Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.
Abstract
Spinale motorische neuronen (MNs) breiden hun axonen om te communiceren met hun innervating doelen, waardoor beheersing van beweging en complexe taken in gewervelden. Het is dus van cruciaal belang voor het ontdekken van de moleculaire mechanismen van hoe motor axonen Navigeer naar arborize en hun perifere spier innervate richt zich tijdens het ontwikkelen en degeneratie. Hoewel transgene Hb9::GFP muis lijnen lang diende hebben te visualiseren motor axon trajecten tijdens de embryonale ontwikkeling, gedetailleerde beschrijvingen van het volledige spectrum van axon terminal arborization onvolledig als gevolg van de complexiteit van de patroon blijven en beperkingen van de huidige optische microscopie. Hier beschrijven we een verbeterde protocol dat combineert licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) en robuuste beeldanalyse kwalitatief en kwantitatief visualiseren ontwikkelen van motorische axonen. Dit systeem kan gemakkelijk worden vastgesteld om het Kruis genetische mutanten of MN ziekte modellen met Hb9::GFP lijnen, onthullende roman moleculaire mechanismen die tot defecten in motor axon navigatie en arborization leiden.
Introduction
Spinale MNs zijn het deel van het centrale zenuwstelsel maar innervate perifere spieren om te controleren van de beweging. De ontwikkelende ruggenmerg, zijn volgens de signalen afkomstig van de chorda en de aangrenzende somieten MN progenitoren (pMNs) gevestigd. Alle post mitotische MNs gedifferentieerd zijn vervolgens gegenereerd op basis van pMNs, die uiteindelijk aanleiding geven tot een reeks van MN subtypen langs de as van de rostrocaudal van het ruggenmerg1,2. Spinale MNs zijn topografisch en anatomisch goed georganiseerd. Hun morfologische overeenkomst correleert met de positie van hun respectieve doel in de periferie-3. Bij het bereiken van hun doelen spier, axonen ontvangen neurotrophic cellulaire en exogene factoren die veroorzaken ze uit te breiden en tak verder in spieren. Innervatie arm en vertakkende gebreken kunnen bijdragen aan het uitblijven van neuromusculaire kruispunten (NMJ) vormen. Bijvoorbeeld gliale-afgeleide neurotrophic factoren (GDNF)-geïnduceerde Pea3 is onmisbaar voor axon arborization in cutane maximus (CM) en latissimus dorsi (LD) spieren4,5. Bovendien, tonen DINE knockout muis embryo's defecte arborization van phrenic zenuwen in het middenrif, respiratoir falen en mortaliteit veroorzaakt onmiddellijk na de geboorte6,7. Deze laatste stap van MN rijping (d.w.z., axonale projectie en vertakking) is daarom van cruciaal belang om communicatie tussen de neuronen en doelcellen.
Als u wilt bekijken arborization patronen, gedrag onderzoekers normaal confocal imaging of de lichte microscopie van de twee-foton fluorescentie van verdeelde of geheel-mount monsters8,9,10. Beide microscopie technieken genereren aanvaardbare resolutie en diepte penetratie. De lichte microscopie van twee-foton fluorescentie omvat excitatie van fluorophores door gelijktijdige absorptie van twee lage-energie fotonen11. Aangezien twee-foton excitatie nabij-infrarood straling gebruikt, bijdraagt de verminderde excitatie-frequentie aan verminderde verstrooiing en betere weefsel penetratie tot 1 mm in weefsel, waardoor beeldbewerking met meer diepte. Confocale microscopie verwijdert u door filters de out-of-focus signalen en verzamelt enkel licht binnen het brandvlak12. Met deze aanpak, kunnen beelden van monsters van verschillende focale vlakken worden gecombineerd voor de productie van een driedimensionaal (3D) beeld via de functie van een Z-stack. Niettemin, signaalsterkte wordt verminderd, zoals de meeste van het licht wordt geblokkeerd en hoge numerieke openingen de diepte-van-veld verdoezelen. Nog belangrijker, bijdragen beide technieken tot de ernstige photodamage en fototoxiciteit aangezien het hele model verlichting, krijgt zelfs wanneer slechts één vliegtuig is beeld op een bepaald moment.
Om te omzeilen deze tekortkomingen, LSFM een favoriet alternatief, met de voordelen van het snel en licht-efficiënt, en minder fototoxische13,14geworden. Verder staat LSFM Multi-View imaging. Deze aanpak is bijzonder geschikt voor het visualiseren van motorische axonen en hun verspreiden terminals zoals ze verspreid via 3D-ruimte. LSFM beter presteert dan de andere twee opties omdat monsters zijn gemonteerd op een podium waarmee rotatie rond een verticale as en bewegingen langs de x-, y- en z-assen. Niet alleen kunt deze set-up voor een minimaal geblokkeerde weergave van het monster, maar ook de keuze van een wenselijk verlichting pad, een tekortkoming van de twee-foton en confocal microscopie, die beide montage van monsters op een vlakke dia vereisen. LSFM is daarom het meest geschikte instrument voor 3D beeldvorming van axon arborization en kwantificering van de terminals van de motorische zenuw in muis embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle levende dieren werden bewaard in een specifieke pathogene vrije (SPF) dier faciliteit, erkende en onder toezicht van de IACUC van de Academia Sinica.
1. fixatie
- Verzamelen van de embryo's van embryonale dag 12,5 (E12.5) dan onthoofden en ze verwijderen van de ingewanden.
- Corrigeer de embryo's afzonderlijk in 24-Wells-platen met 1 mL/goed van vers bereide 4% paraformaldehyde in 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) 's nachts. Incubeer bij 4 ° C op een shaker.
- Wassen van de vaste embryo's ten minste 3 x, elk voor 5-10 min, met 1 mL 1 x PBS en na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een shaker te verwijderen van de resterende paraformaldehyde.
2. geheel-mount immunokleuring
- Permeabilize elk embryo in 1 mL 0,5% PBS-Triton-X-100 (PBST) 's nachts bij 4 ° C op een shaker.
- Blokkeren van elk monster met 1 mL 10% FBS bereid in 1 x PBS's nachts bij 4 ° C op een shaker.
- Incubeer het embryo met 1 mL anti-GFP primair antilichaam (1:1, 000 verdunning in 10% FBS) bij 4 ° C gedurende 72 uur met constante schudden intensiveren van het GFP-signaal van de motorzenuwen.
- Na de primaire antilichaam-incubatie, wassen met 1 mL van 0,5% PBST in de loop van 1-2 dagen bij 4 ° C op een shaker, veranderen de 0,5% PBST ten minste driemaal.
- 1 mL van secundair antilichaam van toepassing (1:1, 000 verdunning in 10% FBS) en na een nacht bebroeden in het donker bij 4 ° C, met constante schudden.
- 3 x met 1 mL 0,5% wassen PBST bij 4 ° C op een shaker in de loop van 2-3 dagen. Monsters in 1 x PBS houden bij 4 ° C tot de dag voor de beeldvorming.
Opmerking: Embryo's kunnen worden ontleed in kleinere segmenten voor clearing, afhankelijk van welk deel van de embryo's image zal worden gemaakt. Voorpoten worden bewaard in deze experimentele aanpak (figuur 1A). - Incubeer het embryo in een commerciële clearing reagens met een brekingsindex voor 1,49 nD in een tube van 1,5 mL, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur 's nachts, zodat het embryo transparant is voor de beeldvorming worden weergegeven.
Opmerking: Het volume van het clearing reagens is ongeveer vijf keer het monstervolume.
3. LSFM (2 – 3 h)
-
Monster set-up
- Instellen van 5 X / 0,1 verlichting optica en 5 X / 0.16 detectie optica. Monteer de monsterhouder en monster capillair (1,5 mm binnendiameter, groen) en plaats hen in de Microscoop.
Opmerking: Raadpleeg de Microscoop de operationele handleiding voor gedetailleerde set-up procedures. - Mount het embryo als volgt:
- De P200 Pipetteer tip voor te bereiden door het snijden van het bovenste gedeelte weg zodat deze de diameter van het capillair past en verwijder het puntige gedeelte (~ 3 mm) voor de bevestiging van het monster.
- Smelt de afgestompte einde van het uiteinde van de pipet met behulp van een kleine vlam.
- Doven van de vlam en snel hechten het embryo verticaal op het gesmolten einde.
- Het bovenste gedeelte van het uiteinde van de pipet met het monster capillaire passen.
- Laat de kamer buffer equilibreer met het embryo voor 1 min naar duidelijk uit puin of bellen.
- Met behulp van het imaging software, selecteer zoeken capillaire onder het tabblad zoeken en aanpassen van de x, y, z-as positie van de capillaire monster.
- Selecteer zoeken monster en zoom om 0,6 X te concentreren op het embryo. Draai het embryo om ervoor te zorgen dat de lengteas van de verbeelde ledemaat wordt uitgelijnd met het licht pad van de twee lichtbronnen (figuur 1B).
- Instellen van 5 X / 0,1 verlichting optica en 5 X / 0.16 detectie optica. Monteer de monsterhouder en monster capillair (1,5 mm binnendiameter, groen) en plaats hen in de Microscoop.
-
Beeldacquisitie
- Onder het tabblad overname Definieer de lichtpad parameters zoals de doelstellingen van de detectie, laser blokkeren filter, balk splitter, camera's en lasers.
Opmerking: Het GFP-kanaal wordt gebruikt in dit experiment (excitatie golflengte: 488 nm, emissie filter: BP 505 naar 545 nm, balk splitter: SPS LP 560). - Vink het selectievakje aan van pivot, scan voor vermindering van de schaduw.
- De overname-instellingen definiëren: bitdiepte, 16 bit; zoom, 0.36-0.7 X; verlichting van de één-kant (links/rechts) of dual-side verlichting.
- Klikt u op doorlopend en stelt u de intensiteit van de laser, belichtingstijd, laser macht en lichte blad positie te verwerven scherpere beelden.
Opmerking: De kracht van de laser is zo laag mogelijk te minimaliseren photodamage. - Druk op STOP om einde Beeldacquisitie.
- Onder het tabblad overname Definieer de lichtpad parameters zoals de doelstellingen van de detectie, laser blokkeren filter, balk splitter, camera's en lasers.
-
Multidimensionale overname
- De z-stack definiëren door het bewegen van de Z-positie voor de eerste en de laatste afbeelding. Klik op de optimale om in te stellen van de Segmentnummer.
- Klik op Start Experiment te verwerven van de geselecteerde z-stack.
- Als het klaar is, sla de afbeelding in .czi formaat.
-
Beeldverwerking (optioneel)
- Ga verder met dubbele kant fusie onder het kanaal Lightsheet verwerking als dual-side verlichting wordt toegepast. Multiview verwerking is noodzakelijk als meerdere weergaven zijn verworven uit te beelden vanuit meerdere invalshoeken combineren.
- Maak een 2D beeld met behulp van gegevens uit de hoogste intensiteit pixels langs de as van de projectie onder de Maximale intensiteit projectie -kanaal.
- Klik onder kopie kanaal, op Subset Schakel deelverzamelingen van afbeeldingen uit de oorspronkelijke set.
4. kwantificering van Axon Arborization (30 min. voor elke individuele zenuw)
- Open het afbeeldingsbestand in de beeldvorming analysesoftware (standaard de afbeelding met de XYZ gegevens is geopend in Surpass modus en als een 3D-gerenderde weergave).
- De afbeelding kleur, helderheid, aanpassen en het contrast met behulp van het venster Weergave aanpassing (Edit | Toon Display aanpassing) te detecteren door samensmelting van filamenten op basis van lokale intensiteit contrast.
- Klik op het pictogram Nieuwe filamenten toevoegen en selecteer de Autopath (geen lus) algoritme in het drop-down menu.
- Selecteer de regio van belang (in dit geval de segmenting axon van belang). Klik op volgende wanneer u klaar bent.
- Definieer de begin- en zaad punten door de diameter van de grootste en dunste metingen, die kunnen worden gemeten met behulp van de Slice -modus toe te wijzen.
- Het toewijzen van een startpunt aan de rand van de regio van belang. Om te bereiken manuele toevoeging of verwijdering van de uitgangspunten, wijzigt u eerst de aanwijzer modus (navigeren | Select) en vervolgens Shift + Klik met de rechtermuisknop op de punten van belang.
- Selecteer Handmatige drempelwaarden voor zaad punten om ervoor te zorgen dat alle van de zichtbare arborization is gemarkeerd. Wijzig de aanwijzer-modus (navigeren | Select) en vervolgens Shift + Klik met de linkermuisknop op de punten van belang handmatig toevoegen of verwijderen van de zaad punten.
Opmerking: Het is belangrijk dat het handmatig verwijderen van achtergrondgeluiden en signalen van naburige zenuwen. - Vink het selectievakje verwijderen zaad punten rond de uitgangspunten.
- Controleer verwijderen verbroken segmenten zodat de uitsluiting van de punten die te ver weg zijn en dat de achtergrondgeluiden kan vertegenwoordigen. De Maximumlengte van de kloof in de volgende stap als u wilt definiëren de bovengrens voor uitsluiting geven.
- De drempel voor achtergrond aftrekken, die gebruik maakt van een Gaussiaans filter te schatten van de intensiteit van de achtergrond van elke voxel aanpassen.
- Stel Automatische drempel voor dendriet diameter met behulp van het algoritme van de geschatte dwarsdoorsnede gebied .
- Sla de stappen voor de berekening van de wervelkolom.
- Afwerking van het proces en kies de gewenste stijl en kleur.
- Uncheck de doos van het volume in de Eigenschappen bekijken alleen de gereconstrueerde axonen.
- Selecteer het tabblad Statistieken gedetailleerd. Gebruik gloeidraad Nee. Dendriet Terminal punten te kwantificeren van de motorische zenuw terminals als indicator van de arborization van de motor axon.
Opmerking: Statistische aantekening kan worden toegevoegd indien gewenst. - Het beeld van de gereconstrueerde axon exporteren als een TIF-bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSFM biedt gedetailleerde 3D visualisatie van MN baan en axon arborization in muis embryo's. Onder heldere veld verschijnen weefsels volledig transparant na ondergedompeld worden in de commerciële clearing-reagens. Geen krimp of zwelling van het monster werd opgemerkt na maximaal een week van opslag in het reagens voor imaging ontruimen. Onder fluorescentie kanaal, worden motorische neuronen aangeduid met transgenically uitgedrukt GFP (film 1). In sommige bijvoorbeeld details van de structuur van de axon in gevaar komen. Figuur 2 geeft bijvoorbeeld lage kwaliteit imaging. Verschillende factoren kunnen belemmeren imaging kwaliteit. In de eerste plaats kunnen onvoldoende permeabilization en wassen stappen leiden tot hoge achtergrond signaal. Ten tweede, lichtverstrooiing door onvoldoende gewiste weefsel zal resulteren in wazige beelden. Tot slot misschien suboptimaal monster positionering tijdens Beeldacquisitie lichtverstrooiing verhogen of blokkeren van het licht weg.
Naar afbeelding axon arborization uitvoeriger en uit te voeren van de kwantificering, vergroting kan worden aangepast, zodat elke fijn arborized structuur kan worden geopenbaard (Movie 2). Beelden van single - en dual-side verlichting moeten worden vergeleken om te bepalen van de optimale resolutie van arborization patroon (Figuur 3). Imaging-analysesoftware kan vervolgens worden gebruikt voor de wederopbouw van de axon arborization patronen voor individuele voorpoot zenuwen (Figuur 4). Door het definiëren van het startpunt en de diameter voor zaad punt detectie, kunnen deze arborized structuren semi-automatisch worden gedetecteerd en berekend terwijl achtergrond signalen handmatig worden verwijderd. We gebruikten de "Filament - nr. Dendriet Terminal Pts"functie modus voor het berekenen van de totale motorische zenuw terminals van afzonderlijke zenuwen als indicator van de arborization van de motor axon. Bovendien, kunnen tak lengte, gemiddelde diameter en volume worden berekend met behulp van "Filament - dendriet lengte", "Filament - dendriet bedoel Diameter" en "Filament - dendriet Volume", respectievelijk.
Figuur 1: grafische illustratie van monster set-up. (A) tijdens de bereiding van de monsters, embryo's zijn eerste onthoofd en gestript. Voorpoten worden ontleed langs de stippellijn. (B) In de monsterkamer, monsters zijn gepositioneerd om te houden van de hele regio van belang langs het licht weg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: licht blad fluorescentie microscopie van een groot gezichtsveld van de bovenste helft van een E12.5 transgene muis embryo (Hb9::GFP). De film toont duidelijk de motorzenuwen projecteren vanuit het ruggenmerg naar hun innervating doelen. De 3D-afbeelding wordt eerst verworven onder 0,3 X vergroting met single-side verlichting en 30 ms belichtingstijd en later tot video met behulp van de software van de analyse van de afbeelding wordt verwerkt. Schaal staaf vertegenwoordigt 500 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 2: voorbeeld van een lage kwaliteit beeld met hoge achtergrond signaal en vervaagde regio's (blauwe pijlen). De onjuiste stappen tijdens de sample voorbereiding en beeld overname kunnen leiden tot de verminderde beeldkwaliteit de nauwkeurigheid van elke daaropvolgende kwantificering van axon arborization in gevaar brengen. Schaal in de afbeelding balk 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Movie 2: visualisatie van E12.5 voorpoot zenuwen onder 488 nm excitatie met dual-side verlichting bij een vergroting van 0,6 X. De film ingezoomd-in maakt duidelijk en panoramische visualisatie van elke fijn arborized structuren op afzonderlijke zenuwen. Schaal staaf vertegenwoordigt 300 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 3: vergelijking tussen single - en dual-side verlichting. Zowel links als rechts illuminations weergeven details voor bepaalde gebieden alleen (rode pijlen), overwegende dat een gecombineerde image van dual-side illuminations een vollediger beeld van de arborization-patroon biedt. Single-side verlichting kan echter worden bereikt in een kortere tijd van beeldvorming en soms met betere beeldkwaliteit. Dit is vanwege het feit dat verlichting paden van beide kanten kunnen niet perfect op een enkel vliegtuig, wat resulteert in het vervagen tijdens dual-side illuminations liggen. Afbeeldingen worden weergegeven als maximale intensiteit projectie. Schaal staaf vertegenwoordigt 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de wederopbouw van de axon arborization van individuele voorpoot zenuwen, vergelijkende als volgt: suprascapular (rood), axillaire (roze), radiaal (blauw), posterior brachialis cutane (paars). Complexiteit van de arborization werd berekend volgens het aantal terminal eindpunten gedetecteerd met behulp van onze semi-geautomatiseerde methode. De Autopath (geen lus) algoritme sporen door samensmelting van filamenten en detecteert zaad punten van gebruiker gedefinieerde uitgangspunten. Schaal in beide afbeeldingen balk 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende stappen in het protocol kunnen worden onderworpen aan wijzigingen onder bepaalde omstandigheden. De duur van fixatie hangt bijvoorbeeld af van de leeftijd, van de embryo's, variërend van 2 h tot 1 of meer dagen met behulp van vers-en-klare paraformaldehyde. Aangezien de fixatie wordt uitgevoerd vóór de hele berg immunokleuring, op antilichamen die gevoelig voor eiwit crosslinking zijn, kan methanol worden gebruikt als een alternatieve kleefpoeders agent. Voor een hoge signaal-/ ruisverhouding na kleuring, is het noodzakelijk voor het optimaliseren van het wasmiddel concentratie (tussen 0,1-0,5%). Extra wassen stappen vóór en na een incubatieperiode van antilichaam kunnen ook het verhogen van de signal-to-noise verhouding. Daarnaast is een weefsel-clearing stap is belangrijk om ervoor te zorgen dat het licht weg gedeblokkeerd in heel diep axonale projecties. Om weefsel transparantie te verbeteren, is het belangrijk om minimale invoering van PBS tijdens de incubatie in de commerciële clearing agent, zoals het effect van de clearing wordt omgekeerd door monsters in bufferoplossingen opnieuw onder te dompelen. Anders, een clearing-reagens met een hogere refractive index of een langere periode van clearing is aanbevolen. Ondertussen, parameters tijdens Beeldacquisitie variëren tussen verschillende monsters. Dual-side verlichting en multiview imaging mogelijk beeldbewerking met meer diepte-van-veld en verbeterde detail. Aangezien verlichting vanuit verschillende invalshoeken gelijktijdig verworven wordt, is één-kant verlichting echter efficiënter voor kleinere exemplaren of bewegende monsters. Een afbeelding van goede kwaliteit zorgt voor nauwkeurigheid voor de volgende kwantitatieve analyses.
Eerdere studies, met inbegrip van die van onze fractie hebben gebruikt ofwel confocal beeldbewerkings- of twee-foton microscopie te observeren de motor axon navigatie proces of arborization patroon in Hb9::GFP embryo's10,15, 16 , 17. op basis van onze ervaring, wij geloven LSFM te zijn superieur aan deze andere twee methoden sinds: 1) Imaging tijd grotendeels wordt verminderd als LSFM meer snelle en hogere kwaliteit imaging biedt, terwijl het minimaliseren van photodamage en fototoxiciteit van monsters. Specimens worden belicht van de zijde met een dun licht blad, waardoor een intrinsieke optische sectie14,18,19. Het centrum van het lichte blad convergeert met het brandvlak van de detectiesysteem, dat loodrecht op de as van de verlichting is. Bijgevolg, out-of-focus licht wordt verminderd en enige fluorophores binnen het brandvlak voor elk beeld, dat wil zeggen, in plaats van het gehele model, waardoor vermindering photobleaching20worden belicht. 2) de details van het patroon van de arborization zijn veel beter geïllustreerd als LSFM multiview imaging toelaat. In plaats van het model wordt gemonteerd op een dia, vastzit op zodanige wijze dat de rotatie rond een verticale as mogelijk, is omdat bewegingen langs de x-, y- en z-afmetingen zijn. De beelden van de verschillende vliegtuigen en weergaven worden gestapeld om meer isotrope 3D beelden te produceren. LSFM heeft echter ook een beperking in vergelijking met confocale en twee-foton benaderingen op het gebied van de enorme bestandsgrootte voor elke afbeelding gemaakt. Deze voor- en nadelen moeten worden afgewogen bij de beslissing welke beeldvorming methode te gebruiken, maar uiteindelijk de keuze zal afhangen van welke microscopische hardware/software beschikbaar op aanvraag is.
Kortom, dit protocol combineert geheel-mount immunokleuring, state-of-the-art licht blad 3D-beeldbewerking, samen met kwantificering in de software van de analyse van de afbeelding. Wij geloven dat dit protocol biedt niet alleen een nieuw paradigma voor het visualiseren van motor axon navigatie en trajecten in embryo's met kwantificatie van axon arborization complexiteit maar kan ook worden toegepast op andere neuron-systemen (d.w.z., sensorische neuronen) met passende transgene muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
LSFM experimenten en data-analyse werden uitgevoerd gedeeltelijk met behulp van de geavanceerde optische microscopen van de afdeling van de dienst van de Instrument in de Academia Sinica en met de hulp van Ms. Shu-Chen Shen. Wij danken mevrouw Sue-Ping Lee van de Imaging Core faciliteit van IMB voor aanzienlijke technische bijstand met Imaris beeldanalyse. Van de IMB wetenschappelijke Engelse bewerken Core herzien het manuscript. Dit werk wordt gefinancierd door de Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), meest (104-2311-B-001-030-MY3) en NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
