Summary
Her, beskriver vi en protokol til at visualisere motorneuron projektion og axon arborization i transgene Hb9::GFP mus embryoner. Efter immunfarvning for motoriske neuroner brugte vi lys ark Fluorescens mikroskopi billede embryoner til efterfølgende kvantitativ analyse. Denne protokol finder anvendelse på andre neuron navigation processer i centralnervesystemet.
Abstract
Spinal motor neuroner (MNs) udvide deres axoner til at kommunikere med deres innervating mål, derved kontrollere bevægelse og komplekse opgaver i hvirveldyr. Det er således afgørende for at afdække de molekylære mekanismer af hvordan motor axoner navigere til, arborize og innerverer deres perifere muskel mål i løbet af udvikling og degeneration. Selvom transgene Hb9::GFP mus linjer har længe tjente til at visualisere motor axon baner under fosterudviklingen, detaljerede beskrivelser af hele spektret af axon terminal arborization fortsat er ufuldstændige på grund af mønster kompleksiteten og begrænsninger af nuværende Optisk mikroskopi. Her, beskriver vi en forbedret protokol, der kombinerer lette ark Fluorescens mikroskopi (LSFM) og robust billedanalyse til kvalitativt og kvantitativt visualisere udvikle motoriske axoner. Dette system kan let vedtages for at krydse genetiske mutanter eller MN sygdomsmodeller med Hb9::GFP linier, afslørende roman molekylære mekanismer, der fører til fejl i motor axon navigation og arborization.
Introduction
Spinal MNs er del af det centrale nervesystem, men innerverer perifere muskler til at styre bevægelsen. I udvikle rygmarven, er MN stamfaderen (pMNs) udarbejdet i overensstemmelse med signalerne fra notochord og tilgrænsende somites. Alle opdelte post mitotiske MNs genereres derefter fra pMNs, i sidste ende giver anledning til en række MN undertyper langs rostrocaudal aksen af rygmarven1,2. Spinal MNs er Topografisk og anatomisk godt organiseret. Deres morfologiske arrangement korrelerer med placeringen af deres respektive mål i periferien3. Efter at nå deres mål, muskel, axoner modtage cellulære og eksogen neurotrope faktorer, at få dem til at udvide og filial yderligere ind i musklerne. Innervation og forgrening defekter kan bidrage til at danne neuromuskulære vejkryds (NMJ). For eksempel glial-afledte neurotrope faktorer (GDNF)-induceret Pea3 er uundværlig for axon arborization til kutane maximus (CM) og latissimus dorsi (LD) muskler4,5. Derudover vise Spis knockout mus embryoner defekte arborization af phrenic nerver i mellemgulvet, forårsager respirationssvigt og dødelighed umiddelbart efter fødslen6,7. Dette sidste trin i MN modning (dvs., cytoskeletale projektion og forgrening) er derfor afgørende at sikre kommunikationen mellem neuroner og target-cellerne.
For at få arborization mønstre, foretage forskere normalt Konfokal imaging eller to-foton fluorescens lysmikroskopi sektioneret eller hele-mount prøver8,9,10. Begge disse mikroskopi-teknikker generere acceptabel opløsning og dybde penetration. To-foton fluorescens lysmikroskopi indebærer excitation af fluorophores ved samtidige absorption af to lavere-energi fotoner11. Da to-foton excitation bruger nær-infrarød stråling, bidrager nedsat excitation frekvens til reduceret spredning og bedre væv penetration op til 1 mm i væv, således at billeddannelse med større dybde. Konfokal mikroskopi fjerner af filtre out-of-fokus-signaler og kun indsamler lys inden for brændplanet12. Med denne fremgangsmåde, kan billeder af prøver fra forskellige fokale planer kombineres for at producere et tre-dimensionelle (3D) billede via en Z-stakken funktion. Ikke desto mindre reduceres signal intensitet som de fleste af lys er blokeret og høj numeriske åbninger obskure dybde-af-felt. Endnu vigtigere, bidrage begge teknikker til svær solskader og fototoksicitet da hele prøven modtager belysning, selv når kun ét fly er afbildet på et givet tidspunkt.
For at omgå disse mangler, er LSFM blevet et yndet alternativ med fordelene ved at være hurtig, lys-effektiv, og mindre fototoksisk13,14. Desuden giver LSFM multi-view billeddannelse. Denne fremgangsmåde er især velegnet til at visualisere motor axoner og deres sprede terminaler, som de spredes gennem 3D-rum. LSFM udkonkurrerer de andre to muligheder, fordi prøver er monteret på en scene, der tillader rotation omkring en lodret akse og bevægelser langs x, y og z-akser. Dette set-up giver ikke kun mulighed for en minimalt blokerede visning af prøven men også valget af en ønskelig belysning sti, en mangel ved to-foton og konfokal mikroskopi, som begge kræver montering af prøver på en flad dias. LSFM er derfor den mest velegnede værktøj til 3D imaging af axon arborization og til kvantificering af motoriske nerve terminaler i mus embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle levende dyr var holdt i en specifik pathogen gratis (SPF) Dyrefacilitet, godkendt og overvåget af IACUC af Academia Sinica.
1. fiksation
- Indsamle embryoner af embryonale dag 12,5 (E12.5) og derefter halshugge og rense dem.
- Fix embryonerne individuelt i 24-godt plader med 1 mL/godt af frisklavede 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x fosfat buffer saltvand (PBS) natten over. Der inkuberes ved 4 ° C på en shaker.
- Vaske fast embryoner mindst 3 x, hver med 5-10 min, med 1 mL af 1 x PBS og inkuberes natten over ved 4 ° C på en shaker til at fjerne de resterende PARAFORMALDEHYD.
2. hele-mount immunfarvning
- Permeabilize hver embryo i 1 mL 0,5% PBS-Triton-X-100 (PBST) natten over ved 4 ° C på en shaker.
- Blokere hver prøve med 1 mL 10% FBS forberedt i 1 x PBS natten over ved 4 ° C på en shaker.
- Inkuber embryo med 1 mL af anti-normal god landbrugspraksis primære antistof (1:1, 000 fortynding i 10% FBS) ved 4 ° C for 72 h med konstant ryster for at intensivere normal god landbrugspraksis signal af motoriske nerver.
- Efter inkubationen primære antistof vaske med 1 mL 0,5% PBST i løbet af 1-2 dage ved 4 ° C på en shaker, ændre 0,5% PBST mindst tre gange.
- Anvende 1 mL sekundær antistof (1:1, 000 fortynding i 10% FBS), og der inkuberes natten i mørke ved 4 ° C under konstant omrystning.
- Vask 3 x med 1 mL 0,5% PBST ved 4 ° C på en shaker i løbet af 2-3 dage. Holde prøver i 1 x PBS ved 4 ° C indtil dagen før billeddannelse.
Bemærk: Embryoner kan blive dissekeret i mindre segmenter før clearing, afhængigt af hvilken del af embryoner vil blive afbildet. Forbens er bevaret i denne eksperimentelle tilgang (figur 1A). - Inkuber embryo i en kommerciel clearing reagens med et brydningsindeks på 1,49 nD i en 1,5 mL tube, beskyttet mod lys ved rumtemperatur natten over, for at gøre embryonet gennemsigtig for billeddannelse.
Bemærk: Mængden af clearing reagens er cirka fem gange sample volumen.
3. LSFM (2-3 h)
-
Prøven set-up
- Oprettet 5 X / 0,1 belysning optik og 5 X / 0.16 påvisning optik. Samle prøveholderen og prøve kapillær (1,5 mm indre diameter, grønne) og placere dem i mikroskopet.
Bemærk: Henvise til mikroskopet betjeningsvejledning for detaljerede set-up procedurer. - Montere embryoet som følger:
- Forberede P200 pipette tip ved at skære væk den øverste del, således at det passer til diameteren af kapillær og fjerne den spidse del (~ 3 mm) for eksempel udlæg.
- Smelt den afrundede ende af pipette spidsen ved hjælp af en lille flamme.
- Slukke flammen og hurtigt vedhæfte embryo lodret ind i smeltet slutningen.
- Tilpas den øverste del af pipette tip med prøven kapillær.
- Tillad kammer buffer til Reagensglasset med Foster for 1 min at rydde væk debris eller bobler.
- Ved hjælp af billedbehandling software, Vælg Find kapillær under fanen Find og justere x, y, z-akser til at placere prøve kapillær.
- Vælg Find prøven og zoom til 0,6 X at fokusere på fosteret. Rotere Foster for at sikre, at den lange akse af afbildet lemmer flugter med lys stien til de to lyskilder (figur 1B).
- Oprettet 5 X / 0,1 belysning optik og 5 X / 0.16 påvisning optik. Samle prøveholderen og prøve kapillær (1,5 mm indre diameter, grønne) og placere dem i mikroskopet.
-
Billede erhvervelse
- Under fanen erhvervelse definere lys sti parametre såsom afsløring mål, laser blokerer filter, stråledeler, kameraer og lasere.
Bemærk: Normal god landbrugspraksis kanal er brugt i dette eksperiment (Excitation bølgelængde: 488 nm; emission filter: BP 505 til 545 nm, beam splitter: SPS LP 560). - Indskrive pivot scan checkhæfte nemlig skygge reduktion.
- Definer indstillingerne for erhvervelse: bit-dybde, 16 bit; zoom, 0,36-0,7 X; Single-side illumination (venstre/højre) eller dual-side belysning.
- Klik på fortløbende og indstille den laser intensitet, eksponeringstid, laser power og lys ark holdning at erhverve skarpere billeder.
Bemærk: Laser power holdes så lavt som muligt for at minimere solskader. - Tryk på STOP til at afslutte billede erhvervelse.
- Under fanen erhvervelse definere lys sti parametre såsom afsløring mål, laser blokerer filter, stråledeler, kameraer og lasere.
-
Flerdimensionale erhvervelse
- Definere z-stakken ved at flytte Z position til det første og sidste billede. Klik på Optimal for at angive nummeret for skive.
- Klik på Start eksperiment for at erhverve den valgte z-stakken.
- Når det er gjort, skal du gemme billedet i .czi format.
-
Billedbehandling (valgfri)
- Fortsæt med dobbelt side fusion under Lightsheet behandling kanalen hvis dual-side belysning anvendes. MultiView behandling er nødvendig, hvis flere visninger er erhvervet for at kombinere billeder fra flere vinkler.
- Oprette et 2D-billede ved hjælp af data fra de højeste intensitet pixel langs projektionsaksen under den Maksimale intensitet projektion kanal.
- Under kopi kanal, skal du klikke på udsnit for at vælge undersæt af billeder fra det oprindelige sæt.
4. kvantificering af Axon Arborization (30 min. for hver enkelte Nerve)
- Åbne billedfilen i billedbehandlingsprogrammer analyse (som standard åbnes det billede, der indeholder XYZ data i overgå tilstand og som en 3D-afsmeltet visning).
- Justere billedfarve, lysstyrke, og kontrast ved hjælp af vinduet Justeringen af skærmens (Edit | Vis justeringen af skærmens) til at registrere filamenter baseret på lokale intensitet kontrast.
- Klik på ikonet Tilføj ny filamenter og vælg Autopath (ingen loop) algoritme i drop-down menuen.
- Vælg regionen af interesse (i dette tilfælde, den segmenting axon af interesse). Klik på næste når du er færdig.
- Definere start- og frø point ved at tildele de største og tyndest diameter målinger, som kan måles ved hjælp af skive -tilstand.
- Tildele et udgangspunkt på kanten af det pågældende område. For at opnå manuel tilføjelse eller fjernelse af udgangspunktet, først ændre tilstanden pointer (Naviger | Vælg) og derefter Skift + højreklik på punkterne af interesse.
- Vælg Manuel tærskler for frø point til at sikre, at alle de synlige arborization er markeret. Ændre markøren mode (Naviger | Vælg) og derefter Skift + venstre-klik på punkterne af interesse at manuelt tilføje eller fjerne frø point.
Bemærk: Det er vigtigt at manuelt fjerne baggrundsstøj og signaler fra nærliggende nerver. - Marker afkrydsningsfeltet Fjern frø punkter omkring udgangspunkter.
- Kontrollere Fjern afbrudt segmenter for at tillade udelukkelse af punkter, der er for langt væk og der kan repræsentere baggrundsstøj. Angive Maksimumlængden hul i de næste trin for at definere en øvre grænse for udstødelse.
- Justere tærsklen for baggrunden subtraktion, som bruger en Gaussisk filter til at vurdere baggrunden intensiteten af hver voxel.
- Angive automatiske tærskel for dendrit diameter ved hjælp af den omtrentlige tværsnit område algoritme.
- Springe trin for rygsøjlen beregning.
- Afslutte processen og vælge den ønskede stil og farve.
- Uncheck boksen volumen i Egenskaber for at se kun de rekonstruerede axoner.
- Vælg detaljeretunder fanen statistik . Bruge glødetrådens nr. Dendrit Terminal punkter at kvantificere de motoriske nerve terminaler som en indikator for motor axon arborization.
Bemærk: Statistiske anmærkning kan tilføjes hvis ønsket. - Eksportere billede af den rekonstruerede axon som en .tif-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSFM indeholder detaljerede 3D visualisering af MN bane og axon arborization i mus embryoner. Under lysfelt vises væv helt gennemsigtig efter at blive nedsænket i den kommercielle clearing reagens. Ingen svind eller hævelse af prøven blev bemærket efter op til en uge efter opbevaring i clearing reagens før billeddannelse. Under fluorescens kanal, er motoriske neuroner mærket med transgenically udtrykt normal god landbrugspraksis (film 1). I nogle tilfælde, er oplysninger om axon struktur kompromitteret. For eksempel, repræsenterer figur 2 lav kvalitet billeddannelse. Flere faktorer kan hindre billeddiagnostiske kvalitet. For det første, utilstrækkelig permeabilization og vaske trin kan føre til høje baggrund signal. For det andet vil lysspredning gennem utilstrækkeligt ryddet væv resultere i slørede billeder. Endelig kan suboptimal prøve positionering under image erhvervelse øge lysspredning eller blokere den lette vej.
At billedet axon arborization mere detaljeret og til at udføre kvantificering forstørrelse kan justeres, således at hver fint arborized struktur kan være afsløret (Movie 2). Billeder af single - og dual-side belysning bør sammenlignes for at bestemme den optimale opløsning af arborization mønster (figur 3). Imaging analyse software kan derefter bruges til at rekonstruere axon arborization mønstre for individuelle forelimb nerver (figur 4). Ved at definere udgangspunkt og diameter for frø punkt påvisning, kan disse arborized strukturer være semi-automatisk opdaget og beregnet mens baggrunden signaler fjernes manuelt. Vi brugte "glødetråd - No. Dendrit Terminal Pts"funktion tilstand til at beregne de samlede motoriske nerve terminaler af individuelle nerver som en indikator for motor axon arborization. Derudover kan filial længde, gennemsnitlig diameter og volumen beregnes ved hjælp af "Glødetråd - dendrit længde", "Glødetråd - dendrit betyder Diameter" og "Glødetråd - dendrit volumen", henholdsvis.
Figur 1: grafisk illustration af prøven set-up. (A) under prøveforberedelse, embryoner er først halshugget og renses. Forbens er dissekeret langs den stiplede linje. (B) i prøve salen, prøver er positioneret til at holde hele regionen af interesse langs stien lys. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: lys ark Fluorescens mikroskopi af et stort synsfelt i den øverste halvdel af embryonet E12.5 Transgene mus (Hb9::GFP). Filmen viser klart motoriske nerver projektering fra rygmarven til deres innervating mål. 3D-billedet er først erhvervet under 0,3 X forstørrelse med single-side belysning og 30 ms eksponeringstid og senere forarbejdes til video ved hjælp af billede analyse software. Skalalinjen repræsenterer 500 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Figur 2: eksempel på en lav kvalitet billede med høj baggrund signal og sløret regioner (blå pile). De forkert skridt under prøven forberedelse og image erhvervelse kan føre til forringet billedkvalitet at bringe nøjagtigheden af nogen efterfølgende kvantificering af axon arborization. Skalalinjen i billedet repræsenterer 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 2: visualisering af E12.5 forelimb nerver under 488 nm excitation med dual-side belysning ved en forstørrelse på 0,6 X. Zoomet i filmen giver klare og panoramisk visualisering af hver fine arborized strukturer på individuelle nerver. Skalalinjen repræsenterer 300 µm. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Figur 3: sammenligning mellem single - og dual-side illumination. Både venstre og højre illuminations vise detaljer i visse regioner kun (røde pile), mens en kombineret billede fra dual-side illuminations giver et mere fuldstændigt billede af arborization mønsteret. Men enkelt-side belysning kan opnås i en kortere tid, billedbehandling og undertiden med bedre billedkvalitet. Dette er at belysning stier fra begge sider ikke kan ligge perfekt på et enkelt fly, resulterer i sløring under dual-side illuminations. Billeder er vist som maksimal intensitet projektion. Skalalinjen repræsenterer 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: rekonstrueret axon arborization af individuelle forelimb nerver, farvekodede som følger: suprascapular (rød), aksil (pink), radial (blå), posterior brachialis kutane (lilla). Arborization kompleksitet var beregnet efter antallet terminal end-point påvises ved hjælp af vores halvautomatisk metode. Autopath (ingen loop) algoritme spor filamenter og registrerer frø point fra brugerdefinerede udgangspunkter. Skalalinjen i både billeder repræsenterer 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trin i protokollen kan blive udsat for ændringer under visse omstændigheder. For eksempel, afhænger varigheden af fiksering af alder af embryoner, varierende fra 2 h til 1 eller flere dage ved hjælp af frisklavede PARAFORMALDEHYD. Da fiksering er udført før hele mount immunfarvning for antistoffer, der er følsomme over for protein crosslinking, kan methanol bruges som en alternativ Fikseringsvæske agent. For en høj signal-støj forhold ved farvningen, er det nødvendigt at optimere vaskemiddel koncentrationen (mellem 0,1-0,5%). Ekstra vask trin før og efter antistof inkubation kan også øge signal / støj-forhold. Derudover er et væv-clearing skridt vigtigt at sikre, at lys stien er ublokerede hele dybt cytoskeletale fremskrivninger. For at øge væv gennemsigtighed, er det vigtigt at sikre minimal indførelsen af PBS under inkubation i den kommercielle clearing agent, som clearing effekt tilbageføres ved at nedsænke re prøver i buffer løsninger. Ellers anbefales en clearing reagens med en højere brydningsindeks eller clearing længere. I mellemtiden, parametre under image erhvervelse varierer blandt forskellige prøver. Dual-side belysning og multiview imaging kan tillade imaging med større dybde-af-felt og forbedrede detaljer. Men da belysning fra forskellige vinkler er erhvervet samtidig, single-side belysning er mere effektive for mindre enheder eller bevægelige prøver. En god kvalitet image sikrer nøjagtighed for de følgende kvantitative analyser.
Tidligere undersøgelser, herunder dem, som vores gruppe har udnyttet enten Konfokal imaging eller to-foton mikroskopi til at observere motor axon navigation proces eller arborization mønster i Hb9::GFP embryoner10,15, 16 , 17. baseret på vores erfaringer, vi mener LSFM at være overlegen i forhold til disse andre to metoder siden: 1) Imaging tid er i høj grad reduceret da LSFM tilbyder mere hurtig og højere kvalitet imaging, samtidig med at minimere solskader og fototoksicitet af prøver. Enheder er belyst fra siden med en lys tyndplade, hvorved der skabes en iboende optisk sektion14,18,19. Midten af arket lys konvergerer med brændplanet af detektionssystemets, som er ortogonale i forhold til belysning akse. Derfor, ud-af-fokus lys reduceres og kun fluorophores inden for brændplanet er belyst for hvert billede, dvs., i stedet for hele modellen, dermed mindske photobleaching20. 2) nærmere oplysninger om arborization mønsteret er meget bedre illustreret som LSFM tillader multiview billeddannelse. I stedet for modellen er monteret på et dias, er det fastgjort på en sådan måde, at rotation omkring en lodret akse er mulige, som er bevægelser langs x, y og z dimensioner. Billeder fra de forskellige fly og visninger er stablet til at producere mere isotropic 3D billeder. LSFM har imidlertid også en begrænsning i forhold til Konfokal og to-foton tilgange størrelsesmæssigt den massive fil oprettes for hvert billede. Disse fordele og ulemper skal afvejes, når de beslutter hvilke billedbehandling metode at bruge, men i sidste ende valget afhænger som mikroskopiske hardware/software er tilgængelig efter anmodning.
Kort sagt, denne protokol kombinerer hele-mount immunfarvning, state-of-the-art lys ark 3D imaging, sammen med kvantificering i billed analyse software. Vi mener, at denne protokol ikke kun giver et nyt paradigme for visualisere motor axon navigation og baner i embryoner med kvantitering af axon arborization kompleksitet, men kunne også anvendes til andre neuron systemer (dvs., sensoriske neuroner) med relevante Transgene mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
LSFM eksperimenter og dataanalyse blev udført delvist ved hjælp af de avancerede optiske mikroskoper Division Instrument tjeneste i Academia Sinica og med bistand fra Ms. Shu-Chen Shen. Vi takke Ms. Sue-Ping Lee fra den Imaging Core facilitet af IMB for betydelig teknisk bistand med Imaris billedanalyse. IMBS videnskabelige engelsk redigering Core gennemgik håndskriftet. Dette arbejde er finansieret af Academia Sinica karriere udvikling Award (CDA-107-L05), mest (104-2311-B-001-030-MY3) og NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
