Summary
Hier presenteren we een protocol dat is ontworpen voor het analyseren van de genoom-brede binding van de transcriptiefactor Oligodendrocyt 2 (Olig2) in acuut gezuiverde oligodendrocyte voorloper hersencellen (OPCs) door het uitvoeren van lage-cel chromatine immunoprecipitation (ChIP) , bibliotheek voorbereiding, high-throughput sequencing en bioinformatic data-analyse.
Abstract
Bij zoogdiercellen wordt gene transcriptie geregeld in een cel type specifieke wijze door de interacties van transcriptionele factoren met genomic DNA. Geslacht-specifieke transcriptiefactoren worden beschouwd als spelen een essentiële rol in cel specificatie en differentiatie tijdens de ontwikkeling. ChIP in combinatie met high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) wordt veel gebruikt voor het analyseren van genoom-brede bandplaatsen van transcriptiefactoren (of de bijbehorende complex) aan de genomic DNA. Een groot aantal cellen zijn echter vereist voor een standaard ChIP reactie, waardoor het moeilijk is om te studeren het beperkte aantal geïsoleerde primaire cellen of zeldzame cel populaties. Om te begrijpen van het reguleringsmechanisme van Oligodendrocyt geslacht-specifieke transcriptie factor Olig2 in acuut gezuiverde muis OPCs, een gedetailleerde methode met behulp van ChIP-seq te identificeren van het genoom-brede bandplaatsen of Olig2 (Olig2 complex) wordt weergegeven. Ten eerste, het protocol wordt uitgelegd hoe te zuiveren van de bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor-alpha (PDGFRα) positieve OPCs vanuit muis brains. Vervolgens Olig2 antilichaam gemedieerde ChIP en bibliotheek bouw worden uitgevoerd. Het laatste deel beschrijft de bioinformatic software en procedures voor de Olig2 ChIP-seq analyse. Kortom meldt dit papier een methode voor het analyseren van het genoom-brede bindingen van transcriptionele factor Olig2 in acuut gezuiverde hersenen OPCs.
Introduction
Het is belangrijk om te studeren het eiwit (of eiwit complex) DNA bindingen en de epigenetische merken transcriptionele regulerende netwerken die betrokken zijn bij verschillende biologische processen te bouwen. In het bijzonder kunnen de bindingen van transcriptiefactoren aan de genomic DNA spelen een belangrijke rol in de genregulatie, de celdifferentiatie en het weefsel ontwikkeling. Een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de transcriptionele verordening en Epigenetische mechanismen is chromatine immunoprecipitation (ChIP). Als gevolg van de snelle vooruitgang in de technologie van de volgende generatie sequencing, wordt ChIP in combinatie met high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) gebruikt voor analyses van eiwit-DNA bindingen en epigenetische merken1. Een standaardprotocol voor ChIP-seq vereist echter ongeveer 20 miljoen cellen per reactie, waardoor de toepassing van deze techniek moeilijk wanneer het celaantal beperkt, zoals geïsoleerde primaire cellen en zeldzame cel populaties is.
Oligodendrocyt lineage cellen met inbegrip van oligodendrocyte voorlopercellen (OPCs) en oligodendrocyten zijn wijd verspreid over de hersenen en zijn essentieel voor de ontwikkeling en de functie van de hersenen. Als een soort van voorlopercellen zijn OPCs geschikt voor zowel zelf-vernieuwing en differentiatie. OPCs niet alleen dienen als progenitoren voor oligodendrocyten maar ook een belangrijke rol spelen in de verspreiding van neuronale signalering door te communiceren met andere soorten hersenen cellen2. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat Oligodendrocyt ontwikkeling wordt gereguleerd door geslacht-specifieke transcriptiefactoren zoals Olig2 en Sox103,4. Deze transcriptiefactoren bleken te binden aan de promotor of versterker regio's van sommige cruciale genen te beïnvloeden hun uitdrukking tijdens Oligodendrocyt specificatie en differentiatie. Echter, het is uitdagend om te identificeren van DNA-bindende eiwit (of eiwit complex) belangstelling voor acuut gezuiverde primaire OPCs met een zeer beperkt aantal cellen.
Dit protocol wordt beschreven hoe aan de genomic DNA-immunoprecipitated door Olig2 in gezuiverde muis OPCs op genoom-brede schaal met behulp van ChIP-seq techniek systematisch te onderzoeken. OPCs van muis hersenen waren acuut gezuiverd door immunopanning en gebruikt een ChIP experiment zonder proliferatie in vitro. Een beperkt aantal OPCs kan worden verkregen door immunopanning en voor de standaard ChIP-seq experimenten ontoereikend is. Hierin wordt een lage-cel ChIP-seq protocol met zo laag als 20 duizend cellen per ChIP reactie voor transcriptiefactoren beschreven. Kortom, waren kruislings gekoppelde cellen lysed en sonicated door een ultrasoonapparaat apparaat wilt schuintrekken van de chromatine. De sheared chromatine was geïncubeerd met Olig2 antilichaam evenals eiwit A beklede kralen om te precipiteren Olig2 antilichaam gebonden genomic DNA. Na de elutie van eiwit A beklede kralen en omgekeerde dwarsbinding, werd genomic DNA neergeslagen door Olig2 antilichaam gezuiverd door fenol-chloroform extractie. Het resulterende product werd gekwantificeerd en onderworpen aan T-tailing, primer gloeien sjabloon schakelen en uitbreiding, de toevoeging van adapters en versterking, bibliotheek maat keuze en zuivering stappen voor ChIP-seq bibliotheek bouw.
Na sequencing, was de kwaliteit van de rauwe leesbewerkingen van zowel het monster bereid met Olig2 transcriptie factor antilichaam en de controlemonster geanalyseerd. Lage kwaliteit basenparen en adapter met lezen fragmenten werden bijgesneden. Volgende, bijgesneden leest waren afgestemd op de muis referentie genoom. De genomische regio's die aanzienlijk verrijkt waren voor ChIP leest, in vergelijking met de controlemonster, werden ontdekt als pieken. Belangrijke pieken, die potentiële transcriptie factor bandplaatsen, werden gefilterd en gevisualiseerd in een genoom-browser.
Met name kan de in dit protocol beschreven methode in grote lijnen worden gebruikt voor ChIP-seq van andere transcriptiefactoren met elk celtype van beperkte oplage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke gebruik en experimentele protocollen werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Commissie voor institutionele bioveiligheid en dierenwelzijn Comité bij de University of Texas Health Science Center op Houston.
1. de zuivering van PDGFRα positieve Oligodendrocyt Lineage cellen uit de hersenen van de muis (gewijzigd van bovenstaande immunopanning protocollen5,6,7)
-
Voorbereiding van een plaat van immunopanning voor PDGFRα positieve celselectie en 2 platen voor de uitputting van de endotheliale cellen en microglia.
Opmerking: Houd er rekening mee dat de petrischaaltjes maar niet cel cultuur gerechten voor immunopanning experiment werken; Als de gezuiverde cellen wordt gebruikt voor het kweken, moeten immunopanning stappen worden uitgevoerd in het biosafety kabinet- Jas van een 10 cm Petri plaat met 30 µL geit anti-rat IgG in 10 mL pH 9.5, 50 mM Tris-HCl's nachts bij 4 ° C. De plaat om ervoor te zorgen dat de oppervlakken van de platen worden gelijkmatig en volledig gedekt door de coating oplossing doorroeren.
- PDGFRα antilichaam oplossing bereid door verdunnen 40 µL van rat anti-PDGFRα antistof met 12 mL Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) met 0,2% BSA.
- Na 3 wasbeurten van IgG beklede plaat met 10 mL Incubeer 1 x DPBS elk, IgG beklede plaat met PDGFRα antilichaam oplossing bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Wassen de rat anti-PDGFRα antistof gecoat plaat 3 keer met 10 mL elke 1 x DPBS. Zachtjes toevoegen DPBS oplossing langs de zijwand van de plaat en de gecoate oppervlakken niet storen.
- Jas 2 nieuwe 15 cm Petri platen voor uitputting van endotheliale cellen en microglia met 20 mL DPBS met 2.3 µg/mL van Banderiaea simplicifolia lectine 1 (BSL-1) voor 2 h.
- Wash die de BSL-1 gecoate platen 3 keer met 20 mL 1 x DPBS. Zachtjes toevoegen DPBS oplossing langs de zijwand van de platen en de gecoate oppervlakken niet storen.
-
Zuivering van PDGFRα positieve Oligodendrocyt lineage cellen is aangepast ten opzichte van de eerder gepubliceerde methoden6 , 7 , 8.
- Ontleden van de corticale weefsels van 2 postnatale dag 7 (P7) muis hersenen volgens eerder gepubliceerde protocollen5,6.
- De weefsels voor het genereren van een eencellige ophanging met zenuwweefsel dissociatie Kit (P) volgens instructies van de fabrikant gedetailleerde distantiëren.
- Kortom, de ontleed corticale weefsels snij in stukjes met een scalpel en onderwerpen aan enzymatische spijsvertering bij 37 ° C. Na vertering, moet u handmatig de stukken met Fire gepolijst glas die Pasteur pipettes in de schorsing van een eencellige distantiëren.
- Centrifugeer de eencellige schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en schorten cel pellet met 15 mL immunopanning buffer (buffer van de immunopanning is DPBS met 0,02% BSA en 5 µg Mn/mL insuline).
- Incubeer de eencellige schorsing van 2 muis hersenen opeenvolgend op 2 BSL-1 gecoate platen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie van de plaat elke 5 minuten om te zorgen voor een betere uitputting van microglia en endotheliale cellen.
- Zachtjes swirl de plaat voor het verzamelen van de niet-aanhanger cellen in de celsuspensie en hen op de rat-PDGFRα antilichaam beklede plaat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Na de incubatie van de celsuspensie op de rat-PDGFRα antilichaam beklede plaat, zachtjes de plaat voor het verzamelen van de celsuspensie wervelen, en spoel de plaat 8 keer met DPBS om zich te ontdoen van niet-aanhanger cellen. Zachtjes toevoegen wassen oplossing langs de zijwand van de plaat en de plaat doorroeren meerdere malen om zich te ontdoen van niet-aanhanger cellen.
- Loskoppelen van de cellen van de rat-PDGFRα antilichaam beklede plaat met behulp van een 4 mL van cel detachement oplossing behandeling gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Schud de plaat om te verjagen Adherente cellen.
- De gezuiverde OPCs verzamelen door centrifugeren bij 300 x g bij kamertemperatuur, schorten de cel pellet met 2 mL OPC cel kweekmedium en cellen tellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer (500 mL cel kweekmedium is DMEM/F12 medium met 5 mL penicilline-streptomycine oplossing (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL insuline, 0,1% BSA, 20 ng/mL bFGF en 10 ng/mL PDGFRα).
-
Validatie van de zuiverheid van OPCs na immunopanning.
- Om te evalueren van de verrijking van OPCs na immunopanning, gebruiken een aantal van de gezuiverde OPCs voor RNA extractie met een guanidium kaliumthiocyanaat gebaseerd extractie volgens de instructies van de fabrikant.
- Met fluorescente groene kleurstof master mix om te controleren of de verrijking van PDGFRα expressie in gezuiverde OPCs ten opzichte van gedissocieerde hersencellen volgens de eerder gepubliceerde materialen4uitvoeren qRT-PCR.
- Bovendien, sommige gezuiverde OPCs in de Poly-D-Lysine gecoat zaad 24 platen goed voor immunokleuring met anti-NG2 chondroitin sulfaat Proteoglycaan (NG2) antilichaam zoals eerder gepubliceerd materialen9.
2. laag-cel ChIP voorbereiding en ChIP bibliotheek constructie voor High-Throughput Sequencing
-
Olig2 Low-cel ChIP voorbereiding met een commercieel beschikbare ultrasoonapparaat systeem en een commercieel beschikbare lage celaantal ChIP kit (zie tabel van materialen) door de gedetailleerde standaardprocedures te volgen van de instructies van de fabrikant.
- Na het loskoppelen van de anti-PDGFRα van de rat ter antilichaam beklede plaat en de cel tellen met trypan blauw en een hemocytometer 20.000 gezuiverde OPCs OPC 1 mL kweekmedium cel voor elke ChIP reactie.
- Voeg 27 µL van 36,5% formaldehyde celsuspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur vast te stellen.
Let op: Houd er rekening mee dat er in de chemische zuurkast formaldehyde moet worden gebruikt om veiligheidsredenen. - Stoppen met DNA-proteïne dwarsbinding met 50 µL 2,5 M glycine gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs of in de koude kamer 4 ° C van dit punt. - Wassen van de kruiselings gekoppelde cel pellets met 1 mL van ijskoude Hanks evenwichtige zout oplossing (HBSS) met proteaseinhibitor cocktail en krijgen cellen Ingehuld door een vooraf gekoelde centrifuge bij 300 x g bij 4 ° C.
- Lyse van de cel pellet in 25 µL volledige Lysis Buffer voor 5 min op ijs.
Opmerking: Agitate de buis op te schorten de cellen in de Lysis-buffermengsel. - Een aanvulling op de cel lysate met 75 µL ijskoude HBSS proteaseinhibitor cocktail en schuintrekken met de chromatine van cel lysate door vooraf gekoeld ultrasoonapparaat systeem met 5 cycli van 30 s ON en 30 s OFF programma. Altijd Bewerk ultrasone trillingen samen ten 6 buizen en ervoor te zorgen dat de balans buizen 100 µL water bevatten.
- Na het scheren, centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 min 4 ° C en verzamelen van de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis na het centrifugeren.
- Verdun 100 µL van de sheared chromatine met de gelijke hoeveelheid ijskoude volledige ChIP Buffer met de proteaseinhibitor.
- Sla 20 µL van de verdunde sheared chromatine als Input controlemonster.
Nota: Input controlemonster is ook vereist als de vergelijking met Olig2 immunoprecipitated monster te identificeren Olig2 antilichaam immunoprecipitated DNA. - Voeg 1 µL van konijn anti-olig2 antilichaam aan 180 µL van de verdunde chromatine geschoren en Incubeer de reactiebuis op een draaiend wiel bij 40 omwentelingen per minuut gedurende 16 uur bij 4 ° C.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in een koude kamer. - Voor elke ChIP reactie, wassen 11 µL magnetische eiwit A beklede kralen met 55 µL kralen was Buffer en zet de kraal pellet in 11 µL van parel was buffer na 2 wasbeurten.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in een koude kamer. - Voor elke ChIP reactie, voeg toe 10 µL van vooraf gewassen eiwit A beklede parels aan ChIP reactiebuis. Voer deze stap in een koude kamer.
- Incubeer de reactiebuis van de ChIP bij 4 ° C voor een ander 2 h op een roterend wiel.
- Zet de reactiebuis ChIP op de magnetische rek voor 1 min.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in een koude kamer. - Verwijder het supernatant en niet verjagen de kraal-pellet.
- Wassen van de kraal pellet met 100 µL voor elk van de 4 wassen buffers respectievelijk voor 4 min op een draaiend wiel bij 4 ° C.
- Na wasbeurten, 200 µL van elutie buffer toevoegen aan de kraal pellet en Incubeer de reactiebuis van de ChIP bij 65 ° C gedurende 4 uur om te keren kruislings gekoppelde eiwit-DNA.
- Bovendien 180 µL van elutie buffer toevoegen aan 20 µL Input controlemonster en Incubeer bij 65 ° C gedurende 4 uur om te keren kruislings gekoppelde eiwit-DNA ook.
- Voeg toe 200 µL 25:24:1 (v/v) mengsel van fenol en chloroform isoamyl alcohol aan elke ChIP reactiebuis.
- Vortex krachtig gedurende 1 minuut en centrifuge op 13.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. De bovenste fase overbrengen in een nieuwe buis.
- Voeg 40 µL 3 M natrium acetaat oplossing, 1.000 µL van 100% ethanol en 2 µL van glycogeen precipitant covalent gekoppeld aan een blauwe kleurstof aan elke ChIP reactiebuis 's nachts bij-20 ° C.
- Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant, wassen met 500 µL koude 70% ethanol en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en houd de pellet lucht droog voor 10 min los van de pellet met 50 µL water.
-
ChIP bibliotheek constructie voor hoge gegevensdoorvoer sequencing
- Schoon en concentreren van het DNA van de ChIP met een schoonmaak kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Het monster van de ChIP door een pico-green volgens de instructies van de fabrikant te kwantificeren.
- Gebruik een ChIP-seq-kit voor T-tailing, replicatie en tailing, sjabloon schakelen en de uitbreiding, de toevoeging van adapters en versterking, bibliotheek maat keuze en zuivering volgens de instructies van de fabrikant.
- Na denaturatie van dsDNA, dephosphorylate van 3' eind van ssDNA door de alkalische fosfatase garnalen en een staart poly (T) aan de ssDNA toevoegen door terminal deoxynucleotidyl transferase.
- Ontharden de DNA Poly (dA) Primer aan de sjabloon van de ssDNA voor de DNA-replicatie en het wijzigen van de sjabloon.
- Na sjabloon schakelen, versterken de bibliotheek van de ChIP-seq door PCR met de voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor indexering.
- Selecteer de PCR ChIP-seq bibliotheek met fragmenten versterkt, variërend van 250 tot 500 bp door paramagnetisch kralen door optie 2 voor dubbele grootte selectie.
- De kwaliteit van de geselecteerde ChIP-seq-bibliotheek met behulp van een microfluidic chip-capillaire elektroforese apparaat onderzoeken.
3. de gegevensanalyse
- Mapstructuur voor te bereiden.
- Maak een map voor het uitvoeren van de ChIP-seq data-analyse. In de zojuist gemaakte map, zes submappen te maken met de volgende namen: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis en rapporten.
- Gegevens voorbereiden en uitvoeren van kwaliteitscontrole analyse van ruwe sequencedata.
- Verplaatsen naar de map "raw.files" en download de ChIP-seq-gegevensbestanden.
- Controleer of de bestandsnamen. Als de volgorde gekoppeld-einde was, zal er 4 bestanden (twee voor behandeling) en twee voor invoer met vergelijkbare basis namen: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq en PDGFRα_input.read2.fastq. De bestandsnamen zijn verschillend, deze namen wijzigen met de opdracht "mv".
- Verplaatsen naar de map "fastqc.output".
- Kwaliteitscontrole statistieken verkrijgen bij de ruwe leest met behulp van een fastq bestand kwaliteitscontrole software10. De opdracht gebruiken in Figuur S1A te voeren van de kwaliteitscontrole proces afzonderlijk voor elk fastq-bestand. De software zal diverse kwaliteitscontrole maatstelsels in een HTML-bestand weergeven.
- Open het HTML-bestand voor kwaliteitscontrole en controleer of het aantal leest, lees lengte, per basis volgorde kwaliteit, per reeks kwaliteitsscores, reeks GC inhoud, volgorde dubbel niveaus, adapter inhoud en kmer inhoud.
- Trim achterstand leest van lage kwaliteit en inhoud van de adapter.
- Observeer de "Per basis volgorde kwaliteit" en "Inhoud Adapter" percelen. Bepalen van de lengte van de trimmen voor zowel de kop en de staart van elke lezen. Een voldoende lengte voor trimmen is waar de basis kwaliteit lager dan 30 en er is bewijs van adapter inhoud.
- Verplaatsen naar de map "raw.files".
- Downloaden en installeren van een software voor het trimmen leest11. Gebruik de opdracht in de Figuur S1B voor het trimmen van zowel de behandeling als de input afzonderlijk. Met de parameter 'BIJSNIJDEN' geeft de resterende Lees lengte nadat trimmen van het einde onderstellen en 'HEADCROP' geeft u het aantal basissen worden geëlimineerd uit het begin van het lezen.
- De trimmen opdracht omvat ook de minimale lengte om te worden aanvaard na filtering in de parameter 'MINLEN' lezen. Als leest minstens 50 bp, gebruik 35 bp als drempel Lees lengte.
- Verplaatsen naar de map "fastqc.output".
- De fastq bestand kwaliteitscontrole analyses uit te voeren na het bijsnijden de leest. Controleer of dat de kwaliteitscontrole problemen zijn opgelost. Gebruik de opdracht in de Figuur S1C te verkrijgen van de statistieken van de kwaliteitscontrole.
- De single- of gekoppeld-kant ChIP-seq leest aan het genoom van de verwijzing muis uitlijnen
- Verplaatsen naar de map "bowtie.output" voor de toewijzing.
- Download het GENCODE mm10 muis referentie genoom. Wijzig de naam van het genoom mm10 muis verwijzing als "mm10.fa".
- Een lees mapper12 downloaden en installeer het in het systeem.
- Maak een indexbestand van het genoom van de gedownloade verwijzing met behulp van de opdracht in de Figuur S2A. Zes bestanden worden automatisch gemaakt: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 en mm10.rev.2.bt2.
- De opdracht in de Figuur S2B uit te voeren van de uitlijning en het aanpassen van de parameter "-p" aan het aantal verwerkingskernen volgens uw systeeminstellingen. Als gekoppeld-einde gebruikersstand, geven parameters "-1" en "-2" de namen van de bijgesneden fastq bestanden.
Opmerking: Mapping wordt afzonderlijk uitgevoerd voor de monsters behandeling en input en output metrische logboekbestanden worden gemaakt voor elk monster. - Een software voor het manipuleren van bestanden in SAM formaat13 downloaden en installeren op het systeem. Het uitgelijnde SAM-bestand converteren naar een BAM-bestand met behulp van de opdracht in de Figuur S2C.
- Kwaliteitscontrole statistieken van toegewezen leest voordat piek aangedrongen wordt op beide gekoppeld-einde behandeling en controle monsters te verkrijgen.
- Een van de belangrijkste statistieken van de kwaliteitscontrole naar adres is de diepte van de sequencing. Open de bestanden "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" en "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" in de bowtie.output directory en controleer dat het aantal unieke toegewezen Lees paren in elk monster groter dan 10 miljoen is.
- Verplaatsen naar de map "homer.output".
- Een software voor motif ontdekking en volgende-generatie sequencing analyse14 downloaden en installeren op het systeem.
- Maak een map met de naam "tagDir".
- Om te controleren of de tag tentiemechanismen, gebruik van de opdracht afgebeeld in Figuur S3A. De opdracht "makeTagDirectory" zal genereren vier kwaliteitscontrole uitvoer files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt en tagLengthDistribution.txt.
- Verplaatsen naar de map "tagDir".
- Kopieer het bestand "tagCountDistribution.txt" naar de directory van de 'rapporten'.
- Verplaatsen naar de map 'rapporten'.
- Open het bestand van de tagCountDistribution.txt met behulp van een spreadsheetprogramma en maak een bar plot van het aantal labels per genomic positie. Sla het histogram-bestand met de naam "tag.clonality.xlsx".
- Installeer R programming language15 in het systeem.
- In de terminal, typ 'R' en druk op ENTER om de toegang van de R-programmeeromgeving.
- Een R-pakket voor de verwerking van ChIP-seq gegevens16 downloaden en installeren met behulp van de opdracht die is afgebeeld in Figuur S3B.
- De R-script gebruiken in Figuur S3C uitzetten in de strand cross-correlatie.
- Detectie van pieken met behulp van een piek-mapper.
- Verplaatsen naar de map "macs2.output". Download en installeer een piek mapper17 in uw systeem.
- Gebruik de functie "callpeak" met de behandeling en controle van BAM bestanden die zijn gegenereerd in stap 3.4.6.
Opmerking: Andere parameters omvatten "-f" voor invoerbestand formaat, "-g" voor de grootte van het genoom, "-naam" voor het aanduiden van de basisnaam van alle uitvoerbestanden, en "-B" voor het opslaan van het fragment pileup in bedgraph formaat. De volledige piek aanroepen van opdracht is opgenomen in Figuur S4A. Gebruik BEDPE voor gekoppeld-einde monsters. - Controleer of de piek mapper zes bestanden gegenereerd: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg en PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
- Open bestand PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls te bekijken, de zogenaamde pieken, locatie, lengte, top positie, pileup en de piek verrijking statistieken:-log10(pvalue), vouw verrijking, en -log10(q-value).
- Filteren en annoteren genaamd pieken.
- Met behulp van het bestand geopend in de vorige stap, filteren resulterende pieken volgens de vouw verrijking, de p-waarde en/of de q-waarde. Om te besluiten voldoende filtering drempels, maken een histogram complot om te bepalen van de dichtheid van elke metriek. Waarden onder een geselecteerde drempel te verkrijgen van belangrijke pieken uitfilteren.
- Download de mm10 blacklist (regio's staan bekend om kunstmatig hoog signaal) en filter uit het ChIP-seq pieken die zijn binnen om het even welk van die regio's van artefact.
- Maak een bed-bestand met de gefilterde pieken met de volgende kolommen: chromosoom, begin, einde, peakID, mock en strand. De mock kolom vullen met een stip "." omdat het niet is gebruikt. In de kolom onderdeel alle waarden ingesteld op "+". De bed-bestand opslaan als "filtered.peakData2.bed".
- Kopieer het "filtered.peakData2.bed" bestand in de map 'rapporten'.
- Verplaatsen naar de map 'rapporten'.
- Gebruik de functie "annotatePeaks" met het bed-bestand gemaakt in de vorige stap om te annoteren gefilterde pieken naar een specifiek gen-regio. De opdracht gebruikt wordt weergegeven in Figuur S5A.
- Open het "filtered.annotatedPeaks.txt"-bestand met behulp van een statistische software.
- Resulterende pieken liggen in een intergenic gebied op een afstand groter dan 5 kb van een geannoteerde TSS filteren. Gebruik de "Afstand-TSS" kolom in het bestand als de afstand voor het filteren. Slaat de gefilterde pieken in een excel-bestand met de naam "5kbup.geneBody.peakData.txt".
- Winkel de resulterende gefilterd pieken in een bedGraph bestand met kolommen: chromosoom, begin, einde, en -log10(q-value). Geef het bestand "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
- Genereer kopstuk bestanden voor visualisatie van de browser.
- Downloaden en installeren van een software voor genoom rekenkundige18.
- Een tool voor het converteren van bedgraph naar kopstuk downloaden en installeren in het systeem. Download het bestand 'mm10.chrom.sizes'.
- Gebruik de opdracht in de Figuur S6A een kopstuk-bestand genereren.
- Download en installeer een genoom browser19 in het systeem.
- Open de browser genoom en laad het bestand "5kbup.geneBody.peakData.bigwig" te visualiseren de gefilterde belangrijke toppen en hun ligging ten opzichte van bekende genen.
- Motief zoeken.
- Verplaatsen naar de map "motif.analysis".
- Download een DOVO motief scannen en motief verrijking programma en installeer het in je systeem20.
- Download een uitgebreide motief database waarin motieven voor Olig2.
- Het verkrijgen van de genomic opeenvolgingen van 500 bp regio's gecentreerd op belangrijke piek toppen. De sequenties die zijn opgeslagen als peak.sequences.txt. De opdracht in de Figuur S7 Olig2 motieven binnen elke 500 bp piek regio zoekt.
- Filteren van de resulterende motieven met behulp van een adequate E-waarde (standaard = 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Low-cel ChIP-seq werd uitgevoerd en bioinformatic analyses werden uitgevoerd voor het onderzoek naar de mogelijke interacties tussen transcriptionele factor Olig2 met genomic DNA in acuut gezuiverde hersenen OPCs. Figuur 1 toont een algemene workflow van zowel de experimentele en de procedures van de analyse van gegevens. In dit protocol, werden postnatale muizen hersenen los in de schorsing van een eencellige. Na weefsel dissociatie, werd immunopanning uitgevoerd om te zuiveren OPCs met behulp van PDGFRα antilichaam. Figuur 2 toont de aanzienlijke verrijking van PDGFRα, weinig expressie van neuron markering Tuj1 (neuron-specifieke klasse III bèta-tubuline), Astrocyt marker GFAP (gliale fibrillary zuur eiwit), microglia marker geïoniseerd calcium bindende adapter molecuul 1 (Iba1), myelinating oudere oligodendrocyten marker myeline basic protein (Mbp) en myeline-Oligodendrocyt glycoproteïne (Mog) van gezuiverde OPCs zoals geëvalueerd door RT-qPCR. Immunokleuring resultaat geeft bovendien aan dat de meerderheid van de cellen zijn NG2 positieve zoals afgebeeld in Figuur 2. Vervolgens de gezuiverde OPCs 20 duizend per reactie werden vastgesteld door formaldehyde en chromatine werd geschoren met behulp van een ultrasoonapparaat systeem. Olig2 low-cel ChIP werd uitgevoerd en de bibliotheek werd gebouwd. Na ChIP bibliotheek voorbereiding, werd de kwaliteit van de gegenereerde product gevalideerd door een microfluidic chip-capillaire elektroforese apparaat. Figuur 3 toont een voorbeeld van de electropherogram van een Olig2 laag-cel ChIP bibliotheek. Een duidelijke piek van Oligo2 bibliotheek product variërend van 250 tot 500 bp na grootte selectie van bibliotheek PCR product zichtbaar moet zijn. De ChIP-seq-bibliotheken van zowel het monster bereid met Olig2 transcriptie factor antilichaam en de controlemonster werden onderworpen aan high-throughput rangschikken tot gekoppeld-end 50 cyclus sequencing leest. Langere Lees lengtes zal verbeteren de toewijzing tarieven en verminderen de kans op meerdere toewijzing, ten koste van sequencing kosten. Met 50 bp ChIP-seq gekoppeld-einde sequencing Bibliotheken, zijn meestal goede resultaten bereikt.
Na de eerste kwaliteitscontrole beoordeling van ruwe leest en trimmen van adapters en achterstand van lage kwaliteit baseparen, zijn de kwaliteitscontrole percelen afgebeeld in Figuur 4. Bijgesneden leest moeten een basis kwaliteit groter is dan 30, geen adapter sequenties, en hebben een lage dubbel tarief (figuur 4B-D). Goede kwaliteit getrimd leest zal verhogen de algemene uitlijning. Andere parameters zoals GC inhoud zijn ook belangrijk en moeten worden overwogen voor trimmen.
Zodra de sequencing monsters worden uitgelijnd, is het noodzakelijk om te controleren of de sequencing-diepte. Het is bekend dat het aantal zogenaamde pieken met een hogere rangschikken diepte toenemen zal omdat zwakke sites meer statistisch significant21 wordt. Een analyse van de verzadiging is vereist om te bepalen van een voldoende diepte van de volgorde voor elke specifieke transcriptiefactor gebruikt, ten koste van tijd en budget. Een consensus sequencing diepte voor transcription factor binding is gesuggereerd door het consortium ENCODE over zoogdieren monsters: een minimum van 10 miljoen toegewezen uniek leest voor elk van ten minste twee biologische22 repliceert. Het aantal unieke toegewezen leest en de algehele aanpassing tarief werden berekend door het Lees mapper. Een voorbeeld van goede toewijzing metrics is weergegeven in figuur 5A. Uitgelijnde leest moeten worden toegewezen aan afzonderlijke genomic locaties, met vermelding van de complexiteit van een voldoende bibliotheek, ook wel aangeduid als label tentiemechanismen. Het consortium ENCODE suggereert dat ten minste 80% van de 10 miljoen van uitgelijnde leest moeten worden toegewezen aan verschillende regio genomic's22. Figuur 5B toont een voldoende tag tentiemechanismen waarin meer dan 90% van de leest worden toegewezen aan slechts één genomic locatie. Low-complexiteit bibliotheken optreden in het algemeen als niet genoeg DNA wordt opgehaald, en PCR versterkt fragmenten zijn herhaaldelijk gesequentieerd. Een lage-complexiteit bibliotheek levert een hoge valse piek speurder verhouding.
Bij gebruik van gekoppelde-ChIP-seq endgegevens, binden fragmenten rond de transcriptiefactor met een bepaalde afstand van de scheiding. Gekoppeld-einde sequencing zal zorgen voor een nauwkeuriger schatting van de lengte van de gemiddelde fragment levert een betere schatting van de genomic regio's waar meer bindende zich heeft voorgedaan. De plot van de correlatie onderdeel toont een piek van verrijking overeenkomt met de duur van de overheersende fragment. Zoals aangegeven in figuur 5C, de lengte van berekende fragment is 130 bp overwegende dat de Lees lengte 50 is bp. Een ChIP-seq dataset waar de lengte van het fragment langer dan de Lees lengte is is kenmerkend voor hoge kwaliteit16.
De uitvoer van piek roeping is een lijst van genomic regio's kunnen worden gebonden door de transcriptiefactor (of het complex). De lijst van genomic regio's of pieken is opgenomen in een "bed"-bestand die in een genoom-browser kan worden bekeken. Voor elke piek, dit bestand bevat de ID van een piek, de genomic locatie van de top van de piek, en de FDR als - log10 (q-waarde). De aanzienlijk verrijkt pieken zijn met hogere vouw-verrijking en betekenis statistieken. Een voorbeeld van de uitvoer peak-bestand wordt weergegeven in figuur 6A. Na het selecteren van belangrijke pieken met behulp van aangepaste drempels, pieken binnen de ENCODE blacklist23filteren en identificeren van in de regio van de promotor van een gen (5 kb gene "upstream" en hele lichaam pieken), is een "kopstuk" bestand handig voor het weergeven van pieken in een genoom Browser. Meest verrijkt piek regio's hebben een hogere waarschijnlijkheid van transcription factor binding. Het is belangrijk om te bevestigen piek aanwezigheid in bekende transcriptie factor regelgevende gebieden alsmede piek afwezig in regio's waar de transcriptie factor bindende onwaarschijnlijk is. Figuur 6B -E ziet u voorbeelden van gene regio's met en zonder piek verrijking, alsmede hun locatie ten opzichte van de ENCODE promotor regio's.
In silico complementaire methoden aan ChIP-seq experiment zijn motief verrijking analyse en DOVO motief zoeken. Aangezien Olig2 bindende in OPCs is niet bestudeerd vóór, Olig2 ChIP-seq afgeleid pieken in motor neuron voorlopercellen en embryonale stamcellen werden gebruikt voor DOVO motief identificatie4,24. Olig2 DOVO geïdentificeerd motieven werden toegevoegd aan de uitgebreide ENCODE motief database25 en motief verrijking analyse werd uitgevoerd. Hoge verrijking van de DOVO geïdentificeerd OLIG2 motieven en bekende transcriptie factor (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 en ASCL1) motieven werden gevonden in ChIP-seq pieken van gezuiverd PDGFRα cellen. Een verrijking van 30 DOVO geïdentificeerd motieven met een E-value < 0.05 werd ontdekt. Figure 7 toont de bovenste twee DOVO geïdentificeerd motieven van Olig2. Deze twee DOVO geïdentificeerd Olig2 motieven werden gevonden > 60% van de ChIP-seq pieken verkregen PDGFRα gezuiverd cellen, daarnaast aan bekende motieven.
Figuur 1: overzicht van de werkstroom protocol. PDGFRα positief OPCs werden geïsoleerd van postnatale muis hersenen en werden onderworpen aan Olig2 ChIP experimenteren. De neergeslagen DNA-fragmenten werden gebruikt voor het voorbereiden van de bibliotheek van de ChIP. Na beoordeling van de kwaliteit van de bibliotheek, werden monsters gebruikt voor het rangschikken. Datasets werden geanalyseerd, en pieken werden geïdentificeerd, met vermelding van mogelijke Olig2 bandplaatsen in OPC gezuiverd cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: evaluatie van de zuiverheid van immunopanned OPCs door qPCR en immunokleuring. (A) PDGFRα antilichaam immunopanned cellen werden zaadjes en immunokleuring werd uitgevoerd met behulp van OPC lineage marker NG2 antilichaam. Blauw: DAPI, groen: NG2. Schaal bar = 10 µm. (B) het relatieve expressie niveau van neuron markering Tuj1 in gezuiverde OPCs (PDGFRα +) en gedissocieerde hersencellen (mix) werden geëvalueerd. Tuj1 expressie in gedissocieerde hersencellen was ingesteld op 1. (C) het niveau van de relatieve expressie van Astrocyt marker GFAP in gezuiverde OPCs (PDGFRα +) en gedissocieerde hersencellen (mix) werd geëvalueerd. GFAP expressie in gedissocieerde hersencellen was ingesteld op 1. (D) het niveau van de relatieve expressie van OPC markering PDGFRα in gezuiverde OPCs (PDGFRα +) en gedissocieerde hersencellen (mix) werd geëvalueerd. PDGFRα expressie in gedissocieerde hersencellen was ingesteld op 1. (E) het niveau van de relatieve expressie van myelinating volwassen oligodendrocyten marker Mog in gezuiverde OPCs (PDGFRα +) en gedissocieerde hersencellen (mix) werd geëvalueerd. Mog expressie in gedissocieerde hersencellen was ingesteld op 1. (F) het niveau van de relatieve expressie van myelinating volwassen oligodendrocyten marker Mbp in gezuiverde OPCs (PDGFRα +) en gedissocieerde hersencellen (mix) werd geëvalueerd. MBP expressie in gedissocieerde hersencellen was ingesteld op 1. (G) het niveau van de relatieve expressie van microglia markering Iba1 in gezuiverde OPCs (PDGFRα +) en gedissocieerde hersenen cellen (mix) werd geëvalueerd. Iba1 expressie in gedissocieerde hersencellen was ingesteld op 1. Gegevens in B-G vertegenwoordigen drievoudige experimenten en foutbalken geven standaardfout. T-test analyse * P < 0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de electropherogram van een voorbeeld van een bibliotheek van lage-cell-ChIP Olig2. Na dubbele grootte selectie, was de kwaliteit van Olig2 ChIP bibliotheek geanalyseerd door een microfluidic chip-capillaire elektroforese apparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de controle van de kwaliteit van de representatieve resultaten voor een 50 bp Lees lengte laag-cel ChIP-seq monster. (A) samenvattende tabel beeltenis van het totale aantal leest, aantal slechte kwaliteit leest, volgorde lengte en totale GC-inhoud. (B) Plot met vermelding van de verdeling van basis kwaliteitsscores op verschillende posities in de leest. (C) Plot tonen de potentiële adapter inhoud op verschillende posities in de leest. (D) lijn perceel met vermelding van het percentage van gedupliceerd sequenties. De meerderheid van de leest zijn afkomstig uit de sequenties die alleen optreden zodra binnen de bibliotheek, die daarom aangeeft een lage dubbel tarief of hoge bibliotheek complexiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: kwaliteitscontrole statistieken verkregen piek belt: bowtie2 uitlijning metrics, cross-correlatie strand, en tag tentiemechanismen. (A) uitlijning statistieken de Lees mapper verkregen. De belangrijkste statistieken zijn het aantal unieke toegewezen Lees paren, aangegeven als "uitgelijnd concordantly precies 1 keer", en de algemene uitlijning. (B) Histogram weergegeven: het label tentiemechanismen. Staven geven het percentage van genomic posities waar tags werden gevonden. (C) een voorbeeld van een complot van de cross-correlatie met vermelding van gegevens van goede kwaliteit. Rode lijnen tonen de Lees lengte 50 bps en de overheersende fragment lengte 130 bps. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: ChIP-seq piek Regio'sen genome browser uitzicht op belangrijke ChIP-seq pieken bij verschillende genomic locaties. (A) voorbeeld van de piek regio's geïdentificeerd met de beller piek. (B) significante ChIP-seq pieken gevonden in het lichaam van de gene van Cspg4, een bekende OPC marker-gen. (B) geen ChIP-seq pieken werden gevonden in de promotor regio's of binnen de organen van de gene van Mbp gen, een marker voor volwassen oligodendrocyten, (C) de Tubb3, een marker voor neuronale cel, of (D) GFAP, een marker van de cel van astrocyten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: hoogverrijkt DOVO geïdentificeerd motieven van Olig2 gevonden in PDGFRα-Olig2 ChIP-seq pieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur S1: voorbereiding van ChIP-seq datasets. (A) Directory het platform definitie. (B) rekenmachines rauwe Lees kwaliteitscontrole statistieken. (C) trimmen van luidt als volgt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S2: uitlijning van leest aan het referentie-genoom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S3: kwaliteitscontrole van uitgelijnde luidt, naar adres onderdeel van cross-correlatie en bepalen van de tag tentiemechanismen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S4: Peak roeping. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S5: aantekening van belangrijke pieken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S6: conversie van bedGraph-bestandsindeling naar kopstuk voor visualisatie van de piek in de browser genoom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S7: DOVO motief zoeken en motief verrijking. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S8: Flow-chart met een beschrijving van de bioinformatica analyse van gegevens van de ChIP-seq. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij zoogdiercellen verordening netwerken zijn zeer complex. ChIP-seq is een krachtige methode om onderzoeken van genoom-brede eiwit-DNA interacties. Dit protocol omvat het uitvoeren van Olig2 ChIP-seq met behulp van een laag aantal gezuiverde OPCs vanuit muis brains (zo laag als 20 duizend cellen per reactie). De eerste belangrijke stap voor dit protocol is de zuivering van OPCs van muis hersenen door immunopanning met PDGFRα antilichaam. Voor positieve selectie van OPCs met PDGFRα gecoate platen gecoate OPCs vaak zwak bind aan de PDGFRα platen. Zelfs na meerdere wasbeurten zijn er nog enkele niet-aanhanger cellen links. Het is belangrijk om te controleren dat de cellen van de niet-aanhanger na elke D-PBS wassen onder een microscoop. Als meer D-PBS wassen draagt niet bij tot het verminderen van het aantal niet-aanhanger cellen, is het tijd voor het verzamelen van de geselecteerde cellen, aangezien overtollige wast kunnen bijgevoegde OPCs verjagen en het rendement van gezuiverde cellen te verminderen. Onvoldoende wast kunnen echter resulteren in besmetting van andere hersenen cellen typen. Daarom, elke keer na isolatie, is het nodig om de zuiverheid van de geïsoleerde OPCs door immunokleuring met OPCs marker NG2 qPCR voor de expressie van specifieke genen van de bekende celtype zoals Tuj1 voor neuronen, GFAP voor astrocyten, PDGFRα voor OPCs, Iba1 voor microglia, en MOG en MBP voor myelinating volwassen oligodendrocyten. Zoals blijkt uit Figuur 2, immunokleuring resultaat geeft aan dat de meerderheid van de gezuiverde cellen positief voor NG2 kleuring. Bovendien, sommige klassieke celtype-specifieke markers voor neuronen, astrocyten, microglia en myelinating oudere oligodendrocyten tentoonstelling niet aantoonbaar of extreem lage niveaus van de expressie in gezuiverde OPCs in vergelijking met het ongezuiverde hersenen cel mengsel. PDGFRα vertoont hoge expressie in gezuiverde OPCs in vergelijking met het ongezuiverde hersenen cel mengsel. Immunopanning methode, microglia zijn sterk verminderd in de gezuiverde OPCs t.o.v. het ongezuiverde hersenen cel mengsel, maar een kleine hoeveelheid verontreiniging bestaat. Deze opmerking is in overeenstemming met eerdere publicaties door anderen7,8,26. Bovendien, wanneer vergeleken met eerder gepubliceerde rapporten, wordt een commercieel beschikbare kit gebruikt in dit protocol voor de gestandaardiseerde, efficiënte en handige dissociatie van hersenen weefsels in eencellige schorsingen.
Nadat cross-linking van gezuiverde OPCs, de kruiselings gekoppelde cellen moeten worden gewassen met ijskoude HBSS oplossing en de resterende ChIP stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C, kan niet anders het antilichaam neerslaan de genomic DNA goed.
De volgende belangrijke stap in dit protocol is bibliotheek voorbereiding. De PCR-amplificatie van ChIP materiaal werd gebruikt voor de bouw van de bibliotheek. Het aantal cycli van PCR voor de voorbereiding van de bibliotheek is afhankelijk van de hoeveelheid DNA beginnen. Een goede bibliotheek voorbereiding vereist nauwkeurige kwantificering van input DNA bedrag. Te veel of te weinig cycli van PCR kunnen beïnvloeden bibliotheek concentratie, alsmede de complexiteit, wat leidt tot PCR artefacten.
Het is uitdagend om te bouwen van ChIP-seq bibliotheek bij het gebruik van een beperkt aantal cellen voor immunoprecipitation27. Het eerder gebruikte standaard ChIP protocol vereist 10 ng van immunoprecipitated DNA voor ChIP-seq bibliotheek voorbereiding1,28. Echter, het protocol beschreven hier normaal gesproken genereert 2 ng van immunoprecipitated DNA door Olig2 antilichaam van 20.000 OPCs. DNA wordt door een-voor-stapmodus adapter toevoeging methode, waarmee gevoeligheid zodat picogram van immunoprecipitated DNA verbeterde kan worden versterkt, ter voorbereiding van de ChIP-seq-bibliotheek gebruikt. Door het combineren van commerciële kits, biedt dit protocol een praktische oplossing voor het uitvoeren van ChIP-seq voor transcriptionele factoren op basis van een klein aantal cellen.
Nog belangrijker is, is de lage cel ChIP-seq protocol beschreven toepasselijk voor ChIP-Seq van andere transcriptiefactoren in primaire cellen of zeldzame cel populaties ook. Antilichamen gebruikt in dit protocol moeten experimenteel worden gevalideerd om eerst worden specifieke door IP-experiment. Niet-specifieke binding van antilichamen zal leiden tot slechte resultaten. Bovendien is het beter voor het uitvoeren van dit experiment lage cel ChIP-seq in cellen met een hoge expressie niveau van de transcriptiefactor van belang.
Voor data-analyse, kan het zijn uitdagend om te beslissen welke waarden uw wilt gebruiken als het filteren van cut-offs na piek roeping. Afhankelijk van de doelstellingen van de analyse, mogen strengere of meer ontspannen parameters worden gebruikt. In het algemeen wordt een combinatie van vouw-verrijking en p-waarde of FDR gebruikt. Als sommige bandplaatsen van de transcriptiefactor bestudeerde eerder bekend waren, kan dit helpen bij het bepalen van de filter drempels. Transcription factor binding site databases afgeleid van openbaar ChIP-seq experimenten in verschillende cellijnen en voorwaarden zijn gecompileerde29,30. Een kan zoeken naar een gen en controleer als transcriptie factor bandplaatsen eerder gevonden. Het is echter belangrijk om te beseffen dat transcriptie factor bandplaatsen afhankelijk van celtypes en voorwaarden verschillen.
In silico complementaire methoden aan ChIP-seq experiment zijn motief verrijking analyse en DOVO motief zoeken met behulp van MEME-ChIP20 of soortgelijke programma's. De motif search vereist een uitgebreide bekend en DOVO afgeleid motief database zoals de ENCODE motieven25 of de Hocomoco database31. Hocomoco is een database van motieven ontdekt openbaar beschikbare mensen en muis ChIP-seq experimenten. Als motieven voor de getest proteïne onbekend zijn, kon de DOVO motief zoekopdracht terugkerende sequentie patronen in een belangrijke fractie van de pieken onthullen als nieuwe motieven. De potentiële combinatorische actie van transcriptiefactoren kan worden onthuld als motieven van andere transcriptiefactoren ook aangetroffen worden in de resulterende pieken worden verrijkt.
De verrijkte piek regio's kunnen experimenteel worden gevalideerd met behulp van de chromatine van mutant of afvalrace cellen als besturingselementen. Uitvoeren van ChIP-seq cuvetten niet uitdrukken van de transcriptiefactor worden gebruikt voor het identificeren van valse positieve pieken, ook aangeduid als "phantom peaks"32. Valse positieven moeten worden uitgefilterd.
Het is ook interessant om te vergelijken van de resulterende pieken van de ChIP-seq met transcriptomic gegevens. De toppen van de PDGFRα-Olig2 ChIP-seq werden vergeleken met de expressie van genen in OPCs van een eerdere publicatie18. Deze strategie kan worden beperkt aangezien uitgedrukte genen in OPCs kunnen worden gecontroleerd door andere mechanismen dan Olig2 transcription factor binding. Bovendien Olig2 transcriptiefactor kan binden aan een genes regelgevende regio maar het gen wellicht lage gen expressie niveau als gevolg van mogelijke remmende mechanismen of het gebrek aan mede noodzakelijk voor gene transcriptie factoren.
ChIP-seq is een methode die wordt gebruikt voor het identificeren van genoom-brede DNA bandplaatsen van transcriptiefactoren en andere eiwitten. Echter, door middel van de analyse van co voorkomen van transcriptiefactoren vonden onderzoekers dat transcriptiefactoren hebben de neiging te associëren met andere eiwitten vormen verband met coregulering modules33. Dit betekent dat sommige bindingen tussen transcriptionele factoren en genomic DNA onthuld door ChIP-seq zijn indirecte en overbrugde door andere eiwitten. Daarom, om meer zinvolle resultaten te bereiken onderzoekers overwegen gelijktijdig meer dan één transcriptiefactor studeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
JQW, XD, RCDD en YY werden ondersteund door subsidies van de nationale instituten van gezondheid R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; de Wouters Ogilvie Fonds-Hermann Gedenkfonds; de UTHealth hersenen initiatief en CTSA UL1 TR000371; en een beurs van de Universiteit van Texas systeem neurowetenschap en Neurotechnology Research Institute (Grant #362469).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/ Equipment | |||
| Banderiaea simplicifolia lectin 1 | Vector Laboratories | # L-1100 | |
| Rat anti-PDGFRa antibody | BD Bioscience | # 558774 | |
| Neural tissue dissociation Kit (P) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-092-628 | |
| Accutase | STEMCELL technologies | # 07920 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | # 15596026 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | Millipore | # AB5320 | |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | # B01060001 | |
| True MicroChIP kit | Diagenode | # C01010130 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | # 15593031 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit | MACHEREY-NAGEL | # 740609 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher | # P11496 | |
| DNA SMART ChIP-Seq kit | Clontech Laboratories | # 634865 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Voulter | # A63880 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | # AM9516 | |
| pico-green | Thermo Fisher | # P11496 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | # 14190-144 | |
| SYBR Green master mix | Bio-Rad Laboratories | # 1725124 | |
| DMEM/F12 | Fisher Scientific | # 11-320-033 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Fisher Scientific | # 15140122 | |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | # 17502048 | |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | # 17504044 | |
| insulin | Sigma | # I6634 | Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl. |
| Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) | Sigma | # A4161 | Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4 |
| Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) | EMD Millipore | # GF003 | |
| HUMAN PDGF-AA | VWR | # 102061-188 | |
| poly-D-lysine | VWR | # IC15017510 | Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using. |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm | VWR | # 25373-100 | |
| Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm | VWR | # 25373-187 | |
| HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red | Fisher Scientific | # 14185-052 | |
| Trypan Blue | Stemcell Technologies | # 07050 | |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | # 11697498001 | |
| Software | |||
| FastQC | [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads | |
| Trimmomatic 0.33 | [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | Trimming and filtering raw reads | |
| GENCODE mm10 | ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz | Mouse reference genome | |
| Bowtie2 2.2.4 | [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | Aligning reads to a reference genome | |
| SAMTools 1.5 | [13] http://samtools.sourceforge.net/ | Converting SAM file into BAM format | |
| HOMER 4.9.1 | [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ | Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols | |
| R 3.2.2 | [15] https://www.R-project.org/ | Programming scripts and running functions | |
| SPP 1.13 | [16] https://github.com/hms-dbmi/spp | Creating a strand cross-correlation plot | |
| MACS2 2.2.4 | [17] https://github.com/taoliu/MACS | Finding regions of ChIP enrichment over control | |
| BEDTools 2.25 | [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Genome arithmetics | |
| bedGraphToBigWig | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ | Converting bedGraph file into bigwig | |
| IGV browser 2.3.58 | [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ | Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks | |
| Microsoft Excel | Spreasheet program | ||
| ENCODE's blacklist | https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists | Filtering peaks | |
| mm10.chrom.sizes | http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. | Converting bedGraph file into bigwig | |
| ENCODE's motif database | [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ | Comprehensive motif database required for motif enrichment | |
| MEME-ChIP | [20] http://meme-suite.org/index.html | Motif enrichment analysis and motif discovery | |
| Primer names used for qPCR | Primer sequences used for qPCR | ||
| Mbp-F: | CTATAAATCGGCTCACAAGG | ||
| Mbp-R: | AGGCGGTTATATTAAGAAGC | ||
| Iba1-F: | ACTGCCAGCCTAAGACAACC | ||
| Iba1-R: | GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC | ||
| Mog-F: | GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC | ||
| Mog-R: | TGAATTGTCCTGCATAGCTGC | ||
| GAPDH-F | ATGACATCAAGAAGGTGGTG | ||
| GAPDH-R | CATACCAGGAAATGAGCTTG | ||
| Tuj1-F | TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG | ||
| Tuj1-R | GATGACCTCCCAGAACTTGGC | ||
| PDGFRα-F | AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC | ||
| PDGFRα-R | GTCCCTCCACGGTACTCCT |
References
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
- Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
- Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
- Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
- Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
- Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
- Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
- Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
- Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).
