Summary
Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.
Abstract
Neuronas de motor espinales (MNs) extienden sus axones a comunicarse con sus objetivos innervating, así control de movimiento y las tareas complejas en vertebrados. Por lo tanto, es fundamental para descubrir los mecanismos moleculares de cómo motor axones vaya a arborize y estimular su músculo periférico orienta durante el desarrollo y la degeneración. Aunque de líneas transgénicas de ratón Hb9::GFP durante mucho tiempo han servido para visualizar trayectorias de motor axón durante el desarrollo embrionario, descripciones detalladas de todo el espectro de la arborización terminal del axón permanecen incompletas debido a la complejidad del patrón y limitaciones de la microscopía óptica actual. Aquí, describimos un protocolo mejorado que combina la microscopia de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (LSFM) y análisis de imagen robusta cualitativa y cuantitativamente visualizar desarrollo motor axons. Este sistema puede ser fácilmente adoptado para cruzar mutantes genéticos o modelos de la enfermedad de MN con Hb9::GFP líneas, revelando nuevos mecanismos moleculares que conducen a defectos en la navegación del axón motor y arborización.
Introduction
MNs espinales son parte del sistema nervioso central pero inervan músculos periféricos para controlar el movimiento. En la médula espinal en desarrollo, progenitores de MN (pMNs) se establecen según las señales que emanan de la notocorda y somitas adyacentes. Todos distinguen MNs poste-mitotic se generan luego de pMNs, eventualmente dando lugar a una serie de subtipos de MN en el eje rostrocaudal de la médula espinal1,2. MNs espinales están organizadas topográficamente y anatómicamente bien. La disposición morfológica se correlaciona con la posición de sus respectivos objetivos en la periferia3. Al llegar a sus objetivos de músculo, axones reciben factores neurotróficos exógenos y celular que inducen a extenderse y ramificarse en los músculos. Inervación y ramificación defectos pueden contribuir a la falla para formar a uniones neuromusculares (NMJ). Por ejemplo, factores de neurotrophic glial-derivado (GDNF)-Pea3 inducida es indispensable para la arborización de axon en maximus cutáneos (CM) y4,5de los músculos latissimus dorsi (LD). Además, embriones de ratón knockout DINE muestran defectuosa arborization de nervios frénicos en el diafragma, causando mortalidad y fallo respiratorio inmediatamente después del nacimiento6,7. Por lo tanto, este último paso de la maduración de la MN (por ejemplo, proyección axonal y ramificación) es fundamental para asegurar la comunicación entre las neuronas y las células diana.
Para ver los patrones de la arborización, los investigadores normalmente realizan proyección de imagen confocal o microscopía de fluorescencia de dos fotones de muestras seccionadas o conjunto de montaje8,9,10. Ambas de estas técnicas de microscopía generan aceptable resolución y profundidad de penetración. Microscopía de fluorescencia de dos fotones consiste en la excitación de fluoróforos por absorción simultánea de dos fotones de menor energía11. Puesto que la excitación de dos fotones utiliza la radiación infrarroja, la frecuencia de excitación disminuida contribuye a la dispersión reducida y mejor penetración del tejido hasta 1 mm de tejido, permitiendo la proyección de imagen con mayor profundidad. La microscopia confocal quita filtros fuera de enfoque de señales y sólo recoge la luz dentro del plano focal12. Con este enfoque, imágenes de muestras de diferentes planos focales pueden combinarse para producir una imagen tridimensional (3D) mediante una función de Z-stack. Sin embargo, intensidad de la señal se reduce ya que la mayoría de la luz es bloqueada y aberturas numéricas alta ocultar la profundidad de campo. Más importante aún, ambas técnicas contribuyen al fotoenvejecimiento severo y fototoxicidad puesto que la muestra entera recibe iluminación incluso cuando sólo un plano es reflejado en un momento dado.
Para evitar estas deficiencias, LSFM se ha convertido en una alternativa favorecida, con las ventajas de ser rápido y eficiente a la luz y menos fototóxico13,14. Además, LSFM permite la proyección de imagen multi-view. Este enfoque es particularmente adecuado para visualizar motor axons y sus dispersión terminales ya que esparcir a través del espacio 3D. LSFM supera a las otras dos opciones ya que las muestras se montan en un escenario que permite una rotación alrededor de un eje vertical y los movimientos a lo largo de la x, y y z ejes. Este montaje no sólo permite una visión mínimamente bloqueada de la muestra sino también la elección de un camino de iluminación conveniente, un defecto de la microscopia confocal y de dos fotones, que requieren el montaje de muestras en una lámina plana. Por lo tanto, LSFM es la herramienta más apropiada para la proyección de imagen 3D de arborización de axón y para la cuantificación de los terminales de los nervios motores en embriones de ratón.
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Protocol
Todos los animales se mantuvieron en un patógeno específico (SPF) animal servicio gratuito, aprobado y supervisado por la IACUC de Academia Sinica.
1. fijación
- Recolectar embriones de día embrionario 12.5 (E12.5) luego decapitar y los desentrañan.
- Fijar los embriones individualmente en placas de 24 pocillos con 1 mL o bien recién preparado paraformaldehído al 4% en el 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) durante la noche. Incubar a 4 ° C en un agitador.
- Lavar los embriones fijados por lo menos 3 x, de 5-10 minutos, con 1 mL de PBS 1 x e incubar durante una noche a 4 ° C en un agitador para eliminar el paraformaldehido residual.
2. whole-mount inmunotinción
- Permeabilizar cada embrión en 1 mL de 0.5% PBS-Tritón-X-100 (SAFT) durante la noche a 4 ° C en un agitador.
- Bloque de cada muestra con 1 mL de 10% FBS preparado en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C en un agitador.
- Incubar el embrión con 1 mL de anticuerpo primario anti-GFP (1:1, 000 dilución 10% SBF) a 4 ° C durante 72 h con agitación constante para intensificar la señal GFP de nervios motores.
- Después de la incubación del anticuerpo primario, lave con 1 mL de 0.5% Saft en el transcurso de 1-2 días a 4 ° C en un agitador, cambiando el 0.5% Saft por lo menos tres veces.
- Aplicar 1 mL de anticuerpo secundario (1:1, 000 dilución 10% FBS) e incubar durante la noche en la oscuridad a 4 ° C con agitación constante.
- Lavar 3 x con 1 mL de 0.5% Saft a 4 ° C en un agitador en el transcurso de 2-3 días. Mantener las muestras en PBS 1 x a 4 ° C hasta el día antes de la proyección de imagen.
Nota: Embriones pueden ser disecados en segmentos más pequeños antes claro, dependiendo de que parte de los embriones a ser reflejada. Miembros anteriores se conservan en este enfoque experimental (figura 1A). - Incubar el embrión en un reactivo comercial de claro con un índice de refracción de 1.49 nD en un tubo de 1,5 mL, protegido de la luz a temperatura ambiente durante la noche, para representar el embrión transparente para la proyección de imagen.
Nota: El volumen del reactivo claro es aproximadamente cinco veces del volumen de muestra.
3. LSFM (2-3 h)
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Preparación de la muestra
- Establecer 5 X / 0.1 iluminación óptica y 5 X / 0.16 óptica de detección. Montar el soporte de muestra y tubo capilar de la muestra (1,5 mm de diámetro interno, verde) y coloque en el microscopio.
Nota: Refiérase al Manual de operación del microscopio para los procedimientos de configuración detallada. - Monte el embrión de la siguiente manera:
- Preparar la P200 punta, cortando la parte superior para que coincida con el diámetro del tubo capilar y quite la parte puntiaguda (~ 3 mm) para la fijación de la muestra.
- Se funden al final romas de punta de la pipeta con una pequeña llama.
- Apagar la llama y colocar rápidamente el embrión verticalmente sobre el extremo fundido.
- Ajuste la parte superior de la punta de la pipeta con la muestra capilar.
- Permitir que el tampón de cámara se equilibren con el embrión durante 1 min limpiar escombros o burbujas.
- Utilizando el software de imágenes, seleccione localizar capilar en la pestaña de localizar y ajustar la x, y, z ejes para colocar el capilar de la muestra.
- Seleccionar muestra de localizar y zoom de 0.6 X para centrarse en el embrión. Gire el embrión para asegurarse de que el eje de la extremidad de la imagen se alinea con la trayectoria de la luz de las dos fuentes de luz (figura 1B).
- Establecer 5 X / 0.1 iluminación óptica y 5 X / 0.16 óptica de detección. Montar el soporte de muestra y tubo capilar de la muestra (1,5 mm de diámetro interno, verde) y coloque en el microscopio.
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Adquisición de imágenes
- En la ficha de adquisición , defina los parámetros de trayectoria de la luz como objetivos de detección, laser bloqueo filtro divisor de viga, cámaras y láser.
Nota: El canal GFP se utiliza en este experimento (longitud de onda de excitación: 488 nm; filtro de emisión: BP 505 a 545 nm, divisor de viga: SPS LP 560). - Marque la casilla scan de pivote para la reducción de la sombra.
- Definir los ajustes de adquisición: bit de profundidad de 16 bits; zoom, 0.36-0,7 X; iluminación del solo-lado (izquierda) o iluminación de doble lado.
- Haga clic en continuo y ajustar la intensidad de láser, tiempo de exposición, energía del laser y posición de la ficha técnica de iluminación para la adquisición de imágenes más nítidas.
Nota: La potencia del láser se mantiene tan baja como sea posible para minimizar el fotodaño. - Pulse detener para finalizar la adquisición de la imagen.
- En la ficha de adquisición , defina los parámetros de trayectoria de la luz como objetivos de detección, laser bloqueo filtro divisor de viga, cámaras y láser.
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Adquisición multidimensional
- Definir la pila z desplazando la posición Z de la primera y la última imagen. Haz clic en Optimal para establecer el número de segmento.
- Haga clic en Inicio experimento para adquirir la pila de z seleccionada.
- Cuando esté hecho, guardar la imagen en formato .czi.
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Procesamiento de imágenes (opcional)
- Proceder con fusión bilateral bajo el canal de Lightsheet de procesamiento si se aplica iluminación de doble lado. MultiView de procesamiento es necesario si se adquieren múltiples vistas para combinar imágenes desde múltiples ángulos.
- Crear una imagen 2D, utilizando los datos de los píxeles de intensidad máximos en el eje de proyección en el canal de Proyección de intensidad máxima .
- En canal de copia , haga clic en subconjunto para seleccionar subconjuntos de imágenes del conjunto original.
4. cuantificación de arborización del axón (a 30 Min para cada nervio Individual)
- Abra el archivo de imagen en el software de análisis de imagen (por defecto, la imagen que contiene los datos XYZ se abre en modo Surpass y una vista 3D prestados).
- Ajustar el color de la imagen, brillo y contraste mediante la ventana de Ajuste de la pantalla (edición | Mostrar pantalla de ajuste) para detectar filamentos basados en el contraste de intensidad local.
- Haga clic en el icono de Añadir nuevos filamentos y seleccione el algoritmo Autopath (ningún lazo) en el menú desplegable.
- Seleccione la región de interés (en este caso, el axón divide en segmentos de interés). Haga clic en siguiente cuando haya terminado.
- Definir los puntos de partida y semillas mediante la asignación de las mediciones de diámetro más grande y más delgado, que pueden ser medidas usando el modo de corte .
- Asignar un punto de partida en el borde de la región de interés. Para conseguir manual adición o eliminación de puntos de partida, primero cambie el modo puntero (navegar | Seleccione) y luego Shift + clic derecho en los puntos de interés.
- Seleccione manual umbrales de puntos semilla asegurar que todos los de la arborización visible está marcada. Cambiar el modo puntero (navegar | Seleccione) y luego Shift + botón izquierdo del ratón en los puntos de interés manualmente agregar o quitar puntos de semilla.
Nota: Es importante eliminar manualmente los ruidos de fondo y las señales de los nervios vecinos. - Marque la casilla quitar puntos de semilla alrededor de puntos de partida.
- Asegurarse de quitar desconectado segmentos para permitir la exclusión de los puntos que están muy lejos y que puede representar el ruido de fondo. Indicar la Longitud máxima de la brecha en el siguiente paso para definir el límite superior para la exclusión.
- Ajustar el umbral para sustracción de fondo, que utiliza un filtro gaussiano para estimar la intensidad de fondo de cada voxel.
- Establecer el umbral automático para el diámetro de la dendrita utilizando el algoritmo de área de sección transversal aproximada .
- Sáltese los pasos para el cálculo de la columna vertebral.
- Acabar el proceso y elegir el estilo deseado y el color.
- Desmarque la casilla de volumen en propiedades para ver solamente los axones reconstruidos.
- En la pestaña de estadísticas , seleccione detallado. Usar filamento de . Puntos de la Terminal de dendrita cuantificar los terminales de los nervios motores como indicador de arborización del axón motor.
Nota: Anotación estadística puede agregarse si se desea. - Exportar la imagen del axón reconstruido como un archivo .tif.
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Representative Results
LSFM ofrece visualización 3D detallada de arborización de trayectoria y axón de MN en ratón embriones. En campo claro, los tejidos aparecen totalmente transparentes después de estar inmerso en el reactivo comercial claro. No hay contracción o hinchamiento de la muestra fue notado después de hasta una semana de almacenamiento en la limpieza de reactivo antes de la proyección de imagen. Bajo canal de la fluorescencia, las neuronas motoras están marcadas con GFP transgenically expreso (película 1). En algunos casos, están en peligro los datos de la estructura del axón. Por ejemplo, la figura 2 representa la proyección de imagen de baja calidad. Varios factores pueden impedir la proyección de imagen de calidad. En primer lugar, permeabilización insuficiente y pasos de lavado pueden conducir a la señal de fondo alto. En segundo lugar, dispersión de la luz a través de tejido autorizado dará lugar a imágenes borrosas. Por último, muestra subóptima posicionamiento durante la adquisición de la imagen puede aumentar la dispersión de la luz o bloquear la trayectoria de la luz.
Para arborización de axon de imagen con mayor detalle y para realizar la cuantificación, ampliación puede ajustarse para que cada estructura finamente arborized puede ser revelado (película 2). Imágenes de iluminación de simple y doble lado deben compararse para determinar la resolución óptima del patrón de arborización (figura 3). Software de análisis de imágenes puede utilizarse entonces para reconstruir los patrones de arborización de axon de los nervios de la extremidad delantera individual (figura 4). Definiendo el punto de partida y el diámetro para la detección del punto de semilla, estas estructuras arborized pueden ser semi-automáticamente detecta y computa mientras que manualmente se quitan las señales de fondo. Utilizamos el "filamento – no. Dendrita Terminal Pts"modo de la función para calcular los terminales del nervio de motor total de nervios individuales como indicador de arborización del axón motor. Además, rama largo, diámetro medio y el volumen se pueden calcular usando "Filamento – dendrita longitud", "filamento – dendrita significa diámetro" y "filamento – dendrita", respectivamente.
Figura 1: ilustración gráfica de configuración de ejemplo. (A) durante la preparación de la muestra, embriones son primero descabezados y eviscerados. Miembros anteriores se disecan a lo largo de la línea discontinua. (B) en la cámara de muestras, las muestras se colocan para mantener a toda la región de interés a lo largo de la trayectoria de la luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: luz de microscopía de fluorescencia de la hoja de un gran campo de visión de la mitad superior de un embrión de ratón transgénico de E12.5 (Hb9::GFP). La película demuestra claramente los nervios de motor proyecta desde la médula espinal sus objetivos innervating. Primero se adquiere la imagen 3D bajo 0.3 aumentos con tiempo de exposición de iluminación y 30 ms solo-lado y más tarde se transforma en video usando software de análisis de imagen. Barra de escala representa 500 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Figura 2: ejemplo de una imagen de baja calidad con regiones borrosas (flechas azules) y señal de alto fondo. Los pasos incorrectos durante la adquisición de imagen y preparación de la muestra pueden llevar a la calidad de imagen deteriorada a poner en peligro la precisión de cualquier cuantificación posterior de arborización del axón. Barra de escala en la imagen representa 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 2: visualización del forelimb E12.5 nervios menores 488 excitación nm con iluminación de doble-lado en un aumento de 0,6 x. La película ampliada permite la visualización clara y panorámica de cada estructuras arborized finas en nervios individuales. Barra de escala representa 300 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Figura 3: comparación entre iluminación simple y doble lado. Iluminaciones de izquierda y derecha muestran detalles de algunas regiones solamente (flechas rojas), mientras que una imagen combinada de doble lado iluminaciones proporciona una visión más completa del patrón de arborización. Sin embargo, solo lado iluminación se logra en un menor tiempo de proyección de imagen y, a veces con mejor calidad de imagen. Esto es debido a que los caminos de la iluminación de ambos lados no pueden mentir perfectamente en un solo plano, dando por resultado desenfoque en iluminaciones de doble lado. Imágenes se muestran como proyección de máxima intensidad. Barra de escala representa 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: reconstruido arborization de axon de los nervios individuales del forelimb, codificados por color como sigue: supraescapular (rojo), axilar (rosa), radial (azul), cutáneo braquial posterior (púrpura). Complejidad de la arborización se calculó según el número de terminales terminal detectado mediante nuestro método semiautomático. El algoritmo Autopath (sin asa) rastros de filamentos y detecta puntos de semilla desde puntos de partida definido por el usuario. Barra de escala en las dos imágenes representa 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios pasos en el protocolo pueden ser sometidos a cambios en determinadas circunstancias. Por ejemplo, la duración de la fijación depende de la edad de los embriones, variando de 2 h a 1 o más días utilizando paraformaldehido recién hechos. Puesto que la fijación se lleva a cabo antes de la inmunotinción de Monte todo, para los anticuerpos que son sensibles a la proteína reticulación, metanol puede utilizarse como un agente fijador alternativo. Para un alto cociente signal-to-noise a la coloración, es necesario optimizar la concentración de detergente (entre 0.1-0.5%). Pasos de lavado adicional antes y después de la incubación de los anticuerpos pueden también aumentar la relación señal a ruido. Además, un paso de remoción de tejido es importante para asegurar que la trayectoria de la luz es desbloqueada a través de proyecciones profundo axonal. Para aumentar la transparencia del tejido, es importante asegurar la mínima introducción de PBS durante la incubación en el agente comercial claro, como se invierte el efecto de la compensación por volver a sumergir las muestras en soluciones tampón. De lo contrario, se recomienda un reactivo de compensación con un mayor índice de refracción o un período más largo de claro. Mientras tanto, los parámetros durante la adquisición de la imagen varían entre diferentes muestras. Doble lado iluminación y proyección de imagen de multivisión pueden permitir la proyección de imagen con mayor profundidad de campo y mayor detalle. Sin embargo, puesto que simultáneamente se adquiere la iluminación desde diferentes ángulos, solo lado iluminación es más eficiente para muestras más pequeñas o las muestras móviles. Una imagen de buena calidad garantiza la precisión de los análisis cuantitativos siguientes.
Estudios anteriores, los de nuestro grupo, incluidos han utilizado proyección de imagen confocal o microscopía de dos fotones para observar el patrón axón motor navegación proceso o arborización en embriones de Hb9::GFP 10,15, 16 , 17. en base a nuestra experiencia, creemos LSFM superior a estos otros dos métodos desde: 1) tiempo de la proyección de imagen se reduce en gran medida LSFM ofrece más rápida y de mejor calidad de imagen, mientras que minimizar el fotoenvejecimiento y la fototoxicidad de las muestras. Las muestras se iluminan desde el lado con una hoja fina de la luz, creando una sección óptica intrínseca14,18,19. El centro de la hoja de luz converge con el plano focal del sistema de detección, que es ortogonal al eje de la iluminación. En consecuencia, fuera de foco luz se reduce y fluoróforos sólo en el plano focal se iluminan para cada imagen, es decir, en lugar de la muestra entera, reduciendo fotoblanqueo20. 2) detalles del patrón de arborización son mucho mejor ilustrados LSFM permite proyección de imagen de multivisión. En lugar de la muestra está montada sobre una diapositiva, se une de tal manera que la rotación alrededor de un eje vertical es posible, como son los movimientos a lo largo de la x, y y dimensiones de z. Las imágenes de los diferentes planos y vistas se apilan para producir imágenes en 3D más isótropos. Sin embargo, LSFM también tiene una limitación en comparación con los enfoques en cuanto al tamaño de archivo masivo creado para cada imagen confocales y dos fotones. Estos pros y contras tienen que pesar al momento de decidir qué método de imagen a utilizar, pero en última instancia, la elección dependerá de que hardware y software microscópico está disponible a petición.
En Resumen, este protocolo combina todo Monte immunostaining, estado-de-arte-imágenes 3D de hoja, junto con la cuantificación en software de análisis de imagen de luz. Creemos que este Protocolo no sólo proporciona un nuevo paradigma para la visualización de navegación del axón motor y trayectorias en embriones con cuantificación de la complejidad de arborización de axón pero también podría aplicarse a otros sistemas de neuronas (es decir, las neuronas sensoriales) con ratones transgénicos apropiados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
LSFM experimentos y análisis de datos se realizaron en parte con los microscopios ópticos avanzados de la división de servicio instrumento de Sinica de la Academia y con la asistencia de la Sra. Chen Shu Shen. Agradecemos a la Sra. Sue-Ping Lee de la proyección de imagen núcleo centro de IMB considerable asistencia técnica con Imaris análisis de imagen. Inglés edición base de IMB científica revisó el manuscrito. Este trabajo es financiado por el Premio de desarrollo de carrera Academia Sinica (CDA-107-L05), más (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
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