Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

doi: 10.3791/57543 Published: May 21, 2018

Summary

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

Abstract

הבידוד יעיל וחזק והתרבות של ראשי oligodendrocytes להפוך (OLs) הוא כלי בעל ערך לצורך המחקר במבחנה של הפיתוח של oligodendroglia, כמו גם הביולוגיה של אונים כגון טרשת נפוצה, Pelizaeus-Merzbacher-כמו מחלה (PMLD). כאן, אנו מציגים פשוטה, בחירה יעילה שיטת הבידוד immunomagnetic של שלב O4 3+ preoligodendrocytes תאים מן הגורים עכברים neonatal. מאז ילדותי OL מהווים יותר מ 80% של החומר הלבן מכרסם-מוח ביום כמחנכת 7 (P7) שיטה זו בידוד לא רק מבטיחה תשואה גבוהה הסלולר, אלא גם הבידוד ספציפי של OLs כבר מחויבים השושלת oligodendroglial, להקטין אפשרות לבודד תאים מזהמים כגון האסטרוציטים ותאים אחרים מהמוח העכבר. בשיטה זו הוא שינוי של טכניקות שדווחו בעבר, ומספק אוליגודנדרוציטים טוהר הכנה מעל 80% בכ-4 שעות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Oligodendrocytes להפוך (OLs) הם תאים myelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1. הבידוד והתרבות של ראשי oligodendrocytes להפוך בסביבה בחוזקה מוסדר הוא כלי בעל ערך לצורך המחקר במבחנה של הפיתוח של oligodendroglia, כמו גם הביולוגיה של אונים כגון טרשת נפוצה2 . פעולה זו דורשת יעיל וחזק אוליגודנדרוציטים בידוד ותרבות שיטה3. במחקר זה, ניצלנו הביטוי של סמן משטח תא אוליגודנדרוציטים ייחודי ליישם טכניקה בידוד ששונה הוא מהיר ולא ספציפי.

ארבעה שלבים של התבגרות אוליגודנדרוציטים זוהו, כל אחד מאופיין על-ידי הביטוי של סמני פני שטח התא ייחודי עבור כל שלב התפתחותי (איור 1). סמנים אלה פני שטח התא ניתן לזהות על ידי נוגדנים ספציפיים4,5, והוא יכול לשמש כדי לבודד OLs בשלבים מסוימים. בשלב הראשון, אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) יש את היכולת להתרבות, להעביר, במיוחד לבטא פקטורי גדילה נגזר טסית קולטן (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, פרוטאוגליקן NG27,8 , polysialic חומצה-עצבי תא אדהזיה מולקולה9 ושומן-חומצה-מחייב חלבון 7 (FABP7)10. OPCs יש מורפולוגיה דו קוטבי עם כמה תהליכים קצר שמקורם הפולנים מנוגדות בגוף התא, אשר מאפיינת של תאים עצביים קודמן11.

Figure 1
איור 1: ביטוי של סמני פני שטח התא במהלך ההתפתחות אוליגודנדרוציטים העכבר. OLs תא סמני פני שטח כגון A2B5, GalC (נתיבים1), NG2, O4 ו PDGF-Rα ניתן לבודד oligodendrocytes להפוך בשלב התפתחותי מסוים ספציפי באמצעות נוגדנים ייחודיים.   אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בשלב השני, OPCs להצמיח preoligodendrocytes ולבטא את קרום התא לא רק סמנים OPC, אלא גם את sulfatide (sulfated galactolipid) מזוהה על-ידי O4 נוגדן12,13, את החלבון GPR1714, להתקיים עד השלב אוליגודנדרוציטים ילדותי (OL). בשלב זה, preoligodendrocytes להרחיב תהליכים קצר multipolar. Preoligodendrocytes הם השלב OL הגדולות ביום כמחנכת 2 (P2) בחומר הלבן במוח של עכבר ועכבר עם אוכלוסיה קטנה של OLs לא בוגר15.

בשלב השלישי, OLs ילדותי להמשיך אקספרס O4, לאבד את הביטוי של סמנים A2B5 ו- NG2, להביע את galactocerebroside C16. בשלב זה, מחויבים השושלת oligodendroglial וחקירות להפוך לתאי mitotic פוסט עם סניפים זמן כחוד17,18. לא בוגר OL מהווים יותר מ- 80% של החומר הלבן מכרסמים-P7, בשלב זה התאים MBP+ הראשון הם נצפו15,19,20,21. לכן, בידוד של OLs-P7 יכול להבטיח תשואה גבוהה הסלולר.

בשלב הסופי והרביעית של פיתוח OL, בוגר OLs חלבונים myelinating אקספרס (חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), המיאלין הקשורים גליקופרוטאין (מג) ו המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א)22,23 ,24,25,26. בשלב זה, בוגרת להרחיב ממברנות הזה קומפקטי טופס enwrapping מעילי פרווה סביב האקסונים וחקירות מסוגלים שעוטף. זה עולה בקנה אחד עם התצפית כי במוח החולדה, העכבר, תאים MBP+ הופכים יותר ויותר שופע P1419,20,21.

מאז הבידוד הראשון של אוליגודנדרוציטים על ידי Fewster ועמיתיו בשנת 196727, יושמו מספר שיטות עבור בידוד של OLs מ למכרסמים CNS כולל28,immunopanning29,30, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניצול תא השטח הספציפי אנטיגנים28,31, צנטריפוגה הדרגתיות דיפרנציאלית32,33,34,35 שיטה חזק המבוסס על הדבקות דיפרנציאלית של CNS שונה עכשיו, דונלד36,37. עם זאת, קיימות שיטות יש מגבלות, במיוחד במונחים של טוהר, תשואה, הזמן הנדרש כדי לבצע את ההליכים38. לכן, שיטות בידוד יעיל יותר oligodendrocytes להפוך נדרשים.

בנייר זה, אנו מציגים פשוטה, בחירה יעילה שיטת הבידוד immunomagnetic של שלב O4 3+ preoligodendrocytes תאים מן הגורים עכברים neonatal. בשיטה זו הוא שינוי של טכניקות שדווחו על-ידי אמרי. et al. 39 ו. Dincman et al. 40 ומספק של טוהר הכנה אוליגודנדרוציטים מעל 80% בכ-4 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העכברים השתמשו במחקר זה היו מטופלים בהתאם לקווים המנחים של המספר פרוטוקול SUNY Downstate רפואי מרכז חלוקה של מעבדה חיה משאבים (DLAR) 15-10492.

הערה: oligodendrocytes להפוך הראשי הם בודדו אותנו מהמתרחש neonatal (P5-P7 פראי-סוג C57Bl/6N) עכברים. בשלב זה, לא בשלה OLs מהווים יותר מ- 80% של החומר הלבן מכרסמים הבטחת תשואה גבוהה הסלולר. כל מאגר של יצירות ריאגנט זמינים בסוף הטבלה של חומרים.

1. Coverslips הכנה

הערה: פוליפוני-D-ליזין (PDL) / coverslips laminin מצופה להיות מוכנים לפני OL בידוד.

  1. המקום #1 גרמנית זכוכית coverslips לתוך צינור חרוטי 50-mL ולהוסיף 35 מ ל 70% EtOH כדי לנקות אותם.
  2. סגור את הצינור, למקם אותו במיקסר nutating, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות תוך בעדינות נדנדה. יכול להיות מודגרות Coverslips בן לילה.
  3. למחוק את EtOH 70%.
  4. לשטוף את coverslips 3 פעמים עם מים יונים, להסיר את המים בכל פעם עם השאיפה ואקום.
  5. להוסיף 30-35 מ ל PDL 50 µg/mL coverslips בצינור 50-mL, מספיק כדי לכסות על coverslips.
  6. מקם את הצינור 50-mL המכיל את coverslips על מיקסר nutating, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות תוך נדנדה בעדינות.
  7. לשטוף את coverslips 3 פעמים עם מים יונים, הסרת את המים בכל פעם עם השאיפה ואקום.
  8. להעביר את coverslips 60 מ מ פטרי המכילות מים יונים.
  9. השתמש טיפ פיפטה P200 כדי לארגן את coverslips כשכבה מכסה את כל פני השטח של הפטרי.
  10. . בזהירות, הסר את המים הכלים עם שאיפה ואקום.
  11. להסיר את המים סביב coverslips ולתת להן להתייבש למשך הלילה עם מכסה פתוח, תחת אולטרא סגול בשכונה.
    הערה: PDL מצופה coverslips זכוכית דקה ניתן לאחסן ב 4 ° C בפטרי סטריליות עד שלושה חודשים.
  12. מקם את coverslips לוחות 24-. ובכן, אחד לכל טוב, באמצעות מלקחיים בסדר.
  13. להעביר את coverslips מרכז טוב מוודא שהקצוות אל תיגע בקיר של הבאר.
  14. להוסיף 100 µL של 10 µg/mL laminin מעורבבת עם B27NBMA (ראה טבלה של חומרים) מתחיל במרכז של כל coverslip והעברתו בצורה מעגלית, לכיוון הקצוות כדי לכסות את כל האזור.
    הערה: כיוון laminin מעורב OL תחזוקה ומקדם בידול לתוך OLs בוגרת, היא גורם חשוב של הישרדות OL in vitro לקשרי תרבות41,42,43,44.
  15. דגירה על צלחת 37 ° C החממה ב- 5% CO2 לפחות שעה או עד OLs מוכנים ציפוי.

2. העכבר דיסוציאציה קליפת המוח

  1. להקריב כמחנכת 5-7-יום הישן C57Bl/6N העכבר הגורים ע י עריפת ראשו מהירה עם מספריים בעבר נוקה ב-70% אתנול.
    הערה: מוחי cortices מ- 5-6 עכברים neonatal הגורים שימשו כל הכנה. בממוצע, מוח העכבר אחת מניבה 1-1.5 x 106 OLs.
  2. לחתוך את העור בקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים קטנות ויבתר ומשכו לחשוף את הגולגולת.
  3. לחתוך את הגולגולת בקפידה לאורך הקו האמצעי החל מפתיחת מאחורי הגולגולת לכיוון האזור חזיתית, מרימים עם המספריים כדי למנוע נזק למוח. לאחר מכן, באמצעות פתיחת מאחורי הגולגולת לחתוך לכיוון כל ארובת העין לאורך הבסיס של הגולגולת.
  4. השתמש בסדר מלקחיים בעדינות להקניט את cortices מן המוח האמצעי ולהעביר אותם לצלחת תרבות רקמות 60 מ מ המכיל 7 מ של B27NBMA. חזור על הצעדים 2.2 דרך 2.4 כל המוח, צירוף של cortices גזור.
  5. להעביר את cortices תבשיל תרביות רקמה 60 מ מ חדש המכיל 5 מיליליטר דיסוציאציה מאגר (B27NBMA, פפאין U/mL 20-30 ו- 2,500 U DNase אני).
  6. חותכים לקוביות את cortices לחתיכות קטנות של 1 מ מ3 באמצעות סכין #15 אזמל, תקופת דגירה של 20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.
  7. להוסיף 1 מ"ל בסרום הצמיחה שור (מביע רק) כדי לעצור את התגובה אנזימטיות.
  8. להעביר את cortices יחד עם כלי התקשורת דיסוציאציה צינור חרוטי 15-mL באמצעות pipet סרולוגית 10 מ.
  9. בעדינות נתחיל לנתק את רקמת המוח על-ידי pipetting לאט לאט למעלה, למטה 6 - 8 פעמים באמצעות pipet סרולוגית 10-mL, באמצעות טיפול למזער את בועות.
  10. לאפשר את חתיכות רקמה להתפשר על 2-3 דקות ולהעביר את תגובת שיקוע ל צינור טריים.
  11. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/2500 U DNase I הרקמה גלולה.
  12. השתמש פיפטה סרולוגית 5 מ ל לנתק בעדינות על רקמת המוח בזמן pipetting למעלה ולמטה 6 - 8 פעמים. להיות זהירים כדי למזער את בועות.
  13. לאפשר את חתיכות רקמה להתפשר על 2-3 דקות.
  14. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase I הרקמה גלולה.
  15. בעדינות מביצועם על רקמת המוח באמצעות טיפ pipet P1000, תוך pipetting את המיקס של מדיה, במוח רקמות למעלה ולמטה. חזור על השלבים 2.13 ו 2.14 עד אין נתחים גדולים של רקמות להישאר או עד B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase מוטשת, מה שיבוא קודם. להיות זהירים כדי למזער את בועות.
  16. ההשעיה תא בריכה עם supernatants הקודם.
  17. מניחים מסננת תא 70-מיקרומטר בשפופרת 50-mL. שימוש pipet סרולוגית 10-mL, להעביר את התליה תא במאגר בעדינות מסננת תא 70-מיקרומטר.
  18. לשטוף את מסננת תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase אני.
  19. למחוק את מסננת התא. להביא את אמצעי האחסון 30-mL עם B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase אני.
  20. העברה התליה תא שני צינורות חרוט 15-mL. Centrifuge התליה תא 10 דקות ב- 200 x g.
  21. הסר את תגובת שיקוע מבלי להשאיר את התאים ייחשף לאוויר. תגובת שיקוע יהיה מעונן בגלל שאריות תאים. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק כדי בגדר.
  22. בזהירות מביצועם בגדר התא באמצעות pipet של P1000. להביא את אמצעי האחסון 15 מ"ל עם B27NBMA המכיל 10% BGS.
  23. לעבור התליה תא מעל מסננת תא מיקרומטר 40 טריים.
  24. לשטוף את מסננת תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% BGS. למחוק את מסננת התא.
  25. להביא את אמצעי האחסון 30 מ עם B27NBMA המכיל 10% BGS.
  26. העברה התליה תא צינורות חרוט 2 x 15-mL. Centrifuge התליה תא 10 דקות ב- 200 x g.
  27. להסיר את מרבית תגובת שיקוע מבלי להשאיר את התאים ייחשף לאוויר. Resuspend תא כדורי ב 5 מ של תא מגנטי קר קרח, מיון מאגר (MCS).

3. קביעת ספירת התאים ואת הכדאיות

  1. לדלל µL 100 של התליה תא עם 400 µL של פתרון Trypan Blue צינור 1.5-mL microcentrifuge כדי להשיג לדילול 1:5 ב- 0.4% (w/v).
  2. מרכז זכוכית מכסה מעל hemocytometer קאמרית, מילוי התאים שני עם µL 10 של דילול תאים באמצעות פיפטה P10 והימנעות תמלא יותר מדי. הפתרון יעברו תחת הזכוכית המכסה על ידי נימיות.
  3. מניחים את hemocytometer על הבמה מיקרוסקופ והתאימו את המוקד באמצעות הגדלה X 40.
    הערה: תא ספירת נרשמים באמצעות מונה ידניים בכל חמש משבצות (ארבע הפינות, מרכז אחד). רק כלכלית תאים סופגים את צבען ומופיעים כחול, בעוד בשידור חי, תאים בריאים מופיעים עגול, השבירה, אינם סופגים לצבוע בצבע כחול, המאפשר קביעת מספר התאים הכולל ובר קיימא למיליליטר.

4. בידוד של O4+ oligodendrocytes להפוך

  1. Centrifuge התליה תא ב 200 g x 10 דקות.
  2. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע באמצעות שאיפה ואקום, הימנעות מחשיפה של תאי האוויר.
  3. Resuspend בגדר ב 90 µL מאגר תקליטנים לכל עונה 1 פרק 107 הכולל תאים ואחריו התוספת של 10 µL של אנטי-O4 חרוזים לכל עונה 1 פרק 107 תאים.
  4. מערבבים את התא ההשעיה, חרוזים על ידי מצליף בעדינות את הצינור 15-mL חרוט עם האצבע 4 - 5 פעמים.
  5. דגירה לערבב למשך 15 דקות ב 4 ° C, מצליף הצינור חרוט 15-mL עם האצבע timesevery 4-5 5 דקות.
  6. לשטוף את התערובת על-ידי הוספת בעדינות 2 מ של מאגר תקליטנים לכל עונה 1 פרק 107 תאים הצינור. Centrifuge את המיקס ב 200 g x 10 דקות.
  7. למחוק את תגובת שיקוע באמצעות בקפידה השאיפה ואקום, הימנעות מחשיפה של תאי האוויר. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL MCS מאגר עבור כל התאים7 עונה 1 פרק 10.
  8. לצרף מפריד מגנטי עמדה הפרדה מגנטית. לצרף עמודת בחירה במפריד מגנטי ומניחים על מסננת תא 40 µm יוליאנוס. מקום שני 15-mL או שפופרת אחת של חרוט 50-mL מתחת לעמודת ההפרדה כדי לאסוף את הזרימה.
  9. מראש יש לשטוף את 40-מיקרומטר תא מסננת והפרדה העמודה עם 3 מ"ל של מאגר תקליטנים ותנו המאגר לרוץ דרך העמודה מבלי לתת לו להתייבש.
  10. הוסף את התמהיל של הבולם תא וחרוזים מסננת את התא, לתוך עמודת בחירה.
  11. לשטוף את מסננת תא 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של מאגר תקליטנים.
  12. למחוק את מסננת תא ולתת את התמהיל של תאים, חרוזים, מאגר לרוץ דרך העמודה מבלי לתת לו להתייבש.
  13. לשטוף את העמודה ההפרדה 3 פעמים עם 3 מ"ל של MCS מאגר זמן 1 עם OL תפוצת המדיה.
  14. הסר את העמודה ההפרדה המפריד מגנטי, במהירות למקם אותו לתוך צינור חרוטי 15-mL ולהוסיף מיד 5 מיליליטר OL תפוצת המדיה.
  15. במקום פומפה על גבי העמודה ולדחוף בחוזקה כדי לשטוף את התאים שכותרתו לתוך הצינור חרוט 15-mL.
  16. הסר µL 100 של השעיה תא לקבוע ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות Trypan Blue ו- hemocytometer כמצוין בסעיף 3.
    הערה: תא הכדאיות מעל 80% נחשב מקובל להמשיך עם התרבות של OLs, אך הכדאיות גדול מ- 90% היא אופטימלית.

5. ציפוי של O4 מבודד+ oligodendrocytes להפוך

  1. לדלל התליה תא התשוקה יופיצ צפיפות (5 x 105 תאים לכל coverslip) באמצעות מדיה התפשטות OL.
    הערה: OL זריעה צפיפות הוא מאוד חשוב, אז צפיפות תאים מתאים יש לאשר באמצעות מיקרוסקופ תרביות רקמה לפני שתמשיך. זריעה צפיפות מתחת 10,000 תאים/coverslips עלול להוביל הישרדות cell המסכן. -ציפוי צפיפות-OL 10,000 כדי 25,000, בידול מורפולוגי הוא איטי45. אנחנו צלחת OLs-צפיפות זריעה לפחות 50,000 תאים coverslips כדי להבטיח הישרדות cell.
  2. הזז את הצלחות 24-ובכן המכיל coverslips מצופה laminin של חממה מכסה המנוע תרביות רקמה.
  3. הסר laminin של כל coverslip ולהחליף אותו עם µL 100 של השעיה OL.
  4. דגירה OLs בחממה 37 °C/5% CO2 לתקופה מקסימלית של 45 דקות על מנת לקדם OL הדבקה על coverslips.
  5. לאחר דגירה, הסר את הצלחות 24-ובכן החממה. להציף את כל טוב של צלחת 24-ובכן עם 500 µL OL תפוצת המדיה.
  6. מקם את OLs בחזרה בחממה 37 °C/5% CO2 עבור 24 שעות נוספות.
  7. 24 שעות לאחר ציפוי של OLs, להסיר את תפוצת המדיה, תחליף עם OL מדיה בידול כדי ליצור בידול.
  8. למקם את OLs בחזרה בחממה, אל תסיר עד התאים מוכן עבור קיבעון.
    הערה: שינויים ב- pH פוגמים עבור OLs ו להקטין את הכדאיות התא, ולכן יש להימנע מיותר הסרה של תרבויות OLs מתוך החממה.

6. immunofluorescence מכתים

  1. איתור תא סמני פני השטח (NG2, O1 ו- O4) להסיר לתקשורת מן הבארות.
  2. להוסיף 250 µL של העכבר ליפידים supernatants המכיל נוגדנים ראשי O1 (מדולל)13 ו- O4 (מדולל)13 , ארנב polyclonal נגד NG2 (1:150 מעורבבת עם B27NBMA).
    הערה: אם נוגדנים anti-O1 ו- anti-O4 זמינים מסחרית כדי לשמש, מומלץ לנצל את דילולים שהוצעה על ידי היצרן.
  3. דגירה התאים עם נוגדן ראשוני למשך 45 דקות מקסימום בחממה2 37 °C/5% CO.
  4. לשטוף פעמיים עם 0.05% Tween-20/1 X PBS. לתקן את התאים paraformaldehyde 4% (4% PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  6. לדלל עז מצומדת אלקסה 488 אנטי עכבר IgM או ארנב אנטי איג משני נוגדנים (1:400) ב- B27NBMA.
  7. הסר 0.05% ל- PBS Tween-20/1 X coverslips. דגירה התאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  8. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  9. זוגי מכתים איתור סמנים פנימית (GFAP), להסיר 0.05% Tween-20/1 X PBS התאים ו- permeabilize/בלוק עם בלוק/permeabilization מאגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. אחרת המשך לשלב 6.17.
  10. להסיר לחסום/permeabilization מאגר ולהוסיף 250 µL עוף אנטי-GFAP (1: 100) מדולל במאגר בלוק/permeabilization.
  11. דגירה התאים עם אנטי-GFAP לשעה בטמפרטורת החדר. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  12. לדלל עז מצומדת אלקסה 594 עוף אנטי איג משני נוגדנים (1:400) ב- B27NBMA.
  13. הסר 0.05% ל- PBS Tween-20/1 X coverslips. דגירה התאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  14. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Counterstain עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) והר התאים עם antifade הרכבה המדיה המכילה דאפי.
  16. תן coverslips לרפא בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.
  17. תמונה התאים ויטראז'ים עם מיקרוסקופ epifluorescence.
    הערה: ב פרוטוקול זה, התאים היו עם תמונה בהגדלה X 40 באמצעות זמן חשיפה אחידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מטרת מחקר זה היתה להקים שיטה בידוד משופר עבור O4+ העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך הדורשים מניפולציה שפחות של תאי היעד. ההליך כולו של המתת חסד של הגורים ציפוי של התאים coverslips לוקח כ 4 שעות, הנתונים המוצגים כאן מייצגים 3 ניסויים עצמאית. לאחר רקמת דיסוציאציה, ממוצע של 4.3 ± 0.46 x 107 תאים היו מבודדים עבור ניסוי עצמאית, עם יכולת הקיום של 91% ± 5.6%. לאחר בידוד immunomagnetic באמצעות אנטי-O4 מתויג גרגרי מגנטי ממוצע של ± 0.38 x 10 6.96 OLs התקבלו (1-1.5 x 106 לכל עכבר) אשר הוא 16.2% ± 1.6% של התאים הכולל בתחילה הפומבית; הכדאיות היה 96.3% ± 3.5%.

Figure 2
איור 2: Immunomagnetically מבודדים סמנים אקספרס ילדותי OLs 1DIV. (א) OLs תחת מיקרוסקופ לעומת זאת שלב הצג מורפולוגיה, tri-הקטבים. OLs אקספרס NG2 (B), O4 (C), ואת O1 (D). האסטרוציטים מעט מאוד נכחו במסיבה 1DIV (C, אדום), סולם בר = 50 מיקרומטר. נתונים שנאספו מ- 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי לבחון את פנוטיפ antigenic של התאים immunomagnetically מבודדים, immunofluorescence מכתים היה שבוצעו 24 h (1DIV) ו- 72 h (3DIV) לאחר ציפוי התאים. 1DIV, התא הופיע bi - או tripolar במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 2 א), מאפיין תכונה של שלב מוקדם מתרבים OLs (OPCs, או preoligodendrocytes). 66.1 ± 8.4% של תאים אלה היו התווית על-ידי NG2 (איור 2B), 58% ± 9.4% של התאים היו התווית על-ידי O4 (איור 2C). O1 (GalC)-תיוג, סמן של תאים בוגרים יותר בשושלת אוליגודנדרוציטים, היה הרבה פחות נפוץ (7.4% ± 6.0%, איור דו-ממדי). פרופיל סמן זה עולה כי הרוב המכריע של תאים בשלב זה הם oligodendrocytes להפוך מראש עם oligos לא בוגר או בוגרת באחוזים קטנים יותר, ואולי קצת אוליגודנדרוציטים ובתאים (OPCs). האסטרוציטים, כפי שמעידים GFAP מכתים, המורכב 0.57 ± 1.0% (איור 2C). נתונים אלו מראים כי oligodendrocytes להפוך מבודדת עם טכניקה שונה מאוד וגופם מטוהר, הרוב להראות ביטוי דפוס עבור סימן אופייני של ילדותי oligodendrocytes להפוך.

Figure 3
איור 3: ביטוי של סמנים בוגרת OLs 3DIV. (א) OLs תחת שלב במיקרוסקופ ניגוד להראות מורפולוגיה מורכבים יותר. ב 3DIV, ביטוי של NG2 (B) מפחיתה באופן דרמטי, בעוד O4 (C) ו O1 עלייה (D). האסטרוציטים כמה גלויים ב- 3DIV (C, אדום), סולם בר = 50 מיקרומטר. נתונים שנאספו מ- 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3DIV, מורפולוגיה אוליגודנדרוציטים הופיע מורכב יותר מאשר התאים ב- 1DIV (איור 3 א). בנקודת זמן זו, מורכבת התדירות של תאים חיובי על דה מרקר אוליגודנדרוציטים מוקדם NG2 היה הרבה יותר נמוך בהשוואה 1DIV-תאים התווית על-ידי NG2 31.2 ± 17.1% (לעומת 66.1 ± 8.4%-1DIV, t-מבחן p < 0.0001, איור 3B, איור 4A). אמנם לא נותח כאן, האינטנסיביות הממוצע של צביעת תאים יראוהו חיובי עבור NG2 צומצם ב 3DIV בהשוואה 1DIV. רוב התאים (81.9% ± 4.884%, איור 3C) הראה O4-תיוג, אשר היה גבוה יותר מאשר ב- 1DIV (58% ± 9.4%, t-מבחן p < 0.0001, איור 4B). כמו כן, כמעט חצי התאים (47.2% ± 16.4%, דמות תלת-ממד) הראה צביעת עבור O1 (GalC), סמן של השושלת אוליגודנדרוציטים בוגרת יותר, רומז כי התאים הם המבדילים את הפנוטיפ בוגרת יותר. העלייה של O1+ תאים על 3DIV היה גם משמעותי בהשוואה 1DIV (7.4% ± 6.0%, t-מבחן p < 0.0001, איור 4C). הנוכחות של האסטרוציטים בזה זמן נקודת נשאר נמוך מאוד (0.8% ± 1.5%, איור 3C) וזה לא היה שונה באופן משמעותי בהשוואה 1DIV (0.57% ± 1.0%, לא משמעותי (ns), דמות 4D). תוצאות אלה מציינים כי לאורך זמן, immunomagnetically מבודדים oligodendrocytes להפוך מסוגלים להתמיין במבחנה לשלב השלישי של התבגרות עם זיהום קטן מאוד של סוגי תאים אחרים כגון האסטרוציטים.

Figure 4
איור 4: כימות של הביטוי של סמנים OL 1DIV ו- 3DIV (A-D). 66% של תאים 1DIV, היו NG2+, 58% של התאים היו O4+, 7% של התאים היו O1+ 0.5% של התאים היו GFAP+. 31% של תאים 3DIV, היו NG2+, 81% של התאים היו O4+, 47% מכלל התאים היו O1+ והיו כ- 0.7% של התאים GFAP+. ממוצע הערכים ± SD מוצגים כאן * * * מציין p < 0.0001, ns = לא משמעותי. הנתונים נאספו מ- 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תקשורת זו, אנו מציגים שיטת הבידוד יעיל של תרבויות אוליגודנדרוציטים עכבר לא בוגר נקיים במיוחד. לעומת פרוטוקולים שפורסמו בעבר39,40, שיטה זו הניבה טוהר גבוהה יותר עם רמה נמוכה יותר של GFAP-חיוביות האסטרוציטים ואחוז נמוך מאוד של תאים אחרים שאינם מאופיין. חשוב לציין שאלו הן ילדותי OLs ביצע כבר לשושלת oligodendroglial. לפיכך, תאים אלה לא יהיה שימושי עבור חקר השלבים המוקדמים של בידול.

אחד השינויים מכל פרוטוקול Dincman40 היה הסרת בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF) ממדיה ההפצה שלנו. בעבר דווח כי במבחנה, bFGF פועל כגורם mitogenic חזקות לא רק מעכב OPCs של בידול, אבל גם מקטינה את מספר תהליכים46,47. יתר על כן, bFGF מגדילה dedifferentiation אוליגודנדרוציטים והתפשטות תאים passaged של השושלת oligodendroglial 48. לכן סביר כי המספרים מופחתת של O4+ תאים ומספרים מוגברת של A2B5+ , NG2+ תאים שנצפתה במחקר Dincman40 יכול להיות בגלל ההשפעה של bFGF בתרבות.

למרות באמצעות איגוד O4 כשיטת לבידוד בתאים, רק 59% מהתאים נמצאים O4+ -1DIV. תוצאות אלה הן איכותית דומות לאלו של Dincman ועמיתיו40 שמצא כי באמצעות איגוד O4 לבידוד, מעט פחות מ 50% של תאים היו O4+ -1DIV. הוכח כי PDGF מעכב התפתחות פוסט-mitotic מאת O4 החזרה transiently+GalC אבות כדי A2B5+O4 תאים טרום-progenitor, כמו לאחר מכן להבדיל גם בנוכחות המתמשכת של PDGF 49. לפיכך, סביר להניח כי במהלך התהליך של התפשטות הראשון יום במבחנה כמה OLs לא בוגר עלול להיתקל היפוך של O4+NG2+ כדי O4NG2+, בעוד הנותרים עדיין מחויבים אוליגודנדרוציטים לשושלת. השערה זו נתמכת על ידי ממצא של Dincman40 שהיו מיד לאחר בידוד כ- 80% של התאים O4+.

ב 3DIV, פרוטוקול זה מייצר טוהר OL קצת יותר גבוה מזה המתואר על-ידי אחרים39,40 , למרות שאנחנו לא עשה השוואה ראש בראש עם השיטות שלהם. בהשוואה לפרוטוקול של. Dincman et al. 40, מספר נמוך יותר של תאים GFAP-חיוביות בתרבויות שלנו יכול להיות בגלל חוסר FGF בתקשורת התפשטות. אמרי, Dugas פרוטוקול39 מסתמך על מעבר רציף של תאים דרך תרבות מנות; האסטרוציטים ניתן להצמיד בקלות תרבות מנות50 , יכול להנשא לאחר כל מעבר רציף של תאים במהלך הפרוטוקול immunopanning. השיטה שהוצגו לא לסכן את החדרת מזהמים האסטרוציטים ב שבר טיהור שלנו.

השיטה שונה שלנו מהר יותר לעומת השניים האחרים לוקח כ 4 שעות לביצוע. נוכל להשיג זאת על-ידי ביטול השלבים המיותרים, ריאגנטים ששולבו על-ידי פרוטוקולים אחרים. לדוגמה, אנחנו בהשוואה Dincman פרוטוקול40, אשר לוקח 5-6 h, הושמט גם השימוש של ערכת על דיסוציאציה רקמה עצבית וגם הדגירה של התליה תא OL עם עכבר אנטי-עכבר IgM חרוזים להסרת תאים מתים. במקום זאת, ביצענו את הדיסוציאציה של מוח העכבר cortices עם פפאין ותאים מתים הוסרו על-ידי ביצוע מהירות נמוכה centrifugations (x 200 גרם).

שינוי גדול מ אמרי פרוטוקול39, אשר לוקח בערך 9 h, הסרת הבחירה immunopanning והיה הסרת הדרישה O2/CO2 קו ישיר נהגה מראש equilibrate המאגר פפאין במהלך רקמות עיכול. במקום זאת, השתמשנו מבחר immunomagnetic, דגירה ישירה של המיקס של העכבר מוח cortices ומאגר פפאין בחממה2 CO.

אמנם לא ישירות שנבדקו במחקר זה, גרגרי אנטי-O4 גם ניתן לבודד OLs של עכברוש, רקמת מוח העכבר הטרנסגניים ואנושי. זה מדגיש את הרב-גוניות של הטכניקה להשתמש ממספר מקורות רקמות לבידוד OLs עם הפוטנציאל להרוויח מעבדות מחקר מעונינת לעבוד עם OLs ממקורות אחרים מלבד העכבר.

לסיכום, שיטת בידוד OPC ששונה המתוארים במחקר זה מספק אלטרנטיבה מהירה, מדויקת כדי להשיג את העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך שניתן ליישמם במחקרים של myelination ושל demyelinating המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין גילויים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן האגודה לטרשת נפוצה הלאומית (RG4591A1/2) של מכון הבריאות הלאומי (R03NS06740402). המחברים מודים ד ר איוון הרננדז ואנשי המעבדה שלו על מתן שטח, ציוד וייעוץ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330, (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149, (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209, (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2, (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105, (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43, (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115, (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41, (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354, (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561, (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24, (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83, (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59, (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33, (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12, (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12, (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106, (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7, (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18, (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188, (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280, (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16, (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138, (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102, (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22, (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6, (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167, (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159, (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361, (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21, (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17, (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14, (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6, (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71, (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11, (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209, (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163, (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167, (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14, (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17, (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7, (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111, (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36, (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20, (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter