Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57547

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול אשר נועד לנתח את הגנום כולו הכריכה של הגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2) בתאי המוח בחריפות מטוהרים אוליגודנדרוציטים קודמן (OPCs) על-ידי ביצוע כרומטין נמוך-תא immunoprecipitation (ChIP) , ספריית הכנה, תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים bioinformatic.

Abstract

בתרבית של תאים, שעתוק גנים מוסדר באופן ספציפי סוג התא על ידי פעולת הגומלין בין גורמים תעתיק עם הדנ א. גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין נחשבים ממלאים תפקידים חיוניים ב מפרט תא ובידול במהלך הפיתוח. שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) נעשה שימוש נרחב כדי לנתח אתרי קישור ברמת הגנום של גורמי שעתוק (או שלה מורכב משויכת) ל- DNA גנומי. עם זאת, מספר גדול של תאים נדרשים עבור אחד שבב התגובה השגרתית, מה שהופך את זה קשה ללמוד מספר מוגבל של התאים הראשי מבודד או אוכלוסיות תאים נדיר. כדי להבין את מנגנון רגולטורי של שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין אוליגודנדרוציטים מוצג גורם Olig2 העכבר בחריפות מטוהרים OPCs, שיטה מפורטת באמצעות שבב-seq לזהות את האתרים ברמת הגנום מחייב Olig2 (או Olig2 מורכבים). ראשית, הפרוטוקול מסביר כיצד לטהר את האלפא קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRα) OPCs חיובי מן מוח העכבר. בשלב הבא, נוגדן Olig2 מתווכת שבב, ספריית הבנייה מבוצעות. החלק האחרון מתאר את תוכנת bioinformatic של הליכים המשמשים לניתוח Olig2 שבב-seq. לסיכום, מאמר זה מדווח שיטה לנתח את איגודי ברמת הגנום של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 במוח בחריפות מטוהרים OPCs.

Introduction

חשוב ללמוד את החלבון (או החלבונים) ה-DNA כריכות, הסימנים epigenetic לבנות רשתות בקרה רגולטריות תעתיק המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים. במיוחד, איגודי גורמי שעתוק לדנ א הגנומי יכול לשחק תפקיד חשוב של הכונה, הבידול תא, לבין התפתחות רקמת. כלי רב עוצמה עבור הלומדים את תקנה תעתיק ואת מנגנוני epigenetic הוא immunoprecipitation כרומטין (ChIP). עקב התקדמות מהירה הטכנולוגיה רצף של הדור הבא, שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) משמש עבור הניתוחים של חלבון-DNA כריכות, סימני epigenetic1. עם זאת, פרוטוקול תקני seq שבב דורש כ-20 מיליון תאים לכל תגובה, מה שהופך את היישום של טכניקה זו קשה כאשר מספר התא מוגבל, כגון תאים בודדים ראשי אוכלוסיות תאים נדיר.

אוליגודנדרוציטים שושלת התאים כולל אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) ו אוליגודנדרוציטים מופצים באופן נרחב ברחבי המוח, הם חיוניים עבור ההתפתחות והתפקוד של המוח. כסוג של קודמן תאים, OPCs מסוגלים התחדשות עצמית והן בידול. OPCs לא רק לשמש אבות עבור oligodendrocytes להפוך אלא גם לשחק תפקיד חשוב הפצת אותות עצביים בהתקשרות עם סוגים אחרים של תאים במוח2. מחקרים קודמים הראו כי פיתוח אוליגודנדרוציטים מוסדר על ידי גורמי שעתוק שושלת היוחסין הספציפי כגון3,Olig2 ו- Sox104. גורמי שעתוק אלה נמצאו כדי לאגד האזורים יזם או שיפור של כמה גנים חיוניים כדי להשפיע על הביטוי שלהם במהלך אוליגודנדרוציטים מפרט ובידול. עם זאת, מאתגרות לזיהוי DNA קשירה של חלבון (או החלבונים) עניין בבחריפות מטוהרים OPCs ראשי עם מספר מאוד מצומצם של תאים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור באופן שיטתי את immunoprecipitated דנ א גנומי על ידי Olig2 ב העכבר מטוהרים OPCs בקנה מידה הגנום כולו באמצעות שבב-seq טכניקה. OPCs של מוח העכבר היו בחריפות מטוהרת על-ידי immunopanning, המשמשים ניסוי שבב ללא התפשטות בתוך חוץ גופית. מספר מוגבל של OPCs יכולה להיות מושגת על ידי immunopanning, והוא די לניסויים שבב-seq סטנדרטי. במסמך זה, פרוטוקול שבב-seq נמוך-תא עם יהיה נמוך ככל 20 אלף תאים לכל שבב תגובה עבור גורמי שעתוק מתואר. בקצרה, צולבים התאים היו lysed, sonicated על ידי מכשיר sonication להטיה של כרומטין. כרומטין הוטו, נדגרה עם נוגדנים Olig2, כמו גם חלבון חרוזים מצופים A, כדי לזרז Olig2 נוגדנים מאוגד הדנ א. לאחר • תנאי של חרוזים מצופים של חלבון ו- cross-linking הפוכה, דנ א גנומי משהחמיר נוגדן Olig2 היה טהור על ידי מיצוי פנול-כלורופורם. המוצר הסופי היה לכמת, נתון T-עוקב, פריימר חישול החלפת תבנית והסיומת, התוספת של מתאמי, הגברה, בחירת גודל הספרייה, טיהור צעדים לבניית ספריה שבב-seq.

לאחר רצף, ניתחנו את איכות הקריאות raw המדגם שהוכנו עם נוגדן פקטור שעתוק Olig2 והן את דגימת הבקרה. באיכות נמוכה בסיסי זוגות, מתאם המכילה לקרוא קטעים נגזמו. קריאות הבא, החתוך היו המיושר הגנום הפניה העכבר. האזורים גנומית זה היו באופן משמעותי מועשר עבור קריאות שבב, לעומת הדגימה שליטה, אותרו כמו פסגות. פסגות משמעותית, המייצג אתרי קישור פקטור שעתוק פוטנציאליים, מסוננים, דמיינו בדפדפן הגנום.

ראוי לציין, השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ניתן באופן כללי על שבב-seq גורמים אחרים תמלול עם כל סוג התא של מספרים מוגבלת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל שימוש בבעלי חיים והפרוטוקולים ניסיוני היו שבוצעה על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרה על ידי הוועדה המוסדית אבטחה חיה ועדת הרווחה-אוניברסיטת טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון.

1. טיהור של PDGFRα חיובי שושלת היוחסין אוליגודנדרוציטים תאים מהמוח העכבר (שונה immunopanning שתואר לעיל פרוטוקולים5,6,7)

  1. הכנת צלחת immunopanning PDGFRα תא חיובי הבחירה ו 2 לוחות עבור דלדול תאי אנדותל ואת מיקרוגלייה.
    הערה: שימו לב כי פטרי אבל לא תא תרבות מנות לעבוד לניסוי immunopanning; אם התאים מטוהרים ישמש עבור culturing, צעדים immunopanning צריך להתבצע באבטחה הקבינט
    1. מעיל 10 ס מ צלחת פטרי עם 30 µL עז אנטי חולדה IgG ב 10 מ"ל של pH 9.5, 50 מ מ טריס-HCl בן לילה ב 4 º C. להתסיס את הצלחת לוודא שהמשטחים של הלוחות באופן שווה ולא לגמרי מכוסים על-ידי הפתרון ציפוי.
    2. הכן PDGFRα נוגדן פתרון על ידי המדללת µL 40 של נוגדן anti-PDGFRα חולדה עם 12 מ ל תמיסת מלח של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) המכילה BSA 0.2%.
    3. לאחר 3 שוטף של IgG מצופה צלחת עם 10 מ ל 1 x DPBS כל אחד, דגירה מצופים IgG צלחת עם פתרון נוגדן PDGFRα בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
    4. תשטוף הצלחת מצופים נוגדן anti-PDGFRα חולדה 3 פעמים עם 10 מ ל 1 x DPBS. להוסיף בעדינות DPBS פתרון לאורך הקיר בצד של הצלחת, נא לא להפריע את המשטחים מצופה.
    5. מעיל שתי צלחות פטרי חדש 15 ס מ עבור דלדול תאי אנדותל ואת מיקרוגלייה עם 20 מ של DPBS המכיל 2.3 µg/mL של Banderiaea simplicifolia לקטין 1 (BSL-1) כבר שעתיים.
    6. לשטוף ש-BSL-1 מצופה לוחות 3 פעמים עם 20 מ ל 1 x DPBS. בעדינות מוסיפים DPBS פתרון לאורך הקיר בצד של הלוחות, אל תפריעי משטחים מצופים.
  2. טיהור של PDGFRα חיובי אוליגודנדרוציטים שושלת היוחסין תאים שינוי שיטות שפורסמו בעבר6 , 7 , 8-
    1. לנתח הרקמות קורטיקלית 2 כמחנכת יום 7 (P7) העכבר מוח על פי בעבר פרוטוקולים שפורסמו5,6.
    2. מביצועם הרקמות ליצירת השעיה תא בודד עם רקמה עצבית דיסוציאציה קיט (P) על פי הוראות היצרן מפורט.
    3. בקצרה, לחתוך הרקמות קורטיקלית גזור לחתיכות עם איזמל, מעמיד אותם בפני עיכול אנזימטי ב 37 º C. לאחר עיכול, באופן ידני מביצועם החלקים עם זכוכית מלוטשים אש פסטר סיליקון להשעיה תא בודד.
    4. Centrifuge התליה תא בודד ב 300 גרם x 10 דקות בטמפרטורת החדר, להשהות צניפה התא באמצעות 15 מ"ל של מאגר immunopanning (מאגר immunopanning הוא DPBS עם BSA 0.02% ו- 5 אינסולין µg/mL).
    5. דגירה התליה תא בודד מן מוח העכבר 2 ברצף על שתי צלחות BSL-1 מצופה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין של צלחת כל 5 דקות כדי להבטיח של דלדול יותר מיקרוגלייה ותאי אנדותל.
    6. מערבולת בעדינות את הצלחת כדי לאסוף את התאים שאינם מחסידי ההשעיה תא דגירה אותם על הצלחת מצופים נוגדן חולדה-PDGFRα למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לאחר הדגירה של התליה תא בצלחת מצופים נוגדן חולדה-PDGFRα, בעדינות מערבולת את הצלחת לאסוף התליה תא, ולשטוף את הצלחת 8 פעמים עם DPBS כדי להיפטר שאינם מחסידי תאים. בעדינות מוסיפים שטיפת פתרון לאורך הקיר בצד של הצלחת, להתסיס את הצלחת מספר פעמים כדי להיפטר שאינם מחסידי תאים.
    8. לנתק את התאים מהצלחת נוגדן מצופה חולדה-PDGFRα שימוש של mL 4 של התא ניתוק פתרון טיפול למשך 10 דקות ב 37 º C. לנער את הצלחת להוציא תאים חסיד.
    9. לאסוף את OPCs מטוהרת על ידי צנטריפוגה ב g 300 x בטמפרטורת החדר, להשעות בגדר תא 2 מ"ל OPC תא תרבות בינונית, ספירת התאים באמצעות trypan blue ו- hemocytometer (500 מ"ל תא תרבות בינוני הוא בינוני DMEM/F12 המכיל 5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין פתרון (P/S), 5 מ ל N2, 10 מ"ל B27, 5 אינסולין µg/mL, BSA 0.1%, 20 ng/mL bFGF ו 10 ננוגרם למ"ל PDGFRα).
  3. אימות של טוהר OPCs לאחר immunopanning.
    1. על מנת להעריך את העשרת של OPCs לאחר immunopanning, להשתמש בחלק OPCs מטוהרים לחילוץ RNA עם החילוץ thiocyanate מבוסס guanidium לפי הנחיות היצרן.
    2. לבצע PCR לרביעיית באמצעות מיקס מאסטר הפלורסנט ירוק לבדוק העשרת הביטוי PDGFRα ב OPCs מטוהרים לעומת תאי המוח חלופה מועדפת על פי חומרים שפורסמו בעבר4.
    3. בנוסף, זרע כמה OPCs מטוהרים לתוך פולי-D-ליזין מצופה 24 צלחות טוב immunostaining עם אנטי-NG2 כונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן (NG2) נוגדן כאמור פרסמו חומרים9.

2. נמוך-תא שבב והכנה שבב בניית ספריה עבור רצף תפוקה גבוהה

  1. הכנה שבב נמוך-תא Olig2 עם מערכת זמינים מסחרית sonication ומספר תא נמוך זמינים מסחרית שבב קיט (ראה טבלה של חומרים) על-ידי ביצוע הפרוצדורות תקן מפורט של הוראות היצרן.
    1. לאחר ניתוק של האנטי-PDGFRα העכברוש צלחת מצופים נוגדן, התא סופר עם trypan blue ו- hemocytometer לשים OPCs מטוהרים 20,000 1 מ"ל OPC תא בינוני תרבות עבור כל תגובה שבב.
    2. הוסף µL 27 של 36.5% פורמלדהיד לתקן את הבולם תא 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      התראה: שימו לב כי פורמלדהיד חייב לשמש בשכונה fume כימי מטעמי בטיחות.
    3. לעצור את ה-DNA-חלבון cross-linking עם 50 µL גליצין 2.5 מטר על 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: כל השלבים צריך להתבצע על הקרח או בחדר קר 4 ° C מנקודה זו.
    4. לשטוף את כדורי תא צולבים עם 1 מ"ל של מאוזנת מלח פתרון (HBSS הנקס כקרח) עם מעכב פרוטאז קוקטייל ולקבל תאים מגורען על ידי צנטריפוגה טרום מקורר-300 גרם x-4 מעלות צלזיוס.
    5. Lyse בגדר תא 25 µL להשלים את פירוק מאגר עבור 5 דקות על קרח.
      הערה: להתסיס את הצינור להשעות את התאים במאגר פירוק.
    6. תוספת lysate עם קרח HBSS המכילה מעכב פרוטאז קוקטייל, הטיה כרומטין של תא lysate על ידי טרום מקורר sonication המערכת עם 5 מחזורים של 30 s ON 30 s OFF התוכנית 75 µL התא. תמיד sonicate 6 צינורות יחד וודא כי הצינורות האיזון מכילים 100 µL מים.
    7. לאחר, חיתוך צנטריפוגה ב g 14,000 x 10 דקות 4 ° C ולאסוף את תגובת שיקוע צינור חדש לאחר צנטריפוגה.
    8. לדלל µL 100 של כרומטין הוטו עם הנפח כקרח מאגר שבב להשלים עם מעכב פרוטאז שווה.
    9. שמור µL 20 של כרומטין הוטו מדולל הדגימה בקרת קלט.
      הערה: בקרת קלט לדוגמה נדרש גם כמו ההשוואה Olig2 מדגם immunoprecipitated לזיהוי נוגדנים Olig2 immunoprecipitated דנ א.
    10. להוסיף 1 µL של הארנב נוגדן anti-olig2 כדי µL 180 של מדולל לכסנתם כרומטין, דגירה הצינור התגובה על גלגל מסתובב במהירות של 40 סל ד עבור 16 h-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לבצע שלב זה בחדר קר.
    11. עבור כל תגובה שבב, לשטוף 11 µL חלבון מגנטי מצופה A חרוזים עם 55 µL חרוזים מאגר לשטוף ולשים החרוז הצניפה ב 11 µL חרוז שטיפת מאגר לאחר שוטף 2.
      הערה: לבצע שלב זה בחדר קר.
    12. עבור כל תגובה שבב, להוסיף 10 µL של חרוזים מצופים A חלבון טרום שטף שבב התגובה שפופרת. לבצע שלב זה בחדר קר.
    13. דגירה הצינור התגובה צ'יפ ב 4 ° C עבור עוד 2 h על גלגל מסתובב.
    14. שמכניסים את נקז התגובה שבב על מתלה מגנטי עבור 1 דקות.
      הערה: לבצע שלב זה בחדר קר.
    15. הסר את תגובת שיקוע ועוקרות לא בגדר חרוז.
    16. לשטוף בגדר חרוז עם 100 µL לכל מאגרי שטיפת 4 בהתאמה במשך 4 דקות על גלגל מסתובב ב 4 º C.
    17. לאחר שוטף, להוסיף 200 µL • תנאי מאגר בגדר חרוז, דגירה הצינור התגובה צ'יפ ב 65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות להפוך קישור חלבון-DNA.
    18. בנוסף, להוסיף µL 180 • תנאי מאגר לדגימת פקד קלט µL 20, דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות להפוך קישור חלבון-DNA גם כן.
    19. להוסיף 200 µL 25:24:1 (וי/v) תערובת של אלכוהול פנול, כלורופורם, isoamyl כל שפופרת התגובה של השבב.
    20. מערבולת נמרצות עבור 1 דקות, צנטריפוגה ב 13,000 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את השלב העליון צינור חדש.
    21. להוסיף 40 µL 3 מ' סודיום אצטט פתרון, µL 1,000 של אתנול 100%, µL 2 של גליקוגן precipitant covalently מקושר הצבע הכחול כדי כל שפופרת התגובה שבב בן לילה ב-20 ° C.
    22. צנטריפוגה ב 13,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C.
    23. למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף עם 500 µL קר 70% אתנול, צנטריפוגה-13,000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C.
    24. למחוק את תגובת שיקוע, לשמור את האוויר צניפה להתייבש במשך 10 דקות, לפזר את גלולה עם מים µL 50.
  2. שבב בניית ספריה עבור רצף תפוקה גבוהה
    1. לנקות ולרכז את הדנ א שבב עם ערכת ניקיון בהתאם להנחיות היצרן.
    2. לכמת את הדגימה שבב על ידי פיקו-ירוקה על פי הוראות היצרן.
    3. להשתמש ערכת השבבים-seq עבור T-עוקב, שכפול, עוקב, החלפת תבנית, הרחבה, התוספת של מתאמי, הגברה, בחירת גודל הספרייה וטיהור על פי הוראות היצרן.
      1. לאחר דנטורציה של dsDNA, dephosphorylate 3' סוף ssDNA על ידי phosphatase אלקליין שרימפס, להוסיף זנב poly (T) ssDNA על ידי טרמינל deoxynucleotidyl טרנספראז.
      2. Anneal ומהצמיגים הדנ א פוליפוני (dA) על תבנית ssDNA עבור שכפול ה-DNA ותבנית מיתוג.
      3. לאחר החלפת תבנית, להגביר את הספרייה שבב-seq מאת PCR עם תחל ואחורה לצורך יצירת אינדקס.
      4. בחר ה-PCR מוגבר שבב-seq ספריה עם שברי החל 250 עד 500 bp מאת פאראמגנטיים חרוזים מאת אפשרות 2 לבחירה בגודל כפול.
      5. לבחון את האיכות של הספרייה שבב-seq שנבחרו משתמשים במכשיר אלקטרופורזה שבב-נימי microfluidic.

3. ניתוח נתונים

  1. להכין את מבנה הספריות.
    1. צור ספריה עבור ביצוע ניתוח הנתונים שבב-seq. בתוך הספריה החדשה שנוצרה, ליצור ספריות שש עם השמות הבאים: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis ודוחות.
  2. להכין נתונים ולבצע בקרת איכות ניתוח של נתוני רצף raw.
    1. לעבור הספריה "raw.files", להוריד את קבצי הנתונים שבב-seq.
    2. בדוק את שמות הקבצים. אם הרצף היה סוף-לזווג, יהיו 4 קבצים (שני לטיפול) ו-2 עבור קלט עם שמות הבסיס דומה: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq ו- PDGFRα_input.read2.fastq. אם שמות קבצים שונים, לשנות אותם באמצעות הפקודה "mv".
    3. להעביר הספריה "fastqc.output".
    4. השג מדדים בקרת איכות קריאות raw באמצעות תוכנה10בקרת איכות הקובץ fastq. השתמש בפקודה ב איור S1A כדי להפעיל את תהליך בקרת איכות בנפרד עבור כל קובץ fastq. התוכנה תציג במספר מדדים בקרת איכות בקובץ html.
    5. פתח את קובץ ה-html בקרת איכות, לברר את מספר הקריאות, קרא אורך, לפי איכות רצף הבסיס, לפי רצף איכות ציונים, רצף GC תוכן, רצף שכפול רמות, מתאם תוכן ותוכן kmer.
  3. חתוך קריאות באיכות נמוכה נגרר ותוכן מתאם.
    1. צפו את "לפי רצף הבסיס איכות" חלקות "מתאם תוכן". לקבוע את אורך חיתוך עבור הראש והן הזנב של כל קריאה. אורך נאותה עבור זמירה ואיפה האיכות הבסיס יורד מתחת 30 ראיות של מתאם תוכן.
    2. להעביר הספריה "raw.files".
    3. להוריד ולהתקין תוכנה עבור קריאות זמירה11. השתמש בפקודה S1B איור לקיטום הטיפול והן את הקלט בנפרד. הפרמטר 'חיתוך' מציין את אורך הקריאה הנותרים לאחר חיתוך בסיסים מקצה 'HEADCROP' מציין את מספר בסיסים צריכים להיות מסולקים מן ההתחלה של הקריאה.
    4. הפקודה ' חיתוך ' כולל גם את המינימום לקרוא אורך להתקבל לאחר סינון בפרמטר 'MINLEN'. אם קורא לפחות 50 bp, שימוש 35 bp כמו הסף אורך הקריאה.
    5. להעביר הספריה "fastqc.output".
    6. לבצע את הניתוח בקרת איכות הקובץ fastq לאחר זמירה את הקריאות. ודא כי הסוגיות בקרת איכות היה נפתר. השתמש בפקודה ב איור S1C כדי להשיג את המדדים בקרת איכות.
  4. ליישר יחיד-הסוף או סוף-לזווג שבב-seq מקריאה הגנום הפניה של העכבר.
    1. לעבור אל הספריה "bowtie.output" עבור המיפוי.
    2. הורד את הגנום הפניה GENCODE העכבר mm10. שנה הגנום הפניה של העכבר mm10 כמו "mm10.fa".
    3. הורד ממפה קריאה12 ולהתקין אותה במערכת.
    4. צור קובץ אינדקס של הגנום הפניה שהורדת באמצעות הפקודה באיור S2A. נוצרים באופן אוטומטי קבצים 6: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 ו- mm10.rev.2.bt2.
    5. השתמש בפקודה איור S2B כדי לבצע היישור ולהתאים את פרמטר "-p" על מספר ליבות עיבוד בהתאם להגדרות המערכת. אם מפעיל מצב סיום לזווג, הפרמטרים "-1" ו "-2" מציינים את שמות הקבצים fastq החתוך.
      הערה: המיפוי מתבצע בנפרד על הדגימות טיפול, קלט, פלט קבצי יומן רישום מטרי נוצרות עבור כל דגימה.
    6. הורד תוכנה לטיפול קבצי תבנית סאם13 ולהתקין אותה במערכת. המר את קובץ סאם מיושר לתוך קובץ באם באמצעות הפקודה באיור S2C.
  5. להשיג מדדים בקרת איכות הקריאות ממופה לפני שיא הקוראת טיפול לזווג-end בשתי דגימות הבקרה.
    1. אחד מדדים בקרת איכות הכי חשוב לכתובת הוא העומק רצף. לפתוח את הקבצים "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" ואת "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" בספריה bowtie.output, ודא מספר זוגות קריאה ממופה באופן ייחודי בכל מדגם גדול מ- 10 מיליון.
    2. להעביר הספריה "homer.output".
    3. הורד תוכנה עבור גילוי מוטיב של הדור הבא רצפי ניתוח14 ולהתקין אותה במערכת.
    4. צור תיקיה בשם "tagDir".
    5. כדי לוודא clonality תג, השתמש בפקודה מצטיירת דמות S3A. הפקודה "makeTagDirectory" יפיק ארבע בקרת איכות פלט files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt ו- tagLengthDistribution.txt.
    6. להעביר הספריה "tagDir".
    7. העתק את הקובץ "tagCountDistribution.txt" לתוך הספריה "דוחות".
    8. להעביר הספריה "דוחות".
    9. פתח את הקובץ tagCountDistribution.txt באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני וליצור בר מגרש של מספר תגים לכל עמדה גנומית. אחסן את קובץ היסטוגרמה עם השם "tag.clonality.xlsx".
    10. התקן R תכנות בשפה15 במערכת.
    11. בטרמינל, הקלד 'R' והקש על ENTER כדי לגשת סביבת תכנות של R.
    12. הורדה חבילת R לעיבוד נתונים שבב-seq16 ולהתקין אותה באמצעות הפקודה מצטיירת דמות S3B.
    13. להשתמש בתסריט R איור S3C כדי להתוות קרוס-המתאם strand.
  6. הזיהוי של פסגות באמצעות ממפה נקודות שיא.
    1. להעביר הספריה "macs2.output". הורד והתקן ממפה נקודות שיא17 במערכת שלך.
    2. השתמש בפונקציה "callpeak" עם הטיפול ושליטה באם הקבצים שנוצרו בשלב 3.4.6 הרעלה-הכרה.
      הערה: פרמטרים אחרים כוללים "-f" עבור תבנית קובץ הקלט, "-g" גודל הגנום, "-שם" עבור המציין את שם הבסיס של כל קבצי הפלט, ולא "-B" לאחסון את השרשרת מקטע בתבנית bedgraph. הפסגה מלאה מתקשר הפקודה נכללת באיור S4A. השתמש BEDPE עבור מדגמים מזווגים-end.
    3. ודא כי ממפה נקודות הקצה שיא להפיק קבצים 6: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. פתח קובץ PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls כדי להציג את הפסגות שנקרא, מיקום, אורך, מיקום הפסגה, השרשרת, ו מדדים העשרה שיא:-log10(pvalue), מקפלים העשרה, ו- log10(q-value).
  7. לסנן ומפרשות שנקרא פסגות.
    1. באמצעות הקובץ שנפתח בשלב הקודם, לסנן פסגות המתקבלת לפי את העשרת קיפול, ערך p ו/או את ערך ה-q. כדי להחליט ספי סינון הולם, להפוך מגרש היסטוגרמה לקביעת הצפיפות של כל מדד. לסנן ערכים מתחת לסף מסוים שנבחר כדי להשיג פסגות משמעותית.
    2. הורד לרשימה השחורה mm10 (אזורים ידועים אות גבוה באופן מלאכותי), מסנן השבב-seq פסגות שנמצאים בתוך כל אחד האזורים החפץ.
    3. צור קובץ מיטה עם הפסגות מסוננים המכילה את העמודות הבאות: כרומוזום, התחלה, סיום, peakID, ואימץ ו- strand. מלא את העמודה מעושה עם נקודה "-" מאז לא בשימוש. בעמודה סטרנד, להגדיר כל הערכים "+". שמור את הקובץ מיטה בשם "filtered.peakData2.bed".
    4. העתק את הקובץ "filtered.peakData2.bed" ספריה "דוחות".
    5. להעביר הספריה "דוחות".
    6. כדי להוסיף ביאורים פסגות מסוננים לאזור גנים ספציפיים, השתמש בפונקציה "annotatePeaks" עם מיטה הקובץ נוצר בשלב הקודם. הפקודה מוצג איור S5A.
    7. פתח את הקובץ "filtered.annotatedPeaks.txt" באמצעות תוכנה סטטיסטית.
    8. לסנן פסגות וכתוצאה מכך שוכבת בתוך אזור intergenic במרחק גדול מ- 5 kb מ TSS מוערת. השתמש את העמודה "מרחק כדי TSS" בקובץ כמרחק לסינון. אחסן את הפסגות מסוננים קובץ excel בשם "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. חנות וכתוצאה מכך מסונן פסגות בקובץ bedGraph עם עמודות: כרומוזום, התחלה, סיום, ו- log10(q-value). שם הקובץ "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. ליצור קבצי אישיות חשובה להמחשת דפדפן.
    1. להוריד ולהתקין תוכנה עבור חשבון הגנום18.
    2. הורד כלי להמרת bedgraph אישיות חשובה והתקן במערכת. הורד את הקובץ 'mm10.chrom.sizes'.
    3. השתמש בפקודה ב איור S6A ליצירת קובץ אישיות חשובה.
    4. להוריד ולהתקין את הדפדפן הגנום19 במערכת.
    5. פתח את הדפדפן הגנום, לטעון את הקובץ "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" כדי להמחיש את הפסגות משמעותי מסוננים ואת מיקומם ביחס הגנים הידועים.
  9. מוטיב חיפוש.
    1. להעביר הספריה "motif.analysis".
    2. הורדה של מוטיב דה נובו סריקה ותוכנית העשרה מוטיב ולהתקין אותה לתוך המערכת שלך20.
    3. להוריד את מסד נתונים של מוטיב מקיף הכולל מוטיבים של Olig2.
    4. להשיג את רצף גנומית של 500 אזורים bp מרוכז בכל פסגות שיא משמעותי. אחסן את רצפי כמו peak.sequences.txt. השתמש בפקודה ב איור S7 כדי לחפש מוטיבים Olig2 בתוך כל אחד מאזורי שיא 500 bp.
    5. לסנן את המוטיבים הנוצרת באמצעות E-ערך הולם (ברירת המחדל = 0.05).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נמוך-תא שבב-seq בוצעה, bioinformatic ניתוחים נעשו כדי לחקור את האינטראקציות פוטנציאלי של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 עם ה-DNA גנומי במוח בחריפות מטוהרים OPCs. איור 1 מראה כללי זרימת עבודה הן את ניסיוני והן ההליכים ניתוח נתונים. ב פרוטוקול זה, המוח עכברים כמחנכת היו הפומבית להשעיה תא בודד. לאחר רקמת הדיסוציאציה immunopanning בוצעה לטהר את OPCs באמצעות נוגדן PDGFRα. איור 2 מציג את העשרת משמעותית של PDGFRα, ביטוי קטן של נוירון סמן Tuj1 (המחלקה הספציפי הנוירון השלישי בטא-טובולין), סמן אסטרוציט GFAP (גליה fibrillary חומצי חלבון), מתאם סמן מיונן סידן מחייב מיקרוגלייה מולקולת 1 (Iba1), myelinating בוגרת oligodendrocytes להפוך סמן המיאלין הבסיסי חלבון (Mbp) ו מיאלין-אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) מ- OPCs מטוהרים כפי שהוערכו RT-qPCR. בנוסף, תוצאה immunostaining מציין שרוב התאים הם NG2 חיובי כפי שמוצג באיור2. לאחר מכן, 20 אלף OPCs מטוהרים לכל תגובה תיקנה פורמלדהיד, כרומטין היה לכסנתם באמצעות מערכת sonication. שבב נמוך-תא Olig2 בוצעה, הספרייה נבנה. לאחר הכנה ספריית שבב, איכות המוצר שנוצר אומתה על ידי מכשיר אלקטרופורזה שבב-נימי microfluidic. איור 3 מראה של electropherogram דוגמה של ספריית שבב נמוך-תא Olig2. ספריית ברור שיא של Oligo2 מוצר החל 250 עד 500 bp יהיו גלויים לאחר בחירת גודל של ספריית ה-PCR המוצר. הספריות שבב-seq בשני המדגם שהוכנו עם נוגדן פקטור שעתוק Olig2, המדגם שליטה היו נתונים על רצף תפוקה גבוהה כדי לייצר 50 סוף-לזווג מחזור רצף פעולות הקריאה. אורכי קרא עוד לשפר את המחירים מיפוי ולהפחית את ההסתברות של מיפוי מרובה, על חשבון עלויות רצף. עם 50 bp שבב-seq לזווג-קצה רצף ספריות, מושגות בדרך כלל תוצאות טובות.

לאחר ההערכה הראשונית בקרת איכות של קריאות raw, קיצוץ של מתאמי ונגררים באיכות נמוכה בסיסי זוגות, החלקות בקרת איכות מתוארת באיור4. קריאות החתוך עליו יש בסיס גדול מ- 30, אין מתאם רצפים, איכות, יש שיעור נמוך שכפול (איור 4B-D). איכות טובה גזוז קורא יגביר את הקצב יישור הכולל. פרמטרים נוספים כגון GC תוכן חשובים אף הם, יש לשקול עבור זמירה.

ברגע הדגימות רצף מיושרים, זה הכרחי לאמת את עומק רצף. זה ידוע כי מספר פסגות שנקרא יגדל עם עומק רצף גבוה יותר מאז חלש אתרים יהפוך יותר משמעותית מבחינה סטטיסטית21. ניתוח רוויה נדרש לקבוע לעומק רצף מספקת עבור כל גורם שעתוק ספציפיים בשימוש, על חשבון תקציב וזמן. עומק רצף קונצנזוס לכריכה פקטור שעתוק הוצע על ידי האיחוד קדד לגבי דוגמאות יונקים: מינימום של 10 מיליון ממופה באופן ייחודי קריאות עבור כל אחד לפחות שני ביולוגית משכפל22. המספר של הקצב יישור הכולל של קריאות ממופה באופן ייחודי חושבו על ידי ממפה נקודות הקצה קריאה. דוגמה טובה מיפוי מדדי מוצג באיור 5A. קריאות מיושר צריך למפות למיקומים גנומית ברורים, המציינת את המורכבות של ספריית נאותה, המכונה גם clonality תג. . האיחוד קדד עולה כי לפחות 80% 10 המיליון. הקריאות מיושר צריך ניתן למפות אזורים שונים גנומית22. איור 5B מראה של clonality תג נאותה שבו למעלה מ-90% הקריאות ממופה למיקום גנומית אחד בלבד. ספריות המורכבות נמוך מתרחשות בדרך כלל כאשר אין מספיק דנ א מתקבל, הגביר ה-PCR שברי הם וסודרו שוב ושוב. ספריה נמוכה-המורכבות תניב שיעור איתור שיא שווא.

בעת שימוש לזווג שבב-seq נתונים, שברי לאגד סביב גורם שעתוק עם מרחק מסויים של הפרדה. רצף לזווג-end יאפשר הערכה מדויקת יותר של אורך קטע רע מניב אומדן טוב יותר של האזורים גנומית שבו אירעה מחייב יותר. העלילה המתאם סטרנד מתארת לשיא של העשרה המתאים לאורך קטע הדומיננטית. כפי שנצפתה 5C איור, אורך קטע מחושב הוא 130 bp ואילו אורך הקריאה הוא 50 bp. Dataset שבב-seq איפה אורך קטע ארוך יותר מאשר אורך הקריאה הוא מעיד על איכות גבוהה16.

הפלט של שיא הביקור הוא רשימה של אזורים גנומית עשוי להיות מחויב על ידי הגורם שעתוק (או שלה מורכב). רשימת אזורים גנומית או פסגות נכלל בקובץ "מיטה" אשר ניתנת לצפייה בדפדפן הגנום. עבור כל שיא, קובץ זה מכיל מזהה שיא, המיקום גנומית של הפסגה שיא, פד-log10 (q-ערך). הפסגות מועשר באופן משמעותי הם אלה עם קיפול גבוה יותר-העשרה ומדדים משמעות. להלן דוגמה של קובץ הפלט שיא מוצג באיור 6A. לאחר בחירת פסגות משמעותית באמצעות ספי המותאם אישית סינון פסגות בתוך הרשימה השחורה של קדד23, זיהוי פסגות של גן מקדם מכירות אזור (5 kb ג'ין במעלה הזרם, כל גוף), קובץ "אישיות חשובה" הוא שימושי עבור הצגת פסגות של גנום דפדפן. אזורים שיא מועשר ביותר יש הסתברות גבוהה יותר של איגוד פקטור שעתוק. חשוב לוודא נוכחות שיא באזורים רגולטוריות גורם תמלול ידועה, כמו גם שיא ההיעדרות באזורים שבו איגוד פקטור שעתוק סביר. איור 6B -E מציג דוגמאות של ג'ין אזורים עם ובלי שיא העשרה, כמו גם את מיקומם ביחס קדד יחצ ן אזורים.

אין סיליקו שיטות משלימות לניסוי שבב-seq הם מוטיב העשרה ניתוח ו דה נובו מוטיב חיפוש. מאז Olig2 מחייב ב- OPCs לא נחקרה בעבר, Olig2 שבב-seq נגזר בפסגות ובתאים מוטור נוירון, תאי גזע עובריים שימשו דה נובו מוטיב זיהוי4,24. Olig2 דה נובו לזהות מוטיבים נוספו מקיף קדד מוטיב מסד25 ובוצע ניתוח העשרת מוטיב. העשרת דה נובו גבוהה לזהות מוטיבים OLIG2, תמלול ידועה פקטור (HDAC2 SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5, ASCL1) מוטיבים נמצאו שבב-seq פיקס של תאים PDGFRα טהור. העשרה של מוטיבים 30 דה נובו המזוהה עם E-ערך התגלה < 0.05. איור 7 מראה העליון שני המוטיבים דה נובו מזוהה Olig2. המוטיבים Olig2 דה נובו זיהו שני נמצאו > 60% של הפסגות שבב-seq שהושגו מתאי PDGFRα טהור, בנוסף כדי מוטיבים מוכרים.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על פרוטוקול זרימת העבודה. PDGFRα חיובי OPCs היו מבודדים מן מוח העכבר כמחנכת, היו נתונים Olig2 שבב הניסוי. שברי DNA precipitated שימשו להכנת שבב הספרייה. לאחר הערכת איכות ספריה, הדגימות שימשו רצף. ערכות הנתונים נותחו, פסגות אותרו, המציינת את אתרי קישור Olig2 פוטנציאליים ב- OPC מטוהרים תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הערכה של טוהר immunopanned OPCs qPCR, immunostaining. (א) PDGFRα נוגדן immunopanned התאים היו נזרע, immunostaining בוצעה באמצעות נוגדן סמן NG2 היוחסין OPC. כחול: דאפי, ירוק: NG2. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ב') רמת הביטוי היחסי של נוירון סמן Tuj1 OPCs מטוהרים (PDGFRα +), תאי המוח חלופה מועדפת (mix) הוערכו. Tuj1 ביטוי בתאי המוח הפומבית היה מוגדר כ- 1. (ג) רמת הביטוי יחסי אסטרוציט סמן GFAP OPCs מטוהרים (PDGFRα +), תאי המוח חלופה מועדפת (mix) הוערך. GFAP ביטוי בתאי המוח הפומבית היה מוגדר כ- 1. (ד) רמת הביטוי יחסי OPC סמן PDGFRα OPCs מטוהרים (PDGFRα +), תאי המוח חלופה מועדפת (mix) הוערך. PDGFRα ביטוי בתאי המוח הפומבית היה מוגדר כ- 1. (E) רמת ביטוי היחסי של סמן oligodendrocytes להפוך בוגרת myelinating ש א ב OPCs מטוהרים (PDGFRα +) וב -תאי המוח חלופה מועדפת (mix) הוערך. ש א ביטוי בתאי המוח הפומבית היה מוגדר כ- 1. (F) רמת ביטוי היחסי של סמן oligodendrocytes להפוך בוגרת myelinating Mbp OPCs מטוהרים (PDGFRα +), תאי המוח חלופה מועדפת (mix) הוערך. הביטוי Mbp בתאי המוח הפומבית היה מוגדר כ- 1. (G) רמת הביטוי יחסי מיקרוגלייה סמן Iba1 OPCs מטוהרים (PDGFRα +), במוח הפומבית תאים (mix) הוערך. Iba1 ביטוי בתאי המוח הפומבית היה מוגדר כ- 1. נתונים בסול-B מייצגים ניסויים triplicate וציין קווי שגיאה שגיאה סטנדרטית. T-מבחן ניתוח * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: electropherogram דוגמה של ספריה של שבב נמוך-תא Olig2. לאחר בחירת גודל כפול, האיכות של ספריית Olig2 שבב נותחה על ידי מכשיר אלקטרופורזה שבב-נימי microfluidic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג בקרת איכות תוצאות עבור 50 bp אורך הקריאה נמוך-תא שבב-seq דגימה. (א) טבלת סיכום המתארים את המספר הכולל של קריאות, מספר קריאות באיכות ירודה, רצף אורך ותוכן GC הכללית. מגרש (B) המציין את חלוקת ציונים איכות הבסיס לעבר עמדות שונות בקורא. (ג) מציג את התוכן מתאם פוטנציאליים לעבר עמדות שונות בקורא העלילה. (ד) קו עלילה המציין את האחוז משוכפלים רצפים. הרוב המכריע של קריאות מקורן רצפים המתרחשים רק פעם אחת בתוך הספרייה, לכן המציין של קצב השכפול נמוך או ספריית גבוהה המורכבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: בקרת איכות מדדים שהושגו לפני קריאה שיא: bowtie2 יישור מדדים, לנטישה של צלב-קורלציה, ולסמן clonality. (א) יישור מדדים המתקבל ממפה נקודות הקצה קריאה. המדדים החשובים ביותר נמצאים מספר זוגות קריאה ממופה באופן ייחודי, המצוין "מיושר פעם אחת אולי תבין בדיוק", וכן את קצב יישור הכוללת. היסטוגרמה (B) מציג את clonality תג. מציינות את האחוזים של עמדות גנומית שבו נמצאו תגיות. (ג) דוגמה של מגרש קרוס-המתאם המציין נתונים באיכות טובה. הקווים האדומים מתארים לאורך קריאה-50 bps, אורך קטע השולט ב 130 bps. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: שבב-seq שיא אזורים ונוף דפדפן הגנום של פסגות שבב-seq משמעותית במקומות שונים גנומית. (א) דוגמה של האזורים שיא המזוהה עם המתקשר שיא. (B) משמעותי שבב-seq פסגות נמצא בגוף הגן של Cspg4, גן סמן OPC ידוע. (ב) פסגות שבב-seq לא נמצאו באזורים יזם או בתוך הגופים גנים של Mbp ג'ין, סמן בוגרת oligodendrocytes, Tubb3 (ג), סמן דופאמינרגיים, או GFAP (D), סימן תא האסטרוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: מאוד מועשר דה נובו לזהות מוטיבים של Olig2 מצא שבב PDGFRα-Olig2-seq פיקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

S1 איור: הכנת ערכות נתונים שבב-seq. (א) מדריך הגדרת ארכיטקטורה. (B) ומחושב raw לקרוא מדדים בקרת איכות. (ג) זמירה הקריאות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S2 איור: יישור הקריאות כדי הגנום הפניה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S3 איור: בקרת איכות הקריאות מיושר, לכתובת לנטישה של צלב-המתאם ולקבוע תג clonality. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S4 איור: שיא הביקור. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S5 איור: ביאור של פסגות משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

איור S6: המרה של תבנית הקובץ bedGraph אישיות חשובה להמחשת שיא בדפדפן הגנום. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S7 איור: דה נובו מוטיב החיפוש ואת מוטיב העשרה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S8 איור: תזרים המתארת ביואינפורמטיקה ניתוח של נתונים שבב-seq. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ג'ין בתרבית של רגולציה רשתות הם מורכבים מאוד. שבב-seq היא שיטה חזקה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו. פרוטוקול זה כולל כיצד לבצע Olig2 שבב-seq באמצעות מספר נמוך של OPCs מטוהרים מוח העכבר (נמוך כמו 20 אלף תאים לכל תגובה). הצעד הראשון מפתח עבור פרוטוקול זה הוא הטיהור של OPCs של מוח העכבר על ידי immunopanning עם נוגדנים PDGFRα. עבור בחירת חיובי OPCs עם PDGFRα מצופה לוחות, לאגד PDGFRα לעיתים קרובות חלש OPCs מצופה לוחות. גם לאחר מספר שוטף, יש עדיין נותרו כמה תאים שאינם מחסידי. חשוב לבדוק שהתאים שאינם מחסידי לאחר כל D-PBS לשטוף תחת מיקרוסקופ. אם יותר לשטוף D-PBS לא עוזר להפחית את מספר התאים שאינם מחסידי, זה הזמן לאסוף את התאים שנבחרו, מאז מסירים עודפי אולי מכך OPCs מצורף ולהפחית את התשואה של תאים מטוהרים. עם זאת, שוטף לא מספיק עלול לגרום לזיהום של סוגים אחרים של תאים במוח. לכן, בכל פעם לאחר בידוד, זה הכרחי כדי להעריך את טוהר OPCs מבודדים מאת immunostaining עם OPCs סמן NG2 qPCR על הביטוי של גנים ספציפיים ידוע סוג התא כגון Tuj1 של הנוירונים, GFAP עבור האסטרוציטים, PDGFRα עבור OPCs, Iba1 מיקרוגלייה, ו ש א ו- MBP עבור oligodendrocytes להפוך בוגר myelinating. כפי שמוצג באיור2, תוצאה immunostaining מציין כי הרוב המכריע של התאים מטוהרת הם חיוביים עבור NG2 מכתים. בנוסף, כמה סימונים תא קלאסי-סוג ספציפי נוירונים, האסטרוציטים, מיקרוגלייה, myelinating בוגר oligodendrocytes להפוך בנספח לא לגילוי או מאוד נמוכה רמות ביטוי מטוהרים OPCs בהשוואה התערובת בתא ולזרימה המוח. PDGFRα תערוכות רמת ביטוי גבוהה ב מטוהרים OPCs בהשוואה התערובת בתא ולזרימה המוח. באמצעות השיטה immunopanning, מיקרוגלייה התדירות נמוכה ב- OPCs מטוהרים בהשוואה התערובת בתא ולזרימה המוח, אך קיימת כמות קטנה של זיהום. התבוננות זו עולה בקנה אחד עם פרסומים קודמים על-ידי אחרים7,8,26. בנוסף, כאשר לעומת דוחות שפורסמו בעבר, ערכת זמינים מסחרית משמש ב פרוטוקול זה דיסוציאציה מתוקננת, יעיל ונוח של רקמות המוח לתוך תא בודד המתלים.

לאחר cross-linking של OPCs מטוהרים, התאים צולבים יש לחפוף פתרון HBSS קר כקרח השלבים הנותרים שבב צריך להתבצע ב 4 ° C, אחרת הנוגדן לא יכול לזרז את הדנ א הגנומי כראוי.

השלב הבא מפתח פרוטוקול זה היא ספריית הכנה. הגברה PCR של שבב החומר שימש לבנייה הספרייה. מספר מחזורים PCR להכנה הספרייה תלוי כמות מתחיל ה-DNA. הכנה ספריה טובה דורשת כימות מדויק של כמות הדנ א קלט. מחזורי PCR מדי או מעט מדי יכול להשפיע על ספריית ריכוז, כמו גם את המורכבות, שמוביל PCR חפצים.

זה מאתגר לבנות ספריה שבב-seq בעת שימוש במספר מצומצם של תאים עבור immunoprecipitation27. הפרוטוקול שבב הסטנדרטי השתמשו בעבר דורש 10 ng של immunoprecipitated ה-DNA עבור שבב-seq ספריית הכנה1,28. עם זאת, פרוטוקול המתוארים כאן בדרך כלל יוצר 2 ng של immunoprecipitated ה-DNA על ידי נוגדנים Olig2 מ- 20,000 OPCs. DNA משמש כדי להכין את ספריית שבב-seq בשיטה בנוסף מתאם צעד אחר צעד, אשר מאפשר משופרת רגישות ומאפשר picograms של immunoprecipitated DNA הגברה. על ידי שילוב קיטים מסחריים, פרוטוקול זה מספק פתרון מעשי לבצע שבב-seq עבור גורמים תעתיק מבוסס על מספר קטן של תאים.

חשוב, התא נמוך שבב-seq פרוטוקול המתואר ישימה עבור שבב-Seq גורמים אחרים שעתוק ראשי תאים או אוכלוסיות תאים נדיר גם כן. נוגדנים בשימוש פרוטוקול זה צריך לאמת השפעול חייב להיות ספציפי על ידי ניסוי ה-IP הראשון. איגוד שאינו ספציפי של נוגדנים יוביל תוצאות המסכן. בנוסף, עדיף לבצע את הניסוי הזה נמוך תא שבב-seq בתאים עם רמת ביטוי גבוהה של הגורם שעתוק של עניין.

עבור ניתוח נתונים, זה יכול להיות מאתגר כדי להחליט אילו ערכי שתשמש סינון גזור-offs לאחר שיא הביקור. המטרות של הניתוח, פרמטרים מחמירים או רגוע יותר עשוי לשמש בהתאם. בדרך כלל, נעשה שימוש בשילוב של קיפול-העשרה, או ערך-p או פד. אם כמה אתרי קישור של הגורם שעתוק במחקר היו ידועים בעבר, זה עשוי לעזור בקביעת הסף הסינון. פקטור שעתוק איגוד האתר מסדי נתונים של נגזר זמין לציבור ניסויים שבב-seq בשורות תאים שונים, התנאים היה הידור29,30. אחד יכול לחפש גן, בדוק אם אתרי קישור פקטור שעתוק התגלו בעבר. עם זאת, חשוב להיות מודעים כי אתרי קישור פקטור שעתוק משתנות בהתאם סוגי תאים והתנאים.

אין סיליקו שיטות משלימות לניסוי שבב-seq הן מוטיב העשרה ניתוח ו דה נובו מוטיב חיפוש באמצעות שבב מם20 או תוכניות דומות. מוטיב החיפוש דורש מקיפה ידוע, דה נובו נגזר מוטיב מסד נתונים כגון מוטיבים קדד25 או מסד נתונים Hocomoco31. Hocomoco הוא מסד נתונים של מוטיבים שהתגלו מן האדם זמין לציבור וניסויים עכבר שבב-seq. אם מוטיבים של החלבון assayed אינם ידועים, החיפוש מוטיב דה נובו יכול לחשוף תבניות החוזרות על עצמן רצף חלק משמעותי מן הפסגות כמו מוטיבים חדשים. פעולת קומבינטורית פוטנציאלי של גורמי שעתוק עשויה להיות חשפה כאשר מוטיבים של גורמי שעתוק אחרים נמצאים גם כדי להעשיר את פיקס וכתוצאה מכך.

האזורים שיא מועשר השפעול הניתנים לאימות באמצעות של כרומטין של תאים מוטציה או נוקאאוט כפקדים. ביצוע שבב-seq באמצעות תאים לא מבטא את הפקטור שעתוק משמשים לזיהוי פסגות חיובי כוזב, מסומן גם בתור "פסגות פנטום"32. תוצאות חיוביות שגויות לסנן.

. זה גם מעניין להשוות בין הפסגות שבב-seq שנוצר עם נתונים transcriptomic. הפסגות PDGFRα-Olig2 שבב-seq הושוו עם הביטוי של גנים OPCs מן הפרסום הקודם18. אסטרטגיה זו עשויה להיות מוגבלת משום ביטוי גנים OPCs עשויה להיות נשלט על ידי מנגנונים שאינו מחייב פקטור שעתוק Olig2. בנוסף, גורם שעתוק Olig2 עלול להיקשר לאזור הרגולציה של הגן אבל הגן שאולי רמת ביטוי גנים נמוך עקב מנגנונים אפשריים מעכבות או חוסר שיתוף גורמים הכרחי עבור שעתוק גנים.

שבב-seq היא שיטה לזיהוי אתרי קישור ה-DNA הגנום כולו של גורמי שעתוק וחלבונים אחרים. עם זאת, באמצעות ניתוח של מופע משותף של גורמי שעתוק, חוקרים גילו כי גורמי שעתוק נוטים לשייך לחלבונים אחרים להרכיב מודולים co-regulatory33. זה אומר כמה איגודי בין גורמים תעתיק, הדנ א על ידי שבב-seq עקיף, גישור על ידי חלבונים אחרים. לכן, כדי להשיג תוצאות משמעותי יותר חוקרים לשקול ללמוד גורם שעתוק אחד או יותר בו זמנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

JQW, XD, RCDD ו- YY נתמכו על ידי מענקים נבחרת מוסדות של בריאות R01 NS088353; 1R21AR071583 גרנט NIH-01; קרן Staman אוגילבי קרן-אנדרטת הרמן; היוזמה המוח UTHealth ואת CTSA UL1 TR000371; מענק מן האוניברסיטה של טקסס מערכת מדעי המוח מכון המחקר Neurotechnology (גרנט #362469).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/ Equipment
Banderiaea simplicifolia lectin 1 Vector Laboratories # L-1100
Rat anti-PDGFRa antibody BD Bioscience # 558774
Neural tissue dissociation Kit (P) MACS Miltenyi Biotec # 130-092-628
Accutase STEMCELL technologies # 07920
TRIzol Thermo Fisher # 15596026
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody Millipore # AB5320
Bioruptor Pico sonication device Diagenode # B01060001
True MicroChIP kit Diagenode # C01010130
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher # 15593031
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit MACHEREY-NAGEL # 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher # P11496
DNA SMART ChIP-Seq kit Clontech Laboratories # 634865
Agencourt AMPure XP Beckman Voulter # A63880
GlycoBlue Thermo Fisher # AM9516
pico-green Thermo Fisher # P11496
D-PBS Thermo Fisher # 14190-144
SYBR Green master mix Bio-Rad Laboratories # 1725124
DMEM/F12 Fisher Scientific # 11-320-033
Penicillin-Streptomycin (P/S) Fisher Scientific # 15140122
N-2 Supplement Fisher Scientific # 17502048
B-27 Supplement Fisher Scientific # 17504044
insulin Sigma # I6634 Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl.
Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) Sigma # A4161 Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4
Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) EMD Millipore # GF003
HUMAN PDGF-AA VWR # 102061-188
poly-D-lysine VWR # IC15017510 Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using.
Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm VWR # 25373-100
Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm VWR # 25373-187
HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red Fisher Scientific # 14185-052
Trypan Blue Stemcell Technologies # 07050
protease inhibitor cocktail Sigma # 11697498001
Software
FastQC [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads
Trimmomatic 0.33 [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic Trimming and filtering raw reads
GENCODE mm10 ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz Mouse reference genome
Bowtie2 2.2.4 [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml Aligning reads to a reference genome
SAMTools 1.5 [13] http://samtools.sourceforge.net/ Converting SAM file into BAM format
HOMER 4.9.1 [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols
R 3.2.2 [15] https://www.R-project.org/ Programming scripts and running functions
SPP 1.13 [16] https://github.com/hms-dbmi/spp Creating a strand cross-correlation plot
MACS2 2.2.4 [17] https://github.com/taoliu/MACS Finding regions of ChIP enrichment over control
BEDTools 2.25 [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Genome arithmetics
bedGraphToBigWig http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ Converting bedGraph file into bigwig
IGV browser 2.3.58 [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks
Microsoft Excel Spreasheet program
ENCODE's blacklist https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists Filtering peaks
mm10.chrom.sizes http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. Converting bedGraph file into bigwig
ENCODE's motif database [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ Comprehensive motif database required for motif enrichment
MEME-ChIP [20] http://meme-suite.org/index.html Motif enrichment analysis and motif discovery
Primer names used for qPCR Primer sequences used for qPCR
Mbp-F: CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R: AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F: ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R: GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F: GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R: TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-F ATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-R CATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-F TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-R GATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-F AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-R GTCCCTCCACGGTACTCCT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

Tags

מדעי המוח בעיה 134 OPCs Olig2 נמוך-תא שבב-seq רגולציה תעתיק immunopanning MACS2
זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dong, X., Cuevas-Diaz Duran, R.,More

Dong, X., Cuevas-Diaz Duran, R., You, Y., Wu, J. Q. Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRα+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis. J. Vis. Exp. (134), e57547, doi:10.3791/57547 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter