Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera motorneuronen projektion och axon arborization i transgena Hb9::GFP musembryon. Efter immunfärgning för motoriska nervceller använde vi ljus ark fluorescensmikroskopi bild embryon för efterföljande kvantitativ analys. Detta protokoll är tillämpligt till andra neuron navigering processer i det centrala nervsystemet.
Abstract
Spinal motoriska nervceller (MNs) förlänga deras axoner att kommunicera med sina innervating mål, därmed styra rörelsen och komplexa uppgifter hos ryggradsdjur. Därför är det kritiskt att avslöja molekylära mekanismer för hur motorn axoner navigera till arborize och innerverar deras perifera muskler mål under development och degeneration. Även om transgena Hb9::GFP mus linjer har länge tjänat till att visualisera motor axon banor under fosterutvecklingen, detaljerade beskrivningar av hela spektrumet av axon terminal arborization förblir ofullständig på grund av mönstret komplexitet och begränsningar av nuvarande optisk mikroskopi. Här beskriver vi ett förbättrat protokoll som kombinerar ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM) och robust bildanalys att kvalitativt och kvantitativt visualisera utveckla motoriska axoner. Detta system kan lätt antas för att korsa genetiska mutanter eller MN sjukdomsmodeller med Hb9::GFP linjer, avslöjar nya molekylära mekanismer som leder till fel i motor axon navigering och arborization.
Introduction
Spinal MNs ingår i det centrala nervsystemet men innerverar perifera muskler för att styra rörelsen. Utveckla ryggmärgen, är MN stamfäder (pMNs) etablerade enligt de signaler som kommer från ryggsträng och intilliggande thoraxsegmenten. Alla differentierade efter mitotiska MNs genereras sedan från pMNs, så småningom ger upphov till en rad MN subtyper längs rostrocaudal axeln av ryggmärgen1,2. Spinal MNs anordnas topographically och anatomiskt väl. Deras morfologiska arrangemang korrelerar med placeringen av sina respektive mål i periferin3. Efter att nå koldioxidmålen muskel, axoner får cellulära och exogena neurotrofa faktorer som förmå dem att utvidga och gren längre in muskler. Innervation och förgrenade defekter kan bidra till att bilda neuromuskulära korsningar (NMJ). Exempelvis gliaceller neurotrofa faktorer (GDNF)-inducerad Pea3 är oumbärlig för axon arborization till kutan maximus (CM) och latissimus dorsi (LD) muskler4,5. Dessutom visar DINE knockout musembryon defekta arborization av phrenic nerver i membranen, orsakar andningssvikt och dödlighet omedelbart efter födseln6,7. Det sista steget av MN mognad (dvs, axonal projektion och förgrening) är därför avgörande för att säkerställa kommunikationen mellan nervceller och målceller.
Om du vill visa arborization mönster, genomföra forskare normalt confocal imaging eller ljus två-photon fluorescensmikroskopi av sektionerad eller hela-mount prover8,9,10. Båda dessa mikroskopi tekniker generera acceptabel upplösning och djup penetration. Två-foton fluorescensmikroskopi ljus innebär excitation av fluorophores genom samtidig absorption av två lägre energi fotoner11. Sedan två-photon excitation använder nära-infraröd strålning, bidrar minskad excitation frekvensen till minskad spridning och bättre vävnad penetration upp till 1 mm i vävnaden, vilket möjliggör avbildning med större djup. Konfokalmikroskopi tas bort filter den out-of-fokus signaler och bara samlar ljus inom den fokalplan12. Med detta synsätt, kan bilder av prover från olika focal plan kombineras för att producera en tredimensionell (3D) bild via en Z-stack funktion. Dock reduceras signalintensitet eftersom de flesta av ljuset blockeras och hög numerisk bländare skymma den djup-of-field. Viktigare, bidrar både tekniker till allvarliga photodamage och fototoxicitet eftersom hela preparatet får belysning även när endast en planet är avbildade vid en given tidpunkt.
För att kringgå dessa brister, har LSFM blivit en gynnad alternativ, med fördelarna av att vara snabb, ljus-effektiv, och mindre fototoxisk13,14. LSFM kan dessutom multi-View imaging. Detta tillvägagångssätt är särskilt lämpad att visualisera motoriska axoner och deras spridning terminaler som de sprids genom 3D-rymden. LSFM utklassar de andra två alternativen eftersom prover är monterade på en scen som tillåter rotation kring en vertikal axel och rörelser längs x, y och z-axlarna. Detta upplägg möjliggör inte bara minimalt blockerade utsikt över provet men också valet av en önskvärd belysning sökväg, en brist i två-foton och confocal microscopy, vilka båda kräver montering av prover i en platt bild. LSFM är därför det lämpligaste verktyget för 3D imaging av axon arborization och för kvantifiering av motor nerv terminaler i musembryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla levande djur förvarades i en specifik patogen fri (SPF) djuranläggningen, godkänts och övervakas av IACUC av Academia Sinica.
1. fixering
- Samla in embryon av embryonala dag 12,5 (E12.5) sedan halshugga och rensning dem.
- Fixa embryona individuellt i 24 brunnar med 1 mL/väl av nylagade 4% PARAFORMALDEHYD 1 x fosfat buffert saltlösning (PBS) över natten. Inkubera vid 4 ° C i en shaker.
- Tvätta de fasta embryona minst 3 x, var och en för 5-10 min, med 1 mL 1 x PBS och inkubera över natten vid 4 ° C på en shaker ta bort de kvarvarande PARAFORMALDEHYD.
2. hela-mount immunfärgning
- Permeabilize varje embryo i 1 mL 0,5% PBS-Triton-X-100 (PBST) över natten vid 4 ° C i en shaker.
- Blockera varje prov med 1 mL 10% FBS beredd i 1 x PBS över natten vid 4 ° C i en shaker.
- Inkubera embryot med 1 mL av anti-GFP primär antikropp (1:1, 000 spädning i 10% FBS) vid 4 ° C i 72 h under ständig skakning intensifiera GFP signalen i motoriska nerver.
- Efter primär antikropp ruvning, tvätta med 1 mL 0,5% PBST under loppet av 1-2 dagar vid 4 ° C i en shaker, ändra på 0,5% PBST minst tre gånger.
- Applicera 1 mL av sekundär antikropp (1:1, 000 spädning i 10% FBS) och inkubera över natten i mörker vid 4 ° C under ständig skakning.
- Tvätta 3 x med 1 mL 0,5% PBST vid 4 ° C på en shaker under loppet av 2-3 dagar. Hålla prover i 1 x PBS vid 4 ° C fram till dagen före imaging.
Obs: Embryon kan vara dissekeras i mindre delar innan röjningen, beroende på vilken del av embryon kommer avbildas. Frambenen är bevarade i detta experimentella tillvägagångssätt (figur 1A). - Inkubera embryot i en kommersiell clearing reagens med 1,49 nD i en 1,5 mL tub, skyddas från ljus i rumstemperatur över natten, för att återge embryot transparent för imaging brytningsindex.
Obs: Volymen av clearing reagens är cirka fem gånger provvolymen.
3. LSFM (2-3 h)
-
Prov set-up
- Ställa in 5 X / 0.1 belysning optik och 5 X / 0.16 upptäckt optik. Montera provhållare och prov kapillär (1,5 mm inre diameter, grön) och placera dem i Mikroskop.
Obs: Se mikroskopets bruksanvisning för detaljerad uppsättning förfaranden. - Montera embryot enligt följande:
- Förbereda P200 pipettspetsen genom att skära bort den övre delen så att den passar diameter kapillären och ta bort den spetsiga delen (~ 3 mm) för provet kvarstad.
- Smält den trubbiga änden pipettspetsen använder en liten låga.
- Släck lågan och snabbt fäster embryot vertikalt på smält slutet.
- Montera den övre delen av pipettspetsen med provet kapillär.
- Tillåta kammare bufferten temperera med embryot för 1 min att rensa bort skräp eller bubblor.
- Med avbildningsprogrammet, Välj hitta kapillär under fliken lokalisera och justera x, y, z-axlar att placera provet kapillären.
- Välj hitta prov och zooma till 0,6 X att fokusera på embryot. Rotera ett embryo för att säkerställa att den långa axeln av den avbildade lem justerar med ljusstrålen av två ljuskällor (figur 1B).
- Ställa in 5 X / 0.1 belysning optik och 5 X / 0.16 upptäckt optik. Montera provhållare och prov kapillär (1,5 mm inre diameter, grön) och placera dem i Mikroskop.
-
Bild förvärv
- Under fliken förvärv , fastställa ljusbanan parametrar såsom upptäckt mål, laser blockerande filter, stråldelare, kameror och lasrar.
Obs: GFP kanalen används i detta experiment (Excitation våglängd: 488 nm; utsläpp filter: BP 505 till 545 nm, stråldelare: SPS LP 560). - Bocka i pivot scan för shadow minskning.
- Ange inställningar för förvärvet: bitdjup, 16 bit; zooma, 0,36-0,7 X; enkelsidigt belysning (vänster/höger) eller dual-side belysning.
- Klicka på löpande och ange laser intensitet, exponeringstid, lasereffekt och lätta blad position att få skarpare bilder.
Obs: Lasereffekten hålls så låg som möjligt för att minimera photodamage. - Tryck på STOP för att avsluta bild förvärv.
- Under fliken förvärv , fastställa ljusbanan parametrar såsom upptäckt mål, laser blockerande filter, stråldelare, kameror och lasrar.
-
Flerdimensionella förvärv
- Ange z-stacken genom att flytta Z positionen för den första och sista bilden. Klicka på Optimal om du vill ange antalet segment.
- Klicka på Starta experimentet för att förvärva den valda z-stacken.
- När den är klar, spara bilden i .czi format.
-
Bildbehandling (valfritt)
- Fortsätt med Dual side fusion under kanalen Lightsheet bearbetning om dual-side belysning används. MultiView bearbetning är nödvändigt om flera vyer förvärvas för att kombinera bilder från flera vinklar.
- Skapa en 2D-bild med hjälp av data från de högsta intensity pixlarna längs projektionsaxeln under Maximal intensitet projektion kanalen.
- Klicka på delmängd för att välja grupper av bilder från den ursprungliga uppsättningen under kopia kanal.
4. kvantifiering av Axon Arborization (30 Min för varje enskild nerv)
- Öppna bildfilen i avbildningsprogrammet analys (som standard bilden som innehåller XYZ data öppnas i överstiga läge och som en 3D-renderade vy).
- Justera bildfärg, ljusstyrka och kontrast med hjälp av Justering av bildskärmens fönstret (Redigera | Visa bildskärm justering) att upptäcka filament baserat på lokala intensitet kontrast.
- Klicka på ikonen Lägg till ny filament och välj Autopath (ingen loop) algoritmen i den nedrullningsbara menyn.
- Välj området av intresse (i detta fall, segmentera axonet av intresse). Klicka på Nästa när du är klar.
- Definiera start-och utsäde genom att tilldela största och tunnaste diametern mätningarna, som kan mätas med Slice läge.
- Tilldela en utgångspunkt vid kanten av regionen av intresse. För att uppnå manuell tillsats eller borttagande av utgångspunkter, först ändra pekaren läge (navigera | Välj) och sedan Skift + Högerklicka på sevärdheter.
- Välj Manuell tröskelvärden för utsäde punkter för att garantera att alla de synliga arborization är markerad. Ändrar pekaren läge (navigera | Välj) och sedan Shift + vänsterklick på sevärdheter att manuellt lägga till eller ta bort utsäde punkter.
Obs: Det är viktigt att manuellt ta bort bakgrundsljud och signaler från närliggande nerver. - Markera kryssrutan ta bort utsäde punkter runt utgångspunkter.
- Markera ta bort frånkopplade segment för att tillåta uteslutandet av punkter som är alltför långt borta och som kan utgöra bakgrund buller. Ange Maximal Gap längd i nästa steg för att definiera den övre gränsen för uteslutning.
- Justera tröskeln för bakgrunden subtraktion, som en Gaussisk filter används för att uppskatta bakgrund intensiteten i varje voxel.
- Ange automatisk tröskelvärde för dendrite diameter med ungefärliga tvärsnittområde algoritm.
- Hoppa över stegen för ryggraden beräkning.
- Slutföra och välj önskad stil och färg.
- Avmarkera rutan volym i Egenskaper för att visa endast den rekonstruerade axoner.
- Välj detaljeradunder fliken statistik . Använda glödtråden nej. Dendrite Terminal punkter att kvantifiera motor nerv terminalerna som en indikator på motor axon arborization.
Obs: Statistiska anteckning kan läggas om så önskas. - Exportera bilden av den rekonstruerade axonen som en .tif-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSFM ger detaljerade 3D visualisering av MN bollbana och axon arborization i musen embryon. Under ljusa fält visas vävnader helt transparent efter nedsämkmimg i kommersiella clearing reagensen. Ingen krympning eller svullnad av provet var märkt efter upp till en veckas lagring i clearing reagens innan imaging. Under fluorescens kanal, är motoriska nervceller märkta med transgenically uttryckta GFP (film 1). I vissa fall äventyras Detaljer av axon struktur. Figur 2 representerar exempelvis låg kvalitet imaging. Flera faktorer kan hindra imaging kvalitet. För det första, otillräcklig permeabilisering och tvättning steg kan leda till hög bakgrund signal. För det andra resulterar ljusspridning genom otillräckligt rensade vävnad i suddiga bilder. Slutligen skulle suboptimala prov positionering under bild förvärv öka ljusspridning eller blockerar ljusbanan.
Till bild axon arborization mer i detalj och att utföra kvantifiering, förstoring kan justeras så att varje fint arborized struktur kan vara avslöjade (Movie 2). Bilder av singel - och dual-side belysning bör jämföras för att bestämma optimal upplösning av arborization mönster (figur 3). Imaging analysprogram kan sedan användas för att rekonstruera axon arborization mönster för enskilda forelimb nerver (figur 4). Genom att definiera utgångspunkten och diameter för utsäde punkt upptäckt, kan dessa arborized strukturer halvautomatiskt upptäckas och beräknas medan bakgrunden signaler avlägsnas manuellt. Vi använde ”glödtråden – nej Dendrite Terminal Pts ”funktionsläge att beräkna de totala motor nerv terminalerna i enskilda nerver som en indikator på motor axon arborization. Dessutom kan grenlängd, genomsnittlig diameter och volym beräknas med ”glödtråden – Dendrite längd”, ”glödtråden – Dendrite menar Diameter” och ”glödtråden – Dendrite volym”, respektive.
Figur 1: grafisk illustration av provet set-up. (A) under provberedning, embryon först halshuggas och urtagen. Frambenen är dissekerade längs den streckade linjen. (B) i provkammaren, prover är positionerade för att hålla hela regionen sevärdheter längs ljusstrålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: ljus ark fluorescensmikroskopi av ett stort synfält i den övre halvan av ett E12.5 transgena möss embryo (Hb9::GFP). Filmen visar tydligt motoriska nerver projicera från ryggmärgen till sina innervating mål. 3D-bilden är först förvärvade under 0,3 X förstoring med enkelsidigt belysning och 30 ms exponeringstid och senare bearbetas till video med bild analys programvara. Skalstapeln representerar 500 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur 2: exempel på en låg kvalitet bild med hög bakgrund signal och suddig regioner (blå pilar). Felaktig stegen under prov förberedelse och bild förvärv kan leda till försämrad bildkvalitet äventyra riktigheten av någon efterföljande kvantifieringen av axon arborization. Skalstapeln i bilden representerar 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Movie 2: visualisering av E12.5 forelimb nerver under 488 nm excitation med dual-side-belysning vid förstoring 0,6 X. Inzoomad filmen gör tydliga och panoramautsikt över visualisering av alla fina arborized strukturer på enskilda nerver. Skalstapeln representerar 300 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Figur 3: jämförelse mellan singel - och dual-side illumination. Både vänster och höger illuminations Visa Detaljer för vissa regioner endast (röda pilar), medan en kombinerad bild från dual-side illuminations ger en mer komplett bild av arborization mönster. Enkelsidigt belysning kan dock uppnås på kortare imaging tid och ibland med bättre bildkvalitet. Detta är på grund av att belysning sökvägar från båda sidor inte kan ligga helt på ett enda plan, vilket resulterar i oskärpa under dual-side illuminations. Bilder visas som maximal intensitet projektion. Skalstapeln representerar 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: rekonstruerat axon arborization av enskilda forelimb nerver, färgkodade enligt följande: suprascapular (röd), axillärt (rosa), radiell (blå), bakre brachialis kutan (lila). Arborization komplexitet beräknades enligt antalet terminal slutpunkter detekteras med hjälp av vår halvautomatisk metod. Autopath (ingen loop) algoritmen spår filament och upptäcker utsäde punkter från användardefinierade utgångspunkter. Skalstapeln i båda bilderna representerar 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera steg i protokollet kan bli föremål för ändringar under vissa omständigheter. Till exempel beror fixering varaktighet på ålder av embryon, varierande från 2 h till 1 eller flera dagar med nygjorda PARAFORMALDEHYD. Eftersom fixering utförs före hela mount immunfärgning, för antikroppar som är känsliga för protein crosslinking, kan metanol användas som alternativa fixativ agent. För hög signal-brus-förhållandet vid färgning, är det nödvändigt att optimera tvättmedel koncentration (mellan 0,1-0,5%). Ytterligare tvätt steg före och efter antikropp inkubation kan också öka det signal-brus-förhållandet. En vävnad-clearing steg är dessutom viktigt att se till att ljusstrålen är avblockerad i hela djupt axonal prognoser. För att öka vävnad öppenhet, är det viktigt att säkerställa minimal införandet av PBS under inkubation i kommersiella clearing agent, som clearing effekten återförs genom åter doppa prover i fungera som buffertlösningar. Annars rekommenderas en clearing reagens med högre brytningsindex eller röjningen längre. Under tiden varierar parametrarna under bild förvärv bland olika prover. Dual-side belysning och Multivy imaging kan bildbehandling med större djup-of-field och förbättrad detalj. Eftersom belysningen från olika vinklar förvärvas samtidigt, är emellertid enkelsidigt belysning mer effektivt för mindre prover eller rörliga prover. En bild med bra kvalitet säkerställer noggrannhet för följande kvantitativa analyser.
Tidigare studier, inklusive de av vår grupp, har använt antingen confocal imaging eller två-foton mikroskopi att iaktta motor axon navigering processen eller arborization mönstret i Hb9::GFP embryon10,15, 16 , 17. baserat på vår erfarenhet, vi tror LSFM att vara överlägsen till dessa andra två metoder sedan: 1) Imaging tid reduceras till stor del eftersom LSFM erbjuder mer snabba och högre kvalitet imaging, samtidigt minimera photodamage och fototoxicitet av prover. Prover är belyst från sidan med en tunn ljus plåt, och skapar därmed en inneboende optiska avsnitt14,18,19. I mitten av bladet ljus konvergerar med fokalplanet av detection Systems, som är ortogonal till belysning axeln. Följaktligen, out-of-fokus ljus reduceras och enda fluorophores inom fokalplanet belyses för varje bild, dvs, i stället för hela preparatet, därmed minska fotoblekning20. (2) Detaljer av arborization mönster är mycket bättre illustrerade som LSFM tillåter multiview imaging. I stället för det exemplaret som monteras på ett objektglas, är den kopplad på ett sådant sätt att rotation kring en vertikal axel är möjligt, som är rörelser längs x, y och z-dimensioner. Bilder från de olika plan och vyer är staplade att producera mer isotropiskt 3D-bilder. LSFM har dock en begränsning jämfört med confocal och två-photon tillvägagångssätt när det gäller massiva filstorleken skapas för varje bild. Dessa för- och nackdelar måste vägas när man beslutar vilken bildgivande metod att använda, men i slutändan valet beror på vilka mikroskopiska maskin-och programvara är tillgänglig på begäran.
Kort sagt, detta protokoll kombinerar hela-mount immunfärgning, state-of-the-art lätta blad 3D imaging, tillsammans med kvantifiering i bild analys programvara. Vi anser att detta protokoll inte bara ger ett nytt paradigm för att visualisera motor axon navigering och banor i embryon med kvantitering av axon arborization komplexitet men skulle också kunna tillämpas på andra neuron system (dvs, sensoriska nervceller) med lämpliga transgena möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
LSFM experiment och dataanalys utfördes delvis med de avancerade optiska mikroskop av avdelningen av instrumentet tjänster i Academia Sinica och med hjälp av Ms Shu-Chen Shen. Vi tackar Ms. Sue-Ping Lee från Imaging Core Facility av IMBEN för betydande teknisk assistans med Imaris bildanalys. IMBENS vetenskapliga engelska redigering kärna granskade manuskriptet. Detta arbete finansieras av Academia Sinica karriär Development Award (CDA-107-L05), mest (104-2311-B-001-030-MY3) och NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
