Summary
ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション プロセスに適用されます。
Abstract
運動と脊椎動物の複雑なタスクを制御の支配のターゲットと通信するための軸索を脊髄運動ニューロン (MNs) に拡張します。したがって、どのようにモーター軸索に移動、arborize とその周辺の筋肉を刺激するターゲット開発と変性の間の分子機構を明らかにするため重要です。Hb9::GFPマウスの遺伝子組み換えの行は、萌芽期の開発の間にモーター軸索の軌跡を視覚化する提供して長い軸索ターミナル楔形の完全なスペクトルの詳細な説明のパターンの複雑さのため不完全なまま、現在の光学顕微鏡の限界。ここでは、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) と, 定性的かつ定量的視覚化モータ軸索を開発するロバストな画像解析を組み合わせた改良されたプロトコルについて述べる。このシステムは、遺伝的変異体またはミネソタ病気モデルHb9::GFP線、モーター軸索ナビゲーションおよび楔形の欠陥につながる新規の分子メカニズムを明らかに越えるに簡単に適用できます。
Introduction
脊髄 MNs は中枢神経系の一部が、動きを制御する末梢の筋肉を刺激します。発展途上の脊髄における MN 前駆細胞 (Pmn) は脊索と隣接する体節から発せられる信号によって確立されます。ポスト mitotic の MNs を区別すべてが最終的に一連の脊髄1,2rostrocaudal 軸 MN サブタイプに上昇を与える Pmn から生成されます。脊髄 MNs 地形的、解剖学的にも整理されています。周囲3の彼らのそれぞれのターゲットの位置と相関する形態での配置。その筋の目標に達して、時に軸索を受信を拡張し、分岐するように誘導する細胞および外因性神経栄養因子の筋肉にさらに。分岐の欠陥と神経支配神経筋接合部 (NMJ) を形成する失敗に貢献するかもしれない。たとえば、グリア由来神経栄養因子 (GDNF)-誘導 Pea3 は皮膚大殿 (CM) に軸索分枝に不可欠なと広背筋 (LD) 筋肉4,5。さらに、食事ノックアウト マウス胚は誕生6、7の直後に呼吸障害や死亡の原因と、横隔膜の横隔神経の欠陥の分枝を示します。したがって、MN 成熟 (すなわち、軸索投射および分岐) のこの最後のステップは、神経細胞と標的細胞の間の通信を確保する重要です。
分枝パターンを表示するのには研究者では、共焦点レーザー顕微鏡や断面、ホール マウント標本8,9,10の 2 光子蛍光顕微鏡が行う通常。これらの顕微鏡検査の技術の両方を許容解像度と深度貫入を生成します。2 光子蛍光顕微鏡は、2 つの低エネルギー光子11の同時吸収による蛍光物質の励起を含みます。2 光子励起近赤外放射を使用するので減少励起周波数は減らされた散乱と最大 1 mm 以上の深さでイメージングできるように組織のより良い組織浸透に貢献します。共焦点顕微鏡は、焦点のずれた信号し、フォーカル プレーン12内の光を収集するだけのフィルターによって削除します。このアプローチでは、Z スタック関数を介して三次元 (3 D) 画像を生成する別の焦点面からのサンプルの画像を結合できます。それにもかかわらず、光の大部分はブロックされ、高い数値の開口部あいまいなフィールドの深さと、信号強度が低下します。もっと重要なは、両方の技術は重度の生成や毒性に貢献する時点で一枚の平面のイメージが作成された場合でも、全体の標本が照明を受け取るので。
これらの欠点を回避するために LSFM は、支持された代わりに、高速、光効率の高い, という利点を持つと以下の光毒性13,14になっています。さらに、LSFM は、多視点画像をことができます。このアプローチは、3 D 空間で広まったモータ軸索と分散端末を可視化に特に適しています。サンプルは縦の軸線および x、y、および z 軸に沿って動きの周りの回転を可能にするステージ上にマウントされるため、LSFM は他の 2 つのオプションを上回ります。このセットアップだけでなく、両者フラット スライド上のサンプルの実装サンプルの最小ブロック表示が、また望ましい照明パス、2 光子および共焦点の顕微鏡検査の欠点の選択ことができます。したがって、LSFM は軸索分枝の 3 D 画像処理およびマウス胚における運動神経終末の定量化のための最適なツールです。
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Protocol
すべての生きている動物は特定病原体無料 (SPF) 動物施設、承認アカデミアシニカ IACUC によって監督で保管されました。
1. 固定
- 胚日 12.5 (E12.5) の胚を収集し、首をはねるそれらを骨抜き。
- 胚個別の修正 24 ウェル プレート 1 ml/1 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 作りたての 4% のパラホルムアルデヒドの一夜。シェーカーで 4 ° C で孵化させなさい。
- X、5-10 分のためのそれぞれ 1 mL の 1x PBS で少なくとも 3 固定の胚を洗浄し、残留パラホルムアルデヒドを削除するシェーカーで 4 ° C で一晩インキュベートします。
2. 全取り付ける染色
- 0.5 %1 mL にそれぞれの胚を permeabilize PBS-トリトン-X-100 (pbst;) シェーカーの 4 ° C で一晩。
- 1 ml の 10 %fbs がシェーカーで 4 ° C で一晩 1x PBS で準備の各サンプルをブロックします。
- 1 ml 抗 GFP 一次抗体の胚を孵化させなさい (1:1, 000 10% 希釈 FBS) 運動神経の GFP シグナルを強化する一定の揺れで 72 h 4 ° C で。
- 一次抗体の孵化後の 0.5 %1 mL で洗う 0.5% の変更、シェーカーで 4 ° C で 1-2 日にわたって PBST pbst; 少なくとも 3 回。
- 二次抗体の 1 ml (1:1, 000 10% 希釈 FBS) と一定の揺れで 4 ° C で暗闇の中で一晩インキュベートします。
- 0.5 %1 mL で 3 x を洗う pbst; 2-3 日間にわたってシェーカーで 4 ° c。1x PBS でイメージング前日までの 4 ° C でのサンプルを保ちます。
注: 胚は、胚の一部のイメージングによって、クリアする前に小さなセグメントに解剖することができます。前肢は、この実験的アプローチ (図 1 a) に保持されます。 - 屈折率 1.49 nD イメージングのため透明な胚のレンダリングに一晩室温で光から保護、1.5 mL チューブの商業消去試薬で胚を孵化させなさい。
注: 消去試薬の量、約 5 回のサンプル ボリューム。
3. LSFM (2-3 h)
-
サンプルのセットアップ
- 5 X/0.1 を設定用照明光学系と 5 X/0.16 検出光学系。サンプル ホルダーおよびサンプル毛細血管 (1.5 mm 内側直径、緑) を行い、顕微鏡にそれらを置きます。
注: は、詳細なセットアップ手順は、顕微鏡の操作マニュアルを参照してください。 - 胚をマウントするには、次のとおり。
- 毛細血管の直径を収まるように上の部分を切り取ることで P200 ピペット チップを用意し、尖った部分を取り外します (~ 3 mm) サンプル添付の。
- 小さな炎を用いたピペット先端末の鈍化を溶かします。
- 炎を消すし、すぐに溶けた端に垂直方向に胚を添付します。
- 毛細血管サンプル ピペット チップの上の部分をフィットします。
- 破片や泡をオフに 1 分のための胚と平衡に商工会議所のバッファーを許可します。
- イメージング ソフトウェアを使用して、[検索] タブで毛細血管を検索を選択し、x、y、サンプル管の位置に z 軸を調整します。
- 検索サンプルを選択し、胚に焦点を当てる 0.6 X ズームします。(図 1 b) 2 つの光源の光路とイメージの手足の長い軸が配置されていることを確認する胚を回転させます。
- 5 X/0.1 を設定用照明光学系と 5 X/0.16 検出光学系。サンプル ホルダーおよびサンプル毛細血管 (1.5 mm 内側直径、緑) を行い、顕微鏡にそれらを置きます。
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画像の取得
- [取得] タブで、検出目標など光路パラメーターを定義、ブロック フィルター、ビームスプリッター、カメラ、およびレーザーのレーザーします。
注: この実験で GFP チャネルを使用 (励起波長: 488 nm; 発光フィルター: BP 505 に 545 nm、ビームスプリッター: SPS LP 560)。 - シャドウ削減のピボット スキャンをチェックします。
- 取得設定を定義する: ビット深度 16 ビット;ズーム、0.36-0.7 X;片面照射 (左/右) またはデュアル サイド イルミネーション。
- 連続] をクリックし、シャープな画像を取得するレーザー強度、露出時間、レーザー出力、光シートの位置を設定します。
注: レーザー出力は、光損傷を最小限に抑えるため可能な限り低く保持されます。 - 画像の取得を終了するを停止を押します。
- [取得] タブで、検出目標など光路パラメーターを定義、ブロック フィルター、ビームスプリッター、カメラ、およびレーザーのレーザーします。
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多次元買収
- Z スタックを定義するには、最初と最後のイメージの Z 位置を移動します。最適なスライス数を設定するのにをクリックします。
- 選択した z スタックを取得する実験の開始をクリックします。
- それが終わったら、.czi 形式で画像を保存します。
-
画像処理 (オプション)
- デュアル サイド イルミネーションが適用される場合、 Lightsheet 処理したチャネルの下デュアル サイド融合を続行します。Multiview の処理は、複数の角度からの画像を結合する複数のビューを取得する場合に必要です。
- 下にチャンネルを最大強度投影投影軸に沿って最高強度のピクセルからのデータを使用して 2D イメージを作成します。
- コピーチャネルの下には、元のセットから画像のサブセットを選択するサブセットをクリックします。
4 軸索分枝 (それぞれの個々 の神経の 30 分) の定量化
- 画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開く (デフォルトでは、XYZ データを含むイメージを開くサーパス モードでは、3 D レンダリングされたビューとして)。
- 画像の色、明るさを調整し、ディスプレイの調整ウィンドウを使用して比較 (編集 |表示ディスプレイの調整) 局所濃淡のコントラストに基づくフィラメントを検出します。
- 新しいフィラメントを追加アイコンをクリックし、ドロップ ダウン メニューでAutopath (ループなし)アルゴリズムを選択します。
- (この場合は金利の分割軸索) に関心の領域を選択します。次へ完了をクリックします。
- スライスモードを使用して測定することができます最大かつ最も細い直径の測定を割り当てることによって開始とシード ポイントを定義します。
- 関心領域の端に開始ポイントを割り当てます。手動で追加または開始点の除去を達成するため、最初のポインター モードを変更 (の移動 |Select) と、 Shift + 右クリックで関心のあるポイント。
- シード ポイント表示の楔形のすべてがマークされていることを確認するための手動のしきい値を選択します。ポインター モードを変更 (の移動 |Select)、 Shift + 左クリックで関心のあるポイント シード ポイントを追加・削除する手動でして。
注: 隣接神経からのバック グラウンド ノイズと信号を手動で削除することが重要です。 - スタート地点の周りのシード ポイントを削除] ボックスを確認します。
- 離れすぎているし、バック グラウンド ノイズを表すポイントの除外を許可するように削除切断セグメントをチェックしてください。除外の上限を定義する次のステップで最大のギャップの長さを示します。
- バック グラウンド減算は、ガウス フィルターを使用してすべてのボクセルの背景強度を推定するためのしきい値を調整します。
- 近似の断面積アルゴリズムを用いたデンドライト径自動しきい値を設定します。
- 背骨の計算の手順をスキップします。
- 処理を完了し、目的のスタイルと色を選択します。
- 再建された軸索のみを表示するプロパティで [ボリューム] ボックスをオフにします。
- [統計] タブには、詳細を選択します。No.フィラメントを使用します。デンドライト ターミナル ポイントモーター軸索分枝の指標として運動神経終末を定量化します。
注: 統計的注釈を追加することができます希望する場合。 - .Tif ファイルとして再建された軸索のイメージをエクスポートします。
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Representative Results
LSFM では、マウスで MN 軌道と軸索分枝の 3次元可視化詳細な胚を提供しています。[明るい] フィールドで、組織は商業消去試薬に浸漬されて後完全に透明に表示します。1 週間前にイメージング試薬をクリア内のストレージの後収縮またはサンプルの腫れが気づかなかっただった。蛍光チャネルの下で運動ニューロンは transgenically 表現される GFP (映画 1) が付いています。いくつかのインスタンスでは、軸索の構造の詳細が損なわれます。たとえば、図 2は、低品質の画像を表します。いくつかの要因には、画像品質が低下します。まず、十分な透過および洗浄ステップは高いバック グラウンド信号を可能性があります。第二に、不十分なオフになって組織を光の散乱は、不鮮明な画像になります。最後に、最適なサンプル画像集録中の位置可能性があります光散乱を増やすか光のパスをブロックします。
画像軸索分枝をすべて細かく葉状構造をできるように、倍率を調整ことができますさらに詳しく、定量化を実行 (映画 2) を明らかにしました。シングル ・ デュアル ・ サイド イルミネーションの画像を比較すると、分枝パターン (図 3) の最適な解像度を判断する必要があります。イメージング解析ソフトウェアは、個々 の前肢神経 (図 4) の軸索分枝パターンを再構築する使用ことができます。開始点およびシード ポイント検出の直径を定義する、これらの葉状構造が半自動的に検出・ バック グラウンド信号は手動で削除中計算。"フィラメント-号を使いましたモーター軸索分枝のインジケーターとして個々 の神経の合計運動神経終末を計算するデンドライト ターミナル Pts"関数モード。さらに、分岐の長さ、平均直径およびボリューム計算できます「フィラメント-樹状突起の長さ」、「フィラメント-デンドライト意味径」と「フィラメント-デンドライト ボリューム」、それぞれ使用しています。
図 1: サンプルのセットアップのグラフィック図です。(A) サンプル準備中、胚最初断頭され骨抜きに。前肢は破線の線に沿って解剖しました。(B) 試料室のサンプル、光パスに沿って目的の全体の地域を保つために配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: E12.5 トランスジェニック マウス胚 (Hb9::GFP) の上半分のビューの大きなフィールドのシート蛍光顕微鏡の光します。映画は、明らかに、支配のターゲットに脊髄から突出する運動神経を示します。3 D 画像を 0.3 倍片面イルミネーション、30 ms の露光時間と後で画像解析ソフトウェアを使用してビデオに加工され、最初取得します。スケール バーを表します 500 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
図 2: 高いバック グラウンド信号とぼけ領域 (青い矢印) 低画質の例です。サンプル調製と画像集録時に不適切な手順は軸索分枝の任意の後続の定量化の精度を危うく障害の画像品質をもたらすかもしれない。画像にあるスケール バーを表します 200 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
映画 2: E12.5 前肢の可視化神経 X. 0.6 の倍率でデュアル サイド照明下で 488 nm 励起拡大されたムービーは、個々 の神経上すべての罰金の葉状構造のはっきりとパノラマの可視化を許可します。スケール バーを表す 300 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
図 3: シングル ・ デュアル ・ サイド照明比較。左と右の両方のイルミネーションは、デュアル サイド イルミネーションから合成した画像は分枝パターンのより完全なビューを提供しています一方 (赤矢印)、のみ特定の領域の詳細を表示します。しかし、優れた画像品質と時々 短い撮像時間の単一側面のイルミネーションを実現できます。これは、両方の側面から照明パス デュアル サイド イルミネーションの中にぼかしの結果、1 つの平面に完全にあってはならないためにです。画像は、最大強度投影として表示されます。スケール バーを表します 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 次のように色分けされた個々 の前肢神経の軸索分枝を再建: 甲 (赤)、腋窩 (ピンク) ラジアル (青)、後部上腕皮膚 (パープル).楔形の複雑さは、半自動化された手法を使用して検出されたターミナルのエンドポイントの数によって計算されました。Autopath (ループなし) アルゴリズムは、フィラメントをトレースし、ユーザー定義の開始点からのシード ポイントを検出します。両方の画像でスケール バーを表します 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
特定の状況で変更は、プロトコルのいくつかの手順を受ける場合があります。たとえば、固定の期間はたてパラホルムアルデヒドを使用して 1 つ以上の日に 2 h から様々 な胚の年齢によって異なります。抗体タンパク質架橋に敏感なため、全体のマウント染色前に固定されるので、代替の固定剤としてメタノールを使用できます。染色時に高い信号対雑音比、洗剤の濃度を最適化する必要がある (0.1 0.5%)。求による追加洗車手順前に、と抗体の孵化後も信号対雑音比を増やすことができます。さらに、組織のクリア ステップと光パスが深い軸索投射の全体を通じてブロックされたであることを確認することが重要です。組織の透明性を高めるためには、再サンプル溶液中に浸漬によってクリアリングの効果を逆転させる、商業決済エージェントで潜伏中に PBS の最小限の導入を確保するため重要です。そうでなければ、高い屈折または清算期間と消去試薬をお勧めします。一方、画像集録中のパラメーターは、異なるサンプルの間で異なります。デュアル サイドの照明と多視点画像より被写し界深度と拡張された詳細イメージングが可能ことがあります。しかし、以来、さまざまな角度から照明を同時に取得すると、単一側面のイルミネーションは小さい標本または移動のサンプルの効率的です。良い品質のイメージは、以下の定量分析の精度を保証します。
私たちのグループによってそれらを含むこれまでの研究は、共焦点イメージングまたはHb9::GFP胚10,15,のモーター軸索ナビゲーション プロセスまたは分枝パターンを観察する 2 光子顕微鏡を利用して16,17. 我々 の経験に基づいて、我々 が信じるこれらに優れていることを LSFM から他の 2 つの方法: 1) イメージングの時間を大幅に軽減として LSFM は、イメージング、生成や試料の毒性を最小限に抑えながらより迅速かつ高品質を提供しています。標本は、本質的な光学セクション14,18,19を作成照明板が薄く側から照らされます。光シートのセンターは、照射軸に直交する検出システムの焦点面に収束します。その結果、アウト フォーカス ライトが減り、全体の標本、削減の退色20ではなく、すなわち、すべての画像の焦点の平面内で唯一 fluorophores が付いてが照らされます。2) 分枝パターンの詳細は、大いにより良い説明された LSFM により、多視点画像です。スライド マウントした標本、代わりに x、y、および z 次元に沿って動き、垂直軸の周りの回転が可能であるような方法で添付されます。別の飛行機とビューからの画像は、等方性より多くの 3 D 画像を生成するスタックされます。しかし、LSFM もに各イメージの作成された大規模なファイルのサイズの点で共焦点および光子のアプローチに比べて制限があります。これらの長所と短所を使用するイメージング方法を決めるときに考慮する必要が、最終的に選択するか顕微鏡によるハードウェア/ソフトウェアがリクエストを承ります。
一言で言えば、このプロトコルを組み合わせた全取り付ける染色、新式のシート 3 D イメージング、一緒に画像解析ソフトウェアの定量化の光します。このプロトコルだけでなくモーター軸索ナビゲーションと胚軸索分枝複雑さの定量における軌道可視化する新しいパラダイムを提供しますと他のニューロン システム (すなわち、感覚ニューロン) にも適用できると考えています適切なトランスジェニック マウス。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
LSFM 実験とデータ解析をさん・ シュー-chen シェンの援助と中央研究院の一部で楽器サービス部門の高度な光学顕微鏡を使用して行った。イメージング コア施設の IMB の Imaris 画像解析にかなりのテクニカル サポートからスー Ping リーさんに感謝いたします。IMB の科学英語編集コアは、原稿を検討しました。この作品は NHRI (NHRI-EX106-10315NC)、(104-2311-B-001-030-MY3) 最もアカデミア シニカ キャリア ・ デベロップメント賞 (CDA-107-L05) によって資金を供給します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
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