Summary
Здесь мы представляем протокол, который предназначен для анализа генома всей привязки Олигодендроциты транскрипционного фактора 2 (Olig2) в клетки-предшественники Олигодендроциты остро очищенный мозга (OPCs), выполнив низким клеточной хроматина иммунопреципитации (чип) , подготовка Библиотека, высокопроизводительного секвенирования и bioinformatic анализ данных.
Abstract
В клетках млекопитающих транскрипции гена регулируются определенным образом клетки типа взаимодействия транскрипционный анализ факторов с геномной ДНК. Линии специфических транскрипционных факторов считаются играть существенную роль в ячейки спецификации и дифференциация во время разработки. Чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) широко используется для анализа сайтов генома общесистемной связывания транскрипционных факторов (или его связанный комплекс) в геномной ДНК. Однако большое количество клеток, необходимы для одного стандартного чип реакцию, которая делает его трудным для изучения ограниченное число изолированных клеток первичной или редкие клеточных популяций. Для того чтобы понять механизм регулирования Олигодендроциты линии конкретных транскрипции показано фактором Olig2 остро очищенный мыши OPCs, подробный метод, с помощью чип seq для выявления генома всей привязки сайтов Olig2 (или Olig2 комплекс). Во-первых, протокол объясняет, как очистить тромбоцитарный фактор роста рецепторов альфа (PDGFRα) положительных OPCs от мыши мозги. Далее Olig2 антител при посредничестве чип и строительство библиотеки выполняются. Последняя часть описывает bioinformatic программного обеспечения и процедуры, используемые для анализа Olig2 чип seq. В целом этот документ сообщает метод для анализа генома всей привязки транскрипционный анализ фактора Olig2 в мозге остро очищенный OPCs.
Introduction
Это важно для изучения белков (или комплекс белков) ДНК привязок и эпигенетических меток для построения транскрипционный анализ регулирования сети, участвующие в различных биологических процессах. Частности привязки транскрипционных факторов в геномной ДНК могут играть важную роль в регуляции гена, дифференцировки клеток и тканей развития. Мощный инструмент для изучения регуляцию и эпигенетические механизмы — иммунопреципитации chromatin (обломока). Благодаря быстрому достижениями в технологии виртуализации следующего поколения чип, в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования ДНК (чип seq) используется для анализа привязок протеин дна и эпигеномные марок1. Однако это стандартный протокол чип seq требует около 20 миллионов клеток на реакцию, которая затрудняет применение этой методики, когда номер ячейки ограничено, как отдельные клетки первичной и редких клеточных популяций.
Олигодендроциты линии клеток, включая клетки-предшественники Олигодендроциты (OPCs) и Олигодендроциты широко распространены по всему мозгу и имеют важное значение для развития и функционирования мозга. Как тип клеток-предшественников OPCs способны самообновления и дифференциации. OPCs не только служить прародителями олигодендроциты, но также играют важную роль в распространении нейрональных сигнализации, общаясь с другими типами клеток мозга2. Предыдущие исследования показали, что развитие Олигодендроциты регулируется линии специфических транскрипционных факторов таких как Olig2 и Sox103,4. Эти факторы транскрипции были найдены для привязки к промоутер или усилитель регионах некоторых важнейших генов влиять на их выражение во время Олигодендроциты спецификации и дифференциации. Однако это сложно определить ДНК-связывающих белков (или комплекс белков) интерес к остро очищенный первичной OPCs с очень ограниченное количество клеток.
Этот протокол описывает систематически расследовать геномной ДНК immunoprecipitated по Olig2 в очищенной мыши OPCs в геном-масштабе, используя чип seq технику. OPCs от мыши мозги были остро очищенная методом immunopanning и используется в чип эксперимент без распространения в пробирке. Ограниченное количество OPCs могут быть получены путем immunopanning и является недостаточным для стандартных чип seq экспериментов. Здесь с низким клеточной чип seq протокол как низко как 20 тысяч клеток на чип реакции транскрипционных факторов описан. Вкратце сшитого клетки лизированы и sonicated sonication устройство, чтобы наклонить хроматина. Стриженый хроматина был инкубировали с Olig2 антитела, а также белка A-покрытием бусины в осадок Olig2 антитела связаны геномной ДНК. После элюции от протеина A-покрытием бусы и обратного сшивания геномной ДНК, осаждают Olig2 антитела был очищен путем экстракции фенольных хлороформ. Полученный продукт был количественно и подвергнут T-хвостов, грунтовка, отжиг шаблон коммутации и расширения, адаптеры и амплификации, выбор размера библиотеки и очистки шагов для чип seq библиотека строительства.
После выполнения виртуализации, было проанализировано качество сырья читает из образца, подготовлен с антителом фактор транскрипции Olig2 и образец элемента управления. Пар низкого качества и содержащие адаптер читать фрагменты были обрезаны. Далее, подстриженные чтений были выровняны к геноме мыши ссылку. Геномный регионов, которые были значительно обогатили для читает чип, по сравнению с пример элемента управления, были обнаружены как вершины. Значительные вершины, представляющих потенциальные сайтов связывания фактор транскрипции, были отфильтрованы и визуализированы в браузере генома.
Примечательно метод, описанный в настоящем Протоколе может широко использоваться для чип seq других факторов транскрипции с любой тип клеток ограниченного числа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Всех животных использования и экспериментальные протоколы были выполнены в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных и одобрены институциональные Комитета по биобезопасности и животного благосостояния Комитет в Техасском университете центра науки здоровья на Хьюстон.
1. Очистка PDGFRα положительные Олигодендроциты Lineage клеток мозга мыши (с изменениями от ранее описанных immunopanning протоколы5,6,7)
-
Подготовка immunopanning пластины PDGFRα положительный клеточный отбор и 2 пластины для истощения эндотелиальных клеток и микроглии.
Примечание: Пожалуйста, обратите внимание, что Петри, но не блюда культуры клеток работать для immunopanning эксперимента; Если очищенной ячейки будут использоваться для культивирования, immunopanning шаги должны осуществляться в кабинет биобезопасности- Пальто на 10 см пластины Петри с 30 мкл крыса коза против IgG в 10 мл рН 9,5, 50 мм трис-HCl на ночь при 4 ° C. Агитируйте пластину, чтобы убедиться, что на поверхности пластин полностью и равномерно покрыты раствор для нанесения покрытия.
- Подготовьте раствор антител PDGFRα путем разбавления 40 мкл антител анти PDGFRα Крыса с 12 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) содержащие 0,2% BSA.
- После 3 стирок IgG покрытием плиты с 10 мл 1 x DPBS каждый, инкубировать IgG покрытием плиты с PDGFRα раствор антител при комнатной температуре в течение 4 ч.
- Вымойте пластину антитела покрытием анти PDGFRα крысы 3 раза с 10 mL 1 x DPBS. Аккуратно добавить решение DPBS вдоль боковой стенке пластины и не беспокоить с покрытием поверхности.
- Слой 2 новых плит Петри 15 см для истощения эндотелиальных клеток и микроглии с 20 мл DPBS, содержащих 2,3 мкг/мл Banderiaea simplicifolia лектины 1 (BSL-1) за 2 ч.
- Мыть BSL-1 покрытием пластин 3 раза с 20 мл 1 x DPBS. Аккуратно добавить решение DPBS вдоль боковой стенке плит и не беспокоить с покрытием поверхности.
-
Очистка PDGFRα положительные Олигодендроциты линии клетки изменяется от ранее опубликованные методы6 , 7 , 8.
- Вскрыть кортикального слоя ткани от 2 послеродовом день 7 (P7) мыши мозги согласно ранее опубликованные протоколы5,6.
- Отделить ткани для создания одной ячейки подвеска с нервной ткани диссоциации Kit (P) согласно инструкциям производителя подробные.
- Вкратце нарезать расчлененных кортикального слоя тканей с помощью скальпеля и подвергает их ферментативного пищеварения при 37 ° C. После переваривания вручную отделить куски с огнем полированные стекла, которую пипетки Пастера в одну ячейку подвеска.
- Центрифуга одноклеточных подвеска на 300 g x 10 мин при комнатной температуре и приостановить Пелле клеток с использованием 15 мл immunopanning буфера (immunopanning буфер является DPBS с 0,02% BSA и 5 мкг/мл инсулина).
- Инкубируйте одноклеточных подвеска с 2 мыши мозги последовательно на 2 пластины с покрытием BSL-1 15 мин при комнатной температуре с мягким перемешиванием пластины каждые 5 мин для обеспечения лучшего истощение Микроглия и эндотелиальных клеток.
- Аккуратно водоворот пластину для сбора не сторонник клеток в суспензии клеток и инкубировать их крыса PDGFRα антителами пластина для 45 мин при комнатной температуре.
- После инкубации суспензию клеток на пластину крыса PDGFRα антителами аккуратно водоворот пластину для сбора суспензии клеток и промойте пластины 8 раз с DPBS избавиться от non сторонник клеток. Аккуратно добавить промывочный раствор вдоль боковой стенке пластины и агитировать пластину несколько раз избавиться от non сторонник клеток.
- Отсоединить клетки из крыса PDGFRα антитела покрытием пластину, используя 4 мл клеток отряд решение лечение для 10 минут при 37 ° C. Встряхните пластину выбить адэрентных клеток.
- Собирать очищенный OPCs центрифугированием при 300 x g при комнатной температуре, приостановить клетки лепешка с 2 мл OPC клетки культуры среднего и подсчитать количество ячеек с помощью Трипановый синий и Горяева (500 мл клетки культуры среднего является среде DMEM/F12, содержащей 5 мл пенициллин стрептомицином решение (P/S), 5 мл N2, 10 мл B27, 5 мкг/мл инсулин, 0.1% BSA, bFGF 20 нг/мл и 10 нг/мл PDGFRα).
-
Проверка чистоты OPCs после immunopanning.
- Для того, чтобы оценить обогащения OPCs после immunopanning, использовать некоторые из очищенного OPCs для извлечения РНК с guanidium тиоцианат на основе добычи согласно инструкциям производителя.
- Выполните qRT ПЦР с помощью флуоресцентный зеленый краситель микс Мастер для проверки для обогащения PDGFRα выражение в очищенной OPCs по сравнению с диссоциированных мозг клеток согласно ранее опубликованных материалов4.
- Кроме того, семян некоторых очищенный OPCs в поли-D-лизин покрытием 24 хорошо плиты на иммуноокрашивания с анти NG2 хондроитин сульфат протеогликана (NG2) антитела как ранее опубликованные материалы9.
2. низкий ячейка чипа подготовка и строительство библиотеки чип для высокопроизводительного секвенирования
-
Olig2 подготовка Low ячейка чипа с системой коммерчески доступных sonication и коммерчески доступных низкой сотовый номер чипа комплекта (см. таблицу материалы), следуя инструкциям производителя подробные стандартные процедуры.
- После отсоединения от крыс анти PDGFRα антителами пластины и ячейки, считая с Трипановый синий и Горяева поставить 20000 очищенный OPCs в 1 мл OPC клеток питательной среды для каждого чипа реакции.
- 27 мкл 36,5% формальдегида исправить суспензию клеток для 10 мин при комнатной температуре.
Внимание: Обратите внимание, что формальдегид должны использоваться в химической Зонта по соображениям безопасности. - Остановите, ДНК белковых cross-linking с 50 мкл 2,5 М глицин для 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Все действия должны осуществляться на льду или в холодной комнате 4 ° C от этой точки. - Вымойте сшитого ячейки окатышей с 1 мл раствора из ледяной Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) с ингибитором протеазы коктейль и получить клетки, гранулированных, предварительно охлажденный центрифуги на 300 x g при 4 ° C.
- Лизировать клетки Пелле в 25 мкл полный буфер Lysis для 5 минут на льду.
Примечание: Агитируйте трубки приостановить ячейки в буфер Lysis. - Дополнить lysate с 75 мкл ледяной HBSS, содержащий ингибитор протеазы коктейль и сдвига хроматин клеток lysate, предварительно охлажденный sonication система с 5 циклов 30 s OFF программы и 30 s на ячейку. Всегда sonicate 6 трубы вместе и убедитесь, что баланс трубы содержат 100 мкл воды.
- После стрижки, центрифуги на 14 000 x g 10 мин 4 ° C и собирать супернатант в новой трубки после центрифугирования.
- Разбавляют 100 мкл стриженый хроматина с равным объемом ледяной полный чип буфера с ингибитором протеазы.
- Сохраните 20 мкл разбавленного стриженый хроматина как образец элемента управления ввода.
Примечание: Образец элемента управления ввода требуется также как сравнение Olig2 immunoprecipitated образец для определения Olig2 антител immunoprecipitated ДНК. - Добавить 1 мкл антител анти olig2 кролика к 180 мкл разбавленного стриженый хроматина и инкубировать реакции трубку на вращающееся колесо на 40 об/мин в течение 16 часов при 4 ° C.
Примечание: Выполните этот шаг в холодной комнате. - Для каждого чипа реакции, мыть 11 мкл магнитные белок А-покрытием бусины с 55 мкл буфера мытья бусы и поместить шарик пеллет в 11 мкл буфера мытья шарик после 2 стирок.
Примечание: Выполните этот шаг в холодной комнате. - Для каждого чипа реакции добавьте 10 мкл предварительно выстиранные белок А-покрытием бусины чип реакции трубки. Выполните этот шаг в холодной комнате.
- Инкубируйте чип реакции трубки на 4 ° C для еще 2 h на вращающееся колесо.
- Положите трубку реакции чип на магнитные стойки за 1 мин.
Примечание: Выполните этот шаг в холодной комнате. - Удалить супернатант и не выбить шарик Пелле.
- Помыть лепешка из бисера с 100 мкл для каждого из 4 мыть буферов соответственно по 4 мин на вращающееся колесо при 4 ° C.
- После смывки 200 мкл буфера Пелле шарик и инкубировать чип реакции трубки при 65 ° C для 4 h обратить вспять перекрестных ссылок белка ДНК.
- Кроме того 180 мкл буфера до 20 мкл пример ввода элемента управления и Инкубируйте на 65 ° C для 4 h обратить вспять перекрестных ссылок протеин дна также.
- Добавьте 200 мкл 25:24:1 (v/v) смесь фенол, хлороформ и изоамилового спирта к каждой пробке реакции чип.
- Вихрь энергично за 1 мин и центрифуги на 13 000 x g 15 мин при комнатной температуре. Верхний этап передать новой трубки.
- Добавить 40 мкл 3 M натрия ацетата раствор, 1000 мкл, 100% этанола и 2 мкл гликогена осадителя ковалентно связан с голубой краситель к каждой пробке реакции чип на ночь при-20 ° C.
- Центрифуга на 13 000 x g 20 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатанта, мыть с 500 мкл холодный 70% этанола и центрифуги на 13 000 x g 20 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатанта, держать воздух гранул сухого за 10 мин и растворяют гранулы с 50 мкл воды.
-
Строительство библиотеки чип для высокопроизводительного секвенирования
- Чистота и сконцентрировать чип ДНК с комплектом очистки согласно инструкции производителя.
- Количественно чип образец Пико-зеленый согласно инструкциям производителя.
- Используйте чип seq комплект для T-хвостов, репликации и хвостохранилища, шаблон коммутации и расширения, адаптеры и амплификации, выбор размера библиотеки и очистки согласно инструкциям производителя.
- После denaturation dsDNA dephosphorylate 3' концу ssDNA, креветки щелочной фосфатазы и добавить хвост поли (T) ssDNA, трансферазы deoxynucleotidyl терминала.
- Отжиг ДНК поли (dA) грунт ssDNA шаблон для репликации ДНК и шаблон переключения.
- После переключения шаблон усиливают чип seq библиотека методом ПЦР с прямого и обратного праймерами для индексации.
- Выберите ПЦР усиленный чип seq библиотека с фрагментами, начиная от 250 до 500 bp парамагнитных бисером вариант 2 для двойной размер выделения.
- Проверьте качество выбранной библиотеки чип seq, используя microfluidic чип капиллярного электрофореза устройство.
3. анализ данных
- Подготовка структуры каталогов.
- Создайте каталог для выполнения анализа данных чип seq. Внутри только что созданный каталог, создать шесть подкаталоги со следующими именами: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis и докладов.
- Подготовка данных и контроль качества анализа необработанные данные о последовательности.
- Переместить в папку «raw.files» и скачать чип seq файлы данных.
- Проверьте имена файлов. Если последовательность была в паре конец, будет 4 файлов (два для лечения) и два для ввода данных с одинаковыми именами базы: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq и PDGFRα_input.read2.fastq. Если имена не совпадают, переименуйте их, используя команду «МВ».
- Перейти к каталогу «fastqc.output».
- Получение метрик контроля качества от сырых чтений, с использованием программного обеспечения контроля качества fastq файл10. Используйте команду в Рисунке S1A для запуска процесса контроля качества отдельно для каждого файла fastq. Программное обеспечение будет отображаться несколько метрик качества управления в html-файле.
- Откройте html-файл контроля качества и проверки количество операций чтения, чтение длина, за качество базовой последовательности, последовательность показателей качества, последовательности GC содержание, последовательность дублирования уровней, адаптер содержание и содержание kmer.
- Трим конечные низкого качества чтения и адаптер содержание.
- Соблюдайте «за качество базовой последовательности» и «Адаптер содержание» участков. Определите длину обрезки для головы и хвоста каждого чтения. Надлежащей длины для обрезки, где базовый качество падает ниже 30, и есть свидетельства адаптер содержание.
- Перейти к каталогу «raw.files».
- Скачать и установить программное обеспечение для обрезки читает11. Используйте команду в Рисунке S1B для обрезки как лечения, так и вход отдельно. Параметр «Урожай» длина оставшихся чтения после усечения баз из конца и «HEADCROP» указывает количество баз устраняются от начала читать.
- Обрезки команда также включает в себя минимум, читать длина принимаются после фильтрации в параметре «MINLEN». Если чтение, по крайней мере 50 bp, bp использования 35 как прочитано длина порог.
- Перейти к каталогу «fastqc.output».
- Выполните анализ контроля качества файл fastq после обрезки читает. Убедитесь, что вопросы контроля качества были решены. Используйте команду в Рисунке S1C для получения контроля качества метрик.
- Выровняйте одно конец или конец парных чип seq читает генома мыши ссылку.
- Перейти к каталогу «bowtie.output» для сопоставления.
- Скачайте GENCODE мм10 мыши ссылку генома. Переименуйте ссылку генома мыши мм10 как «mm10.fa».
- Скачать читать картографа12 и установить его в системе.
- Создание индексного файла генома скачать ссылка, с помощью команды в Рисунке S2A. Автоматически создаются шесть файлов: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 и mm10.rev.2.bt2.
- Используйте команду в Рисунке S2B выполнить выравнивание и отрегулируйте параметр «-p» на количество ядер согласно параметрам системы. Если работает в паре-режим, параметры «-1» и «-2» укажите имена файлов отделаны fastq.
Примечание: Сопоставление выполняется отдельно для образцов лечения и ввода и вывода файлов метрики журнала создаются для каждого образца. - Скачать программное обеспечение для работы с файлами в формате Сэм13 и установить его в системе. Преобразуйте соответствие файла SAM в БАМЕ файл, используя команду в Рисунке S2C.
- Получение метрик качества сопоставленных гласит до пика, призывающие оба парных конец лечения и контроля образцов.
- Одним из наиболее важных показателей контроля качества адрес является глубина последовательности. Открыть файлы «log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt» и «log.bowtie.PDGFRα_input.txt» в каталоге bowtie.output и убедитесь, что количество однозначно сопоставленных чтения пар в каждом образце превышает 10 миллионов.
- Перейти к каталогу «homer.output».
- Скачать программное обеспечение для обнаружения мотив и секвенирование нового поколения анализ14 и установить его в системе.
- Создайте каталог с именем «tagDir».
- Чтобы проверить тег clonality, используйте команду, показано на Рисунке S3A. Команда «makeTagDirectory» будет генерировать четыре контроля качества вывода files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt и tagLengthDistribution.txt.
- Перейти к каталогу «tagDir».
- Скопируйте файл «tagCountDistribution.txt» в папку «Отчеты».
- Переместить в папку «Отчеты».
- Откройте файл tagCountDistribution.txt с помощью программы электронных таблиц и создайте панель участок количество тегов в геномной позиции. Сохраните файл гистограммы с именем «tag.clonality.xlsx».
- Установите Р программирования языка15 в системе.
- В терминале введите «R» и нажмите клавишу ENTER для доступа к среде программирования R.
- Загрузите пакет R для обработки данных чип seq16 и установить его с помощью команды, изображенные в Рисунке S3B.
- Используйте сценарий R в Рисунке S3C печать стренги кросс корреляции.
- Обнаружение с помощью картографа пик вершины.
- Перейти к каталогу «macs2.output». Скачать и установить картографа пик17 в вашей системе.
- Используйте функцию «callpeak» с лечения и контроля BAM файлы, созданные на шаге 3.4.6.
Примечание: Другие параметры включают «-f» для формата входного файла,»-g» для размера генома,»-имя» для указания базовое имя всех выходных файлов, и «-B» для хранения pileup фрагмента в формате bedgraph. Полный пик, вызов команды включен в Рисунке S4A. Используйте BEDPE для парных конец образцов. - Убедитесь, что пик картографа создано шесть файлов: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg и PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Открыть файл PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls для просмотра называется пики, местоположение, длина, саммите позиция, pileup ' а и пик обогащения метрики:-log10(pvalue), сложите обогащения и - log10(q-value).
- Фильтр и аннотировать называется пиков.
- Используя этот файл открыт на предыдущем шаге, фильтр в результате пики согласно раза обогащения, значение p или q значение. Принять адекватные фильтрации порогов, сделайте сюжет гистограммы для определения плотности каждой метрики. Отфильтровать значения ниже выбранного порога для получения значительных вершин.
- Скачать черный мм10 (регионы известны своими искусственно завышенных сигнала) и отфильтровать чип seq пики, которые находятся внутри любой из этих областей артефакт.
- Создайте файл кровати с отфильтрованной пиков, содержащих следующие столбцы: хромосомы, начало, конец, peakID, макет и Стрэнд. Заполните столбец макет с точкой «.» так как он не используется. В столбце Стрэнд, задать все значения как «+». Сохраните файл кровати как «filtered.peakData2.bed».
- Скопируйте файл «filtered.peakData2.bed» в папку «Отчеты».
- Переместить в папку «Отчеты».
- Для аннотирования отфильтрованных пиков в область конкретных генов, используйте функцию «annotatePeaks» с кровати файл, созданный на предыдущем шаге. Команда, используемая показан на Рисунке S5A.
- Откройте файл «filtered.annotatedPeaks.txt», с помощью статистического программного обеспечения.
- Фильтровать результирующий пиков, лежа в intergenic регионе на расстояние более 5 КБ от аннотированный ТП. Используйте столбец «Расстояние до TSS» в файле как расстояние для фильтрации. Сохранять отфильтрованные пиков в файле excel, названный «5kbup.geneBody.peakData.txt».
- Магазина в результате фильтрации пиков в файле bedGraph с колоннами: хромосомы, начало, конец и - log10(q-value). Имя файла «5kbup.geneBody.peakData.bedGraph».
- Создавать файлы воротила для визуализации браузера.
- Скачать и установить программное обеспечение для генома арифметические18.
- Скачать инструмент для преобразования bedgraph воротила и установить в системе. Скачайте файл «mm10.chrom.sizes».
- Используйте команду в Рисунке S6A для создания файла воротила.
- Скачать и установить генома браузер19 в системе.
- Откройте генома браузер и загрузите файл «5kbup.geneBody.peakData.bigwig» для визуализации отфильтрованных значительные вершины и их расположения относительно известных генов.
- Поиск мотива.
- Перейти к каталогу «motif.analysis».
- Скачать de novo мотив сканирование и мотив программы обогащения и установить его в вашей системе20.
- Скачайте мотив всеобъемлющей базы данных, которая включает мотивы Olig2.
- Получите genomic последовательностей 500 bp регионах сосредоточены на существенные пиковых саммитах. Храните последовательности как peak.sequences.txt. Используйте команду в Рисунке S7 для поиска Olig2 мотивы в рамках каждой из 500 bp пик регионов.
- Фильтровать результирующий мотивы, с использованием надлежащих E-значение (по умолчанию = 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Низкий клеточной чип seq была выполнена и bioinformatic анализы были сделаны для расследования потенциальное взаимодействие фактора transcriptional Olig2 с геномной ДНК в остро очищенный мозга OPCs. Рисунок 1 показывает общий рабочий процесс как экспериментальные, так и процедур анализа данных. В настоящем Протоколе послеродовой мышей мозг были отделены в одну ячейку подвеска. После диссоциации ткани immunopanning была выполнена для того чтобы очистить OPCs с помощью PDGFRα антитела. Рисунок 2 показывает значительное обогащение PDGFRα, мало выражения нейрон маркера Tuj1 (нейрон конкретного класса III бета тубулина), маркер экзоцитоз СВМС (глиальные фибриллово кислой белок), микроглии маркер ионизированного кальция привязки адаптера молекула 1 (Iba1), myelinating Зрелые Олигодендроциты маркер основной белок миелина (Mbp) и миелина Олигодендроциты гликопротеина (Mog) из очищенного OPCs, оцениваемое по RT-ПЦР. Кроме того иммуноокрашивания результат указывает, что большинство клеток являются NG2-положительных, как показано на рисунке 2. Впоследствии 20 тысяч очищенный OPCs за реакции были исправлены, формальдегид и хроматина был стриженый с помощью системы sonication. Была выполнена Olig2 низким ячейка чипа и библиотека была построена. После подготовки библиотека чип качество созданного продукта был подтвержден microfluidic чип капиллярного электрофореза устройства. Рисунок 3 показывает пример electropherogram библиотеки чип низким клеточной Olig2. Четкий пик Oligo2 библиотечный продукт от 250 до 500 bp должны быть видны после выбора размера библиотеки ПЦР продукта. Чип seq библиотеки образца, приготовленные антитела фактор транскрипции Olig2 и образец элемента управления были подвергнуты высокопроизводительного секвенирования производить в паре конец 50 цикл чтения последовательности. Читать большой длины улучшит сопоставления ставок и уменьшить вероятность нескольких карт, за счет виртуализации расходы. С 50 bp чип seq в паре конец последовательности библиотеки хорошие результаты обычно достигаются.
После оценки первоначального контроля качества сырья читает и обрезки адаптеров и замыкающих пар низкого качества контроля качества участки изображены на рисунке 4. Обрезанные читает должны иметь базовые качества больше 30, не адаптер последовательностей и имеют низкий дублирования скорость (рис. 4B-D). Хорошее качество подстриженные читает будет увеличить общую скорость выравнивания. Другие параметры, такие как содержание GC также важны и должны быть рассмотрены для обрезки.
После того, как образцы последовательности выровняны, это необходимо для проверки последовательности глубины. Известно, что количество называется пиков увеличится с глубиной выше последовательности, поскольку слабые места станет статистически более21. Насыщенность анализ необходим для определения достаточной глубины последовательность для каждого конкретного транскрипционный фактор используется за счет времени и бюджета. Глубиной последовательность консенсуса для связывания фактор транскрипции было предложено кодирования Консорциум о млекопитающих образцы: минимум 10 миллионов однозначно сопоставлен чтения для каждого из по крайней мере два биологических реплицирует22. Количество однозначно сопоставленных читает и общий уровень выравнивания были рассчитаны путем чтения mapper. В рисунке 5Априведен пример хорошей сопоставления показателей. Соответствие читает должны быть сопоставлены собственный геномной местах, указывающее сложности адекватного библиотеки, также упоминается как clonality тег. КОДИРОВАНИЯ Консорциум предполагает, что по меньшей мере 80% 10 миллионов из унифицированных читает должны быть сопоставлены в различных регионах геномной22. Рисунок 5B показывает адекватного тег clonality, в котором более чем на 90% гласит сопоставляются только один геномной местоположение. Низкой сложности библиотеки обычно происходят, когда не хватает ДНК получается, и усиленный PCR что фрагменты виртуализируются неоднократно. Низкой сложности библиотека принесут высокий ложных Пиковая частота обнаружения.
При использовании данных парных конец чип seq, фрагменты привязать вокруг фактора транскрипции с определенного расстояния от разделения. Для более точной оценки длины означает фрагмент, уступая лучше оценки геномной регионов, где произошло более обязательными позволит паре конец последовательности. Прядь корреляции сюжет изображает пик обогащения, соответствующего длине преобладает фрагмент. Как отмечалось в рисунке 5 c, длина вычисляемый фрагмент составляет 130 bp в то время как чтение Длина составляет 50 bp. Чип seq dataset, где фрагмент длина больше длины, чтения является показателем высокого качества16.
Пик вызова выводится список геномной регионов может быть связанными фактор транскрипции (или его комплекс). Список геномной регионов или вершины включен в файл «кровать», который может рассматриваться в браузере генома. Для каждого пика, этот файл содержит идентификатор пик, геномных расположение пик встречи на высшем уровне и ФДР-log10 (q значение). Значительно обогащается пики являются те, с выше складки обогащение и значение метрики. Пример вывода пик-файла показан в рисунке 6A. После выбора значительные вершины, которые с помощью пользовательских порогов, фильтрация вершин в КОДИРОВАНИИ в черный список23и выявления вершин региона промоутера генов (тело вверх и весь ген 5 КБ), файл «воротила» полезен для просмотра пиков в геноме Обозреватель. Наиболее обогащенного пик регионы имеют более высокую вероятность связывания фактор транскрипции. Важно подтвердить пик присутствие в известных транскрипции фактором регулирования регионах, а также отсутствие пик в регионах, где вряд ли привязка фактор транскрипции. Рисунок 6B -E показывает примеры гена регионов с и без обогащения пик, а также их расположение в отношении кодирования промоутер регионов.
В silico дополнительные методы для чип seq эксперимента являются анализ обогащения мотив и de novo поиск мотива. Поскольку Olig2 привязки в OPCs не было изучено до, Olig2 чип seq производным пиков в клетки-предшественники двигательного нейрона и эмбриональные стволовые клетки были использованы для de novo мотив идентификации4,24. Olig2 de novo определены мотивы были добавлены к всеобъемлющей базы данных кодирования мотив25 и был выполнен анализ обогащения мотив. Высокое обогащение de novo определенных OLIG2 мотивы и известных транскрипционным фактором (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 и ASCL1) мотивы были найдены в чип seq пики PDGFRα очищенный клеток. Обогащение 30 de novo определенных мотивов с E-значение < 0,05 был обнаружен. Рисунок 7 показывает два верхних de novo определены мотивы Olig2. Эти два de novo определенных Olig2 мотивы были найдены в > 60% чип seq пиков полученные от очищенной PDGFRα клеток, кроме известных мотивы.
Рисунок 1: Обзор протокола рабочего процесса. PDGFRα положительные OPCs были изолированы от послеродового мыши мозги и были подвергнуты Olig2 чип эксперимент. Осажденный фрагментов ДНК были использованы для подготовки чип библиотеки. После оценки качества библиотеки образцы были использованы для виртуализации. Наборы данных были проанализированы и пики были выявлены, указывающее потенциальных сайтов связывания Olig2 в OPC очищенной ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оценка чистоты immunopanned OPCs ПЦР и иммуноокрашивания. (A) PDGFRα антитела immunopanned клетки были посеяны и иммуноокрашивания была выполнена с помощью OPC линии маркера NG2 антитела. Синий: DAPI, зеленый: NG2. Шкалы бар = 10 мкм. (B) оценивали относительный уровень экспрессии маркера Tuj1 нейрон в очищенной OPCs (PDGFRα +) и в клетках диссоциированных мозга (микс). Выражение Tuj1 в клетках мозга диссоциированных было присвоено значение 1. (C) относительный уровень экспрессии экзоцитоз маркер СВМС в очищенной OPCs (PDGFRα +) и в клетках диссоциированных мозга (микс) была проведена оценка. Выражение СВМС в клетках мозга диссоциированных было присвоено значение 1. (D) относительный уровень экспрессии OPC маркер PDGFRα в очищенной OPCs (PDGFRα +) и в клетках диссоциированных мозга (микс) была проведена оценка. Выражение PDGFRα в клетках мозга диссоциированных было присвоено значение 1. (E) относительный уровень экспрессии маркера myelinating Зрелые Олигодендроциты Mog в очищенной OPCs (PDGFRα +) и в клетках диссоциированных мозга (микс) была проведена оценка. MOG выражение в клетках мозга диссоциированных было присвоено значение 1. (F) относительный уровень экспрессии маркера myelinating Зрелые Олигодендроциты ПМБ в очищенной OPCs (PDGFRα +) и в клетках диссоциированных мозга (микс) была проведена оценка. MBP выражение в клетках мозга диссоциированных было присвоено значение 1. (G) относительный уровень экспрессии микроглии маркер Iba1 в очищенной OPCs (PDGFRα +) и диссоциированных мозга клетки (микс) была проведена оценка. Выражение Iba1 в клетках мозга диссоциированных было присвоено значение 1. Данные в B-G представляют тройные эксперименты и указывают баров ошибка стандартная ошибка. T-тест анализ * P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: пример electropherogram библиотеки от чипа низким клеточной Olig2. После выбора двойной размер качество Olig2 чип библиотеки был проанализирован microfluidic чип капиллярного электрофореза устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель контроля качества результатов за образец чип seq читать длина низким ячейка 50 bp. (A) Сводная таблица с изображением общее количество операций чтения, количество плохого качества читает, длина последовательности и общее содержание GC. (B) участок указанием распределения базового качества успеваемости на различных позициях в читает. Участок (C) показаны потенциальные адаптер контента на различных позициях в читает. (D) линии сюжета, указывающее процент дублирования последовательности. Большинство читает происходят из последовательностей, которые происходят только после того, как в библиотеке, поэтому определяющее скорость низкая дублирования или библиотека высокой сложности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: контроль качества метрики получены перед вызовом пик: bowtie2 выравнивание метрики, прядь кросс корреляции и тег clonality. (A) выравнивание метрики получены от чтения mapper. Наиболее важные метрики являются количество однозначно сопоставленных пар чтения, указывается как «соответствие согласно точно 1 раз» и общее выравнивание темпов. (B) гистограммы показаны clonality тег. Бары указывают процент геномной позиций, где были найдены теги. (C) пример участка кросс корреляции указанием данных хорошего качества. Красные линии изображают чтения длину на 50 bps и преобладающим фрагмент длиной в 130 bps. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: чип seq пик регионов и генома браузер мнения значительного чип seq пиков в разных местах геномной. (A) пример пик регионов, выявленных с вызывающего пик. (B) значительные чип seq пиков найден в организме гена Cspg4, известный гена маркер OPC. (B) не чип seq пики были найдены в регионах промоутер или органах гена Mbp гена, маркер для зрелой олигодендроциты, (C) Tubb3, нейрональные клетки маркер, или (D) СВМС, ячейке маркер астроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: высокообогащенного de novo определены мотивы Olig2 в PDGFRα-Olig2 чип seq пиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок S1: Подготовка наборов данных чип seq. (A) определение архитектуры каталог. (B) расчет сырья читать контроля качества метрик. Обрезка (C) гласит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S2: выравнивание читает генома ссылка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунке S3: контроль качества унифицированных гласит, адрес прядь кросс корреляции и определить тег clonality. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S4: пик призвание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунке S5: Аннотация значительных вершин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S6: преобразование формата файла bedGraph воротила пик визуализации в браузере генома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S7: De novo мотив поиска и мотив обогащения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
S8 фигуры: диаграмму, описывающую биоинформатики анализ данных чип seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
У млекопитающих генных сетей регулирования являются весьма сложными. Чип seq является мощный метод для изучения генома общесистемной протеин дна взаимодействий. Этот протокол включает в себя как выполнять Olig2 чип seq, используя небольшое количество очищенной OPCs от мыши мозги (как низко как 20 тысяч клеток на реакции). Первый ключевой шаг для этого протокола является очистка OPCs от мыши мозги, immunopanning с PDGFRα антител. Для позитивного выбора OPCs с PDGFRα покрытием пластин OPCs часто слабо привязку к PDGFRα покрытием пластин. Даже после нескольких стирок есть еще некоторые non сторонник клетки слева. Важно проверить что non сторонник клетки после каждого D-PBS мыть под микроскопом. Если больше D-PBS мыть не поможет сократить количество ячеек не сторонник, пора собирать выбранные ячейки, так как избыток моет может выбить прилагаемый OPCs и снижения урожайности очищенный клеток. Однако недостаточно моет может привести к загрязнению других типов клеток мозга. Таким образом каждый раз после изоляции, необходимо оценить чистоту изолированных OPCs, иммуноокрашивания с OPCs маркер NG2 ПЦР для выражения конкретных генов известный тип ячейки как Tuj1 для нейронов, СВМС для астроциты, PDGFRα для OPCs, Iba1 для микроглии и мог и ПМБ для myelinating Зрелые олигодендроциты. Как показано на рисунке 2, иммуноокрашивания результат показывает, что большинство очищенный клеток являются позитивными для окрашивания NG2. Кроме того некоторые классические типа клеток конкретных маркеры для нейронов, астроциты, Микроглия и myelinating Зрелые Олигодендроциты экспонат обнаружить или крайне низкие уровни выражения в очищенной OPCs по сравнению с смесь клеток неочищенную мозга. PDGFRα демонстрирует уровень высокой выражения в очищенной OPCs по сравнению с смесь клеток неочищенную мозга. С помощью метода immunopanning, микроглии значительно уменьшена в очищенной OPCs, по сравнению с смесь клеток неочищенную мозга, но существует небольшое количество загрязнения. Этот вывод согласуется с предыдущих публикаций другими7,8,26. Кроме того по сравнению с ранее опубликованными отчетами, коммерчески доступных комплект используется в этом протоколе для стандартизированной, эффективный и удобный диссоциации тканей мозга в сингл клеточной суспензии.
После сшивки очищенный OPCs, сшитого клетки должны быть вымыты с ледяной решения HBSS и оставшиеся шаги чип должен осуществляться при температуре 4 ° C, в противном случае антитела не может осадить геномной ДНК должным образом.
Следующий ключевой шаг в этот протокол является подготовка библиотеки. ПЦР-амплификации чип материала был использован для строительства библиотеки. Количество циклов PCR для библиотеки приготовления зависит от количества начиная ДНК. Хорошая библиотека подготовка требует точной количественной оценки количества ввода ДНК. Слишком много или слишком мало циклов PCR могут влиять на концентрацию Библиотека, а также сложности, ведущих к ПЦР артефактов.
Это сложно построить чип seq библиотеки при использовании ограниченное количество клеток для иммунопреципитации27. Ранее использовались стандартные чип протокол требует 10 нг immunoprecipitated ДНК для чип seq библиотеки подготовка1,28. Однако, протокол, описанные здесь обычно создает 2 нг immunoprecipitated ДНК, Olig2 антитела от 20000 OPCs. ДНК используется для подготовки чип seq библиотека методом сложения одноступенчатых адаптера, который позволяет повысить чувствительность, позволяя пикограмм immunoprecipitated ДНК, чтобы быть усилены. Объединяя коммерческие наборы, этот протокол обеспечивает практическое решение для выполнения чип seq транскрипционный анализ факторов, основанный на небольшое количество клеток.
Важно отметить, что низкий Клетка чип seq протокол описал применима для чип-Seq других факторов транскрипции в Главные ячейки или редкие клеточных популяций также. Антитела, используемые в настоящем протоколе должны проверяться экспериментально быть конкретными экспериментом IP сначала. Привязки без каких-либо специфических антител приведет к плохим результатам. Кроме того желательно провести этот эксперимент низкой ячейка чипа seq в камерах с высоким уровнем экспрессии транскрипционный фактор интереса.
Для анализа данных он может быть сложным, чтобы решить, какие значения использовать как фильтрация обрезков после вызова пик. В зависимости от целей анализа могут быть использованы строгие или более расслабленным параметры. Как правило используется сочетание фолд обогащение и p значение или ФДР. Если ранее были известны некоторые привязки сайтов транскрипционного фактора под исследование, это может помочь в определении пороговых уровней фильтрации. Баз данных сайта связывания фактор транскрипции производным от общедоступных чип seq экспериментов в различных клеточных линий и условия были скомпилированных29,30. Можно искать ген и проверить, если ранее были найдены сайтов связывания фактор транскрипции. Однако важно помнить, что сайтов связывания фактор транскрипции отличаются в зависимости от типов клеток и условий.
В silico дополнительные методы для чип seq эксперимента являются мотивом обогащения анализ и de novo мотив Поиск с использованием MEME-чип20 или аналогичных программ. Мотив поиска требует всеобъемлющего известных и de novo производный мотив базы данных как КОДИРОВАТЬ мотивы25 или Hocomoco базы данных31. Hocomoco представляет собой базу данных мотивы, обнаружил из публично доступных человека и мыши чип seq экспериментов. Если неизвестны мотивы для Оксиметрический анализ белков, поиск de novo мотив может выявить повторяющиеся последовательности шаблонов в значительную долю вершин как новые мотивы. Потенциальных комбинаторной действие транскрипционных факторов может быть открыт когда мотивы других факторов транскрипции встречаются также обогащаться в результате пиков.
Обогащенный пик регионы могут экспериментально проверить с помощью хроматин клеток мутанта или нокаут как элементы управления. Выполнение чип seq с использованием клеток, не выражая транскрипционного фактора используются для выявления ложных положительных вершины, также обозначается как «Фантом пики»32. Следует отфильтровывать ложные срабатывания.
Это также интересно сравнить результирующие чип seq пиков с транскриптомики данными. PDGFRα-Olig2 чип seq пики были сопоставлены с экспрессии генов в OPCs от предыдущей публикации18. Эта стратегия может быть ограничено, поскольку выраженной генов в OPCs могут контролироваться механизмы помимо связывания фактор транскрипции Olig2. Кроме того фактор транскрипции Olig2 могут связывать гена регулирования региона но ген может иметь низкий ген выражение уровня из-за возможное ингибиторная механизмов или отсутствие совместно факторы, необходимые для транскрипции гена.
Чип seq — это метод, используемый для определения генома всей ДНК сайтов связывания транскрипционных факторов и других белков. Однако путем анализа факторов транскрипции, исследователи обнаружили, что транскрипционные факторы склонны связывать с другими белками, образуя совместного модули33. Это означает, что некоторые привязки между транскрипционный анализ факторов и геномной ДНК показал чип seq косвенные и мостовой других белков. Таким образом для достижения более значимых результатов исследователи следует рассмотреть возможность изучения более чем один фактор транскрипции одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD и YY были поддержаны грантов от национальных институтов здоровья R01 NS088353; 1R21AR071583 гранта NIH-01; Staman Огилви фонда Мемориальный фонд Hermann; Инициатива UTHealth мозга и CTSA УЛ1 TR000371; и Грант от университета Техаса системы неврологии и нейротехнология научно-исследовательского института (Грант #362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
