Summary
在这里, 我们提出一个协议, 旨在分析少突胶质转录因子 2 (Olig2) 在急性纯化脑少突胶质前体细胞 (OPCs) 的全基因组结合执行低细胞染色质免疫沉淀 (芯片)、库准备、高通量测序和生物信息学数据分析。
Abstract
在哺乳动物细胞中, 基因转录通过转录因子与基因组 DNA 的相互作用来调节细胞类型的特定方式。谱系特异转录因子被认为在细胞规格和分化过程中发挥重要作用。芯片结合高通量 DNA 测序 (芯片序列) 被广泛用于分析基因组范围内转录因子 (或其关联的复合体) 与基因组 DNA 的结合点。然而, 一个标准的芯片反应需要大量的细胞, 这使得研究孤立的原生细胞或稀有细胞群体的数量有限是困难的。为了了解 Olig2 在急性纯化小鼠 OPCs 中少突胶质谱系特异转录因子的调控机制, 本文给出了用芯片序列识别 Olig2 (或 Olig2 复合体) 全基因组结合点的详细方法。首先, 该协议解释了如何从小鼠脑中纯化血小板衍生生长因子受体α (PDGFRα) 阳性 OPCs。其次, 对 Olig2 抗体介导芯片和库结构进行了实验。最后一部分介绍了用于 Olig2 芯片序列分析的生物信息学软件和程序。总之, 本文报道了一种分析急性纯化脑 OPCs 转录因子 Olig2 的全基因组绑定的方法。
Introduction
重要的是研究蛋白质 (或蛋白质复合物) DNA 绑定和表观遗传标记建立转录调控网络参与各种生物过程。特别是转录因子与基因组 DNA 的绑定, 在基因调控、细胞分化、组织发育等方面都有重要作用。研究转录调节和表观遗传学机制的有力工具是染色质免疫沉淀 (芯片)。由于下一代测序技术的飞速进步, 芯片结合高通量 dna 测序 (芯片序列) 被用于蛋白质 DNA 绑定和表观遗传标记的分析1。然而, 一个标准的芯片序列协议需要大约2000万细胞每反应, 这使得这种技术的应用困难, 当细胞数量有限, 如孤立的原生细胞和稀有细胞群体。
少突胶质谱系细胞包括少突胶质前体细胞 (OPCs) 和少突胶质广泛分布于整个大脑, 对大脑的发育和功能至关重要。OPCs 作为前体细胞的一种, 具有自我更新和分化的能力。OPCs 不仅作为少突胶质的始祖, 而且在神经元信号的传播中起着重要作用, 通过与其他类型的脑细胞进行交流2。以前的研究表明, 少突胶质的发展是由沿袭特定的转录因子 (如 Olig2 和Sox103, 4) 调节的.这些转录因子被发现绑定到一些关键基因的启动子或增强区, 以影响其表达在少突胶质规范和分化。然而, 要确定蛋白质 (或蛋白质复合物) 在急性纯化的初级 OPCs 中的 DNA 结合有很大的挑战性, 细胞数量非常有限。
本协议描述了如何利用芯片序列技术对纯化小鼠 OPCs 中 Olig2 基因组 DNA immunoprecipitated 进行系统的研究。OPCs 从小鼠的大脑被 immunopanning 的敏锐纯化, 并用于芯片实验, 不扩散在体外。有限数量的 OPCs 可以得到 immunopanning, 是不够的标准芯片序列实验。本文介绍了一种低细胞芯片序列协议, 其每片反应的转录因子为2万细胞。简而言之, 交联细胞裂解和微气泡由超声波装置剪切染色质。用 Olig2 抗体和蛋白 A 包覆的微珠对剪切的染色质进行孵化, 沉淀 Olig2 抗体绑定基因组 DNA。从蛋白 A 包膜珠和反向交联洗脱后, 用苯酚-氯仿萃取纯化 Olig2 抗体沉淀的基因组 DNA。该产品经过定量化, 并受到 T 尾矿、底漆退火模板的切换和扩展, 增加了适配器和放大器, 库的大小选择和净化步骤, 为芯片序列库的建设。
在测序后, 分析了用 Olig2 转录因子抗体和对照样品制备的样品的原始读数质量。剪裁了包含读取片段的低质量基对和适配器。接下来, 修剪的读数与鼠标参考基因组对齐。与对照样品相比, 对芯片读数显著丰富的基因组区域被检测为峰值。显著的峰值, 代表潜在的转录因子结合点, 被过滤和可视化的基因组浏览器。
值得注意的是, 本协议中描述的方法可以广泛地用于其他转录因子的芯片序列, 并具有任何细胞类型的有限数目。
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Protocol
所有动物的使用和实验性的协议都是按照《动物护理和使用指南》进行的, 并由德克萨斯大学卫生科学中心的机构生物安全委员会和动物福利委员会批准。休斯顿。
1. 从小鼠脑中纯化 PDGFRα阳性少突胶质谱系细胞 (从先前描述的 immunopanning 协议修改为5, 6, 7)
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PDGFRα阳性细胞选择 immunopanning 板的制备及2片用于内皮细胞和小胶质的损耗。
注: 请注意, 培养皿而不是细胞培养皿为 immunopanning 实验工作;如果纯化细胞将用于培养, immunopanning 步骤必须在生物安全柜中进行- 10厘米培养板与30µL 山羊抗鼠 IgG 在10毫升 pH 9.5, 50 毫米三 HCl 隔夜在4°c。搅拌板, 确保板材表面均匀, 完全覆盖的涂层解决方案。
- 用12毫升 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 稀释40µL 抗 PDGFRα抗体, 制备 PDGFRα抗体溶液, 含 0.2% BSA。
- 用10毫升 1x DPBS 的 igg 涂敷板3洗净后, 室温下用 PDGFRα抗体溶液孵育4小时的 igg 涂层。
- 用10毫升 1x DPBS 的 PDGFRα抗体涂覆钢板3次。在板侧壁上轻轻地添加 DPBS 溶液, 不干扰涂层表面。
- 涂层2新的 15 cm 培养板为内皮细胞和小胶质的耗尽与20毫升 DPBS 包含2.3 µg/毫升的Banderiaea 单叶蔓荆凝集素 1 (BSL-1) 2 h。
- 用20毫升 1x DPBS BSL-1 涂层板3次。在板侧壁上轻轻地添加 DPBS 溶液, 不要扰乱涂层表面。
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从以前发布的方法中修改 PDGFRα正少突胶质沿袭单元格的纯化 6,7, 8.
- 根据以前发布的协议5,6, 从2出生日 7 (P7) 鼠脑中解剖皮质组织。
- 根据详细制造商的说明, 将组织分离产生单细胞悬浮体, 并采用神经组织离解试剂盒 (P)。
- 简要地, 用手术刀把解剖过的皮质组织切成片, 并将其与酶消化37摄氏度。消化后, 手工将工件与火抛光玻璃巴斯德吸管分离成单细胞悬浮。
- 离心机的单细胞悬浮在 300 x g 10 分钟室温和悬浮细胞颗粒使用15毫升的 immunopanning 缓冲 (immunopanning 缓冲 DPBS 与 0.02% BSA 和5µg/毫升胰岛素)。
- 在室温下, 每5分钟将2只小鼠脑细胞悬浮在 2 BSL-1 涂覆板上, 以温和的搅拌板, 以确保小胶质细胞和内皮干细胞的更好的耗竭。
- 轻轻地旋转盘子, 收集细胞悬浮液中的非黏附细胞, 在室温下将其孵化在大鼠 PDGFRα抗体涂层板上45分钟。
- 在对大鼠 PDGFRα抗体涂层板进行细胞悬浮培养后, 轻轻地旋转盘子收集细胞悬浮液, 用 DPBS 冲洗盘子8次以去除非黏附细胞。轻轻地在板侧壁上加洗液, 搅拌板几次, 以摆脱非黏附细胞。
- 用4毫升细胞脱离溶液治疗10分钟37摄氏度, 从大鼠 PDGFRα抗体涂层板中分离出细胞。摇动盘子以去除黏附的细胞。
- 在室温下以 300 x g 离心法收集纯化 OPCs, 用2毫升 OPC 细胞培养基悬浮细胞, 用台盼蓝和 hemocytometer (500 毫升细胞培养培养基 DMEM/F12, 含5毫升的培养基来计数细胞;青霉素-链霉素溶液 (P/S), 5 毫升 N2, 10 毫升 B27, 5 µg/毫升胰岛素, 0.1% BSA, 20 ng/毫升 bFGF 和 10 ng/毫升 PDGFRα)。
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immunopanning 后 OPCs 纯度的验证。
- 为了评价 immunopanning 后 OPCs 的富集情况, 应根据制造商的指示, 使用一些纯化的 OPCs 进行 RNA 提取, 以 guanidium 硫氰酸盐为基础提取。
- 采用荧光绿色染料 qRT 进行 PCR 检测, 以检查纯化 OPCs 中 PDGFRα表达的富集度, 并根据先前发布的材料4与离解脑细胞进行比较。
- 另外, 用 anti-NG2 硫酸软骨素蛋白多糖 (NG2) 抗体作为先前发布的材料9, 将一些纯化的 OPCs 加入聚 d-赖氨酸涂层的24井板中染色。
2. 高通量测序的低细胞芯片制备和芯片库建设
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Olig2 低细胞芯片的准备与商业上可用的超声波系统和一个商业上可用的低细胞数芯片套件 (见材料表), 按照详细的标准程序, 从制造商的指示。
- 分离后的大鼠抗 PDGFRα抗体涂层板和细胞计数的台盼蓝和 hemocytometer 投入2万纯化 OPCs 1 毫升 OPC 细胞培养基为每个芯片的反应。
- 添加27µL 36.5% 甲醛固定细胞悬浮在室温下10分钟。
警告: 请注意, 由于安全原因, 必须在化学油烟机中使用甲醛。 - 在室温下停止 DNA 蛋白交联, 50 µL 2.5 米甘氨酸5分钟。
注: 所有步骤必须在冰或4摄氏度冷室从这一点上进行。 - 将1毫升的冰冷汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 与蛋白酶抑制剂鸡尾酒洗净, 用 300 x 克4摄氏度的预冷离心机把细胞颗粒化。
- 溶解细胞颗粒在25µL 完全溶解缓冲5分钟冰。
注: 搅动管在裂解缓冲液中悬浮细胞。 - 用75µL 冰冷 HBSS 含蛋白酶抑制剂鸡尾酒补充细胞裂解物, 用预冷超声波系统剪切细胞裂解物的染色质, 并在三十年代和三十年代关闭程序。总是油脂实验6管一起, 并确保平衡管包含100µL 水。
- 剪切后, 离心机在 1.4万 x g 10 分钟4°c, 离心后在新管中收集上清。
- 用蛋白酶抑制剂稀释100µL 的剪切染色质, 同体积的冰冷完全芯片缓冲器。
- 保存20µL 稀释剪切染色质作为输入控制样品。
注: 输入控制样本也需要作为比较 Olig2 immunoprecipitated 样本, 以识别 Olig2 抗体 immunoprecipitated DNA。 - 添加1µL 兔 anti-olig2 抗体180µL 稀释剪切染色质和孵化反应管在一个旋转轮 40 rpm 16 小时在4°c。
注: 在冷室中执行此步骤。 - 对于每个芯片的反应, 洗涤11µL 磁性蛋白 A 涂层珠与55µL 珠洗涤缓冲器, 并把珠丸在11µL 的珠洗涤缓冲区后2洗涤。
注: 在冷室中执行此步骤。 - 对于每个芯片的反应, 添加10µL 的预水洗蛋白 A 涂层珠, 以芯片反应管。在寒冷的房间里执行这一步骤。
- 在旋转轮上将芯片反应管孵化为4摄氏度, 另2小时。
- 将芯片反应管放在磁架上1分钟。
注: 在冷室中执行此步骤。 - 移除上清, 不要将珠粒取出。
- 用100µL 为4个洗涤缓冲器分别在4摄氏度的旋转轮上清洗珠粒。
- 洗净后, 将200µL 的洗脱缓冲液添加到珠状颗粒中, 在65°c 处孵化出芯片反应管4小时, 以逆转交联蛋白 DNA。
- 另外, 添加180µL 的洗脱缓冲到20µL 输入控制样本和孵化65°c 4 小时, 以逆转交叉链蛋白 DNA 以及。
- 添加200µL 25:24:1 (v/v) 混合苯酚, 氯仿和异戊醇的每个芯片反应管。
- 涡流为1分钟, 离心机在室温下以 1.3万 x g 为15分钟。将上相转移到新管上。
- 添加40µL 3 米醋酸钠溶液, 1000 µL 100% 乙醇和2µL 糖原沉淀共价键链接到每个芯片反应管隔夜在-20 °c。
- 离心机在 1.3万 x g 20 分钟在4摄氏度。
- 丢弃上清液, 用500µL 冷70% 乙醇和离心机在 1.3万 x g 处洗涤20分钟4摄氏度。
- 丢弃上清液, 保持颗粒空气干燥10分钟, 用50µL 水溶解颗粒。
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用于高通量测序的芯片库构建
- 根据制造商的指示, 清洁和浓缩芯片 DNA 和清洁套件。
- 根据制造商的说明, 用微微绿色量化芯片样品。
- 根据制造商的说明, 使用一个芯片序列套件, 用于 T 尾跟踪、复制和跟踪、模板切换和扩展、添加适配器和放大、库大小选择和纯化。
- dsDNA 变性后, dephosphorylate 3 ' 末端 ssDNA 虾碱性磷酸酶, 并添加一吨 (T) 尾到 ssDNA 由终端 deoxynucleotidyl 转移转移。
- 将 dna 聚 (dA) 底漆退火到 ssDNA 模板进行 dna 复制和模板交换。
- 模板切换后, 用正向和反向引物进行 PCR 放大芯片序列库, 进行索引。
- 选择 PCR 放大芯片序列库, 其片段范围从250到 500 bp 由顺磁珠的选择2为双尺寸选择。
- 使用微流控芯片-毛细管电泳装置检查所选芯片序列库的质量。
3. 数据分析
- 准备目录结构。
- 创建一个用于执行芯片序列数据分析的目录。在新创建的目录内, 创建六个具有以下名称的子目录: 原始文件、fastqc 输出、领结输出、荷马输出、macs2 输出、主题分析和报告。
- 准备数据并对原始序列数据进行质量控制分析。
- 移动到 "原始文件" 目录并下载芯片序列数据文件。
- 验证文件名。如果排序是配对结束, 将有4个文件 (两个用于治疗和两个输入) 具有相似的基本名称: PDGFRα_Olig2. read1 fastq, PDGFRα_Olig2 read2. fastq, PDGFRα_input. read1 fastq, PDGFRα_input. read2. fastq。如果文件名不同, 请使用 "mv" 命令重命名它们。
- 移动到 "fastqc 输出" 目录。
- 使用 fastq 文件质量控制软件10从原始读取中获取质量控制指标。使用图 S1A中的命令分别为每个 fastq 文件运行质量控制过程。该软件将在 html 文件中显示几个质量控制指标。
- 打开 html 质量控制文件并验证读取次数、读取长度、每基序列质量、每个序列质量分数、序列 GC 内容、序列复制级别、适配器内容和 kmer 内容。
- 修剪尾随的低质量读取和适配器内容。
- 观察 "每基序列质量" 和 "适配器内容" 地块。确定每个读取的头部和尾部的修剪长度。修剪的适当长度是基础质量低于 30, 并且有适配器内容的证据。
- 移动到 "原始文件" 目录。
- 下载并安装用于修剪读取11的软件。使用图 S1B中的命令分别修剪处理和输入。参数 "裁剪" 指示从末尾修剪基础后的剩余读取长度, "HEADCROP" 指定从读取开始时要消除的基数。
- 修剪命令还包括在参数 "MINLEN" 中筛选后接受的最小读取长度。如果读数至少为 50 bp, 请使用 35 bp 作为读取长度阈值。
- 移动到 "fastqc 输出" 目录。
- 在修剪读取后执行 fastq 文件质量控制分析。验证质量控制问题是否已解决。使用图 S1C中的命令获取质量控制指标。
- 将单端或配对端的芯片序列读数与鼠标参考基因组对齐。
- 移动到 "领结输出" 目录进行映射。
- 下载 GENCODE mm10 鼠标参考基因组。将 mm10 鼠标参考基因组重命名为 "mm10"。
- 下载读取映射器12并在系统中安装它。
- 使用图 S2A中的命令创建下载的参考基因组的索引文件。将自动创建六个文件: mm10.1 bt2、mm10.2 bt2、mm10.3 bt2、mm10.4 bt2、mm10. 启 1. bt2 和 mm10. 启 2. bt2。
- 使用图 S2B中的命令执行对齐方式, 并根据系统设置将参数 "-p" 调整为处理内核的数目。如果运行配对结束模式, 参数 "-1" 和 "-2" 表示修剪的 fastq 文件的名称。
注意: 为处理和输入示例分别执行映射, 并为每个示例创建输出度量日志文件。 - 下载用于操作 SAM 格式13中的文件并将其安装到系统中的软件。使用图 S2C中的命令将对齐的 SAM 文件转换为 BAM 文件。
- 获得对配对端处理和控制样本的峰值调用前映射读取的质量控制指标。
- 要解决的最重要的质量控制指标之一是排序深度。在领结. 输出目录中打开文件 "领结 PDGFRα_Olig2 .txt" 和 "日志领结. .txt", 并验证每个示例中唯一映射的读对数是否大于1000万。
- 移动到 "荷马输出" 目录。
- 下载用于主题发现和下一代排序分析的软件14并将其安装在系统中。
- 创建名为 "tagDir" 的目录。
- 要验证标记克隆, 请使用图 S3A中描述的命令。"makeTagDirectory" 命令将生成四质量控制输出 files:tagAutocorrelation.txt、tagCountDistribution.txt、tagInfo.txt 和 tagLengthDistribution.txt。
- 移动到 "tagDir" 目录。
- 将 "tagCountDistribution.txt" 文件复制到 "报告" 目录中。
- 移动到 "报告" 目录。
- 使用电子表格程序打开 tagCountDistribution.txt 文件, 并创建每个基因组位置标记数的条形图。存储直方图文件的名称为 "tag.clonality.xlsx"。
- 在系统中安装 R 编程语言15 。
- 在终端中, 键入 "r", 然后按 enter 键访问 R 编程环境。
- 下载用于处理芯片序列数据16的 R 包, 并使用图 S3B中描述的命令安装它。
- 使用图 S3C中的 R 脚本绘制链的交叉关联。
- 使用峰值映射器检测峰值。
- 移动到 "macs2 输出" 目录。在系统中下载并安装峰值映射器17 。
- 使用函数 "callpeak" 与处理和控制在步骤3.4.6 中生成的 BAM 文件。
注: 其他参数包括 "-f" 输入文件格式, "-g" 用于基因组大小, "-名称" 表示所有输出文件的基名称, "-B" 用于存储 bedgraph 格式的碎片堆积。完整的峰值调用命令包括在图 S4A中。对配对端样品使用 BEDPE。 - 验证峰值映射程序生成了六个文件: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks narrowPeak、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits 床、PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model r、PDGFRα_Olig2_vs _PDGFRα_input_control_lambda. bdg 和 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup bdg。
- 打开文件 PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks. xls 查看被称为峰值, 位置, 长度, 山顶位置, 交通, 和峰值浓缩指标:-log10 (pvalue), 折叠浓缩, 和-log10 (q 值)。
- 筛选和注释称为峰值。
- 使用上一步中打开的文件, 根据折叠富集、p 值和/或 q 值对生成的峰值进行筛选。要确定适当的过滤阈值, 请制作一个直方图图来决定每个指标的密度。筛选出选定阈值之下的数值以获得显著峰值。
- 下载 mm10 黑名单 (已知有人为地高信号) 和过滤出芯片序列峰值, 这是在任何一个工件区域内。
- 创建包含以下列的筛选峰值的床文件: 染色体、开始、结束、peakID、模拟和链。用点 "." 填充模拟列, 因为它没有使用。在 "链" 列中, 将所有值设置为 "+"。将床文件保存为 "filtered.peakData2.bed"。
- 在 "报告" 目录中复制 "filtered.peakData2.bed" 文件。
- 移动到 "报告" 目录。
- 若要将筛选的峰值批注到特定的基因区域, 请使用在上一步中创建的床文件的函数 "annotatePeaks"。使用的命令显示在图 S5A中。
- 使用统计软件打开 "filtered.annotatedPeaks.txt" 文件。
- 过滤产生的峰值位于基因间区域的距离大于 5 kb, 从注释的 TSS。使用文件中的 "距离到 TSS" 列作为筛选距离。将已筛选的峰值存储在名为 "5 kbup geneBody peakData .txt" 的 excel 文件中。
- 将生成的筛选峰值存储在具有列的 bedGraph 文件中: 染色体、开始、结束和-log10 (q 值)。命名文件 "5 kbup geneBody peakData bedGraph"。
- 为浏览器可视化生成要人文件。
- 下载并安装用于基因组算术18的软件。
- 下载用于将 bedgraph 转换为要人并安装在系统中的工具。下载 "mm10.chrom.sizes" 文件。
- 使用图 S6A中的命令生成要人文件。
- 在系统中下载并安装一个基因组浏览器19 。
- 打开基因组浏览器并加载文件 "5 kbup, geneBody, peakData", 以可视化的显著峰值和他们的位置有关已知的基因。
- 主题搜索。
- 移动到 "主题分析" 目录。
- 下载一个从头主题扫描和主题浓缩程序, 并将其安装到您的系统20中。
- 下载一个包含 Olig2 主题的综合主题数据库。
- 获得500个以重大高峰峰会为中心的 bp 地区的基因组序列。将序列存储为 peak.sequences.txt。使用图 S7中的命令在500个 bp 峰值区域中搜索 Olig2 图案。
- 使用适当的电子值筛选生成的图案 (默认为 0.05)。
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Representative Results
采用低细胞芯片序列进行生物信息学分析, 研究转录因子 Olig2 与基因组 DNA 在急性纯化脑 OPCs 中的潜在相互作用。图 1显示了实验和数据分析过程的一般工作流。在这个协议中, 产后老鼠的大脑被分离成单细胞悬浮。组织分离后, 采用 PDGFRα抗体对 OPCs 进行纯化, immunopanning。图 2显示了 PDGFRα的显著丰富性、神经元标记 Tuj1 的小表达式 (神经元特异性 III. β蛋白)、星形胶质细胞标记 GFAP (胶质纤维酸性蛋白)、胶质细胞标记电离钙结合适配器分子 1 (Iba1), myelinating 成熟少突胶质标记髓鞘碱性蛋白 (Mbp) 和髓鞘-少突胶质糖蛋白 (Mog) 从纯化 OPCs 评估的 RT-qPCR。此外, 染色结果表明大多数单元格都 NG2 正数, 如图 2所示。随后, 用甲醛固定2万纯化 OPCs, 用超声波系统剪切染色质。对 Olig2 低细胞芯片进行了建库。芯片库准备后, 通过微流控芯片-毛细管电泳装置对所生成产品的质量进行了验证。图 3显示了一个 Olig2 低单元格芯片库的示例电泳图谱。在图书馆 PCR 产品规模选择后, Oligo2 图书馆产品的清晰峰值从250到500都应该是可见的。用 Olig2 转录因子抗体和对照样品制备的样品的芯片序列库, 经过高通量测序, 产生配对端50周期测序读数。更长的读取长度将提高映射速率, 并降低多映射的可能性, 而代价是排序成本。与 50 bp 芯片序列配对端排序库, 通常取得良好的结果。
在对适配器和尾随低质量基对进行原始读取和修整的初始质量控制评估之后, 在图 4中描述了质量控制图。修剪的读取应具有大于30的基本质量, 没有适配器序列, 并且具有低重复率 (图 4B-d)。良好的质量修剪读取将提高总体对齐率。其他参数 (如 GC 内容) 也很重要, 应考虑进行修整。
一旦测序样本对齐, 就有必要验证测序深度。众所周知, 被称为峰值的数量将会随着序列深度的增加而增大, 因为弱站点在统计上将变得更重要21。需要使用饱和度分析来确定每个特定转录因子的足够测序深度, 以牺牲时间和预算。关于哺乳动物样本的编码联合体提出了一种转录因子结合的一致测序深度: 至少有两个生物复制22的每一个最少1000万个唯一映射的读数。唯一映射的读取数和总体对齐率由读取映射器计算。图 5A中显示了良好的映射度量的示例。对齐的读取应映射到不同的基因组位置, 表示足够的库复杂性, 也称为标记克隆。编码联合体建议, 1000万的对齐读取中至少有80% 应映射到不同的基因组区域22。图 5B显示了适当的标记克隆, 其中超过90% 的读取仅映射到一个基因组位置。低复杂度库通常发生在没有足够的 DNA 的情况下, PCR 扩增片段重复排序。低复杂度的库将产生高错误的峰值检测率。
当使用配对端的芯片序列数据时, 碎片会在转录因子附近与一定的分离距离相结合。配对结束排序将允许更准确地估计平均片段长度, 从而更好地估计的基因组区域, 其中有更多的绑定发生。链相关图描绘了与主要片段长度相对应的富集峰。如图 5C所示, 计算出的片段长度为 130 bp, 而读取长度为 50 bp。片段长度长于读取长度的芯片序列数据集表示高质量的16。
峰值调用的输出是一个可能受转录因子 (或其复杂) 约束的基因组区域的列表。基因组区域或峰值列表包括在一个 "床" 文件中, 可以在基因组浏览器中查看。对于每个峰值, 这个文件包含一个峰值 ID, 高峰峰会的基因组位置, 和罗斯福 log10 (q 值)。显着丰富的峰值是那些具有较高的褶皱浓缩和重要指标。输出峰值文件的示例显示在图 6A中。在使用自定义阈值选择显著峰值后, 在编码的黑名单23中筛选峰值, 并识别基因启动器区域 (5 kb 的上游和整个基因体) 中的峰值, 一个 "大人物" 文件有助于查看基因组中的峰值。浏览器。多数富集峰区具有较高的转录因子结合概率。重要的是确认已知转录因子调控区域的峰值存在, 以及转录因子结合不太可能的地区的峰值缺失。图 6B-e显示了具有和没有峰值富集的基因区域的示例, 以及它们在编码启动子区域上的位置。
在硅片中, 对芯片序列实验的互补方法是主题丰富分析和全新主题搜索. 由于以前没有研究过 OPCs 中的 Olig2 绑定, 因此在运动神经元祖细胞和胚胎干细胞中 Olig2 的芯片序列衍生峰用于从头主题标识4,24。Olig2 "从头" 标识的主题被添加到综合编码主题数据库25中, 并进行了主题丰富分析。在 NR3C1 纯化细胞的芯片序列峰中发现了高富集的 OLIG2 识别出的 HDAC2、SP1、FOXP1、NFKB2/4、SMAD2/3、PAX5、ASCL1 和 PDGFRα) 图案. 发现了一个具有 E 值 < 0.05 的 30 "从头" 标识的图案的富集。图 7显示了 Olig2 的前两个全新标识的主题. 这两个 Olig2 标识了在 PDGFRα纯化细胞中获得的芯片序列峰的 > 60%, 以及已知的图案.
图 1: 协议工作流的概述.PDGFRα阳性 OPCs 从产后鼠脑中分离出来, 并受到 Olig2 芯片实验。将沉淀的 DNA 片段用于制备芯片库。在对图书馆质量进行评估后, 采用样本进行排序。分析了数据集, 确定了峰值, 指出了 OPC 纯化细胞中潜在的 Olig2 结合点。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: qPCR 和染色对 immunopanned OPCs 纯度的评价.(A) PDGFRα抗体 immunopanned 细胞被播种, 染色使用 OPC 谱系标记 NG2 抗体进行。蓝色: DAPI, 绿色: NG2。缩放条 = 10 µm. (B) 评价了纯化 OPCs (PDGFRα +) 和游离脑细胞 (混合) 中神经元标记 Tuj1 的相对表达水平。Tuj1 表达在离解的脑细胞被设置了到1。(C) 评价了纯化 OPCs (PDGFRα +) 和分离脑细胞 (混合) 中星形胶质蛋白标记的 GFAP 相对表达水平。游离脑细胞中的 GFAP 表达设为1。(D) 评估了在纯化 OPCs (PDGFRα +) 和分离脑细胞 (混合) 中 OPC 标记 PDGFRα的相对表达水平。PDGFRα表达在离解的脑细胞被设置了到1。(E) myelinating 成熟少突胶质标记 Mog 在纯化 OPCs (PDGFRα +) 和分离脑细胞 (混合) 中的相对表达水平进行了评价。Mog 表达在离解的脑细胞被设置了到1。(F) 评价了纯化 OPCs (PDGFRα +) 和分离脑细胞 (myelinating) 中成熟少突胶质标记 Mbp 的相对表达水平。在离解脑细胞中的 Mbp 表达设为1。(G) 评价了纯化 OPCs (PDGFRα +) 和分离脑细胞 (混合) 中小胶质标记 Iba1 的相对表达水平。Iba1 表达在离解的脑细胞被设置了到1。B G 中的数据代表三项实验, 误差条表示标准误差。T-测试分析 * P < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 从 Olig2 低单元格芯片电泳图谱一个库的示例。在双尺寸选择后, 用微流控芯片-毛细管电泳装置对 Olig2 芯片库的质量进行了分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4:50 bp 读取长度低细胞芯片序列样本的具有代表性的质量控制结果.(A) 摘要表, 描述读取的总数、质量差的读取数、序列长度和 GC 内容的总数量。(B) 图, 指示读取中不同位置的基本质量分数的分布情况。(C) 图中显示读取中不同位置的潜在适配器内容。(D) 表示重复序列的百分比的折线图。大多数读取都来源于在库中只发生一次的序列, 因此表示重复率较低或库复杂度很高。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 在峰值调用之前获得的质量控制度量: bowtie2 对齐度量、链交叉关联和标记克隆.(A) 从读取映射器获得的对齐度量。最重要的度量值是唯一映射的读对的数目, 表示为 "对齐和谐1次", 以及总体对齐率。(B) 显示标记克隆的直方图。条形指示找到标记的基因组位置的百分比。(C) 一个表示良好质量数据的交叉相关图的示例。红线以 50 bps 和主要片段长度为 130 bps 描述读取长度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 芯片序列峰值区域和基因组浏览器视图在不同的基因组位置上有重要的切屑峰.使用峰值调用方标识的峰值区域的 ( A) 示例。(B) 在已知的 OPC 标记基因 Cspg4 的基因体中发现了显著的芯片序列峰。(B) 无论是在启动子区域还是在 Mbp 基因的基因体、成熟少突胶质的标记、(C) Tubb3、神经细胞标记或(D) 的胶质细胞中, 都没有发现芯片序列峰值。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 高度丰富的 Olig2 在 PDGFRα-Olig2 芯片序列峰中发现的可识别图案. 请单击此处查看此图的较大版本.
图 S1: 准备芯片序列数据集.(A) 目录体系结构定义。(B) 计算原始读取质量控制指标。(C) 修剪读取。请单击此处下载此文件.
图 S2: 读取对引用基因组的对齐方式.请单击此处下载此文件.
图 S3: 对齐读取的质量控制, 以解决链相互关联并确定标记克隆.请单击此处下载此文件.
图 S4: 峰值调用.请单击此处下载此文件.
图 S5: 重要峰值的注释.请单击此处下载此文件.
图 S6: 将 bedGraph 文件格式转换为要人, 用于基因组浏览器中的峰值可视化.请单击此处下载此文件.
图 S7: 全新的主题搜索和主题丰富. 请单击此处下载此文件.
图 S8: 描述芯片序列数据的生物信息学分析的流程图.请单击此处下载此文件.
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Discussion
哺乳动物基因调控网络是非常复杂的。芯片序列是研究全基因组蛋白质-DNA 相互作用的有力方法。该协议包括如何使用小鼠大脑中的少量纯化 OPCs (每反应低2万细胞) 来执行 Olig2 芯片序列。该协议的第一个关键步骤是用 PDGFRα抗体 immunopanning 纯化小鼠大脑中的 OPCs。对于 PDGFRα涂覆板的 OPCs 的阳性选择, OPCs 通常与 PDGFRα涂层板紧密结合。即使经过几次洗涤, 仍然有一些非黏附的细胞留下。在显微镜下, 每个 D-PBS 清洗后检查非黏附细胞是很重要的。如果更多的 D-PBS 洗涤无助于减少非黏附细胞的数量, 是时候收集选定的细胞, 因为过量洗涤可能去除附上 OPCs 并且减少纯净的细胞的产量。然而, 不充分的洗涤可能导致其他脑细胞类型的污染。因此, 每次隔离后, 都有必要通过染色与 OPCs 标记 NG2 qPCR 来评估孤立 OPCs 的纯度, 以表达已知的细胞型特异基因, 如神经元的Tuj1 、星形胶质细胞的GFAP 、PDGFRα用于 OPCs、 Iba1为小胶质细胞、 MOG和MBP myelinating 成熟少突胶质。如图 2所示, 染色结果表明, 大部分纯化细胞为 NG2 染色阳性。此外, 与粗脑细胞混合物相比, 某些典型的细胞型特异标记, 如神经元、星形胶质细胞、小胶质和 myelinating 成熟少突胶质在纯化 OPCs 中的表达水平是不可检测或极低的。与粗脑细胞混合物相比, PDGFRα在纯化 OPCs 中表现出较高的表达水平。使用 immunopanning 方法, 在纯化的 OPCs 中, 小胶质细胞的含量大大降低, 与粗脑细胞膜混合物相比, 但存在少量的污染。此观察与其他7、8、26等以前发布的出版物一致。此外, 与以前发布的报告相比, 本协议中使用了一种商业上可用的套件, 用于将脑组织分解为单细胞悬浮液的标准化、高效、方便的分离。
经纯化 OPCs 交联后, 交联细胞应用冷 HBSS 溶液冲洗, 剩余的芯片步骤应在4摄氏度进行, 否则抗体不能正确沉淀基因组 DNA。
此协议的下一个关键步骤是库准备。将芯片材料的 PCR 扩增用于图书馆建设。用于库准备的 PCR 周期数量取决于起始 DNA 的数量。一个好的图书馆准备需要准确定量的输入 DNA 量。pcr 周期太多或太少会影响图书馆的集中度以及复杂性, 导致 pcr 工件。
在使用有限数量的单元格免疫沉淀27时, 构造芯片序列库是很有挑战性的.以前使用的标准芯片协议需要 10 immunoprecipitated DNA 用于芯片序列库准备1,28。然而, 这里描述的协议通常产生 2 immunoprecipitated DNA 的 Olig2 抗体从 2万 OPCs。DNA 是用来准备芯片序列库的单步适配器加法方法, 这使得增强灵敏度, 使 picograms 的 immunoprecipitated DNA 被放大。通过结合商业套件, 该协议提供了一个实用的解决方案, 以执行芯片序列的转录因子基于少量的细胞。
重要的是, 所描述的低细胞芯片序列协议适用于其他转录因子在原代细胞或稀有细胞群中的芯片序列。在本协议中使用的抗体需要经过实验验证, 以特定的 IP 实验为先。抗体的非特异结合将导致不良结果。此外, 更可取的是进行这种低细胞芯片序列实验的细胞具有较高的表达水平的转录因子的兴趣。
对于数据分析, 在峰值调用之后决定使用哪些值作为筛选截割可能会有挑战性。根据分析的目的, 可以使用严格或更宽松的参数。通常, 使用折叠浓缩和 p 值或罗斯福的组合。如果研究中的转录因子的某些结合点以前已知, 这可能有助于确定过滤阈值。转录因子结合站点数据库从公开地可利用的芯片序列实验在不同的细胞线和情况被编译了29,30。你可以寻找一个基因, 并检查是否有转录因子结合点以前发现。然而, 重要的是要知道, 转录因子结合点的不同, 取决于细胞类型和条件。
在硅片中, 对芯片序列实验的互补方法是主题丰富分析和全新主题搜索, 使用的是模芯片 20或类似程序。主题搜索需要一个全面的已知的和从头派生的主题数据库, 如编码图案25或 Hocomoco 数据库31。Hocomoco 是一个从公开可用的人和小鼠芯片序列实验中发现的主题数据库。如果测定蛋白质的图案是未知的, 则 "从头" 主题搜索可以在峰值的重要部分中显示重复序列模式作为新的主题。当其他转录因子的图案也被发现在由此产生的峰值中被丰富时, 转录因子的潜在组合作用可能会揭开。
利用突变体或击倒细胞的染色质作为对照, 可以对富集峰区进行实验验证。使用不表达转录因子的单元格进行芯片序列识别假正峰, 也表示为 "幻峰"32。应筛选出误报。
将产生的芯片序列峰值与 transcriptomic 数据进行比较也很有趣。PDGFRα-Olig2 芯片序列峰与 OPCs 中基因的表达相比, 从以前的出版物18。这一策略可能是有限的, 因为表达的基因 OPCs 可能被控制的机制以外的 Olig2 转录因子绑定。此外, Olig2 转录因子可能绑定到一个基因的调控区域, 但该基因可能有低基因表达水平, 由于可能的抑制机制或缺乏共同因素的基因转录。
芯片序列是一种用于识别转录因子和其他蛋白质的全基因组 DNA 结合点的方法。然而, 通过分析转录因子的共同发生, 研究人员发现转录因子倾向于与其他形成联合调节模块33的蛋白质相关联。这意味着转录因子和基因组 DNA 之间的某些绑定是间接的, 由其他蛋白质所弥合。因此, 为了取得更有意义的结果, 研究者应该考虑同时研究多个转录因子。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
JQW、XD、RCDD 和 YY 得到了国立卫生研究院 R01 NS088353 的赠款的支持;NIH 赠款 1R21AR071583-01;Staman 奥格尔维基金-纪念赫尔曼基金会;UTHealth 脑主动和 CTSA UL1 TR000371;还有德克萨斯大学神经系统科学和 Neurotechnology 研究所的补助金 (赠款 #362469)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
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