Summary
우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.
Abstract
효율적이 고 강력한 격리와 기본 oligodendrocytes (OLs)의 문화는 oligodendroglia의 개발 뿐만 아니라 demyelinating 다 발성 경화 증과 같은 질병의 생물학의 생체 외에서 연구에 대 한 유용한 도구와 Pelizaeus-Merzbacher-같은 질병 (PMLD). 여기, 우리 간단 하 게 제시 하 고의 immunomagnetic 절연에 대 한 효율적인 선택 방법을 단계 3 O4+ preoligodendrocytes 세포에서 신생아 쥐 새끼. 미 숙 OL 80% 이상 설치류 뇌 백색 질 출생 후 제 7 일에의 (P7)이 격리 방법 뿐만 아니라 셀룰러 고수익을 보장 뿐만 아니라 이미 oligodendroglial 계보 최선을 다하고 OLs의 특정 격리 구성, 이후 감소 하는 이다 등 오염 셀과 다른 셀 쥐의 뇌에서 분리 가능성. 이 방법은 기술 이전, 보고의 이며 약 4 시간에 80% 이상 oligodendrocyte 준비 순수성을 제공 합니다.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) 중앙 신경 시스템 (CNS)1의 myelinating 세포 이다. 분리와 밀접 하 게 환경에서 기본 oligodendrocytes의 문화는 oligodendroglia의 개발 뿐만 아니라 demyelinating 질병 다 발성 경화 증2의 생물학의 생체 외에서 연구를 위한 유용한 도구 . 이는 효율적이 고 강력한 oligodendrocyte 고립과 문화 방법3필요합니다. 이 연구에서 우리는 신속 하 고 구체적인 수정된 격리 기술을 구현 하는 독특한 oligodendrocyte 세포 표면 마커 표현의 활용을 했다.
Oligodendrocyte 성숙의 4 단계로 발견 되었습니다, 그리고 각 각 발달 단계 (그림 1)에 대 한 독특한 세포 표면 마커 표현의 특징. 이러한 세포 표면 마커 특정 항 체4,5에 의해 인식 될 수 있다 그리고 특정 단계에서 OLs를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서 oligodendrocyte 선구자 세포 (OPCs) 증식, 마이그레이션, 특히 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG27,8 표현 하 능력을가지고 , polysialic 산 신경 세포 접착 분자9 및 지방 산 묶는 단백질 7 (FABP7)10. OPCs는 신경 선구자 세포11의 특성은 세포 체의 반대 극에서 나오는 몇 가지 짧은 프로세스와 바이 폴라 형태가 있다.
그림 1: 식 세포 표면 마커 마우스 oligodendrocyte 개발 중. OLs 세포 표면 마커 같은 A2B5, GalC (o 1), NG2, O4, 및 PDGF Rα 구체적으로 특정 항 체를 사용 하 여 특정 발달 단계에서 oligodendrocytes를 분리 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
두 번째 단계에서 OPCs preoligodendrocytes 하 고 세포 막에 표현 OPC 표식, 뿐만 아니라 O4 항 체12,13, 그리고14GPR17 단백질 의해 인식 하는 sulfatide (sulfated galactolipid) 미 성숙한 oligodendrocyte (OL) 단계까지 지속합니다. 이 단계에서 preoligodendrocytes는 다중 짧은 프로세스를 확장합니다. Preoligodendrocytes에 있는 주요 OL 무대 출생 후 하루 2 (P2)에 미 숙 OLs15의 작은 인구와 가진 쥐와 쥐의 대뇌 백 질.
세 번째 단계에서 미 숙 OLs O4 표현, 표현의 A2B5 및 NG2 마커를 잃고과 galactocerebroside C16을 표현 하기 시작 계속. 이 단계에서 OLs oligodendroglial 계보에 최선을 다하고 있습니다 그리고 긴 없는 분기17,18와 포스트 mitotic 세포가. 미 숙 OL P7에 설치류 백색 물질의 80% 이상 구성 하 고이 이번에 첫 번째 MBP+ 셀15,19,,2021관찰 된다. 따라서, P7에 OLs의 격리 수 셀룰러 고수익을 확인 하십시오.
OL 개발의 최종적이 고 4 단계에서 성숙 OLs 익스프레스 myelinating 단백질 (myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 수 초 관련 된 당단백질 (MAG) 및 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)22,23 ,,2425,26. 이 단계에서 성숙 OLs 확장 막 투과성 축 삭 주위 sheaths 그 양식 컴팩트 하 고 미 수 있습니다. 이 쥐와 쥐 두뇌에 MBP+ 세포 P1419,,2021에서 점점 더 풍부한가 관찰과 일치 한다.
Fewster와 동료 196727oligodendrocyte의 첫 번째 분리 이후 설치류 CNS에서에서 OLs의 격리를 위해 여러 가지 방법은 immunopanning28,,2930를 포함 하 여 구현 되었습니다. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 세포 표면의 특정 항 원28,31, 차동 그라데이션 원심32,,3334,35 이용 및 다른 CNS 명과36,37의 차동 준수에 따라 떨고 방법. 그러나, 기존의 문화 방법 특히 순도, 수율 및38의 절차 수행 하는 데 필요한 시간 측면에서 한계를가지고. 따라서, oligodendrocytes에 대 한 보다 효율적인 절연 방법이 제시해 주셔야 합니다.
이 문서에서는 간단한 소개 및 immunomagnetic 격리에 대 한 효율적인 선택 방법을 단계 3 O4+ preoligodendrocytes 세포에서 신생아 쥐 새끼. 이 방법은 기술에 머리 외 에 의해 보고 수정 39 그리고 Dincman 외. 40 약 4 h에서 80% 이상이 oligodendrocyte 준비 순수성을 제공 합니다.
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Protocol
이 연구에 사용 된 쥐 SUNY Downstate 의료 센터 부문의 실험실 동물 자원 (DLAR) 프로토콜 번호 15-10492의 지침에 따라 마음에 든다고 했다.
참고: 기본 oligodendrocytes 신생아 (P5-P7 야생-타입 C57Bl/6N)에서 고립 된 쥐. 이 단계에서 미 성숙한 OLs 셀룰러 고수익 보장 설치류 백색 물질의 80% 이상 구성 한다. 모든 버퍼 및 시 약 구성 재료의 테이블의끝에 사용할 수 있습니다.
1. Coverslips 준비
참고: 폴 리-D-리 (PDL) / 코팅 laminin coverslips OL 격리 전에 준비 되어야 한다.
- 장소 #1 독일 50 mL 원뿔 튜브에 coverslips 유리 및 추가 70%의 35 mL EtOH 그들을 청소.
- 튜브, nutating 믹서에 닫고 락을 부드럽게 하는 동안 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어. Coverslips는 하룻밤 incubated 수 있습니다.
- 70 %EtOH 삭제 합니다.
- Coverslips 이온을 제거 된 물으로 3 회 세척, 물 진공 포부와 함께 모든 시간을 제거 합니다.
- PDL 50 µ g/mL의 30-35 mL 50 mL 튜브, 충분히 커버는 coverslips에에서 coverslips를 추가 합니다.
- Nutating 믹서에 coverslips를 포함 하는 50 mL 튜브를 배치 하 고 적어도 30 분 동안 실내 온도에 온화 하 게 흔든 하는 동안 품 어.
- 워시 3 번 물 진공 포부와 함께 모든 시간을 제거 하는 이온된 수로 coverslips.
- 60 mm 접시 포함 하는 이온된 수로는 coverslips를 전송 합니다.
- P200 피 펫 팁을 사용 하 여 레이어를 페 트리 접시의 전체 표면을 커버는 coverslips를 정렬.
- 조심 스럽게, 진공 포부와 함께 요리에서 물 제거.
- coverslips 주위에 물의 과잉을 제거 하 고 그들이 하룻밤 말리 면 뚜껑 열고와 후드에 자외선 아래.
참고: PDL 코팅 유리 coverslips 저장할 수 있습니다 멸 균 페 트리 디쉬에 4 ° C에서 최대 3 개월. - 장소 잘 당 하나 24-잘 접시로 coverslips 미세 집게를 사용 하 여.
- 잘 확인 하 고 가장자리는 우물의 벽을 만지지 마십시오의 센터에 있는 coverslips를 이동 합니다.
- B27NBMA에 희석 10 µ g/mL laminin의 100 µ L를 추가 ( 테이블의 자료를 참조) 각 coverslip의 센터에서 시작 하 고 모든 영역을 커버 원형 패션 가장자리 쪽으로 이동.
참고: 이후 laminin OL 유지 관리에 참여 하 고 성숙한 OLs로 차별화를 추진 하 고, 생체 외에서 문화41,42,,4344한 중요 한 OL 생존 요소 이다. - 접시는 37 ° C 인큐베이터 5% CO2 는 OLs 도금에 대 한 준비가 될 때까지 또는 적어도 1 시간에에서 품 어.
2. 마우스 뇌 피 질 분리
- 이전에 70% 에탄올에 청소 하는 위로 빠른 잘린 여 출생 후 5-7 일 오래 된 C57Bl/6N 마우스 새끼를 희생.
참고: 5-6 신생아 쥐 새끼에서 뇌성 외피가 각 준비를 위해 사용 되었다. 평균적으로, 한 쥐의 뇌 1-1.5 x 106 OLs 생성합니다. - 작은 해가 위로 중간 선 따라 두 피 피부를 잘라내어 노출 두개골을 철회.
- 뇌의 손상을 방지 하려면가 위 들고 정면 지역으로 두개골 뒤쪽 오프닝에서 시작 하는 중간에 따라 신중 하 게 두개골을 잘라. 그런 다음, 두개골의 기지에 따라 각 눈 소켓으로 잘라 두개골 뒤쪽 열기를 사용 하 여.
- 미세 집게를 사용 하 여 부드럽게 애타게 하는 midbrain 멀리 외피가 고 B27NBMA의 7 mL를 포함 하는 60 m m 조직 문화 접시에 그들을 전송. 해 부 외피가 풀링 각 두뇌에 대 한 2.2 2.4 통해 단계를 반복 합니다.
- 외피가 분리 버퍼의 5 mL를 포함 하는 새로운 60 m m 조직 문화 접시에 전송 (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain, 그리고 2500 U DNase I).
- #15 메스 블레이드를 사용 하 여 약 1 m m3 의 작은 조각으로 된 외피가 주사위 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에에서 20 분 동안 품 어.
- 소 성장 혈 청 효소 반응을 중지 하 (BGS)의 1 mL를 추가 합니다.
- 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브 외피가 분리 미디어 함께 전송.
- 부드럽게 천천히를 pipetting으로 뇌 조직의 분열을 시작 하 고 6-8 시간 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 아래로 거품을 최소화 하기 위해 관리 사용 하 여.
- 2-3 분 동안 정착 하 여 신선한 튜브는 상쾌한 전송 조직 덩어리를 허용 합니다.
- 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS/2500 U DNase I 조직에 작은.
- 5 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 위아래로 pipetting 동안 두뇌 조직 해리 번 6-8. 거품을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
- 2-3 분 동안 정착 조직 덩어리를 허용 합니다.
- 신선한 튜브는 상쾌한 전송. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS/DNase I 조직에 작은.
- 부드럽게 P1000 피펫으로 팁을 사용 하 여 미디어의 믹스를 pipetting 뇌 조직의 해리와 뇌 조직 위와 아래로. 반복 단계 2.13, 2.14 조직의 더 큰 덩어리 유지 될 때까지 또는 B27NBMA까지 10% 포함 된 BGS/DNase I는 소진, 둘 중 먼저 온다. 거품을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.
- 풀 세포 현 탁 액 이전 supernatants와.
- 50 mL 튜브에서 70 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 10 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 전달 풀링된 세포 현 탁 액 부드럽게 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해.
- 10%를 포함 하는 B27NBMA의 1 mL을 추가 하 여 셀 여과기를 세척 BGS/DNase I.
- 셀 스 트레이너를 삭제 합니다. 30-mL와 함께 B27NBMA 10%를 포함 하는 볼륨가지고 BGS/DNase I.
- 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 셀 서 스 펜 션 200 x g에서 10 분 원심
- 상쾌한 공기에 노출 하는 셀을 떠나지 않고 제거 합니다. 상쾌한 세포 파편으로 인해 흐린 될 것입니다. 10%를 포함 하는 B27NBMA의 3 mL를 추가 BGS 펠 릿을.
- 조심 스럽게 P1000 피펫으로 사용 하 여 셀 펠 릿 해리. 10%를 포함 하는 B27NBMA와 15 mL에 볼륨을가지고 BGS.
- 신선한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다.
- 10%를 포함 하는 B27NBMA의 1 mL을 추가 하 여 셀 여과기를 세척 BGS. 셀 스 트레이너를 삭제 합니다.
- 10%를 포함 하는 B27NBMA와 30 mL에 볼륨을가지고 BGS.
- 2 x 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 셀 서 스 펜 션 200 x g에서 10 분 원심
- 공기에 노출 하는 셀을 떠나지 않고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다. 얼음 차가운 자기 셀 정렬 (MCS) 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
3입니다. 세포 수 그리고 생존의 결정
- 100 µ L 세포 현 탁 액의 0.4% (w/v)에 1:5 희석을 달성 하기 위해 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 Trypan 블루 솔루션의 400 µ L로 희석.
- 커버 유리 hemocytometer 챔버 및 채우기 셀 희석 P10 피 펫을 사용 하 고 피하의 10 µ L로 두 챔버 연극 센터. 솔루션은 모 세관 작용에 의해 커버 유리 아래에 전달 합니다.
- 현미경 단계에는 hemocytometer를 놓고 40 X 확대를 사용 하 여 초점을 조정 합니다.
참고: 셀 카운트 5 사각형 (4 모서리와 한 센터)의 각각에서 휴대용 카운터를 사용 하 여 기록 됩니다. 비-가능한 셀만 염료를 흡수 하 고 블루, 라이브 하는 동안 표시 그리고 건강 한 세포 라운드 및 굴절 밀리 리터 당 실용적이 고 전체 셀의 수의 결심에 대 한 수 있도록 블루 색 염료를 흡수 하지 않습니다.
4. 절연 O4의+ Oligodendrocytes
- 셀 서 스 펜 션 10 분 200 x g에서 원심
- 신중 하 게 셀의 공기에 노출을 피하고 진공 포부를 사용 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 1 x 107 총 셀 안티-O4 구슬 1 x 107 셀 당 10 µ L의 추가 의해 따라 당 MCS 버퍼의 90 µ L에 펠 릿을 resuspend.
- 부드럽게 터치 손가락 15 mL 원뿔 튜브 4-5 배 하 여 세포 현 탁 액 및 비즈 믹스.
- 터치는 손가락으로 15 mL 원뿔 튜브 4-5 timesevery 4 ° C에서 15 분 동안 혼합 품 어 5 분.
- 부드럽게 튜브를 1 x 107 셀 당 MCS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 여 믹스를 씻어. 10 분 동안 200 x g에서 혼합 원심
- 상쾌한 신중 하 게 셀의 공기에 노출을 피하고 진공 포부를 사용 하 여 삭제 합니다. 모든 1 x 107 셀에 대 한 MCS 버퍼의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 마그네틱 구분 기호 자석 분리기 스탠드에 연결 합니다. 자석 분리기를 선택 열을 연결 하 고 열 위에 40 µ m 셀 여과기를 놓습니다. 두 개의 15 mL 또는 수집을 통해 흐름을 분리 열 아래 한 50 mL 원뿔 튜브를 배치 합니다.
- 미리 40 µ m 셀 스 트레이너 및 분리 열 MCS 버퍼의 3 mL을 헹 구 고 버퍼 없이 건조 시키는 열 통해 실행 하자.
- 셀 스 트레이너를 선택 열에 세포 현 탁 액 및 구슬의 믹스를 추가 합니다.
- MCS 버퍼의 1 mL와 함께 40 µ m 셀 여과기를 세척.
- 셀 스 트레이너를 삭제 하 고 셀, 구슬 및 버퍼 없이 건조 시키는 열을 통해 실행의 혼합.
- MCS 버퍼의 3 mL와 함께 3 번 분리 열 및 OL 확산 미디어와 1 시간 세척.
- 자석 분리기에서 분리 열을 제거 하 고 신속 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 배치 즉시 OL 확산 미디어의 5 mL을 추가.
- 열과 단단히 15 mL 원뿔 튜브로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시를 위에 플런저 장소.
- 세포 수 및 섹션 3에에서 표시 된 대로 Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 생존 능력 결정에 세포 현 탁 액의 100 µ L을 제거 합니다.
참고: 80% 이상의 세포 생존 능력의 OLs, 문화 계속 허용 것으로 간주 됩니다 하지만 가능성 90% 이상 최적입니다.
5. 격리 O4 도금+ Oligodendrocytes
- 밀도 (coverslip 당 5 x 105 셀)을 도금 하는 욕망에 세포 현 탁 액 희석 OL 확산 미디어를 사용 하 여.
참고: OL 시드 밀도 이므로 매우 중요 한 진행 하기 전에 조직 문화 현미경을 사용 하 여 적절 한 세포 밀도 확인 해야 합니다. 10, 000 셀/coverslips 아래 밀도 시드 가난한 세포 생존을 이어질 수 있습니다. 10, 000에 25000, OL에서 밀도 도금 형태학 차별화 느린45입니다. 우리는 세포 생존을 위해 적어도 50, 000 셀/coverslips의 시드 밀도에 OLs 플레이트. - 포함 하는 조직 문화 후드에 인큐베이터에서 laminin 코팅 coverslips 24-잘 접시를 이동 합니다.
- 각 coverslip에서 laminin를 제거 하 고 이런 서 스 펜 션의 100 µ L로 대체.
- 홍보는 coverslips에 OL 접착 45 분의 최대 37 °C/5% CO2 배양 기에서 OLs를 품 어.
- 부 화, 후 인큐베이터에서 24-잘 접시를 제거 합니다. 각 홍수 OL 확산 미디어의 500 µ L로 24-잘 접시의 잘.
- 추가 24 h에 대 한 37 °C/5% CO2 배양 기에 다시는 OLs를 놓습니다.
- OLs, 도금 후 24 h 확산 미디어를 제거 하 고 차별화를 유도 하기 위해 이런 차별화 미디어와 대체.
- 인큐베이터에는 OLs를 놓고 셀 고정을 위한 준비가 될 때까지 제거 하지 마십시오.
참고: ph에서 변화 OLs에 대 한 저해는 세포 생존 능력을 감소, 따라서 OLs 문화 인큐베이터에서의 불필요 한 제거는 피해 야 한다.
6. 면역 형광 염색
- 셀의 검출에 대 한 표면 마커 (NG2, o 1와 O4) 우물에서 미디어를 제거합니다.
- O 1 (undiluted)13 과 O4 (undiluted)13 에 대 한 1 차 항 체를 포함 하는 마우스 hybridoma supernatants의 250 µ L을 추가 하 고 NG2 상대로 polyclonal 토끼 (1:150 B27NBMA에 희석).
참고: 상용 안티-o 1와 안티-O4 항 체 사용할 수 있다면, 그것은 제조 업체에서 제안 하는 희석을 활용 하는 것이 좋습니다. - 37 °C/5% CO2 배양 기에서 최대 45 분에 대 한 1 차적인 항 체와 세포를 품 어.
- 트윈-20/1 X PBS 0.05%로 두 번 세척. 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 (4 %PFA) 실 온에서 10 분.
- 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
- 알 렉 사 488 활용 된 염소 반대로 마우스 IgM 또는 안티-토끼 IgG 이차 항 체 (1:400) B27NBMA에 희석.
- coverslips에서 0.05% 트윈-20/1 X PBS를 제거 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.
- 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
- 이중 내부 마커 (GFAP)의 검출에 대 한 얼룩, 0.05% 트윈-20/1 X PBS와 블록/permeabilize 셀 블록/permeabilization 버퍼 실 온에서 15 분을 제거 합니다. 그렇지 않으면 6.17 단계로 진행 합니다.
- 블록/permeabilization 버퍼를 제거 하 고 250 µ L 닭 안티-GFAP (1: 100) 블록/permeabilization 버퍼에 희석을 추가.
- 실 온에서 1 h에 대 한 안티-GFAP와 셀을 품 어. 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
- 알 렉 사 594 활용 된 염소 항 치킨 IgG 이차 항 체 (1:400) B27NBMA에 희석.
- coverslips에서 0.05% 트윈-20/1 X PBS를 제거 합니다. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체와 세포를 품 어.
- 트윈-20/1 X PBS 각 0.05 %5 분에 대 한 세 번 씻어.
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 counterstain 하 고 antifade DAPI 포함 된 미디어 설치 된 셀을 탑재.
- coverslips 하룻밤 실 온에서 어두운에서 치료 하자.
- Epifluorescence 현미경으로 얼룩진된 셀을 이미지.
참고:이 프로토콜에 셀은 몇 군데 균일 한 노출 시간을 사용 하 여 40 X 확대.
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Representative Results
이 연구의 목적은 O4에 대 한 향상 된 절연 방법을 확립 하는 것 이었다+ 대상 셀의 가능한 최소 조작 해야 하는 기본 마우스 oligodendrocytes. Coverslips 셀의 도금에 새끼의 안락사에서 전체 절차에 대 한 4 시간 걸립니다 그리고 여기에 표시 된 데이터 3 개의 독립적인 실험을 대표 한다. 조직 분리 후 4.3 ± 0.46 x 107 셀의 평균 각 독립적인 실험, 91% ± 5.6%의 생존 능력에 대 한 격리 했다. Immunomagnetic 절연 안티-O4를 사용 하 여 태그 자석 microbeads 후 평균 6.9 ± 0.38 x 106 의 OLs 가져온 (1-1.5 x 10 마우스 당6 )는 16.2% ± 1.6% 총 처음 해리; 생존은 96.3% ± 3.5%.
그림 2: Immunomagnetically 절연 OLs 익스프레스 미 숙 마커 1DIV에. (A) OLs 단계 대조 현미경 쇼 및 트라이-양극 형태에서. OLs NG2 익스프레스 (B), O4 (C), 및 o 1 (D). 아주 몇몇 이다 1DIV에 참석 했다 (C, 빨간색), 눈금 막대 = 50 µ m. 데이터 3 독립적인 실험에서 수집 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Immunomagnetically 절연 세포의 항 원 표현 형 검사, 면역 형광 염색 되었고 수행 24 h (1DIV) 72 h (3DIV) 셀 도금 후. 1DIV에 셀 등장 bi-또는 위상 대비 현미경 (그림 2A-B), 흡입 초기 단계 OLs (OPCs 또는 preoligodendrocytes) 확산의 기능 특성. 이러한 세포의 66.1 ± 8.4 %NG2 표시 (그림 2B), 고 셀의 58% ± 9.4 %O4 표시 (그림 2C) 했다. O 1 (GalC)-oligodendrocyte 혈통에 더 성숙한 세포의 표식 매우 보다 적게 일반적 되었다, (7.4% ± 6.0%, 그림 2D). 이 마커 프로 셀의 대부분이 시점에서 더 작은 비율 미 숙 또는 성숙한 oligos와 가능성이 일부 oligodendrocyte 조상 세포 (OPCs) 사전 oligodendrocytes는 건의 한다. 이다, GFAP 얼룩, 0.57 ± 1.0% (그림 2C)의 구성에 의해 입증 이 데이터 수정된 기법으로 고립 된 oligodendrocytes는 매우 정화 대부분 표식에 대 한 식 패턴을 보여 미 숙 oligodendrocytes의 전형적인 것이 좋습니다.
그림 3: 3DIV에서 성숙한 OLs 마커의 식. (A) OLs 단계 대조 현미경 쇼 더 복잡 한 형태에서. 3DIV, NG2의 표현에 (B) O4 동안 극적으로 감소 (C)와 o 1 (D) 증가. 몇 이다 3DIV에서 볼 수 있습니다 (C, 빨간색), 눈금 막대 = 50 µ m. 데이터 3 독립적인 실험에서 수집 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3DIV에서 oligodendrocyte 형태학 1DIV에 셀 보다 더 복잡 한 출연 (그림 3A). 이 시간 지점에서 긍정적인 초기 oligodendrocyte 마커 NG2 훨씬 낮은 1DIV에 비해 NG2 표시 된 셀은 셀의 주파수 구성 31.2 ± 17.1% (66.1 ± 8.4 %1DIV, t에 비해-p 테스트 < 0.0001, 그림 3B, 그림 4A). 여기서 분석 되지, 비록 NG2에 대 한 긍정적인 것으로 간주 하는 셀에 얼룩의 평균 강도 1DIV에 비해 3DIV에서 감소 되었다. O4-라벨, 있던 1DIV에 보다 더 높은 보였다는 대부분의 세포 (81.9% ± 4.884%, 그림 3C) (58% ± 9.4%, t-테스트 p < 0.0001, 그림 4B). 또한, 거의 절반 세포 (47.2% ± 16.4%, 그림 3D) o 1에 대 한 얼룩을 보여주었다 (GalC), 제안 하는 더 성숙한 표현 형에 셀 차별화는 더 성숙한 oligodendrocyte 혈통의 마커. O 1의 증가+ 3DIV에서 세포 또한 중요 했다 1DIV에 비해 (7.4% ± 6.0%, t-테스트 p < 0.0001, 그림 4C). 존재 이다가 매우 낮은 남아 포인트 (0.8% ± 1.5%, 그림 3C) 시간과 1DIV에 비해 크게 다른 했다 (0.57% ± 1.0%, 중요 하지 (ns), 그림 4D). 이러한 결과 시간이 지남에, 절연 immunomagnetically oligodendrocytes는 다른 종류의 세포 이다 등 아주 작은 오염 성숙의 단계 3으로 체 외에서 분화 할 수 나타냅니다.
그림 4: OL 마커 1DIV와 3DIV의 식의 정량화 (A-D). 1DIV, 셀의 66% 있었다 NG2+, 58 %O4 했다+, 7% o 1은+ 0.5 %GFAP+했다. 3DIV에 셀의 31 %NG2 했다+, 81 %O4 했다+, 47% o 1은+ 0.7% 했다 GFAP+. 평균 ± SD는 여기,에 제시 된 값 * * * p를 나타냅니다 < 0.0001, ns = 중요 한. 데이터 3 독립적인 실험에서 수집 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 통신에 우리는 높게 순화 된 미 숙 마우스 oligodendrocyte 문화의 효율적인 격리 하는 방법을 제시. 이전에 게시 프로토콜39,40에 비해,이 방법은 GFAP 양성 이다의 훨씬 더 낮은 수준 및 기타 비 특징 셀의 매우 낮은 비율 높은 순도 나왔고. 그것은 이들은 미 숙 OLs oligodendroglial 계보 이미 최선을 다하고 지적 하는 것이 중요입니다. 따라서,이 세포 분화의 초기 단계의 연구에 유용 하지 않을 것 이다.
Dincman 프로토콜40 에서 수정 중 하나 우리의 확산 미디어에서 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF) 제거 했다. 그것은 알려졌다 그 생체 외에서bFGF 강한 mitogenic 요소 역할 뿐만 아니라 차별화에서 OPCs를 억제 하지만 또한 프로세스46,47의 수를 감소. 게다가, bFGF oligodendrocyte dedifferentiation 및 oligodendroglial 계보 48의 passaged 세포에서 확산 증가합니다. 따라서, 그것은 그럴 듯 하 게 그 O4의 감소 번호+ 세포와 A2B5의 증가 숫자+ 및 NG2+ Dincman 연구40 에서 관찰 된 세포 문화에 bFGF의 효과 때문일 수도 있습니다.
O4 바인딩을 사용 하 여 셀을 격리 하기 위한 방법으로,에 불구 하 고 셀의 59%는 O4+ 1DIV에. 이러한 결과 질적으로 유사한 격리 O4 바인딩을 사용 하 여, 셀의 50% 경미하게 미만 이었다고 O4 발견 Dincman와 동료40 의+ 1DIV에. PDGF 포스트 mitotic 개발 지연 표시 되었습니다 정도 되돌리기 O4+GalC- A2B5에 창시자+O4 이후에 PDGF의 지속적인된 존재에도 차별화 하는- 사전 progenitor 같은 셀 49. 따라서, 그것은 첫 번째 날에서 체 외에서 증식의 과정에서 일부 미숙한 OLs O4에서 반전 발생할 가능성이+NG2+ O4을-NG2+, 최선을 다하고 아직도 남아 있는 동안 oligodendrocyte 혈통. 이 가설은 세포의 약 80% 절연 직후 O4 이었던 Dincman의 발견40 에 의해 지원 됩니다+.
3DIV에이 프로토콜 보다 다소 높은 OL 순도 생산39,40 다른 사람에 의해 설명 하지만 우리는 그들의 방법으로 머리 비교를 하지 않았다. Dincman 외 의 프로토콜에 비해 40, 우리의 문화에 GFAP 긍정적인 세포의 낮은 수 확산 미디어에 FGF의 부족 때문일 수 있었다. 문화 요리; 셀의 순차적 흐름에 의존 하는 머리와 Dugas 프로토콜39 이다 문화 요리50 에 쉽게 연결할 수 있습니다 그리고 수 수 월 셀의 각 연속 통과 후 immunopanning 프로토콜 중. 제시 방법 소개 하는 우리의 정화 분수에 오염 이다 위험 하지 않습니다.
우리의 수정된 방법은 빨리 복용 하도록 약 4 h 다른 2와 비교 됩니다. 우리는 불필요 한 단계 및 다른 프로토콜에 의해 통합 하는 시 약을 제거 하 여 이것을 달성. 예를 들어 우리 모두 신경 조직 분리에 대 한 키트의 사용과 쥐 반대로 마우스 IgM 구슬과 죽은 세포를 제거 하는 OL 셀 서 스 펜 션의 부 화는 생략 Dincman 프로토콜40, 5-6 시간 소요에 비해. 대신, 우리는 papain와 죽은 세포 외피가 낮은 속도 centrifugations (200 x g)를 수행 하 여 제거 된 쥐의 뇌의 분리를 수행 합니다.
Immunopanning 선택의 제거 및 O2/CO2 직통 미리 조직 중 Papain 버퍼를 equilibrate 하는 데 사용에 대 한 요구의 제거는에 머리 프로토콜39, 약 9 h는에서 중요 수정이 했다 소화입니다. 대신, CO2 배양 기에서 immunomagnetic 선택 하 고 마우스 뇌 외피가 Papain 버퍼의 혼합의 직접 화를 사용 우리.
직접이 연구에서 테스트, 안티-O4 microbeads 또한 쥐, 인간과 유전자 변형 마우스 뇌 조직에서에서 OLs를 분리 사용할 수 있습니다. 이 연구 실험실 마우스 자사에서 OLs 작업에 관심된을 혜택을 가능성으로 OLs 격리에 대 한 여러 조직 소스를 사용 하는 기술의 다양성을 강조 한다.
결론적으로,이 연구에서 설명 하는 수정 된 OPC 격리 방법을 myelination demyelinating 질병의 연구에 적용할 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes를 신속 하 고 구체적인 대안을 제공 합니다.
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Disclosures
저자 아무 공개 있다.
Acknowledgments
이 연구는 국가 다 발성 경화 증 사회 (RG4591A1/2)와 건강의 국가 학회 (R03NS06740402)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 실험실 공간, 장비 및 조언을 제공 하기 위한 박사 이반 에르난데스와 그의 연구실 회원을 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 10ml syringe Luer-Loc tip | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
| 15ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353935 | |
| 40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22368547 | |
| 50ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 5ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 60mm tissue culture plates | Falcon | 353002 | |
| 70µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A21042 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11042 | |
| Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
| Apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
| Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Boric acid | Sigma | B7660 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30541.03 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| CNTF | Peprotech | 450-50 | |
| d-Biotin | Sigma | B4639 | |
| Desoxyribonuclease I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
| Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera | Olympus | Bx51 | |
| Feather disposable scalpels | Andwin Scientific | EF7281C | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | NeuVitro | GG-12-oz | |
| GFAP antibody | Aves | GFAP | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | |
| Magnetic separator stand - MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Magnetic separator-MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex PES 0.22µm filter unit | Millipore | SLG033RS | |
| Mounting media- Prolong Gold with DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
| N-acetyl-cysteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Neurotrophin-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
| NG2 antibody | Millipore | AB5320 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | D5652 | |
| PDGF | Peprotech | 100-13A | |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Selection column-LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S5261 | |
| Trace elements B | Corning | 25-000-CI | |
| Triiodothyronine (T3) | Sigma | T6397 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Corning | 25-900-CI | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| B27NBMA | 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use. | ||
| B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum | ||
| CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) | Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C. |
||
| d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) | Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C. | ||
| DNase I stock solution | 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C. |
||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) | Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C. | ||
| Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) | Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C. | ||
| Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma | 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C. |
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| Insulin stock solution (4000 µg/ml) | Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C. | ||
| Laminin solution | Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months. | ||
| Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer | Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use | ||
| N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) | Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C. | ||
| NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
||
| PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
||
| Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) | Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water. | ||
| Oligodendrocyte proliferation media | see Supplementary Table 1 | ||
| Oligodendrocyte differentiation media | see Supplementary Table 1 | ||
| Sato supplement (100X) | see Supplementary Table 1 | ||
| References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |
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