Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتصور الإسقاط الحركية وأربوريزيشن إكسون في الأجنة الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا. بعد إيمونوستينينج للخلايا العصبية الحركية، استخدمنا الورقة الضوء الفلورية مجهرية للأجنة صورة للتحليل الكمي اللاحقة. ينطبق هذا البروتوكول على الأخرى عمليات الملاحة العصبية في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
توسيع العمود الفقري من الخلايا العصبية الحركية (MNs) على محاور عصبية التواصل مع أهدافها إينيرفاتينج، وبالتالي السيطرة على الحركة والمهام المعقدة في الفقاريات. وبالتالي، من المهم للكشف عن الآليات الجزيئية لكيف تستهدف السيارات انتقل إلى محاور عصبية وأربوريزي ويعصب العضلات المحيطة بهم خلال التنمية، وانحطاط. على الرغم من أن خطوط الماوس Hb9::GFP المعدلة وراثيا منذ فترة طويلة أدت إلى تصور مسارات إكسون السيارات أثناء التطور الجنيني، وصفاً تفصيليا من الطيف الكامل من أربوريزاتيون الطرفية إكسون تظل ناقصة بسبب تعقد نمط و القيود المفروضة على المجهر الضوئي الحالي. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا محسنة التي تجمع بين الورقة الضوء الفلورية مجهرية () وتحليل صورة قوية كما وكيفا تصور وضع محاور عصبية المحرك. ويمكن اعتماد هذا النظام بسهولة عبر طفرات وراثية أو نماذج المرض مينيسوتا مع خطوط Hb9::GFP ، الكشف عن الآليات الجزيئية الرواية التي تؤدي إلى عيوب في موتور إكسون الملاحة وأربوريزيشن.
Introduction
MNs العمود الفقري هي الجزء من الجهاز العصبي المركزي ولكن يعصب العضلات الطرفية للتحكم في الحركة. في الحبل الشوكي النامي، تقام المتكفل مينيسوتا (بمنس) وفقا للإشارات المنبثقة عن notochord وسميتس المتاخمة. كل ما يميز MNs الانقسامية بعد ثم يتم إنشاؤها من بمنس، مما أدى في نهاية المطاف إلى سلسلة من المخططات MN على طول محور روستروكودال في الحبل الشوكي1،2. MNs العمود الفقري منظمون طبوغرافيا وتشريحيا جيدا. ترتيب الخصائص المورفولوجية يرتبط بوضع هدف كل منهما في هامش3. عند الوصول إلى أهدافهم العضلات، تلقي محاور عصبية نيوروتروفيك الخلوية والخارجية من العوامل التي حملها على تمديد وفرع آخر في العضلات. تعصيب وعيوب التفريع قد تسهم في عدم تشكيل الوصلات العصبية العضلية (NMJ). على سبيل المثال، عوامل نيوروتروفيك المستمدة من الدبقية (جدنف)-Pea3 المتعمد لا غنى عنه لمحور عصبي أربوريزيشن إلى مكسيموس الجلدية (سم) والعضلات latissimus dorsi (LD)4،5. وبالإضافة إلى ذلك، تظهر الأجنة الماوس بالضربة القاضية داين أربوريزيشن المعيبة للأعصاب فرنك في الحجاب الحاجز، مما تسبب في فشل الجهاز التنفسي ووفيات فورا بعد الولادة6،7. ولذلك، هذه الخطوة الأخيرة من النضوج مينيسوتا (أي، الإسقاط محواري والتفريع) أمر حاسم لضمان الاتصال بين الخلايا العصبية والخلايا المستهدفة.
لعرض أنماط أربوريزيشن، الباحثون عادة إجراء تصوير [كنفوكل] أو مجهرية fluorescence اثنين-فوتون الضوء من عينات مقسمة أو الجامعة-جبل8،،من910. كل من هذه التقنيات مجهرية تولد اختراق القرار وعمق مقبولة. الأسفار اثنين-فوتون الخفيفة الميكروسكوب ينطوي على إثارة فلوروفوريس بامتصاص المتزامنة اثنين الطاقة المنخفضة الفوتونات11. منذ يومين-فوتون الإثارة يستخدم الإشعاع بالقرب من الأشعة تحت الحمراء، يسهم الإثارة انخفاض وتيرة انخفاض نثر واختراق الأنسجة أفضل ما يصل إلى 1 مم في الأنسجة، مما يتيح التصوير بعمق أكبر. يزيل مجهرية [كنفوكل] عن طريق المرشحات الخارج التركيز إشارات ويجمع الضوء داخل المستوى البؤري12فقط. مع هذا النهج، يمكن الجمع بين الصور عينات من طائرات تنسيق مختلفة لإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد (3D) عن طريق دالة Z-مكدس. ومع ذلك، يتم تقليل كثافة إشارة كما يتم حظر معظم الضوء ويحجب فتحات عددية عالية في العمق من الميدان. الأهم من ذلك، كلا التقنيات المساهمة د شديدة ولالضيائيه نظراً للعينة كلها يتلقى إنارة حتى عندما يتم تصويرها سوى طائرة واحدة في وقت معين.
للالتفاف حول أوجه القصور هذه، أصبح لسفم بديلاً مفضلا، مع مزايا سريعة وفعالة الضوء، وأقل سمي ضيائي13،14. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح لسفم تصوير عرض متعددة. هذا النهج مناسبة خاصة لتصور محاور عصبية المحرك وهذه المحطات تفريق كما أنها تنتشر عبر الفضاء ثلاثي الأبعاد. لسفم يتفوق الخيارين الآخرين لأن عينات تقام على خشبة المسرح الذي يسمح دوران حول محور عمودي والتحركات على طول محاور x و y، و z. لا يسمح هذا الإعداد لطريقة عرض الحد الأدنى محظورة من العينة ولكن أيضا اختيار مسار الإضاءة مستصوبا، عيب من الفحص المجهري اثنين-فوتون و [كنفوكل]، كلاهما يتطلب تركيب العينات على شريحة مسطحة. ولذلك، لسفم هو الأداة الأكثر ملاءمة لتصوير ثلاثي الأبعاد من أربوريزيشن إكسون والتحديد الكمي للمحطات الطرفية الأعصاب الحركية في الأجنة الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأبقى جميع الحيوانات الحية في ممرض محددة مجاناً (منتدى جنوب المحيط الهادئ) حيوانية منشأة، وافقت ويشرف على IACUC سينيكا.
1-التثبيت
- جمع الأجنة اليوم الجنينية 12.5 (E12.5) ثم قطع رأس وافيسسيراتي لهم.
- إصلاح الأجنة منفردة في لوحات 24-جيدا مع 1 مل/جيدا من الطازجة بارافورمالدهيد 4% في 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) بين عشية وضحاها. تبني في 4 درجات مئوية على شاكر.
- تغسل الأجنة ثابتة على الأقل 3 x، كل منهما لمدة 5-10 دقيقة، مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر لإزالة بارافورمالدهيد المتبقية.
2-كل-جبل إيمونوستينينج
- بيرميبيليزي كل الأجنة في 1 مل من 0.5% برنامج تلفزيوني-تريتون-X-100 (ببست) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
- كتلة كل عينة مع 1 مل 10% FBS أعدت في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
- احتضان الجنين مع 1 مل جسم الأساسي مكافحة-التجارة والنقل (1:1، 000 تمييع في 10% FBS) في 4 درجات مئوية عن 72 ساعة مع الهز المستمر تكثيف الإشارات بروتينات فلورية خضراء من الأعصاب الحركية.
- بعد الاحتضان جسم الأولية، يغسل مع 1 مل من 0.5% ببست على مدى الأيام 1-2 في 4 درجات مئوية على شاكر، تغيير 0.5% ببست ثلاث مرات على الأقل.
- تطبيق 1 مل جسم الثانوي (1:1، 000 تمييع في 10% FBS) واحتضان بين عشية وضحاها في الظلام في 4 درجات مئوية مع الرج المستمر.
- أغسل x 3 مع 1 مل من 0.5% ببست في 4 درجات مئوية على شاكر على مدى 2-3 أيام. الاحتفاظ بعينات في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية حتى قبل التصوير بيوم واحد.
ملاحظة: يمكن تشريح الأجنة إلى مقاطع أصغر قبل التخليص، اعتماداً على أي جزء من الأجنة سوف تصويرها. يتم الحفاظ على الأمامية في هذا النهج التجريبي (الشكل 1A). - احتضان الجنين في كاشف تبادل تجاري مع الانكسار nD 1.49 في أنبوب 1.5 مل، محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها، تجعل الجنين شفافة للتصوير.
ملاحظة: حجم الكاشف المقاصة حوالي خمسة إضعاف حجم العينة.
3-(2 – 3 ح)
-
إنشاء نموذج
- إعداد 5 X/0.1 البصريات الإضاءة و 5 ×/0.16 البصريات الكشف. تجميع حامل عينة وعينه الشعرية (1.5 ملم قطر داخلي، الأخضر) ووضعها في المجهر.
ملاحظة: تشير إلى "دليل التشغيل" للمجهر لإجراءات الإعداد التفصيلية. - جبل الجنين على النحو التالي:
- إعداد طرف ماصة P200 بقطع بعيداً من الجزء العلوي حيث يناسب قطر الشعرية وإزالة الجزء أشار (~ 3 مم) للمرفق عينة.
- تذوب يتثلم نهاية طرف ماصة باستخدام لهب صغيرة.
- إطفاء الشعلة وإرفاق الجنين عمودياً على نهاية ذاب بسرعة.
- تناسب الجزء العلوي من طرف الماصة مع العينة الشعرية.
- تسمح الدائرة العازلة لحجته بالجنين لمدة 1 دقيقة لمسح قبالة الحطام أو فقاعات.
- باستخدام برامج التصوير، حدد مكان الشعرية تحت علامة التبويب تحديد وضبط x، y، المحاور z موقف شعري عينة.
- حدد نموذج تحديد وتكبير/تصغير إلى 0.6 X للتركيز على الجنين. تدوير الجنين إلى تأكد من محاذاة المحور الطويل من أطرافهم المصورة مع مسار الضوء من مصادر الضوء هما (الشكل 1B).
- إعداد 5 X/0.1 البصريات الإضاءة و 5 ×/0.16 البصريات الكشف. تجميع حامل عينة وعينه الشعرية (1.5 ملم قطر داخلي، الأخضر) ووضعها في المجهر.
-
الحصول على الصور
- تحت علامة التبويب اقتناء ، تحديد معالم مسار الضوء مثل الكشف عن الأهداف، والليزر حظر عامل التصفية وشعاع الخائن والكاميرات وأشعة الليزر.
ملاحظة: يتم استخدام القناة بروتينات فلورية خضراء في هذه التجربة (الطول الموجي الإثارة: 488 نانومتر؛ وتصفية الانبعاثات: BP 505 إلى 545 نانومتر، شعاع الفاصل: الصحة والصحة النباتية LP 560). - تحقق من خانة الاختيار مسح محوري للحد من الظل.
- تعريف الإعدادات اقتناء: بت عمق، 16 بت؛ تكبير/تصغير، 0.36-0.7 X؛ إضاءة أحادية الجانب (يمين/يسار) أو إضاءة الجانب المزدوج.
- انقر فوق مستمر وتعيين كثافة الليزر وزمن التعرض للضوء وطاقة الليزر والضوء ورقة موقف الحصول على صور أكثر وضوحاً.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ قوة الليزر منخفضة قدر الإمكان للتقليل من د. - اضغط إيقاف لوضع حد للحصول على الصور.
- تحت علامة التبويب اقتناء ، تحديد معالم مسار الضوء مثل الكشف عن الأهداف، والليزر حظر عامل التصفية وشعاع الخائن والكاميرات وأشعة الليزر.
-
شراء متعددة الأبعاد
- تعريف z-المكدس بتحريك الموقف Z للصورة الأولى والأخيرة. انقر فوق الأمثل لتعيين رقم الشريحة.
- انقر فوق بدء التجربة اكتساب z-المكدس المحدد.
- عندما يتم ذلك، حفظ الصورة في تنسيق.czi.
-
معالجة الصور (اختياري)
- المضي قدما في الجانب المزدوج الانصهار تحت القناة تجهيز لايتشيت إذا تم تطبيق إضاءة الجانب المزدوج. تجهيز multiview ضروري إذا كان يتم الحصول على وجهات نظر متعددة دمج الصور من زوايا متعددة.
- قم بإنشاء صورة ثنائية الأبعاد باستخدام بيانات من أعلى كثافة بكسل على طول المحور الإسقاط تحت قناة الأقصى كثافة الإسقاط .
- تحت القناة نسخة ، انقر فوق مجموعة فرعية لتحديد مجموعات فرعية صور من المجموعة الأصلية.
4-تحديد مقدار إكسون أربوريزيشن (30 دقيقة لكل الأعصاب الفردية)
- افتح ملف الصورة في برامج تحليل التصوير (بشكل افتراضي، يحتوي على بيانات XYZ فتح الصورة في وضع تفوق كطريقة عرض 3D-المقدمة).
- ضبط لون الصورة، السطوع، والتباين باستخدام نافذة ضبط العرض (تحرير | إظهار عرض التعديل) للكشف عن خيوط استناداً إلى تباين كثافة المحلية.
- انقر على أيقونة إضافة خيوط جديدة وتحديد خوارزمية أوتوباث (لا حلقة) في القائمة المنسدلة.
- حدد منطقة الاهتمام (في هذه الحالة، إكسون segmenting الاهتمام). انقر فوق التالي عند الانتهاء.
- تحديد نقطة البداية والبذور عن طريق تعيين قياسات قطرها أكبر وأنحف، التي يمكن أن تقاس باستخدام وضع شريحة .
- تعيين نقطة بداية على الحافة المنطقة من الفائدة. ولتحقيق يدوياً إضافة أو إزالة نقاط انطلاق، قم أولاً بتغيير وضع المؤشر (انتقل | حدد) وثم Shift + انقر بالزر الأيمن على النقاط المثيرة للاهتمام.
- تحديد عتبات اليدوي للنقاط البذور لضمان أن يتم وضع علامة كل من أربوريزيشن مرئية. تغيير وضع المؤشر (انتقل | حدد) وثم Shift + الأيسر في نقاط الاهتمام لإضافة أو إزالة نقاط البذور يدوياً.
ملاحظة: من المهم أن يدوياً إزالة ضجيج الخلفية والإشارات من الأعصاب المجاورة. - حدد المربع إزالة نقاط البذور حول نقطة انطلاق.
- تحقق من إزالة قطع شرائح للسماح باستبعاد نقاط التي بعيدة جداً، والتي قد تمثل الضوضاء الخلفية. الإشارة إلى الحد الأقصى لطول الفجوة في الخطوة التالية لتحديد الحد الأعلى للاستبعاد.
- ضبط الحد الأدنى للطرح الخلفية، الذي يستخدم عامل تصفية ضبابي لتقدير كثافة الخلفية لكل فوكسل.
- تعيين العتبة التلقائي للقطر تغصن باستخدام خوارزمية منطقة المقطع العرضي التقريبي .
- تخطي الخطوتين لحساب العمود الفقري.
- الانتهاء من العملية واختيار اللون والنمط المطلوب.
- قم بإلغاء تحديد مربع المجلد في خصائص لعرض فقط محاور عصبية أعيد بناؤها.
- ضمن علامة التبويب الإحصائيات ، حدد مفصلة. استخدم خيوط لا النقاط الطرفية تغصن لتحديد المحطات الطرفية الأعصاب الحركية كمؤشر أربوريزيشن موتور إكسون.
ملاحظة: يمكن إضافة تعليق توضيحي الإحصائية إذا رغبت في ذلك. - تصدير صورة إكسون أعيد بناؤها كملف tif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لسفم يوفر التصور 3D مفصلة من مينيسوتا أربوريزاتيون المسار ومحور عصبي في الماوس الأجنة. تحت حقل مشرقة، تظهر الأنسجة شفافة تماما بعد يجري منغمسين في الكاشف المقاصة التجارية. لاحظت لا انكماش أو تورم في العينة بعد تصل إلى أسبوع واحد للتخزين في مسح كاشف قبل التصوير. تحت قناة الأسفار، تتم تسمية الخلايا العصبية الحركية مع ترانسجينيكالي أعرب عن التجارة والنقل (فيلم 1). في بعض الحالات، تفاصيل الهيكل إكسون تتعرض للخطر. على سبيل المثال، يمثل الرقم 2 تصوير منخفضة الجودة. وهناك عدة عوامل يمكن أن تعوق نوعية التصوير. أولاً، يمكن أن يؤدي permeabilization غير كافية والغسيل الخطوات إلى إشارة خلفية عالية. وثانيا، سيؤدي إلى تشتت الضوء من خلال الأنسجة المطهرة غير كاف في عدم وضوح الصور. وأخيراً، قد عينة دون المستوى الأمثل لتحديد المواقع أثناء الحصول على الصور زيادة تشتت الضوء أو عرقلة مسار الضوء.
إلى صورة إكسون أربوريزيشن بمزيد من التفصيل، والقيام بالتحديد الكمي، يمكن ضبط التكبير حتى تكون كل بنية أربوريزيد ناعما كشفت (2 الفيلم). وينبغي مقارنة الصور الإضاءة جانبي مفرد ومزدوج لتحديد القرار الأمثل لنمط أربوريزيشن (الشكل 3). يمكن استخدام برامج تحليل الصور ثم إعادة بناء أنماط أربوريزيشن إكسون للأعصاب فوريليمب الفردية (الشكل 4). بتحديد نقطة البداية والقطر للكشف عن نقطة البذور، يمكن شبه تلقائياً الكشف عن هذه الهياكل أربوريزيد وحسابها في حين تتم إزالة الإشارات الخلفية يدوياً. قمنا باستخدام رقم – خيوط " وضع الدالة تغصن Pts المحطة الطرفية "لحساب محطات الأعصاب الحركية الإجمالية للأعصاب الفردية كمؤشر أربوريزيشن إكسون موتور. بالإضافة إلى ذلك، طول الفرع والقطر متوسط الحجم يمكن حساب استخدام "خيوط – تغصن طول"، "خيوط – تغصن يعني القطر" و "خيوط – تغصن حجم"، على التوالي.
رقم 1: التوضيح الرسومية لإنشاء عينة- (أ) أثناء إعداد عينة، الأجنة هي أول مقطوعة الرأس وينتزع. يتم تشريح الأمامية على طول خط متقطع. (ب) في قاعة العينة، يتم وضع عينات للحفاظ على المنطقة بأسرها للفائدة على طول مسار الضوء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 1: الضوء ورقة fluorescence مجهرية من مجال رؤية كبير في النصف العلوي من الجنين وراثيا الماوس E12.5 (Hb9::GFP)- الفيلم يبين بوضوح الأعصاب الحركية توقع من النخاع الشوكي لأهدافها إينيرفاتينج. وتكتسب الصورة ثلاثية الأبعاد أولاً تحت 0.3 X التكبير مع وقت التعرض للإضاءة و 30 مللي ثانية أحادية الجانب، وبعد ذلك يجري تجهيز الفيديو باستخدام برمجيات تحليل الصورة. مقياس يمثل الشريط 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الشكل 2: مثال لصورة ذات جودة منخفضة مع الإشارات الخلفية المرتفعة والمناطق غير واضحة (الأسهم الزرقاء)- الخطوات غير لائق أثناء اقتناء صورة وإعداد نموذج قد يؤدي إلى جودة الصورة البصر للخطر دقة أي الكمي اللاحقة لمحور عصبي أربوريزاتيون. يمثل شريط المقياس في الصورة 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 2: تصور فوريليمب E12.5 الأعصاب تحت 488 نانومتر الإثارة مع إضاءة الجانب المزدوج في بير 0.6 عاشرا- يسمح الفيلم التكبير في التصور واضحا وبانورامية لكل الهياكل أربوريزيد غرامة على الأعصاب الفردية. مقياس يمثل الشريط 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
رقم 3: مقارنة بين المفرد والمزدوج الجانب الإضاءة. اضاءات اليمين واليسار على حد سواء عرض التفاصيل من مناطق معينة فقط (الأسهم الحمراء)، بينما صورة مجتمعة من اضاءات الجانب المزدوج يوفر طريقة عرض أكثر اكتمالا من نمط أربوريزيشن. ومع ذلك، يمكن تحقيق إضاءة أحادية الجانب في أقصر وقت تصوير، وأحيانا مع أفضل جودة الصورة. وهذا يرجع إلى أن مسارات الإضاءة من كلا الجانبين قد لا تكمن تماما على متن طائرة واحدة، أدى إلى طمس خلال اضاءات الجانب المزدوج. يتم عرض الصور كأقصى شدتها الإسقاط. يمثل الشريط مقياس 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: أعيد بناؤها أربوريزيشن إكسون للأعصاب فوريليمب الفردية، ومرمزة كما يلي: سوبراسكابولار (أحمر)، الابطية (الوردي)، شعاعي (أزرق)، الجلدية عضدي الخلفي (أرجواني). وحسبت تعقيد أربوريزيشن وفقا لعدد اندبوينتس المحطة الطرفية التي تم الكشف عن استخدام أسلوب شبه الآلي لدينا. خوارزمية أوتوباث (لا حلقة) يتتبع خيوط والكشف عن البذور نقطة من نقاط انطلاق المعرفة من قبل المستخدم. يمثل الشريط مقياس في كل الصور 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عدة خطوات في البروتوكول قد تتعرض لتغيرات في ظروف معينة. على سبيل المثال، مدة التثبيت يعتمد على سن الأجنة، تتراوح بين ح 2 أيام 1 أو أكثر باستخدام بارافورمالدهيد الطازجة. منذ التثبيت تتم قبل كله جبل إيمونوستينينج، للأجسام المضادة التي تكون حساسة للبروتين كروسلينكينج، يمكن استخدام الميثانول كعامل مثبت بديلة. لارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند التلوين، من الضروري تحسين تركيز المنظفات (بين 0.1 0.5%). خطوات الغسيل إضافية قبل وبعد حضانة جسم يمكن أيضا زيادة نسبة الإشارة إلى الضجيج. وباﻹضافة إلى ذلك، المهم خطوة إزالة الأنسجة التأكد من أن المسار الخفيفة ممنوعة في جميع أنحاء الإسقاطات محواري عميقة. لتعزيز الشفافية الأنسجة، من المهم لضمان إدخال الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني أثناء حضانة في عامل تبادل تجاري، كما ينعكس أثر المقاصة بإعادة غمر العينات في المخزن المؤقت للحلول. خلاف ذلك، ينصح كاشف مقاصة مع مؤشر الانكسار أعلى أو أطول فترة مقاصة. ومن ناحية أخرى، تختلف المعلمات أثناء الحصول على الصور بين العينات المختلفة. المزدوج الجانب الإضاءة والتصوير multiview قد تسمح التصوير بعمق أكبر من الميدان والتفاصيل المحسنة. بيد حيث يكتسب الإضاءة من زوايا مختلفة في وقت واحد، أكثر كفاءة لأصغر عينات أو نماذج تتحرك الإضاءة أحادية الجانب. صورة ذات نوعية جيدة يضمن دقة للتحليلات الكمية التالية.
واستخدمت الدراسات السابقة، بما فيها مجموعتنا، أما تصوير [كنفوكل] أو اثنين-فوتون الفحص المجهري مراقبة الملاحة إكسون موتور نمط العملية أو أربوريزيشن في Hb9::GFP الأجنة10،15، 16 , 17-استناداً إلى تجربتنا، نحن نعتقد متفوقة على هذه الأساليب الأخرى اثنين منذ: 1) التصوير وقت ينخفض إلى حد كبير كما لسفم يوفر أكثر سرعة وأعلى جودة التصوير، بينما تقليل د والضيائيه لعينات. هي مضيئة عينات من الجانب مع ورقة رقيقة خفيفة، مما خلق باب بصرية الأصيلة14،18،19. مركز الورقة الخفيفة يتطابق مع المستوى البؤري لنظام الكشف، ومتعامد على محور الإضاءة. ونتيجة لذلك، يتم تقليل الضوء خارج نطاق التركيز وهي مضيئة fluorophores فقط ضمن المستوى البؤري لكل صورة، أي، بدلاً من كامل العينة، وبالتالي تقليل فوتوبليتشينج20. 2) تفاصيل عن نمط أربوريزيشن بكثير أفضل مصورة كما يسمح لسفم تصوير multiview. بدلاً من العينة التي شنت على شريحة، هو يعلق في مثل هذه طريقة أن دوران حول محور عمودي من الممكن، كما حركات على طول x و y، و z الأبعاد. هذه الصور من طائرات مختلفة ووجهات النظر مكدسة على إنتاج مزيد من الصور 3D الخواص. ومع ذلك، قد لسفم أيضا قيداً مقارنة بالنهج [كنفوكل] واثنان-فوتون من حيث حجم الملف الضخمة التي تم إنشاؤها لكل صورة. إيجابيات وسلبيات هذه بحاجة إلى أن وزنه عند البت في أسلوب التصوير المراد استخدامه، ولكن في نهاية المطاف سيتوقف الاختيار على الأجهزة/البرامج المجهرية التي تتوفر عند الطلب.
وباختصار، يجمع هذا البروتوكول كل-جبل إيمونوستينينج، الدولة للفنون الضوء على ورقة تصوير ثلاثي الأبعاد، جنبا إلى جنب مع التقدير الكمي في برمجيات تحليل الصورة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول لا يقدم نموذجا جديداً لتصور الملاحة إكسون السيارات والمسارات في الأجنة مع كوانتيتيشن إكسون أربوريزيشن التعقيد فحسب بل يمكن أيضا تطبيقها على النظم العصبية الأخرى (أي، الخلايا العصبية الحسية) مع الفئران المعدلة وراثيا ملائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
لسفم التجارب وتحليل البيانات أجريت باستخدام المجاهر الضوئية المتقدمة من "شعبة الخدمة صك" جزئيا في سينيكا، وبالمساعدة من السيدة شين شو-تشن. ونشكر السيدة سو بينغ لي من "التصوير الأساسية مرفق للمكتب البحري الدولي" لقدر كبير من المساعدة التقنية مع تحليل الصورة إيماريس. واستعرض "العلمية الإنجليزية الأساسية" للمكتب البحري الدولي تحرير المخطوطة. وتمول هذا العمل الوظيفي التابع سينيكا الأوساط الأكاديمية جائزة التنمية (الحزب الديمقراطي المسيحي-107-L05)، وآخر (104-2311-B-001-030-MY3)، والمؤسسات الوطنية (المؤسسات الوطنية-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
