Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57546
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1,2
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

Abstract

בעמוד השדרה מוטורי לגלוקוז (MNs) להרחיב את האקסונים שלהם לתקשר עם המטרות innervating שלהם, ובכך שליטה התנועה ועל משימות מורכבות גולגולת. לפיכך, חיוני לחשוף את המנגנונים המולקולריים של איך מנוע אקסונים לנווט, arborize ו innervate השרירים ההיקפיים שלהם מטרות במהלך התפתחות והתנוונות. למרות הטרנסגניים קווים העכבר Hb9::GFP שירתו זמן לדמיין מסלולים מוטוריים האקסון במהלך התפתחות עובריים, תיאורים מפורטים של הקשת של האקסון arborization מסוף להישאר שלם בשל המורכבות דפוס ו מגבלות של מיקרוסקופ אופטי הנוכחי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול משופרת המשלבת אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופ (LSFM) וניתוח תמונות איכותית, באופן כמותי להמחיש פיתוח אקסונים מוטוריים. מערכת זו יכולים לאמץ בקלות לעבור מוטציות גנטיות או MN מודלים מחלה עם קווים Hb9::GFP , חשיפת המנגנונים המולקולריים הרומן להוביל לפגמים האקסון מנוע ניווט ו- arborization.

Introduction

MNs בעמוד השדרה הם החלק של מערכת העצבים המרכזית אך innervate השרירים ההיקפיים בקרת תנועה. בחוט השדרה המתפתח, MN אבות (pMNs) נקבעו על פי האותות שמקורם מיתר הגב של somites הסמוך. כל הבדיל MNs mitotic שלאחר מכן מופקים מן pMNs, בסופו של דבר והוליד סדרה של MN יחוברו לאורך ציר rostrocaudal של חוט השדרה1,2. MNs בעמוד השדרה מאורגנים טופוגרפית, גם מבחינה אנטומית. הסידור שלהם מורפולוגי בקורלציה עם המיקום החדש של יעד בהתאמה שלהם של הפריפריה3. כשמגיעים ממטרותיהם שריר, אקסונים לקבל גורמים neurotrophic הסלולר ואת אקסוגני לגרום להם להרחיב, סניף נוסף לתוך השרירים. העצבוב של פגמים מסעף עשוי לתרום הכשל כדי ליצור צמתי neuromuscular (NMJ). לדוגמה, גליה, נגזר neurotrophic גורמים (GDNF)-Pea3 המושרה היא הכרחית עבור אקסון arborization אל תוך עורית מקסימוס (ס מ), שרירי הגב הרחיב (LD)4,5. בנוסף, דיין נוקאאוט העכבר עוברי מראים arborization פגומים של עצבים הסרעפת הסרעפת, גורם לכשל נשימתי ותמותה מיד לאחר הלידה6,7. לכן, זה הצעד האחרון של התבגרות MN (קרי, הקרנה עצב ומסעף) היא קריטית כדי להבטיח תקשורת בין נוירונים ותאי המטרה.

כדי להציג דפוסים arborization, חוקרים התנהגות בדרך כלל קונאפוקלית לדימות או מיקרוסקופ אור שני הפוטונים זריחה של דגימות משרטוטי או כולה-הר8,9,10. שתי טכניקות מיקרוסקופית אלו יוצרות מקובל הרזולוציה ועומק חדירה. מיקרוסקופ אור שני הפוטונים פלורסצנטיות כרוך עירור של fluorophores על ידי סימולטני קליטת פוטונים נמוכה יותר של אנרגיה שני11. מאז שני הפוטונים עירור משתמשת קרינה אינפרא אדום, התדר ירד עירור תורמת פיזור מופחתת, חדירה יותר רקמות עד 1 מ מ בתוך הרקמה, ובכך מאפשר הדמיה עם עומק גדול. מיקרוסקופיה קונפוקלית מסירה על-ידי מסנני out-of-להתמקד מאותת ולא רק אוסף אור בתוך מטוס מוקד12. עם גישה זו, ניתן לשלב תמונות של דגימות מטוסים מוקד שונים כדי לייצר תמונת תלת מימד (3D) באמצעות פונקציה Z-מחסנית. עם זאת, עוצמת האות פוחת כמו רוב האור נחסם ולאחר פתחים מספרית גבוהה מטשטשים את העומק השדה. חשוב מכך, בשתי הטכניקות לתרום נזקי חמור ואת phototoxicity מאז הדגימה כל מקבל תאורה גם כאשר המטוס היחיד הוא עם תמונה בזמן נתון.

כדי לעקוף חסרונות אלה, LSFM הפך חלופה המועדף, עם היתרונות של להיות מהיר, אור-יעיל, פחות פוטוטוקסי13,14. בנוסף, LSFM מאפשר הדמיה multi-view. גישה זו מתאימה במיוחד כדי להמחיש אקסונים מוטוריים ומסופי לפיזור שלהם כפי הם התפשטו בחלל תלת-ממד. LSFM outperforms שתי האפשרויות האחרות כי דגימות הם רכובים על במה המאפשרת סיבוב סביב ציר אנכי ותנועות לאורך x, y ו- z. זה לא רק מאפשר תצוגה חסומים מינימלית של המדגם, אלא גם הבחירה של נתיב רצויה תאורה, חסרונה של מיקרוסקופ שני הפוטונים, וידאו, אשר שניהם דורשים הרכבה של דגימות בשקופית שטוח. לכן, LSFM הוא הכלי המתאים ביותר עבור הדמיה תלת-ממדית של האקסון arborization, כימות של עצבים מוטוריים המסופים העכבר עוברי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל החיות חי הוחזקו במתקן פתוגן מסוים חינם (SPF) בעלי חיים, אושרה ומנוהלת על ידי IACUC של האקדמיה Sinica.

1. קיבוע

  1. לאסוף את העוברים מתחלקים היום 12.5 (E12.5) ואז לערוף, המעיים אותם.
  2. את העוברים בנפרד ב- 24-ובכן צלחות עם 1 מ"ל/טוב של paraformaldehyde המוכנים באופן טרי 4% 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) בן לילה. דגירה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  3. לשטוף את העוברים קבוע לפחות 3 x, כל אחד למשך 5-10 דקות, עם 1 מ"ל של PBS 1 x, דגירה בין לילה ב 4 ° C-מטרף כדי להסיר את paraformaldehyde שיורית.

2. כולה-הר Immunostaining

  1. Permeabilize כל העובר ב 1 מ"ל של 0.5% PBS-טריטון-X-100 (PBST) בן לילה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  2. לחסום כל דגימה עם 1 מ"ל של 10% FBS המבושלות 1 x PBS בן לילה-4 מעלות צלזיוס על מטרף.
  3. דגירה העובר עם 1 מ"ל של נוגדן anti-GFP הראשי (1:1, 000 דילול ב 10% FBS) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 72 h ברעידות תמידי להעצים את האות ה-GFP של העצבים המוטוריים.
  4. לאחר הדגירה נוגדן ראשוני, לשטוף עם 1 מ"ל של 0.5% PBST במהלך 1-2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס על מטרף, שינוי של 0.5% PBST לפחות שלוש פעמים.
  5. החל מ ל 1 של נוגדנים משניים (1:1, 000 דילול ב 10% FBS) דגירה בין לילה בחושך ב 4 ° C עם טלטול מתמיד.
  6. לשטוף 3 x 1 מ של 0.5% PBST ב 4 ° C-מטרף במשך 2-3 ימים. לשמור דגימות ב- 1 x PBS ב 4 ° C עד יום לפני הדמיה.
    הערה: יכול להיות גזור עוברי למקטעים קטנים יותר לפני ניקוי, בהתאם ידומה חלק העוברים. Forelimbs נשמרים בגישה ניסויית זו (איור 1 א').
  7. דגירה העובר ריאגנט ניקוי מסחרי עם מדד השבירה nD 1.49 צינור 1.5 mL, מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר למשך הלילה, כדי להבהיר את העובר שקוף עבור הדמיה.
    הערה: הנפח של ניקוי הכימית היא כ חמש פעמים של אמצעי האחסון מדגם.

3. LSFM (2-3 שעות)

  1. דוגמה הגדרת
    1. להגדיר 5 X / 0.1 אופטיקה תאורה ו- 5 X / 0.16 זיהוי אופטיקה. להרכיב את בעל מדגם ואת מדגם נים (1.5 מ מ קוטר פנימי, ירוק) ולמקם אותם לתוך המיקרוסקופ.
      הערה: עיין במדריך ההפעלה של המיקרוסקופ להליכי הגדרת נתונים היסטוריים.
    2. הר העובר כדלקמן:
      1. להכין את הטיפ פיפטה P200 על ידי חיתוך של החלק העליון כך שיתאים הקוטר של נים ולהסיר את החלק המחודד (~ 3 מ מ) עבור הקובץ המצורף הדגימה.
      2. ממיסים הסוף קהות של קצה פיפטה באמצעות להבה קטנה.
      3. לכבות את הלהבה וצרף במהירות את העובר אנכית על קצה מומסת.
      4. להתאים את החלק העליון של קצה פיפטה עם נימי המדגם.
    3. לאפשר המאגר קאמרית equilibrate עם העובר במשך 1 דקה לנקות את הלכלוך או בועות.
    4. שימוש בתוכנת הדמיה, לבחור אתר נימי תחת הכרטיסיה אתר ולכוונן x, y, z צירים כדי למקם את נימי הדגימה.
    5. בחר אתר לדוגמה , םוז 0.6 X להתמקד על העובר. לסובב את העובר כדי להבטיח כי לציר הארוך של האיבר שבעורך מיישר בנתיב האור של שני מקורות אור (איור 1B).
  2. ייבוא תמונות
    1. תחת הלשונית רכישה , להגדיר את הפרמטרים נתיב האור כגון זיהוי מטרות, לייזר חסימה מסנן קרן הפיצול, מצלמות, לייזרים.
      הערה: ערוץ ה-GFP משמש בניסוי זה (אורך גל עירור: 488 ננומטר; מסנן פליטה: BP 505 כדי 545 ננומטר, קרן ספליטר: SPS LP 560).
    2. בדוק את תיבת הסימון סרוק pivot להפחתת צל.
    3. תורדגהה רכישה: קצת עומק, 16 סיביות; זום, 0.36-0.7 X; תאורה יחיד לצד (ימין/שמאל) או תאורה כפולה בצד.
    4. לחץ על רציף ולהגדיר את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, עוצמת הלייזר, והמיקום אור גיליון לרכוש תמונות חדות יותר.
      הערה: עוצמת הלייזר נשמרת נמוך ככל האפשר למזער את נזקי.
    5. הקש להפסיק לשים קץ ייבוא תמונות.
  3. רכישת רב-ממדי
    1. להגדיר את z-המחסנית על-ידי הזזת את מיקום Z עבור התמונה הראשונה והאחרונה. לחץ אופטימלית כדי להגדיר את המספר פרוסה.
    2. לחץ על ניסוי להתחיל לרכוש את z-אוסף התמונות שנבחר.
    3. כאשר זה נעשה, לשמור את התמונה בתבנית .czi.
  4. עיבוד תמונה (לא חובה)
    1. להמשיך עם פיוז'ן הצדדיים הכפולים תחת בערוץ Lightsheet עיבוד אם תאורה כפולה בצד מוחל. Multiview עיבוד הכרחי אם תצוגות מרובות של נרכשים לשלב תמונות מזוויות מרובות.
    2. ליצור תמונה דו-ממדית באמצעות נתוני הפיקסלים בעוצמה הגבוהה ביותר לאורך ציר הטלה תחת בערוץ הטלה בעוצמה המרבית .
    3. תחת ערוץ ההעתקה , לחץ על ערכת משנה כדי לבחור קבוצות משנה של תמונות מתוך הסט המקורי.

4. כימות של האקסון Arborization (30 דקות עבור כל עצב בודדים)

  1. לפתוח את קובץ התמונה בתוכנת ניתוח ההדמיה (כברירת מחדל, התמונה הכוללת את נתוני XYZ נפתח במצב Surpass ולא כתצוגה 3D שניתנו).
  2. להתאים את צבע התמונה, בהירות, וניגודים שימוש בחלון התצוגה התאמה (עריכה | התאמת תצוגת הצג) כדי לזהות חוטים בהתבסס על עוצמת המקומי חדות.
  3. לחץ על הסמל הוספת חוטים חדש ובחר את אלגוריתם Autopath (לא הלולאה) בתפריט הנפתח.
  4. בחר את האזור בעל עניין (במקרה זה, האקסון segmenting עניין). לחץ על הבא לאחר סיום.
  5. להגדיר את מתחילה, הזרעים נקודות על-ידי הקצאת המדידות בקוטר הגדול, הדק, אשר ניתן למדוד באמצעות מצב פרוסה .
  6. הקצאת נקודת התחלה בקצה של האזור בעל עניין. כדי להשיג ידנית בהוספה ובהסרה של נקודות התחלה, קודם לשנות את מצב המצביע (ניווט | בחר) ולאחר מכן Shift + לחיצה ימנית על נקודות עניין.
  7. בחר ספי ידנית הזרעים נקודות להבטיח כי כל arborization גלוי מסומן. לשנות את מצב המצביע (ניווט | בחר) ולאחר מכן Shift + שמאל לחץ בנקודות עניין כדי להוסיף או להסיר את הזרעים נקודות באופן ידני.
    הערה: חשוב להסיר באופן ידני רעשי רקע, אותות מרוב עצבים סמוכים.
  8. סמן את התיבה להסיר את הזרעים נקודות סביב כנקודות התחלה.
  9. בדוק הסר מנותק מקטעים כדי לאפשר אי-הכללה של נקודות זה רחוק מדי, זה עשוי לייצג את רעשי הרקע. ציין את האורך המרבי של הפער בשלב הבא כדי להגדיר את הגבול העליון עבור אי-הכללה.
  10. התאם את הסף עבור רקע חיסור, אשר משתמש מסנן לפי עקומת גאוס כדי להעריך את עוצמת רקע voxel בכל.
  11. לקבוע סף אוטומטי בקוטר דנדריט באמצעות האלגוריתם שטח חתך משוער .
  12. דלג על השלבים לחישוב עמוד השדרה.
  13. לסיום התהליך ובחרו את הסגנון הרצוי וצבע.
  14. בטל את סימון התיבה נפח מאפיינים כדי להציג רק את האקסונים המשוחזרת.
  15. תחת הכרטיסיה סטטיסטיקה , בחר מפורט. השתמש נימה לא. דנדריט מסוף נקודות לכמת את מסופי עצבים מוטוריים כמחוון של האקסון מנוע arborization.
    הערה: ביאור סטטיסטי ניתן להוסיף במידת הצורך.
  16. לייצא את התמונה של האקסון המשוחזרת כקובץ. tif.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM מספק לוויזואליזציה תלת-ממדית מפורטת של מסלול MN arborization האקסון עכבר עוברי. תחת שדה בהיר, רקמות מופיעים שקוף לחלוטין לאחר להיות שקוע בתוך הכימית ניקוי מסחרי. אין התכווצות או נפיחות של המדגם היה לב אחרי שבוע אחד עד אחסון ניקוי ריאגנט לפני הדמיה. תחת קרינה פלואורסצנטית ערוץ, מוטורי לגלוקוז מסומנות עם GFP transgenically ביטוי (1 סרטים). במקרה כלשהו, נחשפו פרטים של המבנה האקסון. לדוגמה, באיור 2 מייצג הדמיה באיכות נמוכה. מספר גורמים יכולים לעכב איכות הדמיה. ראשית, אין די permeabilization ושטיפת צעדים יכול להוביל רקע אות. שנית, פיזור אור דרך רקמות כראוי שנוקה יביא תמונות מטושטשות. לבסוף, שיוצרת מדגם מיצוב במהלך ייבוא תמונות עלול להגביר את פיזור אור או לחסום את נתיב האור.

כדי arborization האקסון תמונה בפירוט רב יותר וכדי לבצע כמת, הגדלה ניתן להתאים כל מבנה דק arborized שניתן יהיה גילה (2 סרטים). יש להשוות תמונות של תאורה יחיד, כפול-בצד כדי לקבוע את הרזולוציה המיטבית של דפוס arborization (איור 3). הדמיה ניתוח תוכנה ואז ניתן לשחזר דפוסי arborization האקסון לעצבים forelimb בודדים (איור 4). על-ידי הגדרת נקודת ההתחלה ואת הקוטר לגילוי נקודת זרע, מבנים arborized אלה באופן אוטומטי למחצה ועוזרת מחושב בזמן רקע אותות יוסרו באופן ידני. השתמשנו "נימה – לנתיב הימני. דנדריט מסוף Pts"מצב פונקציה לחישוב המסופים עצבים מוטוריים הכולל של עצבים בודדים כמחוון של האקסון מנוע arborization. בנוסף, סניף אורך קוטר מרושע, אמצעי אחסון ניתן לחשב באמצעות "נימה – דנדריט משך", "נימה – דנדריט מתכוון קוטר" ו- "נימה – דנדריט נפח", בהתאמה.

Figure 1
איור 1: איור גרפי של הגדרת דגימה. (א) במהלך הכנת הדוגמא, העוברים הם קודם ערף, מוכרח. Forelimbs ביתר לאורך קו מקווקו. (B) בבית הבליעה לדוגמה, דגימות ימוקמו כדי לשמור על האזור כולו עניין לאורך נתיב האור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 1
סרט 1: אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופיה של תצוגה של שדה גדולה של החצי העליון של העובר העכבר הטרנסגניים E12.5 (Hb9::GFP). הסרט מדגים בבירור העצבים המוטוריים מקרין חוט השדרה אל המטרות innervating שלהם. תמונת התלת-ממד היא רכשה קודם תחת 0.3 X הגדלה עם תאורה יחיד בצד וזמן חשיפה 30 ms ולאחר מכן מעובד לתוך וידאו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. סרגל קנה מידה מייצג 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Figure 2
איור 2: דוגמה של תמונה באיכות נמוכה עם רקע אות ואזורים מטושטשת (חיצים כחולים). השלבים פסולים במהלך הכנת המדגם ורכישת תמונות עלול להוביל איכות התמונה לקוי לסכן את הדיוק של כל כימות עוקבות של האקסון arborization. סרגל קנה מידה בתמונה מייצג 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 2
סרט 2: ויזואליזציה של E12.5 forelimb עצבים מתחת 488 ננומטר עירור עם תאורה כפולה בצד בהגדלה גדולה של 0.6 X. הסרט תקריב-in מאפשר הדמיה פנורמי וברורה של כל המבנים arborized בסדר על העצבים בודדים. סרגל קנה מידה מייצג 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Figure 3
איור 3: השוואה בין תאורה יחיד - וכפולה-side. תאורות שמאלה וימינה להציג פרטים של אזורים מסוימים בלבד (חצים אדומים), ואילו תמונה משולב של תאורות כפולה בצד מספקת תצוגה מקיפה יותר של דפוס arborization. עם זאת, ניתן להשיג תאורה יחיד בצד בזמן ההדמיה קצר ולפעמים עם איכות תמונה טובה יותר. זה בשל העובדה כי נתיבי תאורה משני הצדדים לא ינוח בצורה מושלמת על מטוס בודד, וכתוצאה מכך טשטוש במהלך תאורות כפולה בצד. תמונות מוצגים הטלה בעוצמה מרבית. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: שיחזר האקסון arborization של עצבים forelimb בודדים, מקודדים כדלקמן: suprascapular (אדום), בבית השחי (ורוד), דיאגרמה מוקדית (כחול), אחורי איחתי עורית (סגול). Arborization המורכבות מחושב על פי מספר מסוף והגישור זוהה בשיטה שלנו חצי אוטומטיים. האלגוריתם Autopath (לא הלולאה) רשמים חוטים ומזהה הזרעים נקודות מ נקודות המוצא על-ידי המשתמש. סרגל קנה מידה גם תמונות מייצג 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר צעדים בפרוטוקול עלולים להיות נתונים לשינויים בנסיבות מסוימות. לדוגמה, משך הזמן של קיבעון תלוי גיל העוברים, משתנה מ- 2 h ימים 1 או יותר באמצעות paraformaldehyde טריים. מאז קיבוע מבוצע לפני כל הר immunostaining, עבור נוגדנים הרגישים crosslinking חלבון, מתנול יכול לשמש כסוכן מקבע חלופי. עבור יחס אות לרעש גבוה עם כתמים, זה הכרחי כדי למטב את הריכוז דטרגנט (בין 0.1-0.5%). צעדים נוספים כביסה לפני ואחרי נוגדן הדגירה יכול גם להגדיל את יחס אות לרעש. בנוסף, צעד ניקוי רקמות חשוב להבטיח נתיב האור החסימה לאורך כל התחזיות עצב עמוק. כדי להגביר את השקיפות רקמות, חשוב להבטיח הקדמה מינימלי של PBS במהלך הדגירה של הסוכן ניקוי מסחרי, כמו אפקט ניקוי זה מתהפך במועט מחדש דגימות מאגר פתרונות. אחרת, ריאגנט סליקה עם מקדם שבירה גבוה יותר או תקופה ארוכה יותר ניקוי מומלץ. בינתיים, הפרמטרים במהלך ייבוא תמונות להשתנות בין מדגמים שונים. תאורה כפולה בצד והדמיה multiview עשוי לאפשר הדמיה עם יותר עומק שדה, פרט משופרת. עם זאת, מאז תאורה מזוויות שונות שנרכש בעת ובעונה אחת, תאורה יחיד בצד יעיל יותר עבור דגימות קטנות יותר או דגימות נע. תמונה באיכות טובה מבטיחה דיוק עבור הבאים כמותני.

מחקרים קודמים, כולל אלה של הקבוצה שלנו, נעזרו קונאפוקלית הדמיה או מיקרוסקופ שני הפוטונים להתבונן האקסון מנוע ניווט תבנית תהליך או arborization Hb9::GFP עוברי10,15, 16 , 17. על סמך הניסיון שלנו, אנו מאמינים LSFM להיות מעולה לכל אלה שתי שיטות אחרות מאז: 1) הדמיה זמן מצטמצם במידה רבה כמו LSFM מציע יותר מהיר ואיכותי יותר, הדמיה, תוך הפחתת נזקי ו- phototoxicity של דגימות. דגימות מוארים מן הצד עם סדין אור דק, ובכך יוצר של סעיף אופטי מהותי14,18,19. במרכז הגיליון אור יתמקד עם המטוס מוקד של מערכת זיהוי, המהווה אורתוגונלית לציר תאורה. כתוצאה מכך, אור out-of-להתמקד מצטמצם, fluorophores היחידה בתוך המטוס מוקד מוארים עבור כל תמונה, כלומר, במקום הדגימה כולה, photobleaching ובכך הפחתת20. 2) פרטים של התבנית arborization הם הרבה יותר מאויר כמו LSFM מאפשר הדמיה multiview. במקום הדגימה נטענת לשקופית, הוא מחובר בצורה כזאת, כי סיבוב סביב ציר אנכי הוא אפשרי, כמו גם תנועות לאורך x, y ו- z מידות. תמונות מ מטוסים שונים ונופים נערמים לייצר עוד תמונות תלת-ממד isotropic. עם זאת, LSFM יש גם הגבלה לעומת גישות קונאפוקלית שני הפוטונים במונחים של גודל הקובץ מסיבית שנוצרו עבור כל תמונה. אלה היתרונות והחסרונות צריך להישקל כאשר מחליטים באיזו שיטת הדמיה לשימוש, אך בסופו של דבר הבחירה יהיה תלוי איזה מיקרוסקופיים של חומרה/תוכנה זמין על פי בקשה.

בקיצור, פרוטוקול זה משלב כולה-הר immunostaining, המדינה-of-the-art אור גיליון הדמיה תלת-ממד, יחד עם כימות בתוכנת ניתוח התמונה. אנו מאמינים פרוטוקול זה לא רק מספק פרדיגמה חדשה להמחשת ניווט המנוע האקסון ואת מסלולי ב העוברים עם כימות של האקסון arborization מורכבות אבל יכול גם להיות מיושם למערכות אחרות נוירון (קרי, החישה הניריונים) עם העכברים הטרנסגניים המתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

LSFM ניסויים וניתוח נתונים בוצעו באופן חלקי באמצעות מיקרוסקופים אופטיים מתקדמים של חלוקה של כלי השירות Sinica אקדמיה, בסיועם של גברת שו-חן שן. אנו מודים גב' סו-פינג לי מהספינה הדמיה הליבה מתקן של IMB לסיוע טכני ניכר עם ניתוח תמונות Imaris. הליבה של IMB המדעית עריכה עברית סקרו את כתב היד. עבודה זו ממומן על ידי האקדמיה Sinica הקריירה פיתוח פרס (CDA-107-L05) ביותר (104-2311-B-001-030-MY3), NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hb9::GFP The Jackson labortory 005029 Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5)
4% Paraformaldehyde (PFA) For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.
Triton X-100 Sigma X100-500ML
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079
Sheep polyclonal anti-GFP AbD Serotec 4745-1051 1:1000
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Invitrogen A-11015 1:1000
RapiClear 1.49 clearing reagent SunJin Lab RC149001
1.5ml micro tube Sarstedt 72.690.001
24 wells plate ThermoFisher 142475
5 SA Tweezer ideal-tek 3480641
Iris Scissors striaght sharp/sharp Aesculap BC110R
Microsurgery Scalpels, single use Aesculap BA365
Dissecting microscope Nikon SMZ800
Shaker TKS RS-01
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 image analysis software Bitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) The Jackson Laboratory 005029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Tags

מדעי המוח גיליון 135 מוטור נוירון ניווט האקסון מסלול האקסון האקסון arborization מיקרוסקופ אור גיליון חוט השדרה IMARIS
ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. … More

Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57546, doi:10.3791/57546 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter