Summary
We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.
Abstract
De efficiënte en robuuste isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten (OLs) is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en Pelizaeus-Merzbacher-achtige ziekte (PMLD). Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Aangezien onvolwassen OL vormen meer dan 80% van de knaagdier-hersenen witte stof op postnatale dag 7 (P7) deze methode isolatie zorgt niet alleen voor hoge cellulaire opbrengst, maar ook de specifieke Isolatievan OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming, daalt het mogelijkheid van het isoleren van contaminerende cellen zoals astrocyten en andere cellen uit de hersenen van de muis. Deze methode is een wijziging van de technieken die eerder gerapporteerd en biedt Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.
Introduction
Oligodendrocyten (OLs) zijn de cellen van de myelinating van het centrale zenuwstelsel (CNS)1. De isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten in een strak gereguleerde omgeving is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose,2 . Dit vereist een efficiënte en robuuste Oligodendrocyt isolatie en cultuur methode3. In deze studie profiteerde we van de expressie van een onderscheidende Oligodendrocyt cel oppervlakte markering om een gemodificeerde isolatie-techniek die is snelle en specifieke.
Vier verschillende fasen van Oligodendrocyt rijping zijn geïdentificeerd, elk gekenmerkt door de expressie van de oppervlakte merkers onderscheidend cel voor elke ontwikkelings fase (Figuur 1). Deze cel oppervlakte markers kunnen worden herkend door specifieke antilichamen4,5, en kunnen worden gebruikt voor het isoleren van OLs in specifieke stadia. In de eerste fase, Oligodendrocyt voorlopercellen (OPCs) de capaciteit hebben om te vermenigvuldigen, migreren en specifiek express bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, Proteoglycaan NG27,8 , polysialic zuur-neurale cel adhesie molecuul9 en vetzuren-zuur-bindend-proteïne 7 (FABP7)10. Bipolaire morfologie hebben OPCs met enkele korte processen die afkomstig zijn van de tegengestelde Polen van de cel lichaam, dat is kenmerkend voor de voorloper van de neurale cellen11.
Figuur 1: expressie van cel oppervlakte markers tijdens de ontwikkeling van de muis Oligodendrocyt. OLs cel oppervlakte markeringen zoals A2B5, GalC (O1), NG2, O4 en PDGF-Rα kunnen worden gebruikt om te isoleren specifiek oligodendrocyten specifieke ontwikkelingsstoornissen stadium met behulp van specifieke antilichamen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In de tweede fase, OPCs aanleiding geven tot preoligodendrocytes en express op het celmembraan niet alleen OPC markeringen, maar ook het sulfatide (een sulfated galactolipid) erkend door de O4 antilichaam12,13, en de GPR17-eiwit14, die blijft bestaan tot de fase van onrijpe Oligodendrocyt (OL). In dit stadium uitbreiden preoligodendrocytes multipolaire korte processen. Preoligodendrocytes zijn de grote OL Stadium op postnatale dag 2 (P2) in de cerebrale witte stof voor zowel rat en muis met een kleine bevolking van onrijpe OLs15.
Tijdens de derde fase blijven de onrijpe OLs express van O4, uitdrukking van A2B5 en NG2 markers verliezen en beginnen te express galactocerebroside C16. In dit stadium, OLs zich inzetten voor de oligodendroglial afkomst en post mitotische cellen met lange vertakte takken17,18geworden. Onrijpe OL vormen meer dan 80% van de knaagdier witte stof op P7 en op dit moment de eerste cellen van MBP+ 15,19,20,21worden waargenomen. Daarom kon Isolatievan OLs op P7 cellulaire hoogrentende zorgen.
In het laatste en vierde ontwikkelingsstadium OL express volwassen OLs myelinating eiwitten (myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwitten (PLP), myeline verbonden glycoproteïne (MAG) en myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG)22,23 ,24,25,26. In dit stadium, volwassen OLs uitbreiden van membranen dat formulier compact enwrapping omhulsels rond de axonen en zijn in staat om myelinate. Dit valt samen met de waarneming dat in hersenen rat en muis, MBP+ cellen steeds meer overvloedig op P1419,20,21 worden.
Sinds de eerste Isolatievan Oligodendrocyt door Fewster en collega's in 196727, zijn verschillende methoden voor de isolatie van OLs uit het knaagdier CNS doorgevoerd met inbegrip van de immunopanning28,29,30, fluorescentie-geactiveerde cel sorteren (FACS) exploiteren cel oppervlak-specifieke antigenen28,31, differentiële kleurovergang centrifugeren32,33,34,35 en een schudden methode gebaseerd op differentiële hechting van verschillende CNS glia36,37. Bestaande cultuur methoden hebben echter beperkingen, met name wat betreft zuiverheid, de opbrengst en de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de procedures38. Meer efficiënte isolatie methoden voor oligodendrocyten zijn dus vereist.
In deze paper presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Deze methode is een wijziging van de technieken die zijn gemeld door Emery et al. 39 en Dincman et al. 40 en biedt een Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muizen gebruikt in deze studie werden verzorgd volgens de richtlijnen van het protocolnummer SUNY Downstate Medical Center divisie van laboratorium dier middelen (DLAR) 15-10492.
Opmerking: Primaire oligodendrocyten werden geïsoleerd van neonatale (P5-P7 wild-type C57Bl/6N) muizen. In dit stadium vormen onvolwassen OLs meer dan 80% van de knaagdier witte stof zorgen voor hoge cellulaire opbrengst. Alle buffer en reagens composities zijn beschikbaar aan het einde van de Tabel van materialen.
1. Coverslips voorbereiding
Opmerking: Poly-D-lysine (PDL) / laminin gecoat coverslips moet worden voorbereid voordat OL isolatie.
- Plaats #1 Duits coverslips glas in een conische buis van 50 mL en voeg 35 mL 70% EtOH om deze te reinigen.
- Sluit de buis, plaatst u deze in een nutating mixer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten terwijl het voorzichtig rocken. Coverslips kan 's nachts worden geïncubeerd.
- Gooi de 70% EtOH.
- De coverslips 3 keer met gedeïoniseerd water wassen, verwijder het water telkens met vacuüm aspiratie.
- 30-35 mL PDL 50 µg/ml toevoegen aan de coverslips in de buis met 50 mL, genoeg ter dekking van de coverslips.
- Plaats van de 50 mL-buis met de coverslips op een nutating mixer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten terwijl het voorzichtig rocken.
- Wassen van de coverslips 3 keer met gedeïoniseerd water, het verwijderen van het water telkens met vacuüm aspiratie.
- Breng de coverslips in de 60-mm petrischalen met gedeïoniseerd water.
- Gebruik een tip van de pipet P200 te regelen van de coverslips als een laag die betrekking hebben op het gehele oppervlak van de petrischaal.
- Verwijder voorzichtig, het water van de schotels met vacuüm aspiratie.
- Verwijder de overmaat water rond de coverslips en laat ze drogen overnachting met deksel open en onder UV-licht in de kap.
Opmerking: PDL gecoat glas coverslips kan worden achtergelaten bij 4 ° C in steriele petrischalen voor maximaal drie maanden. - Plaats de coverslips in 24-Wells-platen, één per goed, met behulp van fijne pincet.
- Verplaats de coverslips naar het midden van het goed om ervoor te zorgen dat de randen raak niet aan de muur van de waterput.
- Voeg 100 µL van 10 µg/mL laminin verdund in B27NBMA (Zie de Tabel van materialen) beginnen in het midden van elke dekglaasje aan en verplaatsen in een circulaire mode naar de randen ter dekking van alle gebied.
Opmerking: Aangezien laminin betrokken bij OL onderhoud is en differentiatie in volwassen OLs bevordert, het is een belangrijke factor van de overleving van de OL voor in vitro cultuur41,42,43,44. - Incubeer de plaat in een incubator van 37 ° C bij 5% CO2 voor ten minste 1 uur of totdat de OLs klaar voor de beplating zijn.
2. muis hersenen Cortex dissociatie
- Offeren postnatale 5-7-daagse oude C57Bl/6N muis pups door snelle onthoofding met een schaar eerder gereinigd in 70% ethanol.
Opmerking: cerebrale cortices van 5-6 neonatale muizen pups werden gebruikt voor elk preparaat. Een muis hersenen levert gemiddeld 1-1,5 x 106 OLs. - Snijd de hoofdhuid huid langs de middellijn met een kleine ontleden schaar en intrekken om de schedel bloot te stellen.
- Snijd de schedel zorgvuldig langs de middellijn vanaf de opening aan de achterkant van de schedel naar het frontaal oppervlak, opheft met de schaar om te voorkomen beschadiging van de hersenen. Knip dan, met behulp van de opening aan de achterkant van de schedel naar elke oogkas langs de onderkant van de schedel.
- Gebruik fijne pincet voorzichtig plagen van de cortices uit de buurt van de veroorzaakt en hen overbrengen naar een 60-mm weefselkweek schotel met 7 mL B27NBMA. Herhaal stap 2.2 tot 2.4 voor elke hersenen, bundeling van de ontleed cortices.
- De cortices overbrengen in een nieuwe 60 mm weefselkweek schotel met 5 mL dissociatie buffer (B27NBMA, 20-30 U/mL papaïne en 2.500 U DNase ik).
- Snijd de cortices in kleine stukjes van ongeveer 1 mm-3 met behulp van een scalpel #15-mes en incubeer gedurende 20 min in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Voeg vervolgens 1 mL van boviene groei serum (BGS) om te stoppen met de enzymatische reactie.
- De cortices samen met de dissociatie media overbrengen in een 15-mL conische buis met behulp van een serologische Pipetteer van 10 mL.
- Zachtjes begint te distantiëren van het hersenweefsel door langzaam pipetteren omhoog en naar beneden 6 - 8 keer met behulp van een 10-mL serologische Pipetteer, met behulp van care om te minimaliseren van de bubbels.
- Laat de stukjes weefsel te regelen voor 2-3 min en het supernatant overbrengen in een verse buis.
- Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS/2500 U DNase ik aan het weefsel pellet.
- Een serologische 5 mL-pipet zachtjes het verwerpen van het hersenweefsel terwijl pipetteren omhoog en omlaag gebruiken 6 - 8 keer. Wees voorzichtig om te minimaliseren van de bubbels.
- Laat de stukjes weefsel te regelen voor 2-3 min.
- Het supernatant overbrengen in een verse buis. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS/DNase ik aan het weefsel pellet.
- Zachtjes distantiëren van het hersenweefsel met behulp van een P1000 Pipetteer tip, terwijl de mix van media pipetteren en brain weefsel op en neer. Herhaal stappen 2.13 en 2.14 totdat geen grote brokken van weefsel blijven of tot B27NBMA die 10 gewichtspercenten BGS/DNase ik is uitgeput, indien dit eerder is. Wees voorzichtig om te minimaliseren van de bubbels.
- Zwembad celsuspensie met vorige supernatant.
- 70-µm cel zeef in een 50 mL-buis te plaatsen. Met behulp van een 10-mL serologische Pipetteer, voorbij de gepoolde celsuspensie zachtjes de zeef van de cel 70-µm.
- De cel zeef wassen door toevoeging van 1 mL B27NBMA met 10% BGS/DNase ik.
- Gooi de cel zeef. Zodat het volume 30 mL met B27NBMA met 10% BGS/DNase ik.
- Spoel de celsuspensie twee 15-mL conische buizen. De celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g centrifugeren.
- Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder het verlaten van de cellen die zijn blootgesteld aan de lucht. De bovendrijvende vloeistof zullen bewolkt als gevolg van cel puin. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS aan de pellet.
- Zorgvuldig distantiëren de pellet van de cel met behulp van een pipet P1000. Zodat het volume tot 15 mL met B27NBMA met 10% BGS.
- De celsuspensie voorbij een vers 40 µm cel zeef.
- De cel zeef wassen door toevoeging van 1mL B27NBMA met 10% BGS. Gooi de cel zeef.
- Zodat het volume 30 mL met B27NBMA met 10% BGS.
- De celsuspensie overbrengen in 2 x 15 mL conische buizen. De celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g centrifugeren.
- Allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verlaten van de cellen die zijn blootgesteld aan de lucht. Resuspendeer de cel-pellets op in 5 mL ijs koud magnetische cel sorteren (MCS) buffer.
3. bepaling van de cellen en levensvatbaarheid
- Verdun 100 µL van de celsuspensie met 400 µL van Trypan blauwe oplossing in een buis van de 1.5-mL microcentrifuge om een verdunning 1:5 in 0,4% (m/v).
- Hiermee centreert u een glas cover over een hemocytometer kamer en vul de twee kamers met 10 µL van de verdunning van de cel met behulp van een precisiepipet P10 en het vermijden van overvulling. De oplossing zal passeren onder het glas cover door capillaire werking.
- Plaats van de hemocytometer in het werkgebied van de Microscoop en aanpassen van de focus met behulp van 40 X vergroting.
Opmerking: De cellen zijn opgenomen met behulp van een hand-held teller in elk van de vijf pleinen (vier hoeken en een centrum). Alleen niet-levensvatbare cellen absorberen de kleurstof en blauw, terwijl live en gezonde cellen verschijnen ronde en refractieve en doen niet absorberen de blauw gekleurde kleurstof, zodat voor de bepaling van het aantal levensvatbare en totale cellen per milliliter.
4. isolatie van O4+ oligodendrocyten
- Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant zorgvuldig met behulp van vacuüm aspiratie, vermijden van blootstelling van de cellen aan de lucht.
- Resuspendeer de pellet in 90 µL van MCS buffer per 1 x 107 totaal aantal cellen, gevolgd door de toevoeging van 10 µL van anti-O4 kralen per 1 x 107 cellen.
- Meng de celsuspensie en kralen door zachtjes flicking de buis 15 mL kegelvormig met de vinger 4 - 5 keer.
- Incubeer de mix voor 15 min bij 4 ° C, flicking de buis 15 mL kegelvormig met de vinger 4-5 timesevery 5 min.
- Het wassen van de mix door zachtjes de toevoeging van 2 mL van MCS buffer per 1 x 107 cellen aan de buis. Centrifugeer de mix bij 200 x g gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant door zorgvuldig met behulp van vacuüm aspiratie, vermijden van blootstelling van de cellen aan de lucht. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van MCS buffer voor elk 1 x 107 cellen.
- Een magnetische scheidingsteken aan de stand van een magnetische scheidingsteken koppelen. Een selectiekolom hechten aan het magnetische scheidingsteken en plaatst u een 40 µm cel zeef op de top van de kolom. Plaats twee 15-mL of een 50 mL conische buis onder de kolom van de scheiding voor het verzamelen van de stroom door.
- Vooraf spoelen de 40-µm cel zeef en scheiding kolom met 3 mL MCS buffer en laat de buffer uitvoeren door de kolom zonder het te laten drogen.
- Toe te voegen de mix van celsuspensie en kralen aan de zeef van de cel in de selectiekolom.
- Wassen van de 40 µm cel zeef met 1 mL MCS buffer.
- Negeren van de cel zeef en laat de mengeling van cellen, kralen en buffer uitvoeren door de kolom zonder het te laten drogen.
- Was de scheiding kolom 3 keer met 3 mL MCS buffer en 1 keer met OL proliferatie media.
- Verwijder de scheiding kolom uit de magnetische scheidingsteken, plaats het snel in een conische buis 15 mL en onmiddellijk Voeg 5 mL OL proliferatie media.
- Plaats een zuiger op de top van de kolom en stevig druk te spoelen van de gelabelde cellen in de conische buis 15 mL.
- Verwijder 100 µL celsuspensie cellen en levensvatbaarheid als aangegeven in punt 3 met behulp van de Trypan blauw en hemocytometer te bepalen.
Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen boven de 80% is aanvaardbaar om door te gaan met de cultuur van OLs, maar levensvatbaarheid groter is dan 90% is optimaal.
5. de beplating van geïsoleerde O4+ oligodendrocyten
- Verdun de celsuspensie aan de wens plating dichtheid (5 x 10,5 cellen per dekglaasje aan) met behulp van OL proliferatie media.
Opmerking: OL zaaien dichtheid is zeer belangrijk, zodat passende celdichtheid dient bevestigd te worden met behulp van een Microscoop weefselkweek voordat u verdergaat. Dichtheid onder 10.000 cellen/coverslips zaaien kan leiden tot overleving van de arme cel. Dichtheid bij 10.000 tot 25.000, OL plating is morfologische differentiatie traag45. We plaat OLs bij een seeding dichtheid van ten minste 50.000 cellen/coverslips om de overleving van de cel. - De 24-Wells-platen met coverslips bekleed met laminin van incubator aan de kap van weefselkweek verplaatsen
- Laminin uit elke dekglaasje aan verwijderen en vervangen door 100 µL van OL schorsing.
- Incubeer OLs in de 37 °C/5% CO2 incubator voor een maximum van 45 min ter bevordering van OL hechting op de coverslips.
- Na incubatie het 24-Wells-platen uit de incubator te verwijderen. Overstroming van elk van de 24-well plaat met 500 µL van OL proliferatie media.
- Plaats de OLs terug in de 37 °C/5% CO2 incubator voor extra 24 h.
- 24 uur na de beplating van OLs, proliferatie media verwijderen en vervangen door OL differentiatie media voor het opwekken van differentiatie.
- Het OLs plaats terug in de incubator en verwijder niet totdat de cellen klaar voor fixatie zijn.
Opmerking: Wijzigingen in pH zijn schadelijk voor OLs en afnemen van de levensvatbaarheid van de cellen, daarom geen onnodige verwijdering van OLs culturen uit de incubator moet worden vermeden.
6. immunofluorescentie kleuring
- Voor de detectie van cel Verwijder oppervlakte markeringen (NG2, O1 en O4) het medium van de putten.
- Voeg 250 µL van muis hybridoma supernatant met primaire antilichamen tegen O1 (onverdund)13 en O4 (onverdund)13 en konijn polyklonale tegen NG2 (1:150 verdund in B27NBMA).
Opmerking: Als verkrijgbare anti-O1 en anti-O4 antilichamen zijn om te worden gebruikt, is het raadzaam om te gebruiken verdunningen voorgesteld door de fabrikant. - Incubeer de cellen met primair antilichaam voor 45 min maximale in een 37 °C/5% CO2 incubator.
- Wassen tweemaal met 0,05% Tween-20/1 X PBS. Herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde (4% PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
- Verdun Alexa 488-geconjugeerde geit-antimuis IgM of anti-konijn IgG secundair antilichaam (1:400) in B27NBMA.
- De 0,05% Tween-20/1 X PBS uit de coverslips verwijderen. Incubeer de cellen met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
- Voor dubbele kleuring voor het detecteren van interne merkers (GFAP), verwijdert u de 0,05% Tween-20/1 X PBS en blok/permeabilize cellen met blok/permeabilization buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Ga anders verder met stap 6.17.
- Verwijder blok/permeabilization buffer en voeg van 250 µL kip anti-GFAP (1:100) verdund in blok/permeabilization buffer.
- Incubeer de cellen met anti-GFAP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
- Verdun Alexa 594-geconjugeerde geit anti-kip IgG secundair antilichaam deze (1:400) in B27NBMA.
- De 0,05% Tween-20/1 X PBS uit de coverslips verwijderen. Incubeer de cellen met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
- Counterstain met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en monteer de cellen met antifade montage DAPI met media.
- Laat de coverslips overnachten in het donker bij kamertemperatuur genezen.
- Het imago van de gekleurde cellen met een Microscoop epifluorescence.
Opmerking: In dit protocol, de cellen werden beeld bij 40 X vergroting met behulp van een uniforme belichtingstijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze studie was om een verbeterde isolatie methode voor O4+ primaire muisknop oligodendrocyten waarvoor de minste mogelijke manipulatie van de doelcellen. De hele procedure van euthanasie voor de pups aan de beplating van de cellen in coverslips duurt ongeveer 4 uur en gegevens hieronder vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten. Na weefsel dissociatie, gemiddeld 4,3 ± 0,46 x 107 cellen waren geïsoleerd voor elke onafhankelijke experiment met een levensvatbaarheid van 91% ± 5,6%. Nadat immunomagnetic isolatie met behulp van anti-O4 gelabeld magnetische microbeads gemiddeld 6.9 ± 0,38 x 106 OLs werden verkregen (1-1,5 x 106 per muis) die 16,2% is ± 1,6% van het totaal aantal cellen in eerste instantie los gezien; levensvatbaarheid was 96,3% ± 3,5%.
Figuur 2: Immunomagnetically geïsoleerd OLs uitdrukkelijke onvolwassen markeringen op 1DIV. (A) OLs onder fasecontrastmicroscoop Toon bi - en tri-polaire morfologie. OLs express NG2 (B), O4 (C), en O1 (D). Zeer weinig astrocyten bij 1DIV aanwezig waren (C, rood), schaal bar = 50 µm. gegevens werden verzameld uit 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Om te onderzoeken de antigene fenotype van cellen van de immunomagnetically geïsoleerd, was immunofluorescentie kleuring uitgevoerd 24 h (1DIV) en 72 h (3DIV) na de cellen plating. Bij 1DIV, bleek de cel bi- of driepolige onder de fasecontrastmicroscoop (figuur 2A-B), een kenmerk van functie van vroeg stadium prolifererende OLs (OPCs en of preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4% van deze cellen NG2-label (figuur 2B), en 58% ± 9,4% van de cellen waren O4-label (figuur 2C). O1 (GalC)-etikettering, een marker voor meer volwassen cellen in de Oligodendrocyt bloedlijn, was veel minder vaak (7,4% ± 6,0%, figuur 2D). Deze marker profiel laat zien dat de meerderheid van de cellen op dit punt pre oligodendrocyten met kleinere percentages onvolwassen of volwassen oligos en eventueel enkele Oligodendrocyt voorlopercellen (OPCs zijn). Astrocyten, zoals blijkt uit GFAP kleuring, bestaat uit de 0,57 ± 1,0% (figuur 2C). Deze gegevens suggereren dat de oligodendrocyten geïsoleerd met de gewijzigde techniek zijn sterk gezuiverd en de meeste Toon-expressiepatroon voor een marker typische van onrijpe oligodendrocyten.
Figuur 3: expressie van volwassen OLs markers bij 3DIV. (A) OLs onder fase contrast Microscoop Toon meer complexe morfologie. Op 3DIV, uitdrukking van NG2 (B) vermindert drastisch, terwijl O4 (C) en O1 verhoging van de (D). Paar astrocyten zijn zichtbaar op de 3DIV (C, rood), schaal bar = 50 µm. gegevens werden verzameld uit 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Op 3DIV, verscheen Oligodendrocyt morfologie complexer dan de cellen bij 1DIV (figuur 3A). Op dit punt van tijd, de frequentie van cellen positief voor de vroege Oligodendrocyt markering NG2 was veel lager in vergelijking met 1DIV. NG2-geëtiketteerden cellen telden 31.2 ± 17,1% (ten opzichte van 66,1 ± 8,4% op 1DIV, t-testen p < 0,0001, figuur 3B, Figuur 4A). Hoewel hier niet geanalyseerd, werd de gemiddelde intensiteit van kleuring in cellen beschouwd als positief voor NG2 op 3DIV ten opzichte van 1DIV verminderd. De meeste cellen (81,9 ± 4.884%, Figuur 3 c) toonde O4-etikettering, die hoger dan bij 1DIV was (58% ± 9,4%, t-testen p < 0.0001, figuur 4B). Bijna de helft van de cellen (47.2 ± 16,4%, figuur 3D) bleek ook, kleuring voor O1 (GalC), een marker van rijpere Oligodendrocyt bloedlijn, wat suggereert dat de cellen zijn differentiëren tot een meer volwassen fenotype. De toename van O1+ cellen op 3DIV was ook aanzienlijk in vergelijking met 1DIV (7,4% ± 6,0%, t-testen p < 0.0001, figuur 4C). De aanwezigheid van astrocyten ter zulks tijd bleven uiterst laag punt (0,8% ± 1,5%, Figuur 3 c) en het was niet significant verschillend in vergelijking met 1DIV (0,57% ± 1,0%, niet significant (ns), Figuur 4 d). Deze resultaten wijzen erop dat na verloop van tijd immunomagnetically geïsoleerd oligodendrocyten zijn bekwaam om te onderscheiden in vitro in fase drie van de rijping met zeer weinig besmetting van andere celtypes zoals astrocyten.
Figuur 4: kwantificeren van de expressie van OL markers op 1DIV en 3DIV (A-D). 66% van de cellen waren 1DIV, NG2+, 58% van de cellen werden O4+, 7% van de cellen werden O1+ en 0,5% van de cellen waren GFAP+. Op 3DIV, 31% van de cellen waren NG2+, 81% van de cellen werden O4+, 47% van de cellen werden O1+ en 0,7% van de cellen waren GFAP+. Gemiddelde waarden ± SD worden hier gepresenteerd *** geeft p < 0.0001, ns = niet significant. Gegevens werden verzameld uit 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze mededeling presenteren we een methode voor de efficiënte isolatie van hoogst gezuiverde onvolwassen muis Oligodendrocyt culturen. In vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen39,40, leverde deze methode een hogere zuiverheid met een veel lager niveau van GFAP-positieve astrocyten en een zeer laag percentage van andere cellen niet-gekenmerkt. Het is belangrijk om erop te wijzen dat deze onrijpe OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming. Dus, deze cellen niet nuttig zou zijn voor de studie van de vroege fasen van differentiatie.
Een van de wijzigingen van het Dincman protocol40 was de verwijdering van fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF) uit onze proliferatie media. Er werd gemeld dat in vitro, die fungeert als een sterke mitogene factor bFGF remt niet alleen OPCs van differentiatie, maar ook vermindert het aantal processen46,47. Bovendien verhoogt bFGF Oligodendrocyt dedifferentiation en verspreiding in gepasseerd cellen van de oligodendroglial afstamming 48. Daarom is het aannemelijk dat het verlaagde aantal O4+ cellen en verhoogde aantallen A2B5+ en NG2+ cellen waargenomen in Dincman studie40 kunnen worden veroorzaakt door het effect van bFGF in cultuur.
Ondanks het gebruik van bindende O4 als de methode voor het isoleren van de cellen, slechts 59% van de cellen zijn O4+ op 1DIV. Deze resultaten zijn kwalitatief vergelijkbaar met die van Dincman en collega's40 , die vond dat met behulp van O4 bindend voor isolatie, iets minder dan 50% van de cellen O4 waren+ op 1DIV. Het is aangetoond dat PDGF vertragingen na mitotische ontwikkeling door Transient terugzetten O4+GalC- progenitoren om A2B5+O4- pre-progenitor-achtige cellen, die vervolgens zelfs in de voortdurende aanwezigheid van PDGF onderscheiden 49. Daarom is het waarschijnlijk dat tijdens het proces van de proliferatie in de eerste dag in vitro sommige onvolwassen OLs een omkering van O4 treedt+NG2+ te O4-NG2+, terwijl nog steeds begaan aan de Oligodendrocyt bloedlijn. Deze hypothese wordt ondersteund door Dincman de bevinding40 die onmiddellijk na isolatie ongeveer 80% van de cellen waren O4+.
3DIV, levert dit protocol een iets hogere OL zuiverheid dan die beschreven door anderen39,40 , maar we niet een head-to-head vergelijking te met hun methoden maken hebben. Protocol van Dincman et al. t.o.v. 40, het lagere aantal GFAP-positieve cellen in onze culturen kan worden als gevolg van het ontbreken van FGF in de media van de proliferatie. Het Amaril en Dugas protocol39 is afhankelijk van de sequentiële passage van cellen via cultuur gerechten; astrocyten gemakkelijk kunnen koppelen aan cultuur gerechten50 en kon worden overgedragen na elke sequentiële passage van cellen tijdens het immunopanning-protocol. De onderhavige methode dreigt niet invoering van contaminerende astrocyten in onze fractie zuivering.
Onze gewijzigde methode is sneller in vergelijking met de andere twee nemen ongeveer 4 h uit te voeren. Dit bereiken we door het elimineren van onnodige stappen en reagentia opgenomen door de andere protocollen. Bijvoorbeeld, in vergelijking met het Dincman protocol40, die 5-6 h duurt, wij het gebruik van een kit voor zenuwweefsel dissociatie zowel de incubatie van de celsuspensie OL met rat anti-muis IgM kralen voor het verwijderen van dode cellen weggelaten. In plaats daarvan hebben we uitgevoerd de dissociatie van muis hersenen cortices met papaïne en dode cellen werden verwijderd door het uitvoeren van lage snelheid centrifugations (200 x g).
Een belangrijke wijziging van het Amaril protocol39, waarin ongeveer 9 h, was de verwijdering van de immunopanning-selectie en het schrappen van het vereiste voor een directe O2/CO2 lijn gebruikt om vooraf de Buffer papaïne equilibreer gedurende weefsel spijsvertering. In plaats daarvan hebben we gebruikt immunomagnetic selectie en directe incubatie van de mix van muis hersenen cortices en papaïne buffer in de CO2 incubator.
Hoewel niet direct getest in deze studie, kan de anti-O4 microbeads ook gebruikt worden om te isoleren OLs van rat, menselijke en transgene muis hersenweefsel. Hieruit blijkt de veelzijdigheid van de techniek te gebruiken meerdere weefsel bronnen voor OLs isolatie met het potentieel om te profiteren van onderzoeklaboratoria geïnteresseerd in het werken met OLs uit andere bronnen dan de muis.
Kortom, biedt de gewijzigde OPC isolatie methode beschreven in deze studie een snelle en specifieke alternatief voor het verkrijgen van de primaire muisknop oligodendrocyten die in studies van myelinisering en demyeliniserende ziekte kon worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatieverschaffing.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) en de National Institutes of Health (R03NS06740402). De auteurs bedanken Dr Ivan Hernandez en zijn leden van de lab voor het verstrekken van laboratorium ruimte, apparatuur en advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 10ml syringe Luer-Loc tip | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
| 15ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353935 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22368547 | |
| 50ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 5ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 60mm tissue culture plates | Falcon | 353002 | |
| 70µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A21042 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11042 | |
| Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
| Apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
| Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Boric acid | Sigma | B7660 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30541.03 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| CNTF | Peprotech | 450-50 | |
| d-Biotin | Sigma | B4639 | |
| Desoxyribonuclease I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
| Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera | Olympus | Bx51 | |
| Feather disposable scalpels | Andwin Scientific | EF7281C | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | NeuVitro | GG-12-oz | |
| GFAP antibody | Aves | GFAP | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | |
| Magnetic separator stand - MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Magnetic separator-MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex PES 0.22µm filter unit | Millipore | SLG033RS | |
| Mounting media- Prolong Gold with DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
| N-acetyl-cysteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Neurotrophin-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
| NG2 antibody | Millipore | AB5320 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | D5652 | |
| PDGF | Peprotech | 100-13A | |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Selection column-LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261 | |
| Trace elements B | Corning | 25-000-CI | |
| Triiodothyronine (T3) | Sigma | T6397 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Corning | 25-900-CI | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| B27NBMA | 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use. | ||
| B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum | ||
| CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) | Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C. |
||
| d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) | Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C. | ||
| DNase I stock solution | 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C. |
||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) | Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C. | ||
| Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) | Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C. | ||
| Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma | 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C. |
||
| Insulin stock solution (4000 µg/ml) | Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C. | ||
| Laminin solution | Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months. | ||
| Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer | Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use | ||
| N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) | Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C. | ||
| NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
||
| PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
||
| Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) | Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water. | ||
| Oligodendrocyte proliferation media | see Supplementary Table 1 | ||
| Oligodendrocyte differentiation media | see Supplementary Table 1 | ||
| Sato supplement (100X) | see Supplementary Table 1 | ||
| References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |
References
- Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
- Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
- Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
- Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
- Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
- Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
- Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
- Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
- Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
- Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
- Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
- Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
- Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
- Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
- Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
- Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
- Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
- Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
- Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
- Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
- Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
- Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
- Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
- Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
- Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
- Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
- Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
- Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
- Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
- Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
- Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
- Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
- Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
- Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
- ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
- Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
- Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
- Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
- Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
- Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
