Summary
Her præsenterer vi en protokol, der er designet til at analysere genome-wide bindingen af oligodendrocyte transskription faktoren 2 (Olig2) i akut renset hjernen oligodendrocyte forløber celler (OPCs) ved at udføre lav-celle kromatin immunoprecipitation (ChIP) , bibliotek forberedelse, høj overførselshastighed sekvensering og bioinformatic dataanalyse.
Abstract
I pattedyrceller er gen transskription reguleret på en bestemt måde, celle type af transcriptional faktorer interaktioner med genomisk DNA. Afstamning-specifikke transkriptionsfaktorer betragtes som spiller en afgørende rolle i celle specifikation og differentiering under udvikling. ChIP kombineret med høj overførselshastighed DNA-sekventering (ChIP-FF.) er almindeligt anvendt til at analysere genome-wide bindingssteder transkriptionsfaktorer (eller dens tilknyttede komplekse) til genomisk DNA. Men et stort antal celler er nødvendig for et standard ChIP reaktion, hvilket gør det vanskeligt at studere det begrænsede antal isolerede primærelementer eller sjældne cellepopulationer. For at forstå den regulerende mekanisme af oligodendrocyte afstamning-specifikke transskription faktor Olig2 i akut renset mus OPCs, en detaljeret metode ved hjælp af ChIP-seq til at identificere genome-wide bindingsstederne af Olig2 (eller Olig2 komplekse) er vist. Først protokollen forklarer hvordan til at rense Trombocyt-afledt vækst faktor receptor alpha (PDGFRα) positiv OPCs fra mus hjerner. Dernæst Olig2 antistof medieret ChIP og bibliotek konstruktion udføres. Den sidste del beskriver bioinformatic software og procedurer, der anvendes til Olig2 ChIP-seq analyse. Sammenfattende rapporter dette papir en metode til at analysere genome-wide bindingerne af transcriptional faktor Olig2 i akut renset hjernen OPCs.
Introduction
Det er vigtigt at undersøge protein (eller protein kompleks) DNA bindinger og de epigenetiske mærker at bygge transcriptional regulerende net involveret i forskellige biologiske processer. Især kan bindingerne af transkriptionsfaktorer til genomisk DNA spille en vigtig rolle i genregulering, Celledifferentiering og væv-udvikling. Et kraftfuldt værktøj til at studere transkriptionel regulering og epigenetiske mekanismer er kromatin immunoprecipitation (ChIP). På grund af de hurtige fremskridt i den næste generation sequencing technology anvendes ChIP kombineret med høj overførselshastighed DNA-sekventering (ChIP-seq) til analyser af protein-DNA bindinger og epigenetiske mærker1. En standardprotokol, der ChIP-seq kræver dog omkring 20 millioner celler pr. reaktion, hvilket vanskeliggør anvendelsen af denne teknik, når cellen er begrænset, som isolerede primærelementer og sjældne cellepopulationer.
Oligodendrocyte slægt celler herunder oligodendrocyte forløber celler (OPCs) og oligodendrocytes distribueres bredt i hele hjernen og er afgørende for udvikling og funktion af hjernen. Som en slags forløber celler er OPCs i stand til selvfornyelse og differentiering. OPCs ikke kun tjene som stamfaderen til oligodendrocytes men også spille en vigtig rolle i udbredelsen af neuronal signalering ved at kommunikere med andre typer af hjernen celler2. Tidligere undersøgelser har antydet, at oligodendrocyte udvikling er reguleret af afstamning-specifikke transskriptionsfaktorer såsom Olig2 og Sox103,4. Disse transkriptionsfaktorer fandtes for at binde til regionerne promotor eller forstærker i nogle afgørende gener til at påvirke deres udtryk under oligodendrocyte specifikation og differentiering. Men det er udfordrende at identificere DNA bindende protein (eller protein kompleks) interesse for akut renset primære OPCs med et meget begrænset antal celler.
Denne protokol beskriver hvordan man systematisk undersøge den genomisk DNA immunoprecipitated af Olig2 i renset mus OPCs på genom-plan ved hjælp af ChIP-seq teknik. OPCs fra mus hjerner blev akut renset af immunopanning og bruges i en ChIP eksperiment uden spredning in vitro. Et begrænset antal OPCs kan opnås ved immunopanning og er utilstrækkelig til standard ChIP-seq eksperimenter. Heri, er en lav-celle ChIP-seq protokol med så lavt som 20 tusind celler pr. ChIP reaktion for transkriptionsfaktorer beskrevet. Kort sagt, blev tværbundet celler mængden og sonicated af en sonikering enhed til at vride kromatin. Den vredne kromatin blev inkuberet med Olig2 antistof samt protein A-belagte perler for at faelde Olig2 antistof bundet genomisk DNA. Efter eluering fra protein A-belagte perler og omvendt cross-linking, blev genomisk DNA udfældes ved Olig2 antistof renset ved phenol-chloroform ekstraktion. Det resulterende produkt var kvantificeres og udsat for T-hale, primer udglødning skabelon skifter og udvidelse, tilsætning af adaptere og forstærkning, bibliotek størrelse udvælgelse og rensning skridt for ChIP-seq bibliotek konstruktion.
Efter sekvensering, blev kvaliteten af de rå læsninger fra både den prøve, der tilberedes med Olig2 transskription faktor antistof og stikprøven, der analyseret. Lav kvalitet basepar og adapter indeholdende læse fragmenter blev trimmet. Næste, klippede læser blev justeret til musen reference genom. Genomisk regioner, der var betydeligt beriget for ChIP læser, i forhold til kontrolprøve, blev opdaget som toppe. Væsentlig tinder, der repræsenterer potentielle transskription faktor bindingssteder, blev filtreret og visualiseret i en genom-browser.
Navnlig, kan i denne protokol beskrevne metode anvendes bredt for ChIP-FF. i andre transkriptionsfaktorer med enhver celletype i begrænset antal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske forbrug og eksperimenterende protokoller blev udført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af den institutionelle biosikkerhed og dyrs Velfærdsudvalg på University of Texas Health Science Center i Houston.
1. rensning af PDGFRα Positive Oligodendrocyte slægt celler fra mus hjernen (modificeret fra tidligere beskrevne immunopanning protokoller5,6,7)
-
Forberedelse af en immunopanning plade for PDGFRα positive cellemarkeringen og 2 plader for udtømning i endothelial celler og mikroglia.
Bemærk: Vær opmærksom på at petriskåle, men ikke celle kultur retter arbejde for immunopanning eksperiment; Hvis de oprensede celler vil blive brugt til dyrkning, skal immunopanning trin udføres inden for Biosikkerhed kabinet- Coat en 10 cm Petri plade med 30 µL ged anti-rotte IgG i 10 mL af pH 9.5, 50 mM Tris-HCl natten over ved 4 ° C. Agitere plade for at sikre overflader af pladerne er jævnt og helt dækket af belægning løsning.
- Forbered PDGFRα antistof løsning ved at fortynde 40 µL af rotte anti-PDGFRα antistoffer med 12 mL Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) med 0,2% BSA.
- Efter 3 vask af IgG belagt plade med 10 mL Inkubér 1 x DPBS hver, IgG-belagt plade med PDGFRα antistof løsning ved stuetemperatur i 4 timer.
- Vask rotte anti-PDGFRα antistof coated plade 3 gange med 10 mL 1 x DPBS hver. Forsigtigt tilføje DPBS løsning langs sidevæg af pladen og ikke forstyrre de belagte flader.
- Coat 2 nye 15 cm Petri plader for udtømning i endothelial celler og mikroglia med 20 mL af DPBS indeholdende 2,3 µg/mL af Banderiaea simplicifola lektin 1 (BSL-1) i 2 timer.
- Vask BSL-1 overtrukne plader 3 gange med 20 mL 1 x DPBS. Forsigtigt tilføje DPBS løsning langs sidevæg af pladerne og ikke forstyrre de belagte flader.
-
Rensning af PDGFRα positive oligodendrocyte slægt celler er ændret fra tidligere udgivne metoder6 , 7 , 8.
- Dissekere de kortikale væv fra 2 postnatal dag 7 (P7) mus brains ifølge tidligere publicerede protokoller5,6.
- Adskille væv for at generere en enkelt celle suspension med neurale væv dissociation Kit (P) efter detaljerede producentens anvisninger.
- Kort, skåret dissekeret kortikale væv i stykker med en skalpel og underkaste dem Enzymatisk nedbrydning ved 37 ° C. Efter fordøjelse, adskille manuelt stykker med ild-poleret glas Pasteur pipetter i en enkelt celle suspension.
- Centrifugeres encellede suspension ved 300 x g i 10 min. ved stuetemperatur og suspendere celle pellet med 15 mL immunopanning buffer (immunopanning buffer er DPBS med 0,02% BSA og 5 µg/mL insulin).
- Inkuber encellede suspension fra 2 mus hjerner sekventielt på 2 BSL-1 overtrukne plader i 15 min. ved stuetemperatur med blid agitation af plade hvert 5 min for at sikre en bedre udtømning af mikroglia og endotelceller.
- Forsigtigt swirl plade for at indsamle ikke-tilhænger celler i en cellesuspension og inkuberes dem på rotte-PDGFRα antistof-plade for 45 min ved stuetemperatur.
- Efter inkubation af cellesuspension på rotte-PDGFRα antistof-plade, forsigtigt swirl plade for at indsamle cellesuspension, og skyl pladen 8 gange med DPBS til at slippe af med ikke-tilhænger celler. Forsigtigt tilføje vaskeopløsning langs sidevæg af pladen og agitere pladen flere gange for at slippe af ikke-tilhænger celler.
- Frigør cellerne fra rotte-PDGFRα antistof coated plade ved hjælp af en 4 mL af celle detachement løsning behandling i 10 minutter ved 37 ° C. Ryst plade for at løsne vedhængende celler.
- Indsamle de renset OPCs ved centrifugering ved 300 x g ved stuetemperatur, suspendere celle pellet med 2 mL OPC cellekulturmedium og tælle cellerne ved hjælp af trypan blå og en hemocytometer (500 mL cellekulturmedium er DMEM/F12 medium, der indeholder 5 mL penicillin-streptomycin løsning (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL insulin, 0,1% BSA, 20 ng/mL bFGF og 10 ng/mL PDGFRα).
-
Validering af renheden af OPCs efter immunopanning.
- For at evaluere berigelsen af OPCs efter immunopanning, skal du bruge nogle af de oprensede OPCs for RNA ekstraktion med en guanidium kaliumthiocyanat baseret udvinding ifølge producentens anvisninger.
- Udføre qRT-PCR ved hjælp af fluorescerende grønne farvestof master mix for at tjekke for berigelse af PDGFRα udtryk i renset OPCs forhold til dissocierede hjerneceller ifølge tidligere udgivne materialer4.
- Derudover frø nogle renset OPCs ind i den Poly-D-lysin belagt 24 godt plader for immunfarvning med anti-NG2 Chondroitinsulfat proteoglycan (NG2) antistof som tidligere offentliggjort materialer9.
2. lav-celle ChIP forberedelse og ChIP bibliotek opbygning til høj overførselshastighed sekventering
-
Olig2 lav-celle ChIP forberedelse med en kommercielt tilgængelig sonikering system og et kommercielt tilgængelige lav celle nummer ChIP kit (se tabel af materialer) ved at følge de detaljerede standardprocedurer fra producentens anvisninger.
- Efter afmontering fra rotte anti-PDGFRα sætte antistof-plade og cellen tælle med trypan blå og en hemocytometer 20.000 renset OPCs i 1 mL OPC cellekulturmedium for hver ChIP reaktion.
- Tilføje 27 µL af 36,5% formaldehyd kan lave cellesuspension i 10 min ved stuetemperatur.
Forsigtig: Bemærk venligst, at formaldehyd skal anvendes i den kemiske stinkskab af sikkerhedsmæssige årsager. - Stop DNA-protein cross-linking med 50 µL 2,5 M Glycin til 5 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Alle trin skal udføres på is eller i 4 ° C koldt værelse fra dette punkt. - Vaske krydsbundet celle pellets med 1 mL af iskold Hanks Balanced Salt løsning (HBSS) med protease hæmmer cocktail og få celler pelleted af en pre afkølede centrifuge på 300 x g ved 4 ° C.
- Lyse celle pellet i 25 µL komplet lysisbuffer for 5 min på is.
Bemærk: Agitere røret for at suspendere cellerne i lysisbuffer. - Supplere den celle lysate med 75 µL iskold HBSS indeholdende protease hæmmer cocktail og shear kromatin celle lysate af pre afkølet sonikering system med 5 cyklusser af 30 s ON og 30 s OFF program. Altid der sonikeres 6 rør sammen og sørge for balance rør indeholder 100 µL vand.
- Efter klipning, centrifugeres ved 14.000 x g i 10 min. 4 ° C og indsamle supernatanten i en ny tube efter centrifugering.
- Fortyndes 100 µL af afrevne kromatin med den lige saa stort volumen af iskold komplet ChIP Buffer med protease-hæmmer.
- Spare 20 µL af de fortyndede afrevne kromatin som Input kontrolprøve.
Bemærk: Input kontrolprøve er også nødvendig som sammenligning til Olig2 immunoprecipitated prøve at identificere Olig2 antistof immunoprecipitated DNA. - Tilføj 1 µL af kanin anti-olig2 antistof til 180 µL af de fortyndede forskydes kromatin og inkuberes reaktion røret på et roterende hjul på 40 rpm i 16 timer ved 4 ° C.
Bemærk: Udfør dette trin i et koldt værelse. - For hver ChIP reaktion, vaske 11 µL magnetiske protein A-belagte perler med 55 µL perler Wash Buffer og læg perle pellet i 11 µL af perle vaskebuffer efter 2 vasker.
Bemærk: Udfør dette trin i et koldt værelse. - For hver ChIP reaktion, tilføjes 10 µL af pre vasket Protein A-belagte perler ChIP reaktion tube. Udføre dette trin i et koldt rum.
- Inkuber ChIP reaktionen røret ved 4 ° C for en anden 2 h på et roterende hjul.
- Lægge ChIP reaktion røret på den magnetiske rack for 1 min.
Bemærk: Udfør dette trin i et koldt værelse. - Fjern supernatanten og ikke løsne perle pellet.
- Vaske perle pellet med 100 µL for hver af 4 vask buffere henholdsvis i 4 min på en roterende hjul ved 4 ° C.
- Efter vask, tilføje 200 µL af eluering buffer til perle pellet og inkuberes ChIP reaktionen røret ved 65 ° C i 4 timer at vende cross-link protein-DNA.
- Derudover tilføje 180 µL af eluering buffer til 20 µL Input kontrolprøve og inkuberes ved 65 ° C i 4 timer at vende cross-link protein-DNA så godt.
- Tilføje 200 µL 25:24:1 (v/v) blanding af phenol og kloroform isoamyl alkohol til hver ChIP reaktion tube.
- Vortex kraftigt i 1 min og centrifugeres ved 13.000 x g i 15 min. ved stuetemperatur. Overføre den øverste fase til en ny tube.
- Tilføje 40 µL 3 M natriumacetatopløsning, 1.000 µL af 100% ethanol og 2 µL af glykogen fældningsmiddel kovalent kædet sammen med et blåt farvestof til hver ChIP reaktion tube overnatning på-20 ° C.
- Der centrifugeres ved 13.000 x g i 20 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten, vask med 500 µL koldt 70% ethanol og centrifugeres ved 13.000 x g i 20 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten, holde pellet luft tørre i 10 min. og opløse pellet med 50 µL vand.
-
ChIP bibliotek opbygning til høj overførselshastighed sekventering
- Ren og koncentrere ChIP DNA med en oprydning kit efter fabrikantens anvisninger.
- Kvantificere ChIP prøven af en pico-grøn ifølge producentens anvisninger.
- Bruge en ChIP-seq kit til T-hale, replikering og hale, skabelon skifter og udvidelse, tilsætning af adaptere og forstærkning, bibliotek størrelse udvælgelse og rensning efter fabrikantens anvisninger.
- Efter denaturering af dsDNA, dephosphorylate 3'-enden af ssDNA af rejer alkalisk fosfatase og tilføje en poly (T) hale til ssDNA af terminal deoxynucleotidyl transferase.
- Anneal DNA Poly (dA) Primer til skabelonen ssDNA for DNA-replikation og skabelon skifter.
- Efter skabelon skifter, forstærke ChIP-seq bibliotek af PCR med frem og bak primere til indeksering.
- Vælg PCR forstærket ChIP-seq bibliotek med fragmenter spænder fra 250 til 500 bp af Paramagnetiske perler af valgmulighed 2 til dobbelt størrelse udvælgelse.
- Undersøge kvaliteten af den valgte ChIP-seq bibliotek ved hjælp af en mikrofluid chip-kapillær elektroforese enhed.
3. dataanalyse
- Forberede mappestruktur.
- Opret en mappe til at udføre dataanalyse ChIP-seq. Inde i den nyoprettede mappe, opretter seks undermapper med følgende navne: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis og rapporter.
- Forberede data og udføre kvalitetskontrol analyse af rå sekvens data.
- Gå til mappen "raw.files" og hente ChIP-seq-datafiler.
- Kontrollere filnavne. Hvis Sekventeringen blev parret-ende, der bliver 4 filer (to for behandling) og to for input med lignende base navne: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq og PDGFRα_input.read2.fastq. Hvis filnavnene er forskellige, skal du omdøbe dem ved hjælp af kommandoen "mv".
- Gå til mappen "fastqc.output".
- Få kvalitetskontrol målinger fra de rå læsninger ved hjælp af en fastq fil kvalitetskontrol software10. Brug kommandoen i Figur S1A køre kvalitetskontrol særskilt for hver fastq fil. Softwaren vil vise flere kvalitetskontrol målinger i en HTML-fil.
- Åbn HTML-fil, kvalitetskontrol og kontrollere antallet af læser, læse længde, per base sekvens kvalitet, pr sekvens kvalitetsresultater, sekvens GC, sekvens dobbeltarbejde niveauer, adapter kmer indholdet og.
- Trim efterstillede lav kvalitet læsninger og adapter indhold.
- Observere "pr. base sekvens kvalitet" og "Adapter indhold" parceller. Bestemme trimning længde for både hoved og hale i hvert Læs. En passende længde for trimning er hvor den base kvalitet falder til under 30 og der er beviser for adapter indhold.
- Gå til mappen "raw.files".
- Hente og installere en software til trimning lyder11. Brug kommandoen i Figur S1B til trimning både behandling og input separat. Parameteren 'CROP' angiver den resterende Læs længde efter trimning baser fra udgangen og 'HEADCROP' angiver antallet af baser skal fjernes fra starten af at læse.
- Kommandoen trimning omfatter også minimum læse længde kan accepteres efter filtrering i parameteren 'MINLEN'. Hvis læser er mindst 50 bp, brug 35 bp som Læs længde grænse.
- Gå til mappen "fastqc.output".
- Udføre fastq fil kvalitetskontrol analyse efter trimning af læser. Kontroller, at kvalitetskontrol problemer er blevet løst. Brug kommandoen i Figur S1C for at opnå kvalitetskontrol målinger.
- Juster den single-ende eller parret ende ChIP-seq læser til musen reference genom.
- Gå til mappen "bowtie.output" for tilknytningen.
- Download GENCODE mm10 mus reference genom. Omdøbe mm10 mus reference genom som "mm10.fa".
- Hente et Læs mapperen12 og installere det i systemet.
- Oprette et indeksfil af den hentede reference genom ved hjælp af kommandoen i Figur S2A. Seks filer oprettes automatisk: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 og mm10.rev.2.bt2.
- Brug kommandoen i Figur S2B til at udføre justeringen og justere parameter "-p" til antallet af processorkerner system indstillinger. Hvis kører parret end-tilstand, angiver parametre "-1" og "-2" navnene på de klippede fastq filer.
Bemærk: Kortlægning udføres særskilt behandling og input prøverne og output metriske logfiler oprettes for hver prøve. - Downloade en software til at manipulere filer i SAM format13 og installere det i systemet. Konvertere filen justeret SAM i en BAM fil ved hjælp af kommandoen i Figur S2C.
- Få kvalitetskontrol målinger af tilknyttede læser før peak kræver begge parret-end behandling og kontrol prøver.
- En af de vigtigste kvalitetskontrol målinger til adresse er sekventering dybde. Åbn filer "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" og "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" i mappen bowtie.output og kontrollere, at antallet af entydigt kortlagt Læs par i hver prøve er større end 10 mio.
- Gå til mappen "homer.output".
- Downloade en software til motiv opdagelse og næste generation sequencing analyse14 og installere det i systemet.
- Opret en mappe med navnet "tagDir".
- Du kan kontrollere tag clonality, bruge kommandoen afbildet i Figur S3A. Kommandoen "makeTagDirectory" vil generere fire kvalitetskontrol output files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt og tagLengthDistribution.txt.
- Gå til mappen "tagDir".
- Kopier filen "tagCountDistribution.txt" i mappen "rapporter".
- Gå til mappen "rapporter".
- Åbn filen tagCountDistribution.txt ved hjælp af et regnearksprogram og oprette en bar plot af antallet af mærker pr. genomisk holdning. Gemme filen histogram med navnet "tag.clonality.xlsx".
- Installere R programmering sprog15 i systemet.
- Skriv 'R' i terminalen, og tryk på ENTER for at få adgang til R programmeringsmiljø.
- Download en R pakke til behandling af ChIP-seq data16 og installere det ved hjælp af kommandoen afbildet i Figur S3B.
- Bruge scriptet Rasmussen i Figur S3C afbilde strand Kors-sammenhæng.
- Påvisning af toppe ved hjælp af en peak mapper.
- Gå til mappen "macs2.output". Hent og Installer en peak-mapperen17 i dit system.
- Brug funktionen "callpeak" med behandling og BAM filer genereret i trin 3.4.6.
Bemærk: Andre parametre omfatter "-f" for inputfilens format, "-g" for genom størrelse, "-navn" for den base angivelse af alle outputfiler, og "-B" til at gemme fragment pileup i bedgraph format. Den komplette peak ringer kommandoen indgår i Figur S4A. Brug BEDPE for parret-end prøver. - Kontrollere, at peak-mapperen genereret seks filer: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg, og PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Åbne filen PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls at se kaldet toppene, placering, længde, topmødet holdning, pileup og peak berigelse målinger:-log10(pvalue), fold berigelse, og -log10(q-value).
- Filtrere og anmærke kaldet toppe.
- Du bruger filen åbnes i det forrige trin, filtrere resulterende toppe efter fold berigelse, p-værdi og/eller q-værdi. Du kan beslutte passende filtrering tærskler, gøre et histogram plot til at bestemme tæthed af hver metriske. Filtrer de værdier under en valgte grænse at få betydelig toppe.
- Download den mm10 sorte liste (regioner er kendt for at have kunstigt højt signal) og filter ud ChIP-seq toppe, som er inde i nogen af regionerne artefakt.
- Oprette en seng fil med de filtrerede toppe, der indeholder følgende kolonner: kromosom, start, slut, peakID, mock og strand. Udfyld kolonnen mock med en prik "." da det ikke bruges. Angiv alle værdier i kolonnen strand til "+". Gem filen seng som "filtered.peakData2.bed".
- Kopier filen "filtered.peakData2.bed" i mappen "rapporter".
- Gå til mappen "rapporter".
- For at anmærke filtrerede toppe til et specifikt gen region, skal du bruge funktionen "annotatePeaks" med bed fil oprettet i forrige trin. Kommandoen bruges er vist i Figur S5A.
- Åbn filen "filtered.annotatedPeaks.txt" ved hjælp af en statistisk software.
- Filtrer resulterende toppe liggende i en intergenic region i en afstand større end 5 kb fra en kommenteret TSS. Bruge kolonnen "Afstand til TSS" i filen som afstanden til filtrering. Gemme de filtrerede toppe i en excel fil med navnet "5kbup.geneBody.peakData.txt".
- Butik den resulterende filtreret toppe i en bedGraph fil med kolonner: kromosom, start, slut, og -log10(q-value). Navngiv filen "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
- Generere stor kanon filer til browser visualisering.
- Hente og installere en software til genom aritmetiske18.
- Hente et værktøj til konvertering af bedgraph til stor kanon og installere i systemet. Hent filen 'mm10.chrom.sizes'.
- Brug kommandoen i Figur S6A til at generere en stor kanon fil.
- Hent og Installer en genom-browser19 i systemet.
- Åbn genom-browseren og indlæse filen "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" til at visualisere de filtrerede væsentlige tinder og deres placering i forhold til kendte gener.
- Motiv søgning.
- Gå til mappen "motif.analysis".
- Download en de novo motiv scanning og motiv berigelse program og installere det på din system20.
- Download en omfattende motiv-databasen, der indeholder motiver af Olig2.
- Opnå de genomiske sekvenser af 500 bp regioner centreret på betydelige peak topmøder. Gemme sekvenserne som peak.sequences.txt. Brug kommandoen i Figur S7 til at søge efter Olig2 motiver inden for hver af de 500 bp peak regioner.
- Filtrere de resulterende motiver ved hjælp af en passende E-værdi (standard = 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lav-celle ChIP-seq blev udført og bioinformatic analyser blev udført for at undersøge de potentielle vekselvirkninger mellem transcriptional faktor Olig2 med genomisk DNA i akut renset hjernen OPCs. Figur 1 viser en generel arbejdsgang både den eksperimentelle og procedurer for analyse af data. I denne protokol, var postnatal mus hjerner adskilt i en enkelt celle suspension. Efter væv dissociation, blev immunopanning udført for at rense OPCs ved hjælp af PDGFRα antistof. Figur 2 viser betydelig berigelse af PDGFRα, lille udtryk for neuron markør Tuj1 (neuron-specifik klasse III beta-tubulin), astrocyte markør GFAP (glial fibrillære sure protein), mikroglia markør ioniseret calcium bindende adapter molekyle 1 (Iba1), myelinating modne oligodendrocytes markør myelin grundlæggende protein (Mbps) og myelin-oligodendrocyte glycoprotein (Mog) fra renset OPCs som vurderet af RT-qPCR. Derudover angiver immunfarvning resultat, at størstedelen af celler er NG2 positiv som vist i figur 2. Efterfølgende 20 tusind renset OPCs pr. reaktion blev fastsat af formaldehyd og kromatin var forskydes ved hjælp af en sonikering system. Olig2 lav-celle ChIP blev udført og biblioteket blev bygget. Efter ChIP bibliotek forberedelse, blev kvaliteten af den genererede produkt valideret af en mikrofluid chip-kapillær elektroforese enhed. Figur 3 viser et eksempel elektroferogrammet af en Olig2 lav-celle ChIP bibliotek. En klar top af Oligo2 bibliotek produkt spænder fra 250 til 500 bp bør ses efter størrelse udvælgelse af bibliotek PCR produkt. ChIP-seq biblioteker af både den prøve, der tilberedes med Olig2 transskription faktor antistof og stikprøven, der blev udsat for høj overførselshastighed sekvensering til at producere parret-end 50 cyklus sekventering læser. Længere Læs længder vil forbedre kortlægning priser og reducere sandsynligheden for multi kortlægning, på bekostning af sekventering omkostninger. Gode resultater opnås normalt med 50 bp ChIP-seq parret ende sekventering biblioteker.
Efter den indledende kvalitetskontrol vurdering af rå læsninger og trimning af adaptere og efterfølgende lav kvalitet basepar, er kvalitetskontrol parceller afbildet i figur 4. Trimmet læser bør have en base kvalitet højere end 30, ingen adapter sekvenser, og har en lav dobbeltarbejde sats (figur 4B-D). God kvalitet trimmet læser vil øge den overordnede tilpasning sats. Andre parametre såsom GC indhold er også vigtige og bør overvejes for trimning.
Når sekventering prøver er justeret, er det nødvendigt at kontrollere sekventering dybde. Det er kendt, at antallet af kaldet toppe vil stige med en højere sekventering dybde da svage steder vil blive statistisk mere signifikant21. En mætning analyse er forpligtet til at bestemme en tilstrækkelig sekventering dybde for hver specifik transskription faktor bruges, på bekostning af tid og budget. En konsensus sekventering dybde for transskription faktor bindende er blevet foreslået af ENCODE konsortiet om pattedyr prøver: et minimum af 10 millioner entydigt kortlagt læser for hver af mindst to biologiske replikater22. Antallet af entydigt kortlagt læser og den overordnede tilpasning blev beregnet ved den Læs mapper. Et eksempel på god kortlægning målinger er vist i figur 5A. Justeret læser skal knyttes til særskilte genomisk placeringer, der angiver en passende bibliotek kompleksitet, også kaldet tag clonality. ENCODE konsortiet tyder på, at mindst 80% af de 10 millioner af justeret læser skal være tilknyttet forskellige genomisk regioner22. Figur 5B viser en passende tag clonality, hvor mere end 90% af læst er knyttet til kun én genomisk placering. Lav kompleksitet biblioteker generelt opstår, når ikke nok DNA er opnået, og PCR forstærket fragmenter er sekventeret gentagne gange. En lav kompleksitet bibliotek vil give en høj falsk peak opdagelse sats.
Når du bruger parret ende ChIP-seq data, binde fragmenter omkring transskription faktor med en vis afstand af adskillelse. Parret-end sekventering vil give mulighed for en mere præcis estimering af den gennemsnitlige fragment længde giver et bedre skøn over regionerne genomisk hvor mere bindende opstod. Strand korrelation plot skildrer et højdepunkt på berigelse svarende til den fremherskende fragment længde. Som anført i figur 5 c, beregnede fragment længde er 130 bp Læs længden er 50 bp. En ChIP-seq datasæt hvor fragment længden er længere end den Læs længde er vejledende af høj kvalitet16.
Produktionen af peak kald er en liste over genomisk områder tilbøjelige til at være bundet af transskription faktoren (eller dens komplekse). Listen over genomisk regioner eller toppe er inkluderet i en "bed" fil, som kan ses i en genom-browser. For hver top, denne fil indeholder et peak ID, genomisk placeringen af topmødet mellem peak, og FDR som - log10 (q-værdi). Betydeligt beriget toppene er dem med højere fold-berigelse og betydning målinger. Et eksempel på filen peak er vist i figur 6A. Når du har valgt betydelige toppe ved hjælp af brugerdefinerede tærskler, filtrering toppe inden for ENCODES sortliste23og identificere toppe inden for et gen promotor region (5 kb opstrøms og hele genet krop), er en "stor kanon" fil nyttigt til visning toppe i en genom browser. Mest beriget peak regioner har en højere sandsynlighed for transskription faktor bindende. Det er vigtigt at bekræfte peak tilstedeværelse i kendte transskription faktor lovgivningsmæssige områder samt peak fravær i regioner, hvor transskription faktor bindende er usandsynligt. Figur 6B -E viser eksempler på gen regioner med og uden peak berigelse samt deres placering i forhold til ENCODE promotor regioner.
I siliciummangan komplementære metoder til ChIP-seq eksperiment er motiv berigelse analyse og de novo motiv søgning. Da Olig2 binding i OPCs ikke er blevet undersøgt før, Olig2 ChIP-seq afledt toppe i motorneuron stamceller og embryonale stamceller blev brugt til de novo motiv identifikation4,24. Olig2 de novo identificeret motiver blev føjet til den omfattende ENCODE motiv database25 og motiv berigelse analyse blev udført. Høj berigelse af de novo identificeret OLIG2 motiver og kendte transskription faktor (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5, og ASCL1) motiver blev fundet i ChIP-seq toppene af PDGFRα renset celler. En berigelse af 30 de novo identificeret motiver med en E-value < 0,05 blev opdaget. Figur 7 viser de to øverste de novo identificeret motiver af Olig2. Disse to de novo identificeret Olig2 motiver blev fundet i > 60% af ChIP-seq toppe fremstillet af PDGFRα renset celler, desuden til kendte motiver.
Figur 1: oversigt over protokollen arbejdsprocessen. PDGFRα positive OPCs blev isoleret fra postnatal mus hjerner og blev udsat for Olig2 ChIP eksperimentere. De udfældede DNA fragmenter blev brugt til at forberede ChIP bibliotek. Efter vurdering af biblioteket kvalitet, blev prøver brugt til sekvensering. Datasæt blev analyseret, og toppe var identificeres, med angivelse af potentielle Olig2 bindingssteder i OPC renset celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af renheden af immunopanned OPCs af qPCR og immunfarvning. (A) PDGFRα antistof immunopanned celler var seedede og immunfarvning blev udført ved hjælp af OPC lineage markør NG2 antistof. Blå: DAPI, grøn: NG2. Skalalinjen = 10 µm. (B) relative udtryk niveauet af neuron markør Tuj1 i renset OPCs (PDGFRα +) og i dissocierede hjerneceller (blanding) blev evalueret. Tuj1 udtryk i dissocierede hjerneceller blev sat til 1. (C) relative udtryk niveauet af astrocyte markør GFAP i renset OPCs (PDGFRα +) og i dissocierede hjerneceller (blanding) blev evalueret. GFAP udtryk i dissocierede hjerneceller blev sat til 1. (D) relative udtryk niveauet af OPC markør PDGFRα i renset OPCs (PDGFRα +) og i dissocierede hjerneceller (blanding) blev evalueret. PDGFRα udtryk i dissocierede hjerneceller blev sat til 1. (E) relative udtryk niveauet af myelinating modne oligodendrocytes markør Mog i renset OPCs (PDGFRα +) og i dissocierede hjerneceller (blanding) blev evalueret. Mog udtryk i dissocierede hjerneceller blev sat til 1. (F) relative udtryk niveauet af myelinating modne oligodendrocytes markør Mbp i renset OPCs (PDGFRα +) og i dissocierede hjerneceller (blanding) blev evalueret. MBP udtryk i dissocierede hjerneceller blev sat til 1. (G) relative udtryk niveauet af mikroglia markør Iba1 i renset OPCs (PDGFRα +) og i dissocierede hjerne celler (blanding) blev evalueret. Iba1 udtryk i dissocierede hjerneceller blev sat til 1. Data i B-G repræsenterer tredobbelt eksperimenter og fejllinjer angive standard fejl. T-test analyse * P < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: et eksempel elektroferogrammet af et bibliotek fra Olig2 lav-celle ChIP. Efter valg af dobbelt størrelse, blev kvaliteten af Olig2 ChIP bibliotek analyseret af en mikrofluid chip-kapillær elektroforese enhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative kvalitetskontrol resultater for en 50 bp Læs længde lav-celle ChIP-seq prøve. (A) oversigtstabel skildrer det samlede antal læsninger, antallet af dårlig kvalitet læser, sekvens længde og samlede GC indhold. (B) Plot med angivelse af fordelingen af base kvalitetsresultater på forskellige positioner i læser. (C) Plot viser de potentielle adapter indhold på forskellige positioner i læser. (D) Line plot der angiver procent af duplikeres sekvenser. Fleste af læsninger stammer fra sekvenser, som kun forekommer, når inden for biblioteket, derfor angiver en lav dobbeltarbejde sats eller høj bibliotek kompleksitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kvalitetskontrol metrics fremstillet før peak kald: bowtie2 justering metrics, strand Kors-sammenhæng, og tag clonality. (A) justering metrics fremstillet af Læs-mapperen. De vigtigste målinger er antallet af entydigt kortlagt Læs par, angivet som "justeret konkurrenceloven præcis 1 time", og den overordnede tilpasning sats. (B) histogrammet viser tag clonality. Angiver procent af genomisk positioner hvor tags blev fundet. (C) et eksempel på en cross-korrelation plot med angivelse af data af god kvalitet. Røde linjer skildrer den Læs på 50 bps og den fremherskende fragment længde på 130 bps. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: ChIP-seq peak regioner og genom-browser udsigt over betydelige ChIP-seq toppe på forskellige steder, genomisk. (A) eksempel på peak regioner identificeret med peak ringer. (B) betydelige ChIP-seq toppe fundet i selve genet Cspg4, en kendt OPC markørgen. (B) ingen ChIP-seq toppe blev ikke fundet i regionerne promotor eller inden for Mbp gen, en markør for modne oligodendrocytes, (C) Tubb3, neuronal celle markør, eller (D) GFAP, en celle markør af astrocytter gen organer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: højt beriget de novo identificeret motiver af Olig2 fundet i PDGFRα-Olig2 ChIP-seq toppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: forberedelse af ChIP-seq datasæt. (A) register arkitektur definition. (B) beregner rå læse kvalitetskontrol målinger. (C) trimning af læser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S2: justering af læser til reference genom. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S3: kvalitetskontrol af justeret læser, at adresse strand cross-korrelation og bestemme tag clonality. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S4: Peak kald. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S5: Annotation væsentlig tinder. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S6: konvertering af bedGraph-filformatet til stor kanon for peak visualisering i genom browser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S7: De novo motiv søgning og motiv berigelse. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur S8: Flow-chart beskriver Bioinformatik dataanalysen ChIP-seq. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pattedyr gen forordning netværk er meget komplekse. ChIP-seq er en kraftfuld metode til at undersøge genome-wide protein-DNA interaktioner. Denne protokol omfatter Sådan udføres Olig2 ChIP-seq ved hjælp af et lavt antal renset OPCs fra mus hjerner (så lavt som 20 tusind celler pr. reaktion). Det første vigtige skridt for denne protokol er rensning af OPCs fra mus hjerner af immunopanning med PDGFRα antistof. Til positiv udvælgelse af OPCs med PDGFRα belagt plader belagt OPCs ofte svagt binder sig til PDGFRα plader. Selv efter flere vask er der stadig nogle ikke-tilhænger celler til venstre. Det er vigtigt at kontrollere ikke-tilhænger celler efter hver D-PBS vaske under et mikroskop. Hvis flere D-PBS vask ikke hjælper til at reducere antallet af ikke-tilhænger celler, er det tid at indsamle de markerede celler, da overskydende vasker kan løsne vedlagte OPCs og reducere udbyttet af oprensede celler. Imidlertid kan utilstrækkelige vasker resultere i en forurening af andre hjerne celler typer. Derfor, hver gang efter isoleret, det er nødvendigt at evaluere renhed af de isolerede OPCs ved immunfarvning med OPCs markør NG2 qPCR for udtryk for kendte celle-type specifikke gener såsom Tuj1 til neuroner, GFAP for astrocytter, PDGFRα for OPCs, Iba1 for mikroglia, og MOG og MBP for myelinating modne oligodendrocytes. Som vist i figur 2, angiver immunfarvning resultat, at fleste af de oprensede celler er positive for NG2 farvning. Derudover nogle klassiske celletype specifikke markører for neuroner, astrocytter, mikroglia og myelinating modne oligodendrocytes udstille målbart eller lave ekstremt udtryk niveauer i renset OPCs sammenlignet med urenset hjerne celle blanding. PDGFRα udstiller høj udtryk niveau i renset OPCs sammenlignet med urenset hjerne celle blanding. Ved hjælp af immunopanning metoden, mikroglia er stærkt reduceret i de renset OPCs i forhold til urenset hjerne celle blanding, men en lille mængde af forurening der findes. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere udgivelser af andre7,8,26. Sammenlignet med tidligere publicerede rapporter, bruges et kommercielt tilgængeligt kit desuden i denne protokol for den standardiserede, effektivt og praktisk dissociation af hjernens væv i encellede suspensioner.
Efter cross-linking af renset OPCs, de krydsrefererede blodlegemerne vaskes med iskold HBSS løsning og de resterende ChIP trin skal udføres ved 4 ° C, kan ellers antistoffet udfældes genomisk DNA korrekt.
Det næste vigtige skridt i denne protokol er biblioteket forberedelse. PCR-amplifikation af ChIP materiale blev brugt til biblioteket konstruktion. Antallet af PCR cyklusser for biblioteket forberedelse afhænger af mængden af start DNA. Et godt bibliotek forberedelse kræver nøjagtig kvantificering af input DNA beløb. For mange eller for få PCR cyklusser kan påvirke bibliotek koncentration samt kompleksitet, fører til PCR artefakter.
Det er udfordrende for at konstruere ChIP-seq bibliotek, når du bruger et begrænset antal celler til immunoprecipitation27. Den tidligere anvendte standard ChIP protokollen kræver 10 ng af immunoprecipitated DNA for ChIP-seq bibliotek forberedelse1,28. Dog protokollen beskrevet her normalt genererer 2 ng af immunoprecipitated DNA af Olig2 antistof fra 20.000 OPCs. DNA er bruges til at forberede ChIP-seq bibliotek af en trinvis adapter tilføjelse metode, som muliggør øget følsomhed giver picogram af immunoprecipitated DNA skal forstærkes. Ved at kombinere kommercielle kits, giver denne protokol en praktisk løsning for at udføre ChIP-seq for transcriptional faktorer baseret på et lille antal celler.
Vigtigere, er lav cellen ChIP-seq protokollen beskrevet gældende for ChIP-FF. i andre transkriptionsfaktorer i primærelementer eller sjældne cellepopulationer samt. Antistoffer bruges i denne protokol skal valideres eksperimentelt for at være specifik IP forsøget først. Ikke-specifik binding af antistoffer vil føre til dårlige resultater. Desuden er det at foretrække at udføre dette lav celle ChIP-seq eksperiment i celler med en høj udtryk niveau af transkriptionsfaktor af interesse.
Til analyse af data, kan det være udfordrende at beslutte, hvilke værdier der skal bruge som filtrering cut-offs efter peak kald. Afhængigt af formålet med analysen, kan strengere eller mere afslappet parametre anvendes. Generelt anvendes en kombination af fold-berigelse og enten p-værdi eller FDR. Hvis nogle bindingssteder af transkriptionsfaktor under undersøgelse var tidligere kendt, kan dette hjælpe med til at bestemme de filtrering tærskler. Transskription faktor bindende site databaser stammer fra offentligt tilgængelige ChIP-seq eksperimenter i forskellige cellelinier og betingelserne er blevet kompileret29,30. Man kunne søge efter et gen og tjekke hvis transskription faktor bindingssteder har fundet tidligere. Det er dog vigtigt at være opmærksom på, at transskription faktor bindingssteder varierer afhængigt af celletyper og betingelser.
I siliciummangan komplementære metoder til ChIP-seq eksperiment er motiv berigelse analyse og de novo motiv søgning ved hjælp af MEME-ChIP20 eller lignende programmer. Motiv search kræver en omfattende kendt og de novo afledt motiv database som ENCODE motiver25 eller Hocomoco database31. Hocomoco er en database over motiver opdaget fra offentligt tilgængelige menneskelige og mus ChIP-seq eksperimenter. Hvis motiver for den analyserede protein er ukendt, kunne de novo motiv søgning afsløre gentagne sekvens mønstre i en betydelig brøkdel af toppene som nye motiver. Den potentielle kombinatorisk handling af transkriptionsfaktorer kan blive afsløret, når motiver af andre transkriptionsfaktorer er også fundet at være beriget med de resulterende toppe.
Beriget peak regioner kan valideres eksperimentelt ved hjælp af kromatin mutant eller knockout celler som kontrol. Udfører ChIP-seq bruger celler ikke udtrykker transskription faktor der bruges til at identificere falske positive toppe, også betegnet som "phantom toppe"32. Falske positiver bør være filtreret ud.
Det er også interessant at sammenligne de resulterende ChIP-seq toppe med transkriptom data. PDGFRα-Olig2 ChIP-seq toppe blev sammenlignet med udtrykket af gener i OPCs fra en tidligere publikation18. Denne strategi kan være begrænset, da udtrykte gener i OPCs kan kontrolleres af mekanismer end Olig2 transskription faktor bindende. Derudover Olig2 transskription faktor kan bindes til et gen regulerende region men genet kan have lav gen expression niveau på grund af mulige hæmmende mekanismer eller manglende Co faktorer nødvendige for gen transskription.
ChIP-seq er en metode, der bruges til at identificere genome-wide DNA bindingssteder transkriptionsfaktorer og andre proteiner. Men gennem analyse af samtidig forekomst af transkriptionsfaktorer, forskerne fandt, at transkriptionsfaktorer tendens til at associere med andre proteiner danner samregulerende moduler33. Det betyder nogle bindinger mellem transcriptional faktorer og genomisk DNA afslørede af ChIP-seq er indirekte og bro af andre proteiner. For at opnå mere meningsfulde resultater bør forskere derfor overveje at studere mere end en transkriptionsfaktor samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD og YY blev støttet af tilskud fra de nationale institutter for sundhed R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; den Staman Ogilvie fond-Hermann Mindefond; UTHealth HJERNEN initiativ og CTSA UL1 TR000371; og et tilskud fra University of Texas System neurovidenskab og Neurotechnology Research Institute (Grant #362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
