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Neuroscience

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

doi: 10.3791/57546 Published: May 11, 2018
* These authors contributed equally

Summary

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

Abstract

척추 모터 신경 (MNs) 확장 운동과 척추 동물에서 복잡 한 작업을 제어 함으로써 그들의 innervating 목표와 의사 소통을 그들의 축 삭. 따라서, 어떻게 모터 축 삭으로 이동, arborize, 그리고 그들의 주변 근육을 자극을 개발 및 변성 동안 대상의 분자 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 축 삭 터미널 arborization의 전체 스펙트럼에 대 한 자세한 설명은 남아 패턴 복잡성 때문에 불완전 한 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 라인 모터 축 삭 궤도 배아 개발 하는 동안 시각화를 오래 해 왔으나, 비록 고 현재 광학 현미경 검사 법의 제한입니다. 여기, 우리는 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 및 질적 및 양적 시각화 모터 축 삭을 개발 하기 위해 강력한 이미지 분석을 결합 하 여 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 교차 하는 유전 돌연변이 또는 Hb9::GFP 라인, 모터 축 삭 탐색 및 arborization 결함으로 이어질 새로운 분자 메커니즘을 드러내는 미네소타 질병 모델에 쉽게 채택 될 수 있습니다.

Introduction

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중앙 신경의 일부인 척수 MNs 하지만 이동을 컨트롤 하기 위해 주변 근육을 자극. 개발 척수에서 미네소타 창시자 (pMNs) notochord 그리고 인접 한 somites에서 나오는 신호에 따라 설정 됩니다. 모든 포스트 mitotic MNs 분화 다음 pMNs, 결국 척수1,2의 rostrocaudal 축 미네소타의 일련에 기한에서 생성 됩니다. 척추 MNs 지형학과 해부학 잘 구성 되어 있습니다. 그들의 형태학 배열 주변3에 그들의 각각 대상의 위치와 상관 한다. 그들의 근육 목표에 도달, axons 수신 확장 하 고 분기 하도록 유도 하는 세포와 외 인 neurotrophic 요인 근육으로. 신경 분포 및 분기 결함 neuromuscular 접속점 (NMJ)를 형성 하는 실패에 기여할 수 있습니다. 예를 들어 폐해 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)-유도 Pea3은 축 삭 arborization 피부 막시무스 (CM)에 대 한 필수 및 latissimus dorsi (LD) 근육4,5. 또한, 식사 녹아웃 마우스 배아 탄생6,7직후 호흡 실패 및 사망률을 일으키는 횡 경 막에 인할지 신경의 결함 arborization를 표시 합니다. 따라서, 미네소타 성숙 (, axonal 프로젝션 및 분기)의이 마지막 단계가 신경 세포와 대상 세포 간의 통신을 보장 하기 위해 중요 합니다.

Arborization 패턴을 보려면, 연구자는 일반적으로 confocal 영상 또는 sectioned 또는 전체 마운트 샘플8,,910의 2 광자 형광 가벼운 현미경 검사 법 실시. 현미경 검사 법 기술을 둘 다 생성 허용 해상도 깊이 침투 합니다. 2-광자 형광 가벼운 현미경 검사 법11두 낮은 에너지 광자 동시 흡수 fluorophores의 흥분을 포함 한다. 두 광자 여기 근처-적외선 방사선을 사용 하 여, 이후 감소 여기 주파수 감소 산란 및 1 m m 더 큰 깊이 가진 이미징 되므로 조직에서에서 더 나은 조직 침투에 기여 한다. Confocal 현미경 검사 법 제거 필터 초점 아웃 신호 및만12초점 비행기 내에서 빛을 수집 합니다. 이 방식으로 Z-스택 기능을 통해 3 차원 (3D) 이미지를 생성 하 다른 초점 비행기에서 샘플의 이미지를 결합 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 신호 강도 빛의 대부분을 차단 하 고 높은 수치 apertures 모호한 필드의 깊이 감소 된다. 더 중요 한 것은, 두 기법 때문에 하나의 비행기는 주어진된 시간에 촬영 하는 경우에 전체 표본 조명 받는 심각한 photodamage 및 phototoxicity에 기여 한다.

이러한 단점을 우회 되 고 빠른, 빛 효율의 장점을 선호 대안 및 더 적은 phototoxic13,14LSFM 되고있다. 또한, LSFM 분할 영상이 있습니다. 이 방식은 모터 축 삭 및 그들의 분산 터미널을 시각화 하는 그들은 3D 공간을 통해 확산에 특히 적합 합니다. LSFM 샘플 수직 축과 x, y 및 z 축을 따라 움직임 회전을 허용 하는 단계에 탑재 되어 있기 때문에 다른 두 가지 옵션을 능가. 이 설정 뿐만 아니라 둘 다 요구 플랫 슬라이드 샘플 장착 샘플의 최소 차단된 보기 뿐만 아니라 바람직한 조명 경로, 2 광자 고 confocal 현미경 검사 법의 단점에 대 한 선택 수 있습니다. 따라서, LSFM는 마우스 배아에 있는 모터 신경 맨끝의 정량화 및 축 삭 arborization의 3D 영상에 대 한 가장 적합 한 도구입니다.

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Protocol

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모든 살아있는 동물의 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설, 승인 및 학계 Sinica IACUC에 의해 감독에 유지 했다.

1입니다. 고정

  1. 배아 하루 12.5 (E12.5)의 배아를 수집 다음 목을 벨 하 고 그들 내장을 들어낸.
  2. 수정 배아 개별적으로 24-잘 접시에 1 mL/갓된 4 %paraformaldehyde 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서의 하룻밤. 통에 4 ° C에서 품 어.
  3. 1 x PBS의 1 mL와 함께 x, 5-10 분, 각각 고정된 배아 적어도 3를 세척 하 고 잔여 paraformaldehyde 제거를 통에 4 ° C에서 밤새 품 어.

2. 전체-마운트 Immunostaining

  1. 0.5%의 1 mL에 각 배아를 permeabilize PBS-트리톤-X-100 (PBST) 통에 4 ° C에서 하룻밤.
  2. 10 %FBS 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 x PBS에 준비의 1 mL와 함께 각 샘플을 차단 합니다.
  3. 안티-GFP 1 차적인 항 체의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 모터 신경의 GFP 신호 강화로 지속적인 떨고 72 h 4 ° C에서.
  4. 1 차적인 항 체 외피 후에 0.5%의 1 mL로 씻어 0.5%를 변경 하는 한 통에 4 ° C에서 1-2 일에 걸쳐 PBST PBST 적어도 세 번.
  5. 이차 항 체의 1 mL를 적용 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 및 일정 한 동요와 4 ° C에서 어둠 속에서 밤새 품 어.
  6. 씻어 0.5%의 1 mL와 함께 3 x 2-3 일에 걸쳐 통에 4 ° C에서 PBST. 이미징 전날까지 4 ° C에서 1 x PBS에서 샘플 계속.
    참고: 배아는 개간, 배아의 일부 것입니다 몇 군데 따라 하기 전에 작은 세그먼트로 해 부 될 수 있다. 앞 발이 실험 방법 (그림 1A)에서 유지 됩니다.
  7. 이미징에 대 한 투명 한 태아를 렌더링 하룻밤 실 온에서 빛에서 보호 1.5 mL 튜브에 1.49의 굴절률을 가진 상업적인 청소 시에 태아를 품 어.
    참고: 개간 시 약의 볼륨은 약 5 배 샘플 볼륨의.

3. LSFM (2-3 h)

  1. 샘플 설정
    1. 5 X / 0.1 설정 조명 광학 및 5 X / 0.16 감지 광학. 샘플 홀더 및 샘플 모 세관 (1.5 m m 내부 직경, 녹색)를 조립 하십시오 하 고 현미경으로 그들을 배치.
      참고: 자세한 설정 절차에 대 한 현미경의 운영 설명서를 참조 하십시오.
    2. 다음과 같이 태아를 탑재.
      1. 그것은 모 세관의 직경에 맞도록 위쪽 부분을 멀리 절단 하 여 P200 피 펫 팁을 준비 하 고 뾰족한 부분을 제거 (~ 3 mm) 샘플 첨부 파일에 대 한.
      2. 작은 불꽃을 사용 하 여 피 펫 팁의 무딘된 끝을 녹여.
      3. 불꽃을 소화 하 고 신속 하 게 녹 인된 끝에 수직으로 태아를 연결 합니다.
      4. 샘플 모 세관 피 펫 팁의 위쪽 부분에 맞게.
    3. Equilibrate 파편 또는 거품을 1 분 동안 태아와 챔버 버퍼를 수 있습니다.
    4. 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 찾기 탭 아래 모 세관 찾기 를 선택 하 고 x, y, z 축 샘플 모 세관의 위치 조정.
    5. 찾기 샘플 을 선택 하 고 0.6 X 배아에 초점을 확대. 군데 사지의 긴 축 (그림 1B) 두 광원의 빛 경로와 정렬 있도록 배아를 회전 합니다.
  2. 이미지 수집
    1. 인수 탭 검출 목적 등 가벼운 경로 매개 변수 정의 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저 레이저.
      참고: GFP 채널은이 실험에 사용 (여기 파장: 488 nm; 방출 필터: BP 505 545 nm, 빔 스플리터: SPS LP 560).
    2. 그림자 감소의 피벗 스캔 확인란을 확인 하십시오.
    3. 수집 설정을 정의: 비트 수준, 16 비트; 확대/축소, 0.36-0.7 X; 단일 측면 조명 (왼쪽/오른쪽) 또는 듀얼 사이드 조명.
    4. 연속 을 클릭 하 고 선명한 이미지 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 전력 및 빛 시트 위치를 설정 합니다.
      참고: 레이저 전원 photodamage 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 유지 됩니다.
    5. 이미지 수집 끝에 중지 를 누릅니다.
  3. 다차원 수집
    1. 첫 번째 및 마지막 이미지에 대 한 Z 위치를 이동 하 여 z-스택을 정의 합니다. 최적 조각 수 설정을 클릭 합니다.
    2. 선택한 z-스택 얻으려고 실험 시작 을 클릭 합니다.
    3. 완료 되 면.czi 형태로 이미지를 저장 합니다.
  4. 이미지 처리 (선택 사항)
    1. 듀얼 사이드 조명을 적용 하는 경우 처리 하는 Lightsheet 채널에서 듀얼 사이드 퓨전 으로 진행 합니다. Multiview 처리 하는 것은 멀티 플레이 여러 각도에서 이미지를 결합 하 여 취득 하는 경우에 필요 합니다.
    2. 최대 강도 투영 채널에서 투영 축 따라 최고 강도 픽셀에서 데이터를 사용 하 여 2D 이미지를 만듭니다.
    3. 복사 채널에서 원래 집합에서 이미지의 하위 집합을 선택 하려면 하위 집합 을 클릭 합니다.

4. 축 삭 Arborization (30 분 각 개별 신경에 대 한)의 정량화

  1. 영상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 (기본적으로 XYZ 데이터를 포함 하는 이미지 오픈 Surpass 모드에서 3D 렌더링 보기).
  2. 이미지 색상, 밝기, 조정 하 고 디스플레이 조정 창을 사용 하 여 대조 (편집 | 디스플레이 조정 표시) 로컬 강도 대비에 따라 필 라 멘 트 감지 하.
  3. 추가 새 필 라 멘 트 아이콘을 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 Autopath (루프) 알고리즘을 선택 합니다.
  4. (이 경우 관심의 분단 축 삭)에 관심 영역을 선택 합니다. 다음 완료를 클릭 합니다.
  5. 분할 모드를 사용 하 여 측정 될 수 있는 크고 얇은 직경 측정을 할당 하 여 시작 및 씨앗 포인트를 정의 합니다.
  6. 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정 합니다. 수동으로 추가 또는 제거 시작 지점에 달성 하기 위해, 먼저 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 및 다음 shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 관심의 포인트에.
  7. 보이는 arborization의 모든 표시 되도록 씨 포인트에 대 한 수동 임계값을 선택 합니다. 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 다음 Shift + 왼쪽 클릭 관심의 포인트에 수동으로 추가 하거나 씨앗 포인트를 제거 하 고.
    참고: 그것은 이웃 신경에서 배경 소음 및 신호를 수동으로 제거 하는 것이 중요입니다.
  8. 확인란 시작 지점 주변 씨앗 포인트를 제거합니다.
  9. 포인트는 너무 멀리 떨어져 있으며 배경 잡음을 나타내는 수 있습니다의 배제를 허용 하도록 제거 분리 세그먼트를 확인 합니다. 제외에 대 한 상한값을 정의 하는 다음 단계에서 최대 간격 길이 나타냅니다.
  10. 모든 복의 배경 강도 추정 하는 가우스 필터를 사용 하 여 배경 빼기에 대 한 임계값을 조정 합니다.
  11. 대략적인 횡단면 영역 알고리즘을 사용 하 여 모 수석 직경에 대 한 자동 임계값을 설정 합니다.
  12. 척추 계산에 대 한 단계는 건너뜁니다.
  13. 프로세스를 완료 하 고 원하는 스타일과 색상을 선택 합니다.
  14. 볼만 재건된 축 삭을 속성 에서 볼륨 상자 선택을 취소 합니다.
  15. 통계 탭에서 자세히를 선택 합니다. 필 라 멘 트를 사용 하 여. 모 수석 터미널 포인트 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 모터 신경 맨끝을 계량 하기.
    참고: 통계 주석을 추가할 수 있습니다 원하는 경우.
  16. .Tif 파일로 복원된 축 삭의 이미지를 내보냅니다.

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Representative Results

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LSFM 배아를 마우스에서 미네소타 궤도 및 축 삭 arborization의 상세한 3D 시각화를 제공합니다. 밝은 필드 아래에서 조직 상업 개간 시 약에 몰입 되 고 후 완전히 투명 하 게 나타납니다. 수축 또는 샘플의 붓기는 이미징 하기 전에 시 약을 지우기에 스토리지의 최대 1 주일 후 발견 되었다. 형광 채널에서 모터 뉴런 transgenically 표현된 GFP (영화 1)으로 표시 되어 있습니다. 일부 경우에, 축 삭 구조의 세부 정보는 손상 된다. 예를 들어 그림 2 낮은 품질 이미지를 나타냅니다. 여러 가지 요인이 이미징 품질을 방해 수 있습니다. 첫째, 부족 permeabilization 및 세척 단계 높은 배경 신호 발생할 수 있습니다. 둘째, 이미지를 흐려 inadequately 허가 조직을 통해 산란 발생 합니다. 마지막으로, 차선의 샘플 이미지 중 위치 수 산란 늘리거나 빛 경로 차단 합니다.

이미지 축 삭 arborization를 모든 가늘게 arborized 구조 될 수 있도록 배율 조정 될 수 있다 자세히 고 정량화를 수행 하 (영화 2) 공개. 단일 및 듀얼 사이드 조명 이미지 arborization 패턴 (그림 3)의 최적 해상도 확인 하려면 비교 한다. 이미징 분석 소프트웨어 다음 개별 forelimb 신경 (그림 4)에 대 한 축 삭 arborization 패턴을 재구성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 시작 지점 및 씨앗 포인트 검출에 대 한 직경을 정의 하 여 이러한 arborized 구조 수 세미 자동으로 감지 되며 배경 신호 수동으로 제거 하는 동안 계산. 우리는 "필 라 멘 트-번호 사용 모 수석 터미널 점"기능 모드를 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 개별 신경의 총 모터 신경 맨끝을 계산 합니다. 또한, 분기 길이, 평균 직경, 및 볼륨 계산할 수 있습니다 사용 하 여 "필 라 멘 트-모 수석 길이", "필 라 멘 트-모 수석 직경 의미" "필 라 멘 트-모 수석 볼륨", 각각.

Figure 1
그림 1: 샘플 설정의 그래픽 그림. (A) 샘플 준비 하는 동안 태아는 먼저 참 고 지. 앞 발은 점선 따라 해 부. (B) 샘플 챔버에 샘플 빛 경로 따라 관심의 전체 영역을 유지 하는 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Movie 1
영화 1: E12.5 유전자 변형 마우스 배아 (Hb9::GFP)의 윗부분의 큰 시야의 시트 형광 현미경 빛. 영화는 명확 하 게 모터 신경 그들의 innervating 대상에는 척수에서 예상을 보여 줍니다. 3D 이미지 먼저 0.3 X 배율 단일 측면 조명 및 30 ms 노출 시간 및 나중 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 비디오로 처리에서 취득 된다. 눈금 막대가 나타냅니다 500 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)

Figure 2
그림 2: 높은 배경 신호 및 흐린된 영역 (파란색 화살표) 낮은 품질 이미지의 예. 샘플 준비 및 이미지 수집 동안 부적절 한 단계 축 삭 arborization의 모든 후속 정량화의 정확도 위태롭게 장애인된 이미지 품질을 발생할 수 있습니다. 이미지에 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Movie 2
영화 2: E12.5 forelimb의 시각화 신경 엑스 0.6의 확대에 듀얼-사이드 조명 아래 488 nm 여기 확대에서 영화는 개별 신경에 모든 좋은 arborized 구조에 대 한 명확 하 고 파노라마 시각화 수 있습니다. 눈금 막대가 나타냅니다 300 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)

Figure 3
그림 3: 단일 및 듀얼 사이드 조명 사이 비교. Arborization 패턴의 더 완전 한 보기를 제공 하는 듀얼-사이드 일 루미 네이션에서 이미지를 결합된 하는 반면 왼쪽 및 오른쪽 일 루미 네이션 (빨간색 화살표), 특정 지역만의 세부 사항을 표시 합니다. 그러나, 단일 측면 조명 짧은 영상 시간에 그리고 때로는 더 나은 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 이것이 사실은 양쪽에서 조명 경로 듀얼-사이드 일 루미 네이션 동안 흐리게 인 단일 평면에 완벽 하 게 거짓말 하지 않을 수 있습니다. 이미지는 최대 강도 프로젝션으로 표시 됩니다. 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 다음과 같은 색 개별 forelimb 신경의 축 삭 arborization 재건: suprascapular (레드), 겨드랑이 (분홍색), 방사형 (파란색), 후부 상 완 피부 (보라색). Arborization 복잡성 터미널 종점 우리의 반 자동화 된 방법을 사용 하 여 검색 수에 따라 계산 됩니다. Autopath (루프) 알고리즘 필 라 멘 트를 추적 하 고 사용자 정의 시작 포인트에서 씨앗 포인트를 감지. 두 이미지에 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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프로토콜의 여러 단계 특정 상황에서 변화에 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어 고정 기간의 2 h에서 1 이상의 일 갓 만든 paraformaldehyde를 사용 하 여 다양 한 태아의 나이에 따라 달라 집니다. 고정 단백질 가교에 민감한 항 체에 대 한 전체 마운트 immunostaining 이전 실시 이후 메탄올 대체 통 요원으로 사용할 수 있습니다. 얼룩에 높은 신호 대 잡음 비율, 그것은 세제 농도 최적화 하는 데 필요한 (사이 0.1-0.5%). 추가 세척 단계 전후에 항 체 외피 또한 신호 대 잡음 비율을 높일 수 있습니다. 또한, 조직 개간 단계는 빛 깊은 axonal 예측을 통해 차단 되는지 확인 해야 합니다. 조직의 투명성을 강화 하려면 개간 효과 다시 버퍼 솔루션에 샘플을 immersing에 의해 반전으로 상업 개간 에이전트에서 부 화 하는 동안 PBS의 최소한의 소개를 위해 중요 하다. 그렇지 않으면, 높은 굴절률 또는 장기간 개간으로 개간 시 약이 좋습니다. 한편, 이미지 수집 하는 동안 매개 변수는 다른 샘플 마다 다릅니다. 듀얼 사이드 조명과 multiview 이미징 큰 필드의 깊이와 향상 된 세부 이미지를 수 있습니다. 그러나, 다른 각도에서 조명 동시에 획득 하 고, 이후 단일 측면 조명 작은 표본 이동 위해 더 효율적입니다. 좋은 품질의 이미지는 다음 정량 분석에 대 한 정확도 보장합니다.

우리의 그룹에 의해 포함 하는 이전 연구 confocal 영상 또는 Hb9::GFP 배아10,15, 모터 축 삭 탐색 프로세스 또는 arborization 패턴 관찰 2 광자 현미경 활용 16 , 17. 우리의 경험을 바탕으로, 우리 믿는 이들 우수 하 LSFM 이후 다른 두 가지 방법: 1) 이미징, photodamage 및 샘플의 phototoxicity를 최소화 하는 동안 더 신속 하 고 높은 품질을 제공 하는 LSFM 시간 이미징 감소 크게. 표본 내장 광학 섹션14,,1819만드는 얇은 가벼운 시트와 함께 측면에서 조명 됩니다. 빛 시트의 중심을 조명 축에 직교 하는 탐지 시스템의 초점 평면 converges. 따라서, 밖으로의 초점 빛 감소 초점 비행기 내에서 유일한 fluorophores 전체 견본, 그로 인하여 줄이는 photobleaching20보다는 모든 이미지, , 조명 그리고. 2) arborization 패턴의 내용을 훨씬 더 나은 그림 LSFM 수 multiview 이미징 할 수 있습니다. 표본 슬라이드에 장착 되 고, 대신 세로 축 중심 회전 x, y, 및 z 치수에 따라 움직임은 가능 하다 그런 방법으로 첨부 됩니다. 다른 비행기와 뷰에서 이미지 더 많은 등방성 3D 이미지를 생산 하기 위해 정렬 됩니다. 그러나, LSFM는 또한 각 이미지에 대 한 만든 거 대 한 파일 크기 측면에서 2 광자 공초점 접근에 비해 한계가 있다. 이러한 프로 죄수를 사용 하는 이미징 방법을 결정할 때 무게가 될 필요가 있지만 궁극적으로 선택 어떤 미세한 하드웨어/소프트웨어는 요청 시 사용할 수에 따라 달라 집니다.

즉,이 프로토콜 전체 산 immunostaining,-의 상태--예술 결합 시트 3D 영상, 이미지 분석 소프트웨어에 정량화와 빛. 이 프로토콜 뿐만 아니라 모터 축 삭 탐색 및 축 삭 arborization 복잡성의 정량과 배아에 궤적을 시각화에 대 한 새로운 패러다임을 제공 하지만와 다른 신경 시스템 (, 감각 신경)에 적용 될 수 있다고 적절 한 유전자 변형 쥐입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

LSFM 실험 및 데이터 분석은 일부를 사용 하 여 악기 서비스의 사단의 고급 광학 현미경 학계 Sinica에서 양 슈 첸 쉔의 원조 하는 것을 수행 했다. 우리는 이미징 핵심 시설의 IMB 상당한 기술 지원 Imaris 이미지 분석에서 양 슈 핑 리 감사합니다. IMB의 과학적인 영어 편집 코어 원고 검토. 이 작품은 학계 Sinica 경력 개발 상 (CDA-107-L05), 가장 (104-2311-B-001-030-MY3), 및 NHRI (NHRI-EX106-10315NC)에 의해 자금을.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hb9::GFP The Jackson labortory 005029 Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5)
4% Paraformaldehyde (PFA) For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.
Triton X-100 Sigma X100-500ML
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079
Sheep polyclonal anti-GFP AbD Serotec 4745-1051 1:1000
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Invitrogen A-11015 1:1000
RapiClear 1.49 clearing reagent SunJin Lab RC149001
1.5ml micro tube Sarstedt 72.690.001
24 wells plate ThermoFisher 142475
5 SA Tweezer ideal-tek 3480641
Iris Scissors striaght sharp/sharp Aesculap BC110R
Microsurgery Scalpels, single use Aesculap BA365
Dissecting microscope Nikon SMZ800
Shaker TKS RS-01
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 image analysis software Bitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) The Jackson Laboratory 005029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화
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Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57546, doi:10.3791/57546 (2018).More

Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57546, doi:10.3791/57546 (2018).

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