Summary
여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.
Abstract
척추 모터 신경 (MNs) 확장 운동과 척추 동물에서 복잡 한 작업을 제어 함으로써 그들의 innervating 목표와 의사 소통을 그들의 축 삭. 따라서, 어떻게 모터 축 삭으로 이동, arborize, 그리고 그들의 주변 근육을 자극을 개발 및 변성 동안 대상의 분자 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 축 삭 터미널 arborization의 전체 스펙트럼에 대 한 자세한 설명은 남아 패턴 복잡성 때문에 불완전 한 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 라인 모터 축 삭 궤도 배아 개발 하는 동안 시각화를 오래 해 왔으나, 비록 고 현재 광학 현미경 검사 법의 제한입니다. 여기, 우리는 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 및 질적 및 양적 시각화 모터 축 삭을 개발 하기 위해 강력한 이미지 분석을 결합 하 여 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 교차 하는 유전 돌연변이 또는 Hb9::GFP 라인, 모터 축 삭 탐색 및 arborization 결함으로 이어질 새로운 분자 메커니즘을 드러내는 미네소타 질병 모델에 쉽게 채택 될 수 있습니다.
Introduction
중앙 신경의 일부인 척수 MNs 하지만 이동을 컨트롤 하기 위해 주변 근육을 자극. 개발 척수에서 미네소타 창시자 (pMNs) notochord 그리고 인접 한 somites에서 나오는 신호에 따라 설정 됩니다. 모든 포스트 mitotic MNs 분화 다음 pMNs, 결국 척수1,2의 rostrocaudal 축 미네소타의 일련에 기한에서 생성 됩니다. 척추 MNs 지형학과 해부학 잘 구성 되어 있습니다. 그들의 형태학 배열 주변3에 그들의 각각 대상의 위치와 상관 한다. 그들의 근육 목표에 도달, axons 수신 확장 하 고 분기 하도록 유도 하는 세포와 외 인 neurotrophic 요인 근육으로. 신경 분포 및 분기 결함 neuromuscular 접속점 (NMJ)를 형성 하는 실패에 기여할 수 있습니다. 예를 들어 폐해 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)-유도 Pea3은 축 삭 arborization 피부 막시무스 (CM)에 대 한 필수 및 latissimus dorsi (LD) 근육4,5. 또한, 식사 녹아웃 마우스 배아 탄생6,7직후 호흡 실패 및 사망률을 일으키는 횡 경 막에 인할지 신경의 결함 arborization를 표시 합니다. 따라서, 미네소타 성숙 (즉, axonal 프로젝션 및 분기)의이 마지막 단계가 신경 세포와 대상 세포 간의 통신을 보장 하기 위해 중요 합니다.
Arborization 패턴을 보려면, 연구자는 일반적으로 confocal 영상 또는 sectioned 또는 전체 마운트 샘플8,,910의 2 광자 형광 가벼운 현미경 검사 법 실시. 현미경 검사 법 기술을 둘 다 생성 허용 해상도 깊이 침투 합니다. 2-광자 형광 가벼운 현미경 검사 법11두 낮은 에너지 광자 동시 흡수 fluorophores의 흥분을 포함 한다. 두 광자 여기 근처-적외선 방사선을 사용 하 여, 이후 감소 여기 주파수 감소 산란 및 1 m m 더 큰 깊이 가진 이미징 되므로 조직에서에서 더 나은 조직 침투에 기여 한다. Confocal 현미경 검사 법 제거 필터 초점 아웃 신호 및만12초점 비행기 내에서 빛을 수집 합니다. 이 방식으로 Z-스택 기능을 통해 3 차원 (3D) 이미지를 생성 하 다른 초점 비행기에서 샘플의 이미지를 결합 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 신호 강도 빛의 대부분을 차단 하 고 높은 수치 apertures 모호한 필드의 깊이 감소 된다. 더 중요 한 것은, 두 기법 때문에 하나의 비행기는 주어진된 시간에 촬영 하는 경우에 전체 표본 조명 받는 심각한 photodamage 및 phototoxicity에 기여 한다.
이러한 단점을 우회 되 고 빠른, 빛 효율의 장점을 선호 대안 및 더 적은 phototoxic13,14LSFM 되고있다. 또한, LSFM 분할 영상이 있습니다. 이 방식은 모터 축 삭 및 그들의 분산 터미널을 시각화 하는 그들은 3D 공간을 통해 확산에 특히 적합 합니다. LSFM 샘플 수직 축과 x, y 및 z 축을 따라 움직임 회전을 허용 하는 단계에 탑재 되어 있기 때문에 다른 두 가지 옵션을 능가. 이 설정 뿐만 아니라 둘 다 요구 플랫 슬라이드 샘플 장착 샘플의 최소 차단된 보기 뿐만 아니라 바람직한 조명 경로, 2 광자 고 confocal 현미경 검사 법의 단점에 대 한 선택 수 있습니다. 따라서, LSFM는 마우스 배아에 있는 모터 신경 맨끝의 정량화 및 축 삭 arborization의 3D 영상에 대 한 가장 적합 한 도구입니다.
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Protocol
모든 살아있는 동물의 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 동물 시설, 승인 및 학계 Sinica IACUC에 의해 감독에 유지 했다.
1입니다. 고정
- 배아 하루 12.5 (E12.5)의 배아를 수집 다음 목을 벨 하 고 그들 내장을 들어낸.
- 수정 배아 개별적으로 24-잘 접시에 1 mL/갓된 4 %paraformaldehyde 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서의 하룻밤. 통에 4 ° C에서 품 어.
- 1 x PBS의 1 mL와 함께 x, 5-10 분, 각각 고정된 배아 적어도 3를 세척 하 고 잔여 paraformaldehyde 제거를 통에 4 ° C에서 밤새 품 어.
2. 전체-마운트 Immunostaining
- 0.5%의 1 mL에 각 배아를 permeabilize PBS-트리톤-X-100 (PBST) 통에 4 ° C에서 하룻밤.
- 10 %FBS 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 x PBS에 준비의 1 mL와 함께 각 샘플을 차단 합니다.
- 안티-GFP 1 차적인 항 체의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 모터 신경의 GFP 신호 강화로 지속적인 떨고 72 h 4 ° C에서.
- 1 차적인 항 체 외피 후에 0.5%의 1 mL로 씻어 0.5%를 변경 하는 한 통에 4 ° C에서 1-2 일에 걸쳐 PBST PBST 적어도 세 번.
- 이차 항 체의 1 mL를 적용 (1:1, 000 희석 10 %FBS에서) 및 일정 한 동요와 4 ° C에서 어둠 속에서 밤새 품 어.
- 씻어 0.5%의 1 mL와 함께 3 x 2-3 일에 걸쳐 통에 4 ° C에서 PBST. 이미징 전날까지 4 ° C에서 1 x PBS에서 샘플 계속.
참고: 배아는 개간, 배아의 일부 것입니다 몇 군데 따라 하기 전에 작은 세그먼트로 해 부 될 수 있다. 앞 발이 실험 방법 (그림 1A)에서 유지 됩니다. - 이미징에 대 한 투명 한 태아를 렌더링 하룻밤 실 온에서 빛에서 보호 1.5 mL 튜브에 1.49의 굴절률을 가진 상업적인 청소 시에 태아를 품 어.
참고: 개간 시 약의 볼륨은 약 5 배 샘플 볼륨의.
3. LSFM (2-3 h)
-
샘플 설정
- 5 X / 0.1 설정 조명 광학 및 5 X / 0.16 감지 광학. 샘플 홀더 및 샘플 모 세관 (1.5 m m 내부 직경, 녹색)를 조립 하십시오 하 고 현미경으로 그들을 배치.
참고: 자세한 설정 절차에 대 한 현미경의 운영 설명서를 참조 하십시오. - 다음과 같이 태아를 탑재.
- 그것은 모 세관의 직경에 맞도록 위쪽 부분을 멀리 절단 하 여 P200 피 펫 팁을 준비 하 고 뾰족한 부분을 제거 (~ 3 mm) 샘플 첨부 파일에 대 한.
- 작은 불꽃을 사용 하 여 피 펫 팁의 무딘된 끝을 녹여.
- 불꽃을 소화 하 고 신속 하 게 녹 인된 끝에 수직으로 태아를 연결 합니다.
- 샘플 모 세관 피 펫 팁의 위쪽 부분에 맞게.
- Equilibrate 파편 또는 거품을 1 분 동안 태아와 챔버 버퍼를 수 있습니다.
- 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 찾기 탭 아래 모 세관 찾기 를 선택 하 고 x, y, z 축 샘플 모 세관의 위치 조정.
- 찾기 샘플 을 선택 하 고 0.6 X 배아에 초점을 확대. 군데 사지의 긴 축 (그림 1B) 두 광원의 빛 경로와 정렬 있도록 배아를 회전 합니다.
- 5 X / 0.1 설정 조명 광학 및 5 X / 0.16 감지 광학. 샘플 홀더 및 샘플 모 세관 (1.5 m m 내부 직경, 녹색)를 조립 하십시오 하 고 현미경으로 그들을 배치.
-
이미지 수집
- 인수 탭 검출 목적 등 가벼운 경로 매개 변수 정의 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저 레이저.
참고: GFP 채널은이 실험에 사용 (여기 파장: 488 nm; 방출 필터: BP 505 545 nm, 빔 스플리터: SPS LP 560). - 그림자 감소의 피벗 스캔 확인란을 확인 하십시오.
- 수집 설정을 정의: 비트 수준, 16 비트; 확대/축소, 0.36-0.7 X; 단일 측면 조명 (왼쪽/오른쪽) 또는 듀얼 사이드 조명.
- 연속 을 클릭 하 고 선명한 이미지 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 전력 및 빛 시트 위치를 설정 합니다.
참고: 레이저 전원 photodamage 최소화 하기 위해 가능한 한 낮은 유지 됩니다. - 이미지 수집 끝에 중지 를 누릅니다.
- 인수 탭 검출 목적 등 가벼운 경로 매개 변수 정의 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저 레이저.
-
다차원 수집
- 첫 번째 및 마지막 이미지에 대 한 Z 위치를 이동 하 여 z-스택을 정의 합니다. 최적 조각 수 설정을 클릭 합니다.
- 선택한 z-스택 얻으려고 실험 시작 을 클릭 합니다.
- 완료 되 면.czi 형태로 이미지를 저장 합니다.
-
이미지 처리 (선택 사항)
- 듀얼 사이드 조명을 적용 하는 경우 처리 하는 Lightsheet 채널에서 듀얼 사이드 퓨전 으로 진행 합니다. Multiview 처리 하는 것은 멀티 플레이 여러 각도에서 이미지를 결합 하 여 취득 하는 경우에 필요 합니다.
- 최대 강도 투영 채널에서 투영 축 따라 최고 강도 픽셀에서 데이터를 사용 하 여 2D 이미지를 만듭니다.
- 복사 채널에서 원래 집합에서 이미지의 하위 집합을 선택 하려면 하위 집합 을 클릭 합니다.
4. 축 삭 Arborization (30 분 각 개별 신경에 대 한)의 정량화
- 영상 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 (기본적으로 XYZ 데이터를 포함 하는 이미지 오픈 Surpass 모드에서 3D 렌더링 보기).
- 이미지 색상, 밝기, 조정 하 고 디스플레이 조정 창을 사용 하 여 대조 (편집 | 디스플레이 조정 표시) 로컬 강도 대비에 따라 필 라 멘 트 감지 하.
- 추가 새 필 라 멘 트 아이콘을 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 Autopath (루프) 알고리즘을 선택 합니다.
- (이 경우 관심의 분단 축 삭)에 관심 영역을 선택 합니다. 다음 완료를 클릭 합니다.
- 분할 모드를 사용 하 여 측정 될 수 있는 크고 얇은 직경 측정을 할당 하 여 시작 및 씨앗 포인트를 정의 합니다.
- 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정 합니다. 수동으로 추가 또는 제거 시작 지점에 달성 하기 위해, 먼저 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 및 다음 shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 관심의 포인트에.
- 보이는 arborization의 모든 표시 되도록 씨 포인트에 대 한 수동 임계값을 선택 합니다. 포인터 모드 변경 (탐색 | 선택) 다음 Shift + 왼쪽 클릭 관심의 포인트에 수동으로 추가 하거나 씨앗 포인트를 제거 하 고.
참고: 그것은 이웃 신경에서 배경 소음 및 신호를 수동으로 제거 하는 것이 중요입니다. - 확인란 시작 지점 주변 씨앗 포인트를 제거합니다.
- 포인트는 너무 멀리 떨어져 있으며 배경 잡음을 나타내는 수 있습니다의 배제를 허용 하도록 제거 분리 세그먼트를 확인 합니다. 제외에 대 한 상한값을 정의 하는 다음 단계에서 최대 간격 길이 나타냅니다.
- 모든 복의 배경 강도 추정 하는 가우스 필터를 사용 하 여 배경 빼기에 대 한 임계값을 조정 합니다.
- 대략적인 횡단면 영역 알고리즘을 사용 하 여 모 수석 직경에 대 한 자동 임계값을 설정 합니다.
- 척추 계산에 대 한 단계는 건너뜁니다.
- 프로세스를 완료 하 고 원하는 스타일과 색상을 선택 합니다.
- 볼만 재건된 축 삭을 속성 에서 볼륨 상자 선택을 취소 합니다.
- 통계 탭에서 자세히를 선택 합니다. 필 라 멘 트를 사용 하 여. 모 수석 터미널 포인트 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 모터 신경 맨끝을 계량 하기.
참고: 통계 주석을 추가할 수 있습니다 원하는 경우. - .Tif 파일로 복원된 축 삭의 이미지를 내보냅니다.
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Representative Results
LSFM 배아를 마우스에서 미네소타 궤도 및 축 삭 arborization의 상세한 3D 시각화를 제공합니다. 밝은 필드 아래에서 조직 상업 개간 시 약에 몰입 되 고 후 완전히 투명 하 게 나타납니다. 수축 또는 샘플의 붓기는 이미징 하기 전에 시 약을 지우기에 스토리지의 최대 1 주일 후 발견 되었다. 형광 채널에서 모터 뉴런 transgenically 표현된 GFP (영화 1)으로 표시 되어 있습니다. 일부 경우에, 축 삭 구조의 세부 정보는 손상 된다. 예를 들어 그림 2 낮은 품질 이미지를 나타냅니다. 여러 가지 요인이 이미징 품질을 방해 수 있습니다. 첫째, 부족 permeabilization 및 세척 단계 높은 배경 신호 발생할 수 있습니다. 둘째, 이미지를 흐려 inadequately 허가 조직을 통해 산란 발생 합니다. 마지막으로, 차선의 샘플 이미지 중 위치 수 산란 늘리거나 빛 경로 차단 합니다.
이미지 축 삭 arborization를 모든 가늘게 arborized 구조 될 수 있도록 배율 조정 될 수 있다 자세히 고 정량화를 수행 하 (영화 2) 공개. 단일 및 듀얼 사이드 조명 이미지 arborization 패턴 (그림 3)의 최적 해상도 확인 하려면 비교 한다. 이미징 분석 소프트웨어 다음 개별 forelimb 신경 (그림 4)에 대 한 축 삭 arborization 패턴을 재구성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 시작 지점 및 씨앗 포인트 검출에 대 한 직경을 정의 하 여 이러한 arborized 구조 수 세미 자동으로 감지 되며 배경 신호 수동으로 제거 하는 동안 계산. 우리는 "필 라 멘 트-번호 사용 모 수석 터미널 점"기능 모드를 모터 축 삭 arborization의 지표로 서 개별 신경의 총 모터 신경 맨끝을 계산 합니다. 또한, 분기 길이, 평균 직경, 및 볼륨 계산할 수 있습니다 사용 하 여 "필 라 멘 트-모 수석 길이", "필 라 멘 트-모 수석 직경 의미" "필 라 멘 트-모 수석 볼륨", 각각.
그림 1: 샘플 설정의 그래픽 그림. (A) 샘플 준비 하는 동안 태아는 먼저 참 고 지. 앞 발은 점선 따라 해 부. (B) 샘플 챔버에 샘플 빛 경로 따라 관심의 전체 영역을 유지 하는 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: E12.5 유전자 변형 마우스 배아 (Hb9::GFP)의 윗부분의 큰 시야의 시트 형광 현미경 빛. 영화는 명확 하 게 모터 신경 그들의 innervating 대상에는 척수에서 예상을 보여 줍니다. 3D 이미지 먼저 0.3 X 배율 단일 측면 조명 및 30 ms 노출 시간 및 나중 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 비디오로 처리에서 취득 된다. 눈금 막대가 나타냅니다 500 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 2: 높은 배경 신호 및 흐린된 영역 (파란색 화살표) 낮은 품질 이미지의 예. 샘플 준비 및 이미지 수집 동안 부적절 한 단계 축 삭 arborization의 모든 후속 정량화의 정확도 위태롭게 장애인된 이미지 품질을 발생할 수 있습니다. 이미지에 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 2: E12.5 forelimb의 시각화 신경 엑스 0.6의 확대에 듀얼-사이드 조명 아래 488 nm 여기 확대에서 영화는 개별 신경에 모든 좋은 arborized 구조에 대 한 명확 하 고 파노라마 시각화 수 있습니다. 눈금 막대가 나타냅니다 300 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭을이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
그림 3: 단일 및 듀얼 사이드 조명 사이 비교. Arborization 패턴의 더 완전 한 보기를 제공 하는 듀얼-사이드 일 루미 네이션에서 이미지를 결합된 하는 반면 왼쪽 및 오른쪽 일 루미 네이션 (빨간색 화살표), 특정 지역만의 세부 사항을 표시 합니다. 그러나, 단일 측면 조명 짧은 영상 시간에 그리고 때로는 더 나은 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 이것이 사실은 양쪽에서 조명 경로 듀얼-사이드 일 루미 네이션 동안 흐리게 인 단일 평면에 완벽 하 게 거짓말 하지 않을 수 있습니다. 이미지는 최대 강도 프로젝션으로 표시 됩니다. 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 다음과 같은 색 개별 forelimb 신경의 축 삭 arborization 재건: suprascapular (레드), 겨드랑이 (분홍색), 방사형 (파란색), 후부 상 완 피부 (보라색). Arborization 복잡성 터미널 종점 우리의 반 자동화 된 방법을 사용 하 여 검색 수에 따라 계산 됩니다. Autopath (루프) 알고리즘 필 라 멘 트를 추적 하 고 사용자 정의 시작 포인트에서 씨앗 포인트를 감지. 두 이미지에 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜의 여러 단계 특정 상황에서 변화에 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어 고정 기간의 2 h에서 1 이상의 일 갓 만든 paraformaldehyde를 사용 하 여 다양 한 태아의 나이에 따라 달라 집니다. 고정 단백질 가교에 민감한 항 체에 대 한 전체 마운트 immunostaining 이전 실시 이후 메탄올 대체 통 요원으로 사용할 수 있습니다. 얼룩에 높은 신호 대 잡음 비율, 그것은 세제 농도 최적화 하는 데 필요한 (사이 0.1-0.5%). 추가 세척 단계 전후에 항 체 외피 또한 신호 대 잡음 비율을 높일 수 있습니다. 또한, 조직 개간 단계는 빛 깊은 axonal 예측을 통해 차단 되는지 확인 해야 합니다. 조직의 투명성을 강화 하려면 개간 효과 다시 버퍼 솔루션에 샘플을 immersing에 의해 반전으로 상업 개간 에이전트에서 부 화 하는 동안 PBS의 최소한의 소개를 위해 중요 하다. 그렇지 않으면, 높은 굴절률 또는 장기간 개간으로 개간 시 약이 좋습니다. 한편, 이미지 수집 하는 동안 매개 변수는 다른 샘플 마다 다릅니다. 듀얼 사이드 조명과 multiview 이미징 큰 필드의 깊이와 향상 된 세부 이미지를 수 있습니다. 그러나, 다른 각도에서 조명 동시에 획득 하 고, 이후 단일 측면 조명 작은 표본 이동 위해 더 효율적입니다. 좋은 품질의 이미지는 다음 정량 분석에 대 한 정확도 보장합니다.
우리의 그룹에 의해 포함 하는 이전 연구 confocal 영상 또는 Hb9::GFP 배아10,15, 모터 축 삭 탐색 프로세스 또는 arborization 패턴 관찰 2 광자 현미경 활용 16 , 17. 우리의 경험을 바탕으로, 우리 믿는 이들 우수 하 LSFM 이후 다른 두 가지 방법: 1) 이미징, photodamage 및 샘플의 phototoxicity를 최소화 하는 동안 더 신속 하 고 높은 품질을 제공 하는 LSFM 시간 이미징 감소 크게. 표본 내장 광학 섹션14,,1819만드는 얇은 가벼운 시트와 함께 측면에서 조명 됩니다. 빛 시트의 중심을 조명 축에 직교 하는 탐지 시스템의 초점 평면 converges. 따라서, 밖으로의 초점 빛 감소 초점 비행기 내에서 유일한 fluorophores 전체 견본, 그로 인하여 줄이는 photobleaching20보다는 모든 이미지, 즉, 조명 그리고. 2) arborization 패턴의 내용을 훨씬 더 나은 그림 LSFM 수 multiview 이미징 할 수 있습니다. 표본 슬라이드에 장착 되 고, 대신 세로 축 중심 회전 x, y, 및 z 치수에 따라 움직임은 가능 하다 그런 방법으로 첨부 됩니다. 다른 비행기와 뷰에서 이미지 더 많은 등방성 3D 이미지를 생산 하기 위해 정렬 됩니다. 그러나, LSFM는 또한 각 이미지에 대 한 만든 거 대 한 파일 크기 측면에서 2 광자 공초점 접근에 비해 한계가 있다. 이러한 프로 죄수를 사용 하는 이미징 방법을 결정할 때 무게가 될 필요가 있지만 궁극적으로 선택 어떤 미세한 하드웨어/소프트웨어는 요청 시 사용할 수에 따라 달라 집니다.
즉,이 프로토콜 전체 산 immunostaining,-의 상태--예술 결합 시트 3D 영상, 이미지 분석 소프트웨어에 정량화와 빛. 이 프로토콜 뿐만 아니라 모터 축 삭 탐색 및 축 삭 arborization 복잡성의 정량과 배아에 궤적을 시각화에 대 한 새로운 패러다임을 제공 하지만와 다른 신경 시스템 (즉, 감각 신경)에 적용 될 수 있다고 적절 한 유전자 변형 쥐입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
LSFM 실험 및 데이터 분석은 일부를 사용 하 여 악기 서비스의 사단의 고급 광학 현미경 학계 Sinica에서 양 슈 첸 쉔의 원조 하는 것을 수행 했다. 우리는 이미징 핵심 시설의 IMB 상당한 기술 지원 Imaris 이미지 분석에서 양 슈 핑 리 감사합니다. IMB의 과학적인 영어 편집 코어 원고 검토. 이 작품은 학계 Sinica 경력 개발 상 (CDA-107-L05), 가장 (104-2311-B-001-030-MY3), 및 NHRI (NHRI-EX106-10315NC)에 의해 자금을.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
