Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.
Abstract
Os neurônios motores da coluna vertebral (MNs) estender seus axônios para se comunicar com seus alvos innervating, assim, controlar movimentos e tarefas complexas em vertebrados. Assim, é fundamental para descobrir os mecanismos moleculares de como motor axônios navegue até aterraplenar e inervam os seus músculos periféricos alvos durante o desenvolvimento e degeneração. Apesar de linhas de rato transgénicas Hb9::GFP tem servido por muito tempo a visualização trajectórias axônio motor durante o desenvolvimento embrionário, descrições detalhadas de todo o espectro de arborização terminal axônio permanecem incompletas devido à complexidade do teste padrão e limitações de microscopia óptica atual. Aqui, descrevemos um protocolo melhorado que combina microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) e análise de imagem robusta, qualitativa e quantitativamente Visualizar desenvolvimento motor axônios. Este sistema pode ser facilmente adotado para cruzar mutantes genéticos ou modelos de doença MN com linhas Hb9::GFP , revelando novos mecanismos moleculares que levam a defeitos de navegação axônio motor e arborização.
Introduction
MNs da coluna vertebral são a parte do sistema nervoso central mas inervam músculos periféricos para controlar o movimento. Na medula espinhal em desenvolvimento, progenitores de MN (PMN) são estabelecidas de acordo com os sinais que emana a notocorda e somitas adjacentes. Todos diferenciados MNs pós mitóticas então gerados a partir de PMN, eventualmente, dando origem a uma série de subtipos de MN ao longo do eixo de rostrocaudal da medula espinhal,1,2. MNs espinhais são topograficamente e anatomicamente bem organizados. Seu arranjo morfológico correlaciona-se com a posição de seus respectivos na periferia3. Ao atingir suas metas de músculo, axônios recebem fatores celulares e exógena neurotrophic que induzem-los a estender e um ramo ainda mais em músculos. Inervação e ramificação defeitos podem contribuir para a falha para formar junções neuromusculares (JNM). Por exemplo, fatores de neurotrófico derivado de glia (GDNF)-Pea3 induzido é indispensável para a arborização de axônio em cutâneo maximus (CM) e latissimus dorsi (LD) músculos4,5. Além disso, embriões de rato de nocaute DINE mostram defeituosa arborização dos nervos frênico no diafragma, causando mortalidade e insuficiência respiratória, imediatamente após o nascimento,6,7. Portanto, esta última etapa de maturação MN (ou seja, projeção axonal e ramificação) é fundamental para garantir a comunicação entre os neurônios e células-alvo.
Para ver os padrões de arborização, pesquisadores normalmente conduzir imagem latente confocal ou microscopia de luz de dois fotões de fluorescência das amostras seccionado ou toda a montagem8,9,10. Ambas estas técnicas de microscopia geram aceitável resolução e profundidade de penetração. Microscopia de fluorescência de dois fotões de luz envolve excitação de fluorophores por absorção simultânea de dois fótons de baixa energia11. Desde que dois fotões excitação usa radiação infravermelha, a frequência de diminuição da excitação contribui para a dispersão reduzida e melhor penetração de tecido até 1 mm de tecido, permitindo imagens com maior profundidade. Microscopia confocal remove pelos filtros do fora-de-foco sinais e apenas recolhe a luz dentro do plano focal12. Com esta abordagem, imagens das amostras dos diferentes planos focais podem ser combinadas para produzir uma imagem de tridimensional (3D) através de uma função de Z-pilha. Não obstante, intensidade de sinal é reduzida como a maioria da luz é bloqueada e altas aberturas numéricas obscurecem o profundidade de campo. Mais importante, ambas as técnicas contribuem para a grave Fotodano e fototoxicidade desde o espécime recebe iluminação mesmo quando apenas um avião é fotografado em um determinado momento.
Para contornar essas deficiências, LSFM tornou-se uma alternativa favorecida, com as vantagens de ser rápido, luz eficiente e menos fototóxico13,14. Além disso, o LSFM permite múltipla visualização imagem. Esta abordagem é particularmente adequada para visualização motor axônios e seus terminais de dispersão como eles se espalharam através do espaço 3D. LSFM supera as outras duas opções, porque as amostras são montadas em um palco que permite a rotação em torno de um eixo vertical e movimentos ao longo o x, y e z eixos. Esta montagem não só permite uma visão minimamente bloqueada da amostra, mas também a escolha de um caminho de iluminação desejável, uma lacuna de microscopia confocal e de dois fotões, ambos dos quais requerem montagem de amostras em uma corrediça plana. Portanto, LSFM é a ferramenta mais adequada para imagens 3D de arborização de axônio e para a quantificação dos terminais do nervo motor em embriões do rato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os animais foram mantidos em uma patógeno específico livre (SPF) animal facilidade, aprovado e supervisionado por IACUC da Academia Sinica.
1. fixação
- Coletar embriões de dia embrionário 12,5 (E12.5) em seguida, decapitar e acabo com eles.
- Fixar os embriões individualmente em placas de 24 poços com 1ml/bem de acabadas paraformaldeído 4% em 1x salino de tampão fosfato (PBS) durante a noite. Incube a 4 ° C, um agitador.
- Lave os embriões fixos pelo menos 3 x, cada um por 5-10 min, com 1 mL de 1X PBS e incubar durante uma noite a 4 ° C, um agitador para remover o paraformaldeído residual.
2. toda a montagem imunocoloração
- Permeabilize cada embrião em 1 mL de 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) durante a noite a 4 ° C, um agitador.
- Bloco de cada amostra com 1 mL de 10% FBS preparado em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, um agitador.
- Incubar o embrião com 1 mL de anticorpo primário anti-GFP (1:1, 000 diluição em 10% FBS) a 4 ° C, durante 72 h com agitação constante para intensificar o sinal do GFP de nervos motores.
- Após a incubação do anticorpo primário, lavar com 1 mL de 0.5% PBST ao longo de 1-2 dias a 4 ° C, um agitador, mudando a 0,5% PBST pelo menos três vezes.
- Aplicar 1 mL de anticorpo secundário (1:1, 000 diluição em 10% FBS) e incubar durante uma noite, no escuro a 4 ° C, com agitação constante.
- Lavar 3x com 1 mL de 0.5% PBST a 4 ° C, um agitador ao longo de 2-3 dias. Manter amostras de 1X PBS a 4 ° C até o dia anterior a imagem.
Nota: Os embriões podem ser dissecados em segmentos menores antes de compensação, dependendo de qual parte dos embriões vai ser fotografada. Membros dianteiros são preservados nesta abordagem experimental (figura 1A). - Incube o embrião de um reagente de compensação comercial com um índice de refração de 1.49 nD em um tubo de 1,5 mL, protegido da luz em temperatura ambiente durante a noite, para processar o embrião transparente para a imagem latente.
Nota: O volume de reagente a clareira é aproximadamente cinco vezes que o volume de amostra.
3. LSFM (2-3 h)
-
Configuração de amostra
- Configurar a 5 X / 0.1 iluminação ótica e 5 X / 0,16 óptica da deteção. Montar o porta-amostras e amostra capilar (1,5 mm de diâmetro interno, verde) e colocá-los no microscópio.
Nota: Consulte Manual de operação do microscópio para procedimentos de instalação detalhadas. - Monte o embrião da seguinte forma:
- Preparar a ponta da pipeta P200 cortando a parte superior para que ele caiba o diâmetro do capilar e remover a parte pontiaguda (~ 3 mm) para a fixação da amostra.
- Derreta a extremidade cega da ponta da pipeta usando uma pequena chama.
- Extinguir a chama e rapidamente anexar o embrião verticalmente na ponta derretida.
- Encaixe a parte superior da ponta da pipeta com a amostra capilar.
- Permitir que o buffer de câmara para equilibrar com o embrião para 1 min limpar os detritos ou bolhas.
- Usando o software de imagem, selecione Localizar capilar sob a guia de Localizar e ajustar o x, y, eixos z para posicionar o capilar de amostra.
- Selecione Localizar amostra e zoom de 0,6 X para focar o embrião. Gire o embrião para garantir que o longo eixo do membro imagem alinha com o trajeto da luz das duas fontes de luz (figura 1B).
- Configurar a 5 X / 0.1 iluminação ótica e 5 X / 0,16 óptica da deteção. Montar o porta-amostras e amostra capilar (1,5 mm de diâmetro interno, verde) e colocá-los no microscópio.
-
Aquisição de imagem
- Sob a guia de aquisição , defina os parâmetros de trajeto da luz como objectivos da deteção, laser bloqueio filtro, divisor de feixe, câmeras e lasers.
Nota: O canal GFP é usado neste experimento (comprimento de onda de excitação: 488 nm; filtro de emissão: BP 505 para 545 nm, divisor de feixe: SPS LP 560). - Marque a caixa de verificação de pivô para redução de sombra.
- Definir as configurações de aquisição: bit profundidade, 16 bits; zoom, 0,36-0,7 X; iluminação do único-lado (esquerda/direita) ou lado do dual iluminação.
- Clique em contínua e definir a intensidade do laser, tempo de exposição, poder do laser e posição de folha de luz para obter imagens mais nítidas.
Nota: A potência do laser é mantida tão baixa quanto possível minimizar o Fotodano. - Pressione parar para aquisição de imagem final.
- Sob a guia de aquisição , defina os parâmetros de trajeto da luz como objectivos da deteção, laser bloqueio filtro, divisor de feixe, câmeras e lasers.
-
Aquisição multidimensional
- Defina a z-pilha, deslocando a posição de Z para a primeira e a última imagem. Clique em Optimal para definir o número de fatias.
- Clique em Iniciar o experimento para adquirir a z-pilha selecionada.
- Quando estiver pronto, salve a imagem no formato .czi.
-
Processamento de imagem (opcional)
- Prosseguir com a fusão de lado duplo sob o canal de Processamento de Lightsheet se iluminação dual-lado é aplicada. Processamento de MultiView é necessário se múltiplos pontos de vista são adquiridos para combinar imagens de vários ângulos.
- Crie uma imagem 2D usando os dados de pixels maiores intensidade ao longo do eixo de projeção sob o canal da Projeção de intensidade máxima .
- Em canal de cópia , clique em subconjunto para selecionar subconjuntos das imagens do conjunto original.
4. quantificação de arborização axônio (30 Min. para cada nervo Individual)
- Abra o arquivo de imagem do software de análise de imagem (por padrão, a imagem que contém os dados XYZ é aberta no modo Surpass e como um modo de exibição em 3D-rendered).
- Ajustar a cor da imagem, brilho e usando a janela de Exibição ajuste de contraste (Editar | Ajuste de exposição mostrar) para detectar filamentos baseados no contraste local de intensidade.
- Clique no ícone Adicionar novos filamentos e selecionar o algoritmo de relationship (sem laço) no menu drop-down.
- Selecione a região de interesse (no caso, o axônio segmentar de interesse). Clique em Next quando terminar.
- Defina os pontos de partida e sementes, atribuindo as medições de diâmetro maior e mais fino, que podem ser medidas usando o modo de fatia .
- Atribua um ponto de partida na borda da região de interesse. Para conseguir o manual adição ou remoção dos pontos de partida, primeiro alterar o modo de ponteiro (navegar | Selecione) e, em seguida Shift + botão direito do mouse nos pontos de interesse.
- Selecione manuais limiares para pontos de sementes garantir que todos a visível arborização está marcado. Alterar o modo de ponteiro (navegar | Selecione) e, em seguida Shift + botão esquerdo do mouse nos pontos de interesse para manualmente adicionar ou remover pontos de semente.
Nota: É importante para manualmente remover ruídos de fundo e sinais de nervos vizinhos. - Marque a caixa remover pontos de semente em torno de pontos de partida.
- Verifique remover desconectada de segmentos para permitir que a exclusão dos pontos que estão muito longe e que pode representar o ruído de fundo. Indica o Comprimento máximo da Gap na próxima etapa para definir o limite superior para exclusão.
- Ajuste o limite para subtração de fundo, que utiliza um filtro gaussiano para estimar a intensidade de fundo de cada voxel.
- Definir limite automático para diâmetro dendrito usando o algoritmo de área de seção transversal aproximada .
- Pule as etapas para o cálculo da coluna.
- Terminar o processo e escolher o estilo desejado e cor.
- Desmarque a caixa de volume em Propriedades para exibir apenas os axônios reconstruídos.
- Na guia estatísticas , selecione Detailed. Use o filamento não. Pontos de Terminal dendrito para quantificar os terminais do nervo motor como um indicador da arborização axônio motor.
Nota: Anotação estatística pode ser adicionada se desejado. - Exporte a imagem do axônio reconstruída como um arquivo. tif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSFM fornece visualização 3D detalhada de arborização de trajetória e axônio MN no mouse embriões. Sob campo claro, tecidos aparecem completamente transparentes após ter sido mergulhado no reagente de compensação comercial. Nenhum encolhimento ou inchaço da amostra foi notado após uma semana de armazenamento no reagente antes de imagem de compensação. Canal de fluorescência, neurônios motores são rotulados com GFP transgenicamente expressa (filme 1). Em alguma instância, detalhes da estrutura de axônio estão comprometidos. Por exemplo, a Figura 2 representa a imagem de baixa qualidade. Vários fatores podem impedir a qualidade de imagem. Em primeiro lugar, permeabilização insuficiente e etapas de lavagem podem levar ao sinal de fundo elevado. Em segundo lugar, a dispersão da luz através de tecido inadequadamente limpo irá resultar em imagens tremidas. Por último, amostra suboptimal posicionamento durante a aquisição de imagens pode aumentar a dispersão da luz ou bloquear o trajeto da luz.
Para arborização de axônio imagem em maior detalhe e para realizar a quantificação, ampliação pode ser ajustada para que cada estrutura finamente arborized pode ser revelado (filme 2). Imagens de iluminação de lado único e duplo devem ser comparadas para determinar a resolução ideal do padrão de arborização (Figura 3). Software de análise de imagem pode ser usado para reconstruir os padrões de arborização de axônio para nervos individuais membro anterior (Figura 4). Definindo o ponto de partida e o diâmetro para a deteção do ponto semente, essas estruturas arborized podem ser semi automaticamente detectadas e computadas enquanto sinais de fundo são removidos manualmente. Usamos o "filamento – não. Modo de função Pts Terminal dendrito"para calcular os terminais do nervo motor total dos nervos individuais como um indicador da arborização axônio motor. Além disso, comprimento de ramo, diâmetro médio e volume podem ser calculados usando o "Filamento – dendrito comprimento", "Filamento – dendrito significa diâmetro" e "Filamento – dendrito Volume", respectivamente.
Figura 1: ilustração gráfica de configuração de exemplo. (A) durante a preparação da amostra, os embriões são primeiro decapitados e eviscerados. Membros dianteiros são dissecados ao longo da linha tracejada. (B) na câmara de amostra, amostras são posicionadas para manter toda a região de interesse ao longo do trajeto da luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: luz de microscopia de fluorescência de folha de um grande campo de visão da metade superior de um embrião de rato geneticamente modificado E12.5 (Hb9::GFP). O filme demonstra claramente projetando da medula espinhal para seus destinos innervating de nervos motores. A imagem 3D é primeiro adquirida ao abrigo de 0.3 X ampliação com tempo de exposição de iluminação e 30 ms de único-lado e depois é transformada em vídeo usando o software de análise de imagem. Barra de escala representa 500 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Figura 2: exemplo de uma imagem de baixa qualidade com sinal de fundo elevado e regiões desfocadas (setas azuis). As etapas impróprias durante a aquisição de imagem e preparação de amostra podem levar à qualidade de imagem prejudicada para comprometer a precisão de qualquer quantificação subsequente de arborização de axônio. Barra de escala da imagem representa 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Movie 2: visualização do membro anterior E12.5 os nervos abaixo dos 488 excitação nm com iluminação de duplo-lado com uma ampliação de 0,6 x. O zoom no filme permite visualização clara e panorâmica de todas as estruturas arborized bem nos nervos individuais. Barra de escala representa 300 µm. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Figura 3: comparação entre a iluminação de lado único e duplo. Iluminações de esquerda e direita exibem detalhes de certas regiões apenas (setas vermelhas), Considerando que uma imagem combinada de iluminações dual-lado fornece uma visão mais completa do padrão de arborização. No entanto, único-lado iluminação pode ser alcançada em um tempo menor de imagem e, por vezes, com melhor qualidade de imagem. Isto é devido ao fato de que caminhos de iluminação de ambos os lados não podem mentir perfeitamente em um único plano, resultando em desfoque durante iluminações dual-lado. Imagens são mostradas como projeção de intensidade máxima. Barra de escala representa 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: reconstruída arborização axônio dos nervos do membro anterior individual, codificados por cores da seguinte forma: supraescapular (vermelho), axilar (rosa), radial (azul), cutâneo braquial posterior (roxo). Complexidade de arborização foi calculada de acordo com o número de pontos de extremidade terminais detectado usando nosso método semi-automático. O algoritmo de relationship (sem laço) traços de filamentos e detecta pontos de semente de pontos de partida definida pelo usuário. Barra de escala em ambas as imagens representa 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diversas etapas no protocolo podem ser sujeitas a alterações em determinadas circunstâncias. Por exemplo, a duração da fixação depende da idade dos embriões, variando entre 2 h e 1 ou mais dias usando paraformaldeído acabadas. Desde que a fixação é feita antes de toda montagem imunocoloração, para anticorpos que são sensíveis à proteínas de reticulação, metanol pode ser usado como um agente fixador alternativo. Para uma relação sinal / ruído elevada após coloração, é necessário otimizar a concentração de detergente (entre 0.1-0.5%). Etapas de lavagem adicionais antes e após a incubação do anticorpo também podem aumentar a relação sinal-ruído. Além disso, uma etapa de remoção de tecido é importante para garantir que o feixe luminoso é desbloqueado por todo fundo axonal projeções. Para aumentar a transparência do tecido, é importante garantir a introdução mínima de PBS durante incubação em despachante comercial, como o efeito de compensação é invertido por re-imersão amostras em soluções tampão. Caso contrário, recomenda-se uma clareira reagente com um maior índice de refração ou um longo período de compensação. Entretanto, parâmetros durante a aquisição de imagens variam entre diferentes amostras. Duplo-lado iluminação e imagem multiview podem permitir imagens com maior profundidade de campo e maior detalhe. No entanto, desde iluminação de diferentes ângulos é adquirida em simultâneo, único-lado iluminação é mais eficiente para espécimes menores ou amostras em movimento. Uma imagem de boa qualidade assegura a precisão para as seguintes análises quantitativas.
Estudos anteriores, incluindo os do nosso grupo, têm utilizado a imagem latente confocal ou dois fotões microscopia para observar o padrão axônio motor de processo ou arborização de navegação em Hb9::GFP embriões10,15, 16 , 17. com base na nossa experiência, acreditamos que LSFM ser superior a esses outros dois métodos desde: 1) Imaging tempo é reduzido em grande parte como LSFM oferece a mais rápida e maior qualidade de imagem, enquanto minimizando Fotodano e fototoxicidade das amostras. Espécimes são iluminados do lado com uma folha fina de luz, criando uma secção óptica intrínseca14,18,19. O centro da folha luz converge com o plano focal do sistema de detecção, que é ortogonal ao eixo da iluminação. Consequentemente, fora do foco luz é reduzida, e a única fluorophores situado no plano focal são iluminados para cada imagem, ou seja, ao invés do espécime inteiro, desse modo reduzindo fotobranqueamento20. 2) detalhes do padrão de arborização são muito melhor ilustrados como LSFM permite imagens multiview. Em vez da amostra ser montada numa lâmina, está ligado de modo que a rotação em torno de um eixo vertical é possível, como são os movimentos ao longo do x, y e z dimensões. As imagens dos diferentes planos e vistas são empilhadas para produzir mais imagens 3D isotrópicas. No entanto, LSFM também tem uma limitação em comparação com abordagens confocal e dois fotões em termos de tamanho de arquivo enorme criado para cada imagem. Estes prós e contras precisam ser ponderado ao decidir qual método de imagem para usar, mas em última análise, a escolha vai depender qual microscópicas de hardware/software está disponível mediante pedido.
Em suma, este protocolo combina toda a montagem imunocoloração, estado-da-arte luz imagem 3D da folha, juntamente com a quantificação em software de análise de imagem. Acreditamos que este protocolo não só fornece um novo paradigma para a visualização de navegação axônio motor e trajetórias em embriões com quantificação de complexidade de arborização de axônio, mas também pode ser aplicado a outros sistemas de neurônio (ou seja, os neurônios sensoriais) com apropriado ratos transgénicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
LSFM experimentos e análise de dados foram realizadas em parte usando os avançados microscópios óticos do divisão de instrumento serviço na Academia Sinica e com o auxílio do MS. Shu-Chen Shen. Agradecemos a Sra. Sue-Ping Lee do Imaging Core Facility do IMB considerável assistência técnica com análise de imagem hottie. Científico Inglês edição núcleo do IMB reviu o manuscrito. Este trabalho é financiado pela Academia Sinica prêmio de desenvolvimento de carreira (CDA-107-L05), mais (104-2311-B-001-030-MY3) e INDH (INDH-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
