrycket av särskiljande cell yta markörer för varje utvecklingsfas (figur 1). Dessa cell yta markörer kan kännas igen av specifika antikroppar4,5, och kan användas för att isolera OLs i specifika stadier. I den första etappen har oligodendrocyte föregångare celler (OPCs) förmåga att föröka sig, migrera och specifikt express trombocyt-härrör tillväxtfaktor receptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglykan NG27,8 , polysialic syra-neurala cell adhesion molekyl9 och fettsyror-syra-bindande protein 7 (FABP7)10. OPCs har bipolär morfologi med några korta processer som härrör från de motsatta polerna av cell kroppen, vilket är karaktäristiskt för neurala föregångare celler11.

Figure 1
Figur 1: uttryck för cell yta markörer under musen oligodendrocyte utvecklingen. OLs cell yta markörer såsom A2B5, GalC (O1), NG2, O4 och PDGF-Rα kan användas för att isolera specifikt oligodendrocyter på särskilda utvecklingsstadier med hjälp av specifika antikroppar.   Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

I den andra etappen, OPCs ge upphov till preoligodendrocytes och express på cellmembranet inte bara OPC markörer, men också den sulfatide (en sulfaterade galactolipid) erkänns den O4 antikropp12,13och GPR17 protein14 som framhärdar till omogna oligodendrocyte (OL) scenen. I detta skede förlänga preoligodendrocytes multipolär kort processer. Preoligodendrocytes är den stora OL-scenen på postnatal dag 2 (P2) i den cerebrala vita substansen i både råtta och mus med en mindre befolkning av omogna OLs15.

Under den tredje etappen fortsätta omogna OLs att uttrycka O4, förlora uttryck för A2B5 och NG2 markörer och börjar uttrycka galactocerebroside C16. I detta skede OLs är engagerade av oligodendroglial härstamning och bli efter mitotiska celler med långa förgrenat grenar17,18. Omogna OL utgör mer än 80% av de gnagare vit substansen på P7 och vid denna tid de första MBP+ -cellerna observeras15,19,20,21. Isolering av OLs på P7 kunde därför säkerställa cellernas kickavkastning.

I det sista och fjärde utvecklingsstadiet OL express mogen OLs myelinating proteiner (myelin grundläggande protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelinet förknippas glykoprotein (MAG) och myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. I detta skede mogen OLs förlänga membran att formuläret kompakt omsluter slidor runt axoner och kunna myelinate. Detta sammanfaller med observationen att i råtta och mus hjärna, MBP+ celler blir alltmer riklig P1419,20,21.

Sedan den första isoleringen av oligodendrocyte av Fewster och kollegor i 196727, har flera metoder för isolering av OLs från gnagare CNS genomförts inklusive immunopanning28,29,30, fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) att utnyttja cell surface-specifika antigener28,31, differentiell gradient centrifugering32,33,34,35 och en skakning metod baserad på differentiell följsamhet av olika CNS glia36,37. Befintliga kultur metoder har dock begränsningar, särskilt när det gäller renhet, avkastning och tid som krävs för att utföra de förfarande38. Därför krävs effektivare isoleringsmetoder för oligodendrocyter.

I detta papper, vi presentera ett enkelt och effektivt urvalsmetod för immunmagnetisk isolering av etapp tre O4+ preoligodendrocytes celler från neonatala möss pups. Denna metod är en modifiering av de tekniker som rapporterats av Emery et al. 39 och Dincman o.a. 40 och ger en oligodendrocyte förberedelse renhet över 80% i ca 4 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De möss som används i denna studie var omhändertagna enligt riktlinjerna för SUNY Downstate Medical Center Division av laboratorium djur resurser (DLAR) protokollnumret 15-10492.

Obs: Primära oligodendrocyter isolerades från neonatal (P5-P7 vildtyp C57Bl/6N) möss. I detta skede utgör omogna OLs mer än 80% av den gnagare vita substansen säkerställa cellernas kickavkastning. Alla buffert och reagens kompositioner finns i slutet av Tabellen av material.

1. Coverslips förberedelse

Obs: Poly-D-lysin (PDL) / laminin belagda coverslips bör beredas före OL isolering.

  1. Plats #1 tyska glas coverslips till en 50 mL konisk rör och tillsätt 35 mL 70% EtOH att rengöra dem.
  2. Nära röret, placera den i en nutating mixer och odla i rumstemperatur i minst 30 min medan försiktigt gunga. COVERSLIPS kan inkuberas över natten.
  3. Kassera den 70% EtOH.
  4. Tvätta coverslips 3 gånger med avjoniserat vatten, ta bort vattnet varje gång med vakuum aspiration.
  5. Lägga till 30-35 mL av PDL 50 µg/mL coverslips i 50 mL röret, nog att täcka coverslips.
  6. Placera 50 mL röret som innehåller coverslips på en nutating mixer och odla i rumstemperatur i minst 30 min medan gunga försiktigt.
  7. Tvätta coverslips 3 gånger med avjoniserat vatten, ta bort vattnet varje gång med vakuum aspiration.
  8. Över coverslips till 60 mm petriskålar som innehåller avjoniserat vatten.
  9. Använd en P200 pipettspetsen för att ordna coverslips som ett lager som täcker hela ytan av petriskål.
  10. Noga, ta bort vattnet från rätter med vakuum aspiration.
  11. Ta bort överskottet av vatten runt coverslips och låt dem torka över natten med locket öppet och under UV-ljus i huven.
    Obs: PDL belagda glas coverslips kan lagras vid 4 ° C i sterila petriskålar i upp till tre månader.
  12. Placera coverslips 24 brunnar, en per brunn, med fin pincett.
  13. Flytta coverslips till mitten av det väl att se till att kanterna inte vidrör väggen i brunnen.
  14. Tillsätt 100 µL 10 µg/mL laminin utspätt i B27NBMA (se Tabell för material) börjar i mitten av varje täckglas och går i en cirkulär mode mot kanterna för att täcka hela området.
    Obs: Eftersom laminin är involverad i OL underhåll och främjar differentiering in mogna OLs, är det en viktig OL överlevnadsfaktor för in vitro- kultur41,42,43,44.
  15. Inkubera plattan i en 37 ° C inkubator på 5% CO2 i minst 1 tim eller tills OLs är redo för plätering.

2. mus hjärnans Cortex Dissociation

  1. Offra postnatal 5-7-dagars gamla C57Bl/6N musungar snabb halshuggning med sax tidigare rengöras i 70% etanol.
    Obs: Cerebral cortices från 5-6 neonatala möss pups användes för tillredningen. En mus hjärnan ger i genomsnitt 1-1,5 x 106 OLs.
  2. Skär hårbotten huden längs mittlinjen med liten dissekera sax och dra tillbaka för att exponera skallen.
  3. Skär skallen noga längs mittlinjen från öppningen på baksidan av skallen mot tvärsnittsarea, lyft med saxarmarna för att undvika att skada hjärnan. Sedan använda öppningen på baksidan av skallen skära mot varje ögonhålan längs basen av skallen.
  4. Använd fina pincett att försiktigt reta cortices från mellanhjärnan och överföra dem till en 60 mm vävnadsodling maträtt som innehåller 7 mL B27NBMA. Upprepa steg 2.2 genom 2.4 för varje hjärna, poolning av dissekerade cortices.
  5. Överföra cortices till en ny 60 mm vävnadsodling maträtt innehållande 5 mL dissociation buffert (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain och 2.500 U DNAS jag).
  6. Tärna cortices i små bitar ca 1 mm3 med hjälp av en skalpell #15 blad och inkubera i 20 min i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  7. Tillsätt 1 mL bovint tillväxt serum (BGS) att stoppa enzymatisk reaktion.
  8. Överföra cortices tillsammans med dissociation media till en 15 mL konisk slang använder en serologisk Pipettera 10 mL.
  9. Börja försiktigt dissociera hjärnvävnaden av långsamt pipettering upp och ner 6 - 8 gånger med en serologisk Pipettera 10 mL, med omsorg för att minimera bubblor.
  10. Tillåta vävnad bitarna att nöja sig med 2-3 min och överföra supernatanten till en frisk slang.
  11. Tillsätt 3 mL B27NBMA innehållande 10% BGS/2500 U DNAS I till vävnaden pellet.
  12. Använd en 5 mL serologiska pipetten att försiktigt sära hjärnvävnaden medan pipettering upp och ner 6 - 8 gånger. Var noga med att minimera bubblor.
  13. Tillåta vävnad bitarna att nöja sig med 2-3 min.
  14. Överför supernatanten till en frisk slang. Tillsätt 3 mL B27NBMA innehållande 10% BGS/DNAS I till vävnaden pellet.
  15. Försiktigt separera hjärnvävnaden använder ett P1000 Pipettera tips, medan pipettering mixen av media och hjärnvävnad upp och ner. Upprepa steg 2.13 och 2.14 tills inga stora bitar av vävnad blir kvar eller B27NBMA som innehåller 10% BGS/DNAS jag är utmattad, vilket som kommer först. Var noga med att minimera bubblor.
  16. Pool cellsuspension med föregående supernatanterna.
  17. Plats 70 µm cell SIL i en 50 mL tub. Använder en serologisk Pipettera 10 mL, passera poolade cellsuspensionen försiktigt över 70 µm cell Silen.
  18. Tvätta cell silen genom att tillsätta 1 mL B27NBMA innehållande 10% BGS/DNAS jag.
  19. Kassera cell Silen. Ta volymen till 30-mL med B27NBMA innehållande 10% BGS/DNAS jag.
  20. Överföra cellsuspensionen till två 15 mL koniska rör. Centrifugera cellsuspensionen i 10 min vid 200 x g.
  21. Ta bort supernatanten utan lämnar cellerna exponeras för luften. Supernatanten blir grumlig på grund av cellfragment. Tillsätt 3 mL B27NBMA innehållande 10% BGS att pelleten.
  22. Försiktigt separera cellpelleten använder en P1000 Pipettera. Ta volymen till 15 mL med B27NBMA innehållande 10% BGS.
  23. Passera cellsuspensionen över en färsk 40 µm cell SIL.
  24. Tvätta cell silen genom att tillsätta 1mL B27NBMA innehållande 10% BGS. Kassera cell Silen.
  25. Ta volymen till 30 mL med B27NBMA innehållande 10% BGS.
  26. Överföra cellsuspensionen till 2 x 15 mL koniska rör. Centrifugera cellsuspensionen i 10 min vid 200 x g.
  27. Ta bort de flesta av supernatanten utan lämnar cellerna exponeras för luften. Återsuspendera cell pellets i 5 mL is kallt magnetiska cell sortering (MCS) buffert.

3. bestämning av celltal och livskraft

  1. Späd 100 µL cellsuspension med 400 µL Trypan blå lösning i en 1,5 mL mikrocentrifug rör att uppnå en spädning 1:5 med 0,4% (w/v).
  2. Centrera en täckglaset över en hemocytometer kammare och fyll de två kamrarna med 10 µL av cell-förtunningen med pipett P10 och undvika överfyllnad. Lösningen kommer att passera under täckglaset av kapillärkraften.
  3. Placera hemocytometer på Mikroskop scenen och justera fokus med 40 X förstoring.
    Obs: Blodkroppar registreras med hjälp av en handhållen räknare i varje fem rutor (fyra hörn och en center). Endast icke-viabla celler absorberar färgämnet och visas blå, medan levande och friska celler visas runda och brytningsfel och absorberar inte den blå-färgade färgämne, vilket möjliggör bestämning av antalet livskraftiga och totala celler per milliliter.

4. isolering av O4+ oligodendrocyter

  1. Centrifugera cellsuspension vid 200 x g i 10 min.
  2. Noggrant avlägsna supernatanten med hjälp av vakuum aspiration, att undvika exponering av cellerna i luften.
  3. Återsuspendera pelleten i 90 µL av MCS buffert per 1 x 107 totala celler följt av tillägg av 10 µL anti-O4 pärlor per 1 x 107 celler.
  4. Blanda cellsuspension och pärlor av försiktigt snärta 15 mL koniska röret med fingret 4 - 5 gånger.
  5. Inkubera mixen i 15 minuter vid 4 ° C, snärta 15 mL koniska röret med fingret 4-5 timesevery 5 min.
  6. Tvätta i mixen genom att försiktigt tillsätta 2 mL MCS buffert per 1 x 107 celler i röret. Centrifugera blandningen vid 200 x g i 10 min.
  7. Kassera supernatanten genom omsorgsfullt med vakuum aspiration, att undvika exponering av cellerna i luften. Återsuspendera cellpelleten i 500 µL av MCS buffert för varje 1 x 107 celler.
  8. Fäst en magnetisk separator magnetisk separator ställning. Bifoga ett urval kolumn till den magnetiska avskiljaren och placera en 40 µm cell SIL ovanpå kolumnen. Placera två 15 mL eller 50 mL koniska tuben under kolumnen separation att samla flödet genom.
  9. Före skölj 40 µm cell sil och separation kolumnen med 3 mL MCS buffert och låt buffert som kör genom kolumnen utan att låta det torka.
  10. Lägga till mixen av cellsuspensionen och pärlor till cell silen och i kolumnen urval.
  11. Tvätta 40 µm cell silen med 1 mL av MCS buffert.
  12. Kassera cell silen och låt blandningen av celler, pärlor och buffert kör genom kolumnen utan att låta det torka.
  13. Tvätta kolumnen separation 3 gånger med 3 mL MCS buffert och 1 gång med OL spridning media.
  14. Ta bort kolumnen separation från den magnetiska avskiljaren, snabbt placera det i en 15 mL koniska rör och tillsätt omedelbart 5 mL OL spridning media.
  15. Placera en kolv på toppen av kolumn och fast push att spola ut märkt cellerna i 15 mL koniska röret.
  16. Ta bort 100 µL cellsuspension att bestämma celltal och livskraft med Trypan blå och hemocytometer som anges i avsnitt 3.
    Obs: Cellviabiliteten över 80% anses godtagbart att fortsätta med kulturen i OLs, men lönsamhet högre än 90% är optimal.

5. plätering av isolerade O4+ oligodendrocyter

  1. Späd cellsuspensionen till lusten plätering densitet (5 x 105 celler per täckglas) använder OL spridning media.
    Obs: OL sådd densitet är mycket viktigt, så lämpliga cell densiteten bör bekräftas med vävnadsodling Mikroskop innan du fortsätter. Seedning densitet under 10 000 celler/coverslips kan leda till dålig cellöverlevnad. Vid plätering densitet på 10.000 till 25.000, OL är morfologisk differentiering långsam45. Vi tallrik OLs vid en sådd täthet av minst 50 000 celler/coverslips att säkerställa cellöverlevnad.
  2. Flytta de 24 brunnar innehållande coverslips belagd med laminin från inkubatorn till vävnadsodling huven.
  3. Ta bort laminin från varje täckglas och ersätta det med 100 µL OL suspension.
  4. Inkubera OLs i 37 °C/5% CO2 inkubator för högst 45 min att främja OL vidhäftning till coverslips.
  5. Efter inkubation, ta bort de 24 brunnar från inkubatorn. Översvämning varje väl av 24-väl plattan med 500 µL av OL spridning media.
  6. Placera OLs tillbaka i 37 °C/5% CO2 inkubator för ytterligare 24 h.
  7. 24 h efter pläteringen av OLs, ta bort spridning media och ersätta med OL differentiering media att inducera differentiering.
  8. Placera OLs tillbaka i inkubatorn och ta inte bort tills cellerna är redo för fixering.
    Obs: Ändringar i pH är skadliga för OLs och minska cellernas viabilitet, onödiga avlägsnande av OLs kulturer från inkubatorn bör därför undvikas.

6. immunofluorescens färgning

  1. För detektion av cellen bort yta markörer (NG2, O1 och O4) media från brunnarna.
  2. Tillsätt 250 µL av mus Hybridomteknik supernatanterna som innehåller primära antikroppar mot O1 (outspädd)13 och O4 (outspädd)13 och kanin polyklonala mot NG2 (1:150 utspädd i B27NBMA).
    Obs: Om kommersiellt tillgänglig anti-O1 och anti-O4 antikroppar skall användas, det är tillrådligt att utnyttja utspädningar som föreslås av tillverkaren.
  3. Inkubera cellerna med primär antikropp för 45 min maximala i en 37 °C/5% CO2 inkubator.
  4. Tvätta två gånger med 0,05% Tween-20/1 X PBS. Fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD (4% PFA) under 10 minuter vid rumstemperatur.
  5. Tvätta tre gånger för 5 min varje med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Späd Alexa 488-konjugerad get antimus IgM eller anti-kanin IgG sekundär antikropp (1: 400) i B27NBMA.
  7. Ta bort 0,05% Tween-20/1 X PBS från coverslips. Inkubera cellerna med sekundär antikropp för 1 h i rumstemperatur i mörkret.
  8. Tvätta tre gånger för 5 min varje med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  9. För dubbel färgning för detektion av interna markörer (Fredsgenomförande), ta bort 0,05% Tween-20/1 X PBS och block/permeabilize cellerna med block/permeabilisering buffert under 15 minuter vid rumstemperatur. Gå annars vidare till steg 6.17.
  10. Ta bort block/permeabilisering buffert och tillsätt 250 µL kyckling anti-Fredsgenomförande (1: 100) utspätt i block/permeabilisering buffert.
  11. Inkubera cellerna med anti-Fredsgenomförande för 1 h i rumstemperatur. Tvätta tre gånger för 5 min varje med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Späd Alexa 594-konjugerad get IgG anti kyckling sekundär antikropp (1: 400) i B27NBMA.
  13. Ta bort 0,05% Tween-20/1 X PBS från coverslips. Inkubera cellerna med sekundär antikropp för 1 h i rumstemperatur i mörkret.
  14. Tvätta tre gånger för 5 min varje med 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Motfärg med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och montera cellerna med antifade montering media som innehåller DAPI.
  16. Låt coverslips bota över natten i mörker vid rumstemperatur.
  17. Bild färgas cellerna med ett epifluorescensmikroskop.
    Obs: I detta protokoll, cellerna var avbildad på 40 X förstoring med hjälp av en enhetlig exponeringstid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Syftet med denna studie var att fastställa en metod för förbättrad isolering för O4+ primära mus oligodendrocyter som kräver minsta möjliga manipulering av målceller. Hela proceduren från eutanasi av valparna till plätering av cellerna i coverslips tar ca 4 h och data visas här representerar tre oberoende experiment. Efter vävnad dissociation var i genomsnitt 4,3 ± 0,46 x 107 celler isolerade för varje oberoende experiment, med en lönsamhet på 91% ± 5,6%. Efter immunmagnetisk isolering med anti-O4 taggade magnetiska mikrokulor genomsnitt 6,9 ± 0,38 x 106 OLs erhölls (1-1,5 x 106 per mus) vilket är 16,2% ± 1,6% av de totala celler inledningsvis skiljas; lönsamheten var 96,3% ± 3,5%.

Figure 2
Figur 2: Immunomagnetically isolerade OLs express omogna markörer vid 1DIV. (A) OLs under fas kontrast Mikroskop Visa bi - och tri-polar morfologi. OLs express NG2 (B), O4 (C), och O1 (D). Mycket få astrocyter var närvarande vid 1DIV (C, röda), skalstapeln = 50 µm. Data samlades in från 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att undersöka den antigena fenotypen av immunomagnetically isolerade celler, var immunofluorescens färgning utfört 24 h (1DIV) och 72 h (3DIV) efter plätering cellerna. 1DIV, cellen verkade vara bi- eller tre under mikroskopet fas kontrast (figur 2A-B), ett kännetecken av inslag i tidigt skede frodas OLs (OPCs och eller preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4% av dessa celler var NG2-märkt (figur 2B) och 58% ± 9,4% av cellerna var O4-märkt (figur 2 c). O1 (GalC)-märkning, en markör för mer mogna celler i oligodendrocyte härstamning, var mycket mindre vanligt (7,4% ± 6,0%, figur 2D). Denna markör profil tyder på att majoriteten av celler vid denna punkt före oligodendrocyter med mindre procentsatser omogen eller mogen oligos och möjligen vissa oligodendrocyte stamceller (OPCs). Astrocyter, vilket framgår av Fredsgenomförande färgning, består av de 0.57 ± 1,0% (figur 2 c). Dessa data tyder på att de oligodendrocyter som isolerats med modifierade tekniken är höggradigt renat och majoriteten visar uttrycksmönstret för en markör typiska för omogna oligodendrocyter.

Figure 3
Figur 3: uttryck av mogen OLs markörer på 3DIV. (A) OLs under fas kontrast mikroskopet visar mer komplexa morfologi. På 3DIV, uttryck av NG2 (B) minskar drastiskt, medan O4 (C) och O1 (D) ökning. Några astrocyter syns på 3DIV (C, röda), skalstapeln = 50 µm. Data samlades in från 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3DIV, oligodendrocyte morfologi verkade mer komplexa än cellerna på 1DIV (figur 3A). Frekvensen av celler som är positiva för den tidiga oligodendrocyte markören NG2 var mycket lägre jämfört med 1DIV. NG2-märkt celler bestod vid denna tidpunkt, 31,2 ± 17,1% (jämfört med 66,1 ± 8,4% vid 1DIV, t-testa p < 0,0001, figur 3B, Figur 4A). Även om inte analyseras här, minskade genomsnittliga intensiteten av färgning i celler anses vara positivt för NG2 på 3DIV jämfört med 1DIV. De flesta celler (81,9% ± 4.884%, figur 3 c) visade O4-märkning, vilket var högre än vid 1DIV (58% ± 9,4%, t-testa p < 0,0001, figur 4B). Nästan hälften cellerna (47,2% ± 16,4%, figur 3D) visade också, färgning för O1 (GalC), en markör för mer mogna oligodendrocyte härstamning, vilket tyder på att cellerna är att differentiera till en mer mogen fenotyp. Ökningen av O1+ celler på 3DIV var också signifikant jämfört med 1DIV (7,4% ± 6,0%, t-testa p < 0,0001, figur 4 c). Förekomsten av astrocyter vid denna tid punkt förblev mycket låg (0,8 ± 1,5%, figur 3 c) och det var inte signifikant jämfört med 1DIV (0,57% ± 1,0%, ej signifikant (ns), figur 4 d). Dessa resultat tyder på att över tid, immunomagnetically isolerade oligodendrocyter ska kunna differentieras i vitro till etapp tre av mognad med mycket lite föroreningar i andra celltyper som astrocyter.

Figure 4
Figur 4: kvantifiering av uttrycket av OL markörer vid 1DIV och 3DIV (A-D). På 1DIV, 66% av cellerna var NG2+, 58% av cellerna var O4+, 7% av cellerna var O1+ och 0,5% av cellerna var Fredsgenomförande+. På 3DIV, 31% av cellerna var NG2+, 81% av cellerna var O4+, 47% av cellerna var O1+ och 0,7% av cellerna var Fredsgenomförande+. Genomsnittliga värden ± SD redovisas här, *** indikerar p < 0,0001, ns = inte betydande. Data samlades in från 3 oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta meddelande presenterar vi en metod för effektiv isolering av högrenade omogna mus oligodendrocyte kulturer. Denna metod jämfört med tidigare publicerade protokoll39,40, och gav en högre renhetsgrad med en lägre grad av Fredsgenomförande-positiv astrocyter och en mycket liten andel av andra icke-kännetecknas celler. Det är viktigt att påpeka att dessa är omogna OLs redan åtagit sig att oligodendroglial härstamning. Dessa celler skulle således inte vara användbar för studiet av tidiga faser av differentiering.

En av ändringarna från Dincman protokoll40 var borttagningen av basic fibroblast growth factor (bFGF) från vår spridning media. Det har rapporterats att in vitro-, bFGF agerar som en stark mitogena faktor inte bara hämmar OPCs från differentiering, men minskar också antalet processer46,47. Dessutom ökar bFGF oligodendrocyte Dedifferentiering och spridning i anpassade celler av oligodendroglial härstamning 48. Därför är det rimligt att reducerade antalet O4+ celler och ökade antalet A2B5+ och NG2+ celler som observerats i Dincman studie40 kan bero på effekten av bFGF i kultur.

Trots med O4 bindande som metod för att isolera cellerna, endast 59% av cellerna är O4+ på 1DIV. Dessa resultat är kvalitativt liknar dem av Dincman och medarbetare40 som fann att använda O4 bindande för isolering, något mindre än 50% av cellerna var O4+ på 1DIV. Det har visats att PDGF förseningar efter mitotiska utveckling av övergående återställa O4+GalC– stamfäder till A2B5+O4– pre-progenitor-liknande celler som därefter skilja även i den fortsatta närvaron av PDGF 49. därför är det sannolikt att vissa omogna OLs under processen för spridning i första dag i vitro kan uppleva en omsvängning från O4+NG2+ till O4–NG2+, medan återstående begått till den oligodendrocyte härstamning. Denna hypotes stöds av Dincmans konstaterande40 som omedelbart efter isolering ca 80% av cellerna var O4+.

På 3DIV, detta protokoll ger en något högre OL renhetsgrad än som beskrivs av andra39,40 även om vi inte gjorde en head-to-head jämförelse med sina metoder. Jämfört med protokollet av Dincman et al. 40, det lägre antalet Fredsgenomförande-positiva celler i våra kulturer kan bero på bristen på FGF i spridning media. Den Emery och Dugas protokoll39 är beroende av sekventiell passage av celler genom kultur rätter; astrocyter kan enkelt tillmäter kultur rätter50 och kunde föras över efter varje sekventiella passagen av celler under protokollet immunopanning. Den presenterade metoden riskerar inte att införa kontaminerande astrocyter i vår rening bråkdel.

Vår modifierade metod är snabbare jämfört med de andra två tar 4 timmar att utföra. Detta uppnår vi genom att eliminera onödiga steg och reagenser införlivas genom de andra protokoll. Till exempel utelämnas jämfört med Dincman protokoll40, som tar 5-6 h, vi både användningen av ett kit för nervvävnad dissociation och inkubering av OL cellsuspension med råtta antimus IgM pärlor att ta bort döda celler. Istället utfört vi dissociationen av mus hjärnan cortices med papain och döda celler togs bort genom att utföra låg hastighet centrifugations (200 x g).

En stor ändring från Emery protokoll39, som tar ca 9 h, var borttagningen av immunopanning val och borttagande av kravet på ett direkt O2tillpass2 linje används före temperera Papain bufferten under vävnad matsmältningen. Istället använde vi immunmagnetisk urval och direkta inkubering av mixen av mus hjärnan cortices och Papain buffert i CO2 inkubatorn.

Även inte direkt testas i denna studie, kan den anti-O4 mikrokulor också användas att isolera OLs från råtta, mänskliga och transgen mus hjärnvävnad. Detta belyser mångsidigheten av tekniken att använda flera vävnad källor för OLs isolering med potential för att gynna forskningslaboratorier som är intresserade av att arbeta med OLs från andra källor än musen.

Sammanfattningsvis, ger den modifierade OPC isolering metod som beskrivs i denna studie en snabb och specifika alternativ för att få primära mus oligodendrocyter som skulle kunna tillämpas i studier av myelinisering och demyeliniserande sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga upplysningar.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidrag från den nationell multipelskleros samfund (RG4591A1/2) och National Institutes of Health (R03NS06740402). Författarna tackar Dr. Ivan Hernandez och hans lab-medlemmar för att ge laboratorium utrymme, utrustning och råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Tags

Neurovetenskap fråga 135 oligodendrocyter in vitro- primära celler mus neurovetenskap oligodendrocyte rening immunmagnetisk isolering
Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M.… More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter