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Neuroscience

Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57547
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das entwickelt ist, um die genomweite Bindung des Transkriptionsfaktors Oligodendrozyt 2 (Olig2) in akut gereinigte Brain Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) analysieren durch Ausführen von niedrig-Zelle Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) , Bibliothek-Vorbereitung, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse der Daten.

Abstract

In Säugetierzellen ist Gentranskription die Interaktionen der transcriptional Faktoren mit genomischer DNA in einer Zelle Art bestimmten Weise geregelt. Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren gelten als wesentliche Rollen in der Zelle Spezifikation und Differenzierung während der Entwicklung spielen. ChIP, gepaart mit Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) ist weit verbreitet genomweite Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren (oder seinen zugehörigen Komplex) für die genomische DNA analysieren. Eine große Anzahl von Zellen sind jedoch erforderlich für einen standard ChIP-Reaktion, die es schwierig macht, die begrenzte Anzahl von isolierten Primärzellen oder seltene Zellpopulationen zu studieren. Um zu verstehen, der Regulierungsmechanismus Oligodendrozyt Abstammung-spezifische Transkription Faktor Olig2 in akut gereinigten Maus OPCs, eine detaillierte Methode mit ChIP-Seq um zu identifizieren, die genomweite Bindungsstellen des Olig2 (oder Olig2 Komplex) angezeigt wird. Das Protokoll erklärt zunächst, wie Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor Alpha (PDGFRα) zu reinigen positive OPCs von mäusegehirnen. Als nächstes Olig2 Antikörper vermittelten ChIP und Bibliotheksbau erfolgen. Der letzte Teil beschreibt die bioinformatische Software und Verfahren für die Olig2 ChIP-Seq-Analyse verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen meldet dieses Papier eine Methode, die genomweite Bindungen der transcriptional Faktor Olig2 bei akut gereinigte Brain OPCs zu analysieren.

Introduction

Es ist wichtig zu untersuchen, das Protein (oder Protein-Komplex) DNA-Bindung und die epigenetischen Markierungen transkriptionelle regulationsnetzwerke in verschiedenen biologischen Prozesse zu bauen. Insbesondere können die Bindungen von Transkriptionsfaktoren, die genomische DNA eine wichtige Rolle bei der Genregulation, die Zelldifferenzierung und das Gewebeentwicklung spielen. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das studieren der transcriptional Regelung und epigenetischen Mechanismen Chromatin Immunopräzipitation (ChIP). Aufgrund der rasanten Fortschritte in der Technologie der nächsten Generation Sequenzierung dient die Analysen der Protein-DNA-Bindung und epigenetischen Markierungen1ChIP gepaart mit Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq). Ein standard-ChIP-Seq-Protokoll erfordert jedoch etwa 20 Millionen Zellen pro Reaktion, die die Anwendung dieser Technik erschwert, wenn die Zelle begrenzt, wie isolierte Primärzellen und seltene Zellpopulationen ist.

Oligodendrozyt Linie Zellen einschließlich Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) und Oligodendrozyten sind weit verbreitet im gesamten Gehirn und sind unerlässlich für die Entwicklung und Funktion des Gehirns. Als eine Art von Vorläuferzellen können OPCs Selbsterneuerung und Differenzierung. OPCs nicht nur als Stammväter für Oligodendrozyten dienen, sondern auch eine wichtige Rolle in der Ausbreitung der neuronalen Signalisierung durch die Kommunikation mit anderen Arten von Gehirn Zellen2. Frühere Studien haben vorgeschlagen, dass Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren wie Olig2 und Sox103,4Oligodendrozyt Entwicklung geregelt ist. Diese Transkriptionsfaktoren befanden sich an den Veranstalter oder Enhancer Regionen einige entscheidende Gene binden ihren Ausdruck während Oligodendrozyt Spezifikation und Differenzierung zu beeinflussen. Allerdings ist es schwierig, DNA-bindende Protein (oder Protein-Komplex) Interesse an akut gereinigte primäre OPCs mit einer sehr begrenzten Anzahl von Zellen zu identifizieren.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die genomische DNA-Immunoprecipitated von Olig2 in gereinigten Maus OPCs Genom-weite Ebene mit ChIP-Seq-Technik systematisch zu erforschen. OPCs von mäusegehirnen waren akut durch Immunopanning gereinigt und in einem ChIP Experiment ohne Verbreitung in Vitro. Eine begrenzte Anzahl von OPCs erhalten Sie durch Immunopanning und reicht für standard-ChIP-Seq-Experimente. Hierin ist ein Low-Zelle-ChIP-Seq-Protokoll mit so niedrig wie 20 Tausend Zellen pro ChIP Reaktion für Transkriptionsfaktoren beschrieben. Kurz gesagt, waren vernetzte Zellen lysiert und beschallt durch ein Ultraschall-Gerät, das Chromatin zu scheren. Das geschert Chromatin wurde mit Olig2 Antikörper sowie Protein A-beschichtete Kugeln, um Olig2 Antikörper gebunden genomischer DNA auszufällen inkubiert. Nach der Elution von Protein A-beschichtete Perlen und umgekehrte Vernetzung war genomischer DNA durch Olig2 Antikörper ausgefällt durch Phenol-Chloroform Extraktion gereinigt. Das resultierende Produkt wurde quantifiziert und T-Tailing unterworfen, Grundierung glühen Vorlage Schalt- und Erweiterung, die Zugabe von Adaptern und Verstärkung, Bibliothek Größenauswahl und Reinigung Schritte für ChIP-Seq Bibliotheksbau.

Nach der Sequenzierung wurde die Qualität der raw liest aus der Probe vorbereitet mit Olig2 Transkription Faktor Antikörper und die Kontrollprobe analysiert. Minderwertige Basenpaare und Adapter mit lesen, dass Fragmente getrimmt wurden. Nächste, getrimmte liest wurden auf das Maus-Referenz-Genom ausgerichtet. Die genomischen Regionen, die wesentlich bereichert wurden, für ChIP liest, im Vergleich zu der Kontrollprobe als Peaks erkannt wurden. Bedeutende Gipfel, repräsentieren mögliche Transkription Faktor Bindungsstellen wurden gefiltert und in einem Genom-Browser visualisiert.

In diesem Protokoll beschriebene Methode ist vor allem im großen und ganzen für ChIP-Seq von anderen Transkriptionsfaktoren mit jeden Zelltyp der begrenzten Stückzahlen einsetzbar.

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Protocol

Alle tierischen Verbrauch und experimentelle Protokolle wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und durch die institutionelle Biosafety Committee and Animal Welfare Committee an der University of Texas Health Science Center in genehmigt Houston.

1. Reinigung des PDGFRα Positive Oligodendrozyt Linie Zellen von Gehirn der Maus (geändert von zuvor beschriebenen Immunopanning Protokolle5,6,7)

  1. Vorbereitung eines Immunopanning Platte PDGFRα positive Zellauswahl und 2 Platten für Abbau der Endothelzellen und Mikroglia.
    Hinweis: Bitte beachten Sie, dass Petrischalen aber nicht Zelle Kultur Gerichte für Immunopanning Experiment arbeiten; Wenn für die Kultivierung der gereinigten Zellen verwendet werden, müssen Immunopanning Schritte werden in der Biosicherheit Schrank durchgeführt
    1. Beschichten Sie ein 10 cm Petri-Platte mit 30 µL Ziege Anti-Ratte IgG in 10 mL pH 9.5, 50 mM Tris-HCl über Nacht bei 4 ° C. Schütteln Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Oberflächen der Platten gleichmäßig und vollständig von der Beschichtungslösung abgedeckt werden.
    2. Bereiten Sie PDGFRα-Antikörper-Lösung durch Verdünnung 40 µL Ratte Anti-PDGFRα Antikörper mit 12 mL Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 0,2 % BSA vor.
    3. Nach 3 Wäschen von IgG beschichtet mit 10 mL 1 X DPBS Platte, inkubieren Sie IgG-beschichtete Platte mit PDGFRα Antikörperlösung bei Raumtemperatur für 4 h.
    4. Waschen die Ratte Anti-PDGFRα Antikörper beschichtete Platte 3 Mal mit 10 mL 1 X DPBS. Fügen Sie sanft DPBS Lösung entlang der Seitenwand der Platte und stören Sie die beschichteten Oberflächen nicht.
    5. 2 neue 15 cm Petri Platten für Abbau der Endothelzellen und Mikroglia mit 20 mL des DPBS mit 2,3 µg/mL Banderiaea Simplicifolia Lektin 1 (BSL-1) für 2 h zu beschichten.
    6. Waschen der BSL-1 beschichtete Platten 3 x mit 20 mL 1 X DPBS. Fügen Sie sanft DPBS Lösung entlang der Seitenwand der Platten und stören Sie die beschichteten Oberflächen nicht.
  2. Reinigung von PDGFRα positive Oligodendrozyt Linie Zellen wird von zuvor veröffentlichten Methoden6 geändert , 7 , 8.
    1. Sezieren die kortikalen Gewebe aus 2 postnatale 7.Tag (P7) Maus Gehirne nach zuvor veröffentlichten Protokolle5,6.
    2. Trennen Sie das Gewebe um eine einzelne Zelle Suspension mit Nervengewebe Dissoziation Kit (P) nach detaillierten Angaben des Herstellers zu generieren.
    3. Kurz, Stücke mit einem Skalpell geschnitten Sie seziert kortikalen Gewebe und sie enzymatische Verdauung bei 37 ° C. Nach der Verdauung manuell trennen Sie die Stücke mit feuerpolierten Glas, die in eine einzelne Zelle Suspension Pasteur Pipetten.
    4. Zentrifugieren Sie die Single-Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei Raumtemperatur und Zelle Pellet mit 15 mL Immunopanning Puffer auszusetzen (Immunopanning Puffer ist DPBS mit 0,02 % BSA und 5 µg/mL Insulin).
    5. Inkubieren Sie die einzelligen Aussetzung von 2 mäusegehirnen nacheinander auf 2 BSL-1 beschichtete Platten für 15 min bei Raumtemperatur mit sanften Bewegung der Platte alle 5 min. um eine bessere Entleerung der Mikroglia und Endothelzellen zu gewährleisten.
    6. Vorsichtig schwenken die Platte, um nicht-anhaftende Zellen in der Zellsuspension zu sammeln und sie auf die Ratte-PDGFRα Antikörper-beschichtete Platte für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Nach der Inkubation der Zellsuspension auf der Ratte-PDGFRα Antikörper-beschichtete Platte vorsichtig schwenken der Platte um die Zellsuspension zu sammeln und spülen Sie die Platte 8 Mal mit DPBS get rid of nicht anhaftende Zellen. Sanft fügen Sie Waschlösung entlang der Seitenwand der Platte und schütteln Sie die Platte mehrmals, nicht anhaftende Zellen loszuwerden.
    8. Lösen Sie die Zellen aus der Ratte-PDGFRα Antikörper beschichtete Platte mit 4 mL der Zellbehandlung Ablösung Lösung für 10 min bei 37 ° C. Schütteln Sie die Platte, um adhärente Zellen verdrängen.
    9. Sammeln Sie die gereinigten OPCs durch Zentrifugation bei 300 X g bei Raumtemperatur, aussetzen der Zelle Pellet mit 2 mL OPC Zellkulturmedium und zählen die Zellen mithilfe Trypan blau und eine Hemocytometer (500 mL Zellkulturmedium ist mit 5 mL DMEM/F12-Medium Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 µg/mL Insulin, 0,1 % BSA, 20 ng/mL bFGF und 10 ng/mL PDGFRα).
  3. Validierung der Reinheit des OPCs nach Immunopanning.
    1. Für die Beurteilung der Anreicherung von OPCs nach Immunopanning verwenden Sie einige der gereinigten OPCs für RNA-Extraktion mit einer Guanidium Thiocyanat basierte Extraktion gemäß Anweisungen des Herstellers.
    2. Mit grünen Fluoreszenzfarbstoff-master-Mix für die Bereicherung der PDGFRα Ausdruck im gereinigten OPCs gegenüber dissoziierten Gehirnzellen gemäß den zuvor veröffentlichten Materialien4überprüfen führen Sie qRT-PCR aus.
    3. Darüber hinaus Samen einige gereinigte OPCs in der Poly-D-Lysin beschichtet 24 Platten gut für Immunostaining mit Anti-NG2 Chondroitinsulfat Proteoglykan (NG2) Antikörper wie zuvor Materialien9veröffentlicht.

(2) Low-Cell-ChIP Vorbereitung und ChIP Bibliotheksbau für Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. OLIG2 Low-Cell-ChIP Vorbereitung mit einem handelsüblichen Beschallung-System und eine kommerziell erhältliche niedrige Zellzahl ChIP kit (siehe Tabelle der Materialien), indem man folgt die detaillierte Standardverfahren von Anweisungen des Herstellers.
    1. Nach dem ablösen von der Ratte Anti-PDGFRα setzen Antikörper-beschichtete Platte und der Zelle zählen mit Trypan blau und ein Hemocytometer 20.000 gereinigten OPCs in 1 mL OPC Zellkulturmedium für jeden ChIP-Reaktion.
    2. Fügen Sie 27 µL von 36,5 % Formaldehyd Zellsuspension für 10 min bei Raumtemperatur zu beheben.
      Achtung: Bitte beachten Sie, dass Formaldehyd in der chemischen Dunstabzugshaube aus Sicherheitsgründen verwendet werden muss.
    3. DNA-Protein Vernetzung mit 50 µL 2,5 M Glycin für 5 min bei Raumtemperatur zu stoppen.
      Hinweis: Alle Schritte müssen auf Eis oder in 4 ° C kalten Raum ab diesem Zeitpunkt durchgeführt werden.
    4. Waschen Sie die vernetzte Zelle Pellets mit 1 mL der eiskalte Hanks' Balanced Salz Lösung (HBSS) mit Protease-Inhibitor cocktail und bekommen Zellen, die oelletiert durch eine vorgekühlte Zentrifuge bei 300 X g bei 4 ° c zu
    5. Lyse der Zelle Pellets in 25 µL komplette Lysis Puffer für 5 min auf Eis.
      Hinweis: Bewegen Sie das Rohr um die Zellen in Lysis Puffer zu unterbrechen.
    6. Ergänzung der Zelle lysate mit 75 µL eiskalte HBSS mit Protease-Inhibitor cocktail und Scherung das Chromatin der Zelle lysate durch Ultraschall-System mit 5 Zyklen 30 s und 30 s-OFF-Programm vorgekühlt. Immer Beschallen Sie 6 Rohre zusammen und stellen Sie sicher die Gleichgewicht Röhren 100 µL Wasser enthalten.
    7. Nach der Schur, Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min 4 ° C und überstand in einen neuen Schlauch nach Zentrifugation zu sammeln.
    8. Verdünnen Sie 100 µL geschert Chromatin in gleicher Lautstärke des eiskalten komplette ChIP-Puffer mit der Proteaseinhibitor.
    9. Sparen Sie 20 µL verdünnter geschert Chromatin als Input Kontrollprobe.
      Hinweis: Eingabe Kontrollprobe ist auch erforderlich, wie der Vergleich zu Olig2 Immunoprecipitated Probe, Olig2 Antikörper Immunoprecipitated DNA zu identifizieren.
    10. Fügen Sie 1 µL Kaninchen-Anti-olig2-Antikörper zu 180 µL der verdünnten Chromatin geschert und das Reaktionsgefäß auf einem rotierenden Rad bei 40 u/min für 16 h bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem kalten Raum.
    11. Für jede Reaktion ChIP waschen 11 µL magnetische Protein A-beschichtete Perlen mit 55 µL Waschpuffer Perlen und setzen Sie die Wulst pellet in 11 µL Waschpuffer Wulst nach 2 Wäschen.
      Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem kalten Raum.
    12. Fügen Sie 10 µL vorgewaschen Protein A-beschichtete Perlen für jede Reaktion ChIP ChIP Reaktionsgefäß hinzu. Führen Sie diesen Schritt in einem kalten Raum.
    13. Inkubieren Sie das ChIP-Reaktionsgefäß bei 4 ° C für eine weitere 2 h auf einem rotierenden Rad.
    14. Der magnetische Ständer für 1 min das Reaktionsgefäß ChIP aufsetzen.
      Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem kalten Raum.
    15. Entfernen Sie den überstand zu und verdrängen Sie nicht die Wulst Pellet.
    16. Waschen Sie die Wulst Pellet mit 100 µL für jede der 4 Wash Buffer jeweils für 4 min auf einem rotierenden Rad bei 4 ° c
    17. Nach Wäschen die Perle Pellet 200 µL der Elution Puffer hinzu und inkubieren Sie das ChIP-Reaktionsgefäß bei 65 ° C für 4 h, Cross-Link-Protein-DNA rückgängig zu machen.
    18. Darüber hinaus 20 µL Input Kontrollprobe 180 µL Elution Puffer hinzu und inkubieren Sie bei 65 ° C für 4 h, Cross-Link-Protein-DNA als auch rückgängig zu machen.
    19. Jeder ChIP Reaktionsgefäß 200 µL 25:24:1 (V/V) Mischung aus Phenol, Chloroform und Isoamyl Alkohol hinzufügen.
    20. Vortex energisch für 1 min und Zentrifuge bei 13.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die obere Phase auf einen neuen Schlauch.
    21. Fügen Sie 40 µL 3 M Natrium-Acetat-Lösung, 1.000 µL 100 % Ethanol und 2 µL von Glykogen Fällungsmittel kovalent verbunden zu einem blauen Farbstoff zu jeder ChIP Reaktionsgefäß über Nacht bei-20 ° C.
    22. Zentrifuge bei 13.000 x g für 20 min bei 4 ° C.
    23. Den überstand verwerfen, Waschen mit 500 µL kaltem 70 % Ethanol und Zentrifugieren bei 13.000 x g für 20 min bei 4 ° C.
    24. Verwerfen des Überstands, die Pellet-Luft für 10 min trocken zu halten und das Pellet mit 50 µL Wasser auflösen.
  2. ChIP-Bibliotheksbau für Hochdurchsatz-Sequenzierung
    1. Reinigen und konzentrieren sich die ChIP-DNA mit einem Kit Aufräumarbeiten nach den Anweisungen des Herstellers.
    2. Quantifizieren Sie die ChIP-Probe durch ein Pico-grün nach den Anweisungen des Herstellers.
    3. Verwenden Sie eine ChIP-Seq-Kit für T-Tailing, Replikation und Tailing, Vorlage Umstellung und Erweiterung, die Zugabe von Adaptern und Verstärkung, Bibliothek Größenauswahl und Reinigung nach den Anweisungen des Herstellers.
      1. Nach Denaturierung der DsDNA dephosphorylate das 3'-Ende des SsDNA von Shrimp alkalische Phosphatase und die SsDNA von terminal Deoxynucleotidyl Transferase ein Endstück Poly (T) hinzu.
      2. Tempern des DNA Poly (dA) Primers auf die SsDNA-Vorlage für die DNA-Replikation und Vorlage zu wechseln.
      3. Verstärken Sie nach Vorlage wechseln die ChIP-Seq-Bibliothek mittels PCR mit den vorwärts- und Primer für die Indizierung.
      4. Wählen Sie die PCR verstärkt ChIP-Seq-Bibliothek mit Fragmenten von 250 bis 500 bp von paramagnetischen Perlen von Option 2 für doppelte Größenauswahl.
      5. Prüfen Sie die Qualität der ausgewählten ChIP-Seq-Bibliothek mit einem Mikrofluidik-Chip-Kapillar-Elektrophorese-Gerät.

(3) Datenanalyse

  1. Bereiten Sie die Verzeichnis-Struktur.
    1. Erstellen Sie ein Verzeichnis für die ChIP-Seq-Daten-Analyse durchzuführen. Im neu erstellten Verzeichnis erstellen sechs Unterverzeichnisse mit den folgenden Namen: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis und Berichte.
  2. Vorbereiten von Daten und Qualitätskontrolle Analyse von rohen Sequenzdaten durchführen.
    1. In der "raw.files" Verzeichnis verschieben und die ChIP-Seq-Daten-Dateien herunterladen.
    2. Überprüfen Sie die Dateinamen. Wenn die Sequenzierung gepaart-End war, werden die 4 Dateien (zwei für die Behandlung) und zwei für die Eingabe mit ähnlichen Basis Namen: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq und PDGFRα_input.read2.fastq. Wenn die Dateinamen unterscheiden, benennen Sie sie mit dem Befehl "Mv".
    3. Verschieben Sie in das Verzeichnis "fastqc.output".
    4. Der Rohe liest mithilfe einer Fastq Datei Qualitätskontrolle Software10einzuholen Sie Qualitätskontrolle Metriken. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1A Qualitätssicherungsprozess separat für jede Fastq Datei ausführen. Die Software zeigt mehrere Qualitätskontrolle Metriken in einer HTML-Datei.
    5. Öffnen Sie die html-Qualitätskontrolle-Datei, und überprüfen Sie die Anzahl der Lesevorgänge, lesen Länge pro basensequenz Qualität pro Sequenz Qualitätsfaktoren, Sequenz-GC-Gehalt, Sequenz Vervielfältigung Ebenen, Adapter Inhalt und Kmer Inhalt.
  3. Trim trailing minderwertige liest und Adapter Inhalt.
    1. "Pro basensequenz Qualität" und "Content-Adapter" Grundstücke zu beobachten. Bestimmen Sie die Länge Trimmen für Kopf und Schweif von jedem Lesevorgang. Eine ausreichende Länge für das Trimmen ist, wo die Basis Qualität fällt unter 30 und gibt Hinweise auf Adapter Inhalt.
    2. Verschieben Sie in das Verzeichnis "raw.files".
    3. Downloaden Sie und installieren Sie eine Software für Trimmen liest11. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1B für die Behandlung und den Eingang separat trimmen. Parameter "CROP" zeigt die verbleibende lesen Sie Länge nach Trimmen vom Ende Basen und "HEADCROP" gibt die Anzahl der Stützpunkte von Anfang an lesen Sie beseitigt werden.
    4. Der Beschnitt Befehl schließt auch die minimale Länge akzeptiert werden, nach der Filterung im Parameter "MINLEN" zu lesen. Wenn Lesevorgänge mindestens 50 sind bp, Einsatz 35 bp als Lesen Sie Länge Schwelle.
    5. Verschieben Sie in das Verzeichnis "fastqc.output".
    6. Führen Sie die Fastq Datei Qualitätskontrolle Analyse nach dem Stutzen der liest. Stellen Sie sicher, dass die Probleme behoben wurden. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S1C Qualitätskontrolle Metriken zu erhalten.
  4. Richten Sie die Einend- oder gepaart-End ChIP-Seq Lesezugriffe auf das Maus-Referenz-Genom.
    1. Für die Zuordnung in der "bowtie.output" Verzeichnis verschieben.
    2. Download der GENCODE mm10 Maus Bezug Genom. Benennen Sie das mm10 Maus Bezug Genom als "mm10.fa".
    3. Downloaden Sie lesen Sie Mapper12 und installieren Sie es in das System.
    4. Erstellen Sie eine Indexdatei des heruntergeladenen Referenz Genoms mit dem Befehl in Abbildung S2A. Sechs Dateien werden automatisch erstellt: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 und mm10.rev.2.bt2.
    5. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S2B , führen Sie die Ausrichtung und passen die Parameter "-p" auf die Anzahl der Prozessorkerne gemäß Ihren Systemeinstellungen. Wenn gepaart-End Modus ausgeführt, geben Parameter "-1" und "-2" die Namen der getrimmte Fastq Dateien.
      Hinweis: Mapping erfolgt separat für die Behandlung und Eingang Proben und Ausgang metrische Log-Dateien werden erstellt für jede Probe.
    6. Download einer Software zur Bearbeitung von Dateien im SAM-Format13 und im System zu installieren. Umwandeln Sie die ausgerichtete SAM-Datei in eine BAM-Datei mit dem Befehl in Abbildung S2C.
  5. Erhalten Sie Qualitätskontrolle-Metriken der zugeordneten liest vor Höhepunkt fordern beide gepaart-End Behandlung und Kontrolle Proben.
    1. Eines der wichtigsten Kennzahlen, Qualitätskontrolle, Adresse ist die Sequenzierung Tiefe. Öffnen Sie die Dateien "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" und "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" im Verzeichnis bowtie.output und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der eindeutig zugeordnete lesen Sie Paare in jeder Stichprobe größer als 10 Millionen.
    2. Verschieben Sie in das Verzeichnis "homer.output".
    3. Downloaden Sie eine Software für Motiv-Entdeckung und Next Generation Sequencing Analyse14 und installieren Sie es in das System.
    4. Erstellen Sie ein Verzeichnis namens "TagDir".
    5. Um Tag infektionsstaus zu überprüfen, verwenden Sie den Befehl in Abbildung S3Adargestellt. Der Befehl "MakeTagDirectory" generiert vier Qualitätskontrolle Ausgang files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt und tagLengthDistribution.txt.
    6. Verschieben Sie in das Verzeichnis "TagDir".
    7. Kopieren Sie die Datei "tagCountDistribution.txt" in die ""-Berichtverzeichnis.
    8. In der ""-Berichtverzeichnis verschieben.
    9. Die tagCountDistribution.txt-Datei mit einem Tabellenkalkulationsprogramm öffnen und erstellen Sie eine Bar Plot von die Anzahl der Tags pro genomische Position. Speichern Sie die Histogramm-Datei mit dem Namen "tag.clonality.xlsx".
    10. R Programmierung Sprache15 in das System zu installieren.
    11. Geben Sie im Terminal "R" und drücken Sie die Eingabetaste auf der R-Programmieren-Umgebung zugreifen.
    12. Ein R-Paket für die Verarbeitung von ChIP-Seq Daten16 herunterzuladen und zu installieren mit dem Befehl, dargestellt in Abbildung S3B.
    13. Verwenden Sie das R-Skript in Abbildung S3C der Strang Kreuzkorrelation Plotten.
  6. Erkennung der Gipfel mit einer Peak-Mapper.
    1. Verschieben Sie in das Verzeichnis "macs2.output". Downloaden Sie und installieren Sie eine Peak-Mapper-17 in Ihrem System.
    2. Verwenden Sie die Funktion "Callpeak" mit der Behandlung und Kontrolle BAM Dateien in Schritt 3.4.6 erzeugt.
      Hinweis: Andere Parameter enthalten "-f" für input-Datei-Format, "-g" für Genomgröße, "-Name" für die Anzeige der Basisname der alle Ausgabedateien und "-B" für die Speicherung von Fragment Pileup im Bedgraph-Format. Die komplette Spitze Aufruf Befehls ist in Abbildung S4Aenthalten. Verwenden Sie BEDPE für gepaart-End-Beispiele.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Peak-Mapper sechs Dateien generiert: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_ PDGFRα_input_control_lambda.bdg und PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_treat_pileup.bdg.
    4. Datei öffnen PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls den genannten Gipfeln, Lage, Länge, Gipfel Position, Pile-Up und die Spitze Bereicherung Metriken anzeigen:-log10(pvalue), Falten, Bereicherung und -log10(q-value).
  7. Filtern Sie und kommentieren Sie genannte Gipfeln.
    1. Verwenden die Datei, die im vorherigen Schritt geöffnet, Filtern Sie resultierenden Gipfel nach Falte Bereicherung, der p-Wert und/oder der Q-Wert. Um ausreichende Filterung Schwellenwerte entscheiden, machen Sie ein Histogramm Grundstück zu bestimmen, die Dichte der einzelnen Metriken. Werte unter einem gewählten Schwellenwert zu bedeutenden Gipfeln herausfiltern.
    2. Download der mm10 Blacklist (Regionen bekannt, künstlich hoch Signal zu haben) und Filter aus der ChIP-Seq Gipfeln innerhalb eines Artefakts Regionen sind.
    3. Erstellen Sie eine Bett-Datei mit den gefilterten Gipfeln, die die folgenden Spalten enthält: Chromosom, Beginn, Ende, PeakID, Mock und Strang. Füllen Sie die mock Spalte mit einem Punkt "." da es nicht benutzt wird. Setzen Sie alle Werte in der Spalte "Strang" "+". Speichern Sie die Bett-Datei als "filtered.peakData2.bed".
    4. Kopieren Sie die Datei "filtered.peakData2.bed" im Verzeichnis "Berichte".
    5. In der ""-Berichtverzeichnis verschieben.
    6. Um gefilterte Gipfel zu einer spezifischen gen-Region mit Anmerkungen versehen, verwenden Sie die Funktion "AnnotatePeaks" mit der Bett-Datei im vorherigen Schritt erstellt. Der Befehl verwendet, ist in Abbildung S5Adargestellt.
    7. Öffnen Sie die "filtered.annotatedPeaks.txt"-Datei mit einer Statistik-Software.
    8. Daraus resultierenden Gipfel liegen in einer intergenetischer Region in einem Abstand größer als 5 kb aus einer kommentierten TSS zu filtern. Verwenden Sie die "Entfernung zu TSS" Spalte in der Datei als Abstand zum Filtern. Speichern Sie die gefilterten Gipfeln in einer Excel-Datei namens "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. Shop die resultierende gefiltert Gipfeln in einer BedGraph-Datei mit Spalten: Chromosom, Start, Ende, und -log10(q-value). Benennen Sie die Datei "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. Bigwig Dateien für Browser Visualisierung erzeugt.
    1. Downloaden Sie und installieren Sie eine Software für Genom arithmetische18.
    2. Ein Tool zum Konvertieren von Bedgraph in Bigwig herunterladen und in das System zu installieren. Laden Sie die Datei "mm10.chrom.sizes".
    3. Verwenden Sie den Befehl in Abbildung S6A eine Bigwig-Datei generieren.
    4. Downloaden Sie und installieren Sie ein Genom Browser19 im System.
    5. Öffnen Sie die Genom-Browser und laden Sie die Datei "5kbup.geneBody.peakData.bigwig", die gefilterte bedeutende Gipfel und ihre Position in Bezug auf bekannten Genen zu visualisieren.
  9. Motiv Suche.
    1. Verschieben Sie in das Verzeichnis "motif.analysis".
    2. Herunterladen Sie eine de-Novo -Motiv Scannen und Motiv-Programm und installieren Sie es in Ihrem System20.
    3. Laden Sie eine umfassende Motiv-Datenbank, die Motive des Olig2 enthält.
    4. Erhalten Sie die Genomsequenzen von 500 bp Regionen zentriert auf erhebliche Peak Gipfeln. Speichern Sie die Sequenzen als peak.sequences.txt. Verwenden Sie den Befehl in Figur S7 Olig2 Motive innerhalb aller 500 bp Peak Regionen suchen.
    5. Filtern Sie die daraus resultierenden Motive mit einem angemessenen E-Wert (Standard = 0,05).

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Representative Results

Low-Cell ChIP-Seq durchgeführt wurde und bioinformatische Analysen wurden durchgeführt, um die potenziellen Wechselwirkungen der transcriptional Faktor Olig2 mit genomischer DNA in akut gereinigte Brain OPCs zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt einen allgemeine Workflow von der experimentellen und der Daten-Analyse-Verfahren. In diesem Protokoll wurden postnatale Mäuse Gehirne in einem einzelligen Suspension getrennt. Nach Gewebe Dissoziation wurde Immunopanning durchgeführt, um OPCs mithilfe PDGFRα Antikörper zu reinigen. Abbildung 2 zeigt die deutliche Anreicherung von PDGFRα, wenig Ausdruck der Neuron Marker Tuj1 (Neuron-spezifische Klasse III Beta-Tubulin), Astrozyten Markers GFAP (glial fibrillary sauren Protein), Mikroglia Marker ionisiertes Kalzium Bindung Adapter Molekül 1 (Iba1), Myelinating Reifen Oligodendrozyten Marker Myelin basic Protein (Mbp) und Myelin-Oligodendrozyt Glykoprotein (Mog) aus gereinigtem OPCs wie von RT-qPCR bewertet. Darüber hinaus gibt Immunostaining Ergebnis, dass der Großteil der Zellen NG2 positiv, wie in Abbildung 2dargestellt sind. Anschließend wurden 20 Tausend gereinigten OPCs pro Reaktion von Formaldehyd und Chromatin wurde mithilfe eines Systems Beschallung geschert. OLIG2 Low-Cell-ChIP wurde durchgeführt und die Bibliothek errichtet. Nach ChIP Bibliothek Vorbereitung wurde die Qualität des erzeugten Produkts von einem Mikrofluidik-Chip-Kapillar-Elektrophorese Gerät validiert. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel Electropherogram einer Olig2 Low-Cell ChIP Bibliothek. Ein klarer Höhepunkt der Oligo2 Bibliothek Produkt zwischen 250 bis 500 bp nach Größenauswahl Bibliothek PCR-Produktes sichtbar sein soll. Die ChIP-Seq-Bibliotheken der beiden Probe vorbereitet mit Olig2 Transkription Faktor Antikörper und die Kontrollprobe unterzogen wurden, Hochdurchsatz-Sequenzierung gepaart-Ende 50 produzieren Zyklus Sequenzierung mal gelesen. Mehr lesen Sie Längen verbessert die Mapping-Preise und verringert sich die Wahrscheinlichkeit von Multi-Mapping auf Kosten der Sequenzierung Kosten. Mit 50 bp ChIP-Seq gepaart-End Sequenzierung Bibliotheken sind in der Regel gute Ergebnisse erzielt.

Nach der ersten Qualitätskontrolle Beurteilung der rohen Lese- und Trimmen von Adaptern und nachgestellte minderwertige Basenpaare sind die Qualitätskontrolle Grundstücke in Abbildung 4dargestellt. Getrimmte liest sollte haben eine Basis Qualität größer als 30, keine Adapter-Sequenzen und haben eine geringe Vervielfältigung (Abbildung 4 b-D). Guter Qualität getrimmt liest erhöht sich die Gesamtrate der Ausrichtung. Andere Parameter wie GC-Gehalt sind ebenfalls wichtig und für das Trimmen betrachtet werden.

Sobald die Sequenzierung Proben ausgerichtet sind, ist es notwendig, die Sequenzierung Tiefe zu überprüfen. Es ist bekannt, dass die Anzahl der genannten Gipfel mit einer höheren Sequenzierung Tiefe zunehmen, da schwache Seiten statistisch bedeutsamer21werden werden. Eine Sättigung Analyse ist erforderlich, um eine ausreichend Sequenzierung Tiefe für jede spezifische Transkriptionsfaktor verwendet, auf Kosten des Zeit- und Budgetrahmens zu ermitteln. Eine Konsens Sequenzierung Tiefe für die Transkription Faktor Bindung ist durch das ENCODE-Konsortium bei Säugetieren Proben vorgeschlagen worden: ein Minimum von 10 Millionen eindeutig abgebildet liest für jeweils mindestens zwei biologische22repliziert. Die Anzahl der eindeutig zugeordneten liest und die Gesamtrate Ausrichtung wurden durch Lesen Sie Mapper berechnet. Abbildung 5Azeigt ein Beispiel für gute Zuordnung Metriken. Ausgerichteten Lesevorgänge sollten unterschiedliche genomische Standorte, zeigt eine entsprechende Bibliothek Komplexität, auch bezeichnet als Tag infektionsstaus zugeordnet werden. Das ENCODE-Konsortium legt nahe, dass mindestens 80 % der 10 Millionen ausgerichteten liest verschiedene genomische Regionen22zugeordnet werden sollen. Abbildung 5 b zeigt eine angemessene Tag infektionsstaus, in denen mehr als 90 % der liest nur eine genomische Position zugeordnet sind. Low-Complexity-Bibliotheken in der Regel auftreten, wenn nicht genügend DNA gewonnen, und die PCR verstärkt, dass immer wieder Fragmente sequenziert werden. Eine Bibliothek von geringer Komplexität ergibt eine hohe falschen Spitzenwert-Erkennungsrate.

Wenn Sie gepaart-End-ChIP-Seq-Daten verwenden, binden Fragmente um den Transkriptionsfaktor mit einem bestimmten Abstand der Trennung. Gepaart-End Sequenzierung erlaubt eine genauere Schätzung der mittlere Fragmentlänge nachgeben eine bessere Abschätzung der genomischen Regionen wo mehr Bindung aufgetreten ist. Der Strang Korrelation Plot zeigt einen Spitzenwert von Bereicherung, die vorherrschende Fragmentlänge entspricht. Wie in Abbildung 5feststellte, ist die berechnete Fragmentlänge 130 bp während lesen 50 dauert bp. Ein ChIP-Seq-Dataset wo die Fragmentlänge länger als das Lesen ist ist bezeichnend für hochwertige16.

Die Ausgabe des Peak Berufung ist eine Liste der genomischen Regionen voraussichtlich durch den Transkriptionsfaktor (oder seinen Komplex) gebunden zu sein. Die Liste der genomischen Regionen oder Gipfel ist in einer "Bett"-Datei enthalten, die in einem Genom-Browser angesehen werden kann. Für jeden Peak, diese Datei enthält eine Peak-ID, die genomische Lage des Gipfels Peak und FDR als - log10 (Q-Wert). Die deutlich erweiterte Gipfel sind diejenigen mit höheren Falz-Anreicherung und Bedeutung Metriken. Ein Beispiel für die Ausgabe-Peak-Datei ist in Abbildung 6Agezeigt. Nach Auswahl der bedeutendere Gipfeln, die verwenden benutzerdefinierte Schwellenwerte, Gipfeln im ENCODE Blacklist23Filterung und Identifizierung innerhalb eines Gens Promotorregion (5 kb upstream und ganze gen Körper) Spitzen eignet sich eine "Bigwig" Datei für die Anzeige von Gipfeln in einem Genom Browser. Die meisten angereicherten Peak Regionen haben eine höhere Wahrscheinlichkeit der Transkription Faktor Bindung. Es ist wichtig, Peak Präsenz in bekannten Transkription Faktor regulatorischen Regionen sowie Peak fehlen in Regionen wo Transkription Faktor Bindung unwahrscheinlich ist zu bestätigen. Abbildung 6 b -E zeigt Beispiele für Genregionen mit und ohne Spitze Bereicherung sowie ihre Position in Bezug auf ENCODE Förderer Regionen.

In Silico ergänzende Methoden zur ChIP-Seq-Experiment sind Motiv Anreicherung Analyse und de Novo Motiv Suche. Da Olig2 Bindung in OPCs vor nicht untersucht worden, Olig2 ChIP-Seq abgeleitet Gipfel Motoneuron Vorläuferzellen und embryonaler Stammzellen dienten für die de Novo Motiv Identifikation4,24. OLIG2 de Novo identifiziert Motive wurden hinzugefügt, um die umfassende ENCODE Motiv Datenbank25 und Motiv Anreicherung Analyse wurde durchgeführt. Hohe Anreicherung von de Novo identifiziert OLIG2 Motive und bekannten Transkription Faktor (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 und ASCL1) Motive in ChIP-Seq-Gipfeln der PDGFRα gereinigt Zellen gefunden wurden. Eine Bereicherung der 30 de Novo identifiziert Motive mit einem E-Wert < 0,05 entdeckt wurde. Abbildung 7 zeigt die beiden oberen de Novo identifiziert Motive der Olig2. Diese zwei de Novo identifiziert Olig2 Motive fanden sich in > 60 % von den ChIP-Seq-Gipfeln gewonnenen PDGFRα gereinigt Zellen zusätzlich zu bekannten Motiven.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über die Protokoll-Workflow. PDGFRα Positive OPCs aus postnatale mäusegehirnen isoliert wurden und wurden Olig2 ChIP zu experimentieren. Die ausgefällte DNA-Fragmente wurden verwendet für die Zubereitung von ChIP-Bibliothek. Nach Bewertung der Bibliothek Qualität wurden Proben für die Sequenzierung verwendet. Datensätze wurden analysiert, und Spitzen wurden identifiziert, zeigt potenzielle Olig2 Bindungsstellen im OPC Zellen gereinigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Beurteilung der Reinheit des Immunopanned OPCs von qPCR und Immunostaining. (A) PDGFRα Antikörper Immunopanned Zellen wurden ausgesät und Immunostaining mit OPC Linie Marker NG2 Antikörper durchgeführt wurde. Blau: DAPI, grün: NG2. Maßstabsleiste = 10 µm. (B) die relative Expression von Neuron Marker Tuj1 in gereinigten OPCs (PDGFRα +) und dissoziierten Gehirnzellen (Mix) wurden ausgewertet. Tuj1 Ausdruck in den dissoziierten Gehirnzellen wurde auf 1 festgelegt. (C) die relative Expression von Astrozyten Markers GFAP in gereinigten OPCs (PDGFRα +) und dissoziierten Gehirnzellen (Mischung) wurde evaluiert. GFAP Ausdruck in den dissoziierten Gehirnzellen wurde auf 1 festgelegt. (D) die relative Expression von OPC Marker PDGFRα in gereinigten OPCs (PDGFRα +) und dissoziierten Gehirnzellen (Mischung) wurde evaluiert. PDGFRα Ausdruck in den dissoziierten Gehirnzellen wurde auf 1 festgelegt. (E) die relative Expression von Myelinating Reifen Oligodendrozyten Marker Mog in gereinigten OPCs (PDGFRα +) und dissoziierten Gehirnzellen (Mischung) wurde evaluiert. Mog Ausdruck in den dissoziierten Gehirnzellen wurde auf 1 festgelegt. (F) die relative Expression von Myelinating Reifen Oligodendrozyten Marker Mbp in gereinigten OPCs (PDGFRα +) und dissoziierten Gehirnzellen (Mischung) wurde evaluiert. MBP Ausdruck in den dissoziierten Gehirnzellen wurde auf 1 festgelegt. (G) die relative Expression der Mikroglia Marker Iba1 in gereinigten OPCs (PDGFRα +) und dissoziierten Gehirn Zellen (Mischung) wurde evaluiert. Iba1 Ausdruck in den dissoziierten Gehirnzellen wurde auf 1 festgelegt. Daten in B-G darstellen, dreifacher Experimente und Fehlerbalken zeigen Standardfehler. T-test Analyse * P < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: ein Beispiel Electropherogram einer Bibliothek von niedrig-Cell-ChIP Olig2. Nach der doppelten Größenauswahl wurde die Qualität der Olig2 ChIP Bibliothek ein Mikrofluidik-Chip-Kapillar-Elektrophorese-Gerät analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Ergebnisse der repräsentativen Qualitätskontrolle für ein 50 bp lesen Sie Länge Low-ChIP-Seq Zellprobe. (A) Übersichtstabelle zeigt die Gesamtzahl der Lesevorgänge, Anzahl von schlechter Qualität liest, Sequenz Länge und insgesamt GC-Gehalt. (B) Plot zeigt die Verteilung der Basis Qualitätsfaktoren an verschiedenen Positionen in der liest. (C) Plot zeigt die mögliche Inhalte einer Adapter an verschiedenen Positionen in der liest. (D) Line Plot zeigt den Prozentsatz der dupliziert Sequenzen. Die Mehrheit der Lesevorgänge stammen aus Sequenzen, die nur einmal innerhalb der Bibliothek, daher ein geringen Überschneidungen oder hohe Bibliothek Komplexität zeigt vorkommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Qualitätskontrolle Metriken erhalten vor dem Gipfel-Aufruf: bowtie2 Ausrichtung Metriken, Strang Kreuzkorrelation und tag-infektionsstaus. (A) Ausrichtung Metriken aus lesen Sie Mapper gewonnen. Die wichtigsten Kennzahlen sind die Anzahl der eindeutig zugeordnete lesen Sie Paare, angegeben als "übereinstimmend genau 1 mal ausgerichtet" und die Gesamtausrichtung. (B) Histogramm zeigt die Tag-infektionsstaus. Balken zeigt den Prozentsatz der genomischen Positionen wo Stichworte gefunden wurden. (C) ein Beispiel für eine Kreuzkorrelation Plot zeigt Daten von guter Qualität. Rote Linien zeigen die lesen Sie Länge mit 50 bps und die vorherrschende Fragmentlänge bei 130 bps. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: ChIP-Seq Peak Regionen und Genom Browseransichten erhebliche ChIP-Seq-Gipfel an verschiedenen Standorten genomische. (A) Beispiel für die Peak-Regionen identifiziert mit dem Peak-Anrufer. (B) erhebliche ChIP-Seq Gipfeln im Gen Körper von Cspg4, einem bekannten OPC-Marker-Gen gefunden. (B) ohne ChIP-Seq-Spitzen wurden in den Promoter-Regionen oder in den gen-Gremien des Mbp-gen, ein Marker für Reifen Oligodendrozyten, (C) Tubb3, eine neuronale Zelle Marker oder (D) zuzuführen, eine Zelle Marker der Astrozyten gefunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: hochangereichertes de Novo identifiziert Motive der Olig2 in PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq-Gipfel gefunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung S1: Vorbereitung von Datensätzen ChIP-Seq. (A) Definition der Verzeichnis-Systemarchitektur. (B) Berechnung raw lesen Qualitätskontrolle Metriken. (C) Trimmen liest. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung S2: Ausrichtung der Lesezugriffe auf die Referenz-Genoms. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung S3: Qualitätskontrolle ausgerichteten Lesevorgänge an Adresse Strang Kreuzkorrelation und bestimmen Tag infektionsstaus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung S4: Peak anrufen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung S5: Annotation von bedeutenden Gipfeln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung S6: Umwandlung der BedGraph-Datei-Format in Bigwig für Peak Visualisierung im Genom Browser. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Figur S7: De Novo Motiv Suche und Motiv Bereicherung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Abbildung S8: Flussdiagramm beschreiben die Bioinformatik-Analyse der Daten der ChIP-Seq. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Säugetier-gen Verordnung Netzwerke sind sehr komplex. ChIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dieses Protokoll enthält Olig2 ChIP-Seq ausführen mithilfe von eine geringe Anzahl von gereinigten OPCs aus mäusegehirnen (so niedrig wie 20 Tausend Zellen pro Reaktion). Der erste wichtige Schritt für dieses Protokoll ist die Reinigung des OPCs von mäusegehirnen durch Immunopanning mit PDGFRα-Antikörper. Für positive Selektion der OPCs mit PDGFRα beschichteten Platten beschichtet OPCs oft schwach binden an die PDGFRα Platten. Auch nach mehreren Wäschen gibt es noch einige nicht-anhaftende Zellen links. Es ist wichtig zu überprüfen, dass die nicht-anhaftende Zellen nach jedem D-PBS unter dem Mikroskop waschen. Wenn weitere D-PBS waschen nicht hilft, um die Anzahl der nicht-anhaftende Zellen zu reduzieren, ist es Zeit, die markierten Zellen zu sammeln, da überschüssiges wäscht könnten beigefügten OPCs zu verdrängen und den Ertrag der gereinigten Zellen reduzieren. Jedoch können nicht genügend wäscht die Kontamination von andersartigen Gehirn Zellen führen. Daher ist jedes Mal nach Isolierung, es notwendig, die Reinheit der isolierten OPCs von Immunostaining mit OPCs Marker NG2 qPCR für den Ausdruck der bekannten Zelltyp-spezifische Gene wie Tuj1 für Neuronen, GFAP für Astrozyten zu bewerten, PDGFRα für OPCs, Iba1 für Mikroglia, und MOG und MBP für Myelinating Reifen Oligodendrozyten. Wie in Abbildung 2dargestellt, zeigt Immunostaining Ergebnis, dass die Mehrheit der gereinigten Zellen positiv für NG2 Färbung. Darüber hinaus einige klassische Zelltyp-spezifische Marker für Neuronen, Astrozyten und Mikroglia Myelinating Reifen Oligodendrozyten Ausstellung nicht nachweisbar oder extrem niedrige Ausdruck im gereinigten OPCs im Vergleich zu den ungereinigten Gehirn Zelle Mischung. PDGFRα weist hohe Expression Ebene im gereinigten OPCs im Vergleich zu den ungereinigten Gehirn Zelle Mischung. Immunopanning Methode, Mikroglia sind in den gereinigten OPCs im Vergleich zu den ungereinigten Gehirn Zelle Mischung stark reduziert, jedoch gibt es eine kleine Menge der Verunreinigung. Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Veröffentlichungen von anderen7,8,26. Darüber hinaus ist im Vergleich zu bisher veröffentlichten Berichte eine kommerziell erhältliche Kit in diesem Protokoll für die standardisierte, effiziente und bequeme Dissoziation von Hirngewebe in einzellige Suspensionen verwendet.

Nach der Vernetzung der gereinigten OPCs, vernetzten Zellen sollte mit eiskalten HBSS Lösung gewaschen werden und die verbleibenden Schritte der ChIP sollte bei 4 ° C durchgeführt werden, kann nicht sonst der Antikörper die genomische DNA richtig Niederschlag.

Der nächste wichtige Schritt in diesem Protokoll bereitet Bibliothek. Die PCR-Amplifikation des ChIP Material diente Bibliotheksbau. Die Anzahl der PCR-Zyklen für Bibliothek Vorbereitung richtet sich nach der Menge an DNA ab. Eine gute Bibliothek Vorbereitung erfordert genaue Quantifizierung der eingangsbetrag DNA. Zu viele oder zu wenige PCR-Zyklen können Bibliothek Konzentration sowie die Komplexität führt zu PCR Artefakte beeinflussen.

Es ist schwierig, um ChIP-Seq-Bibliothek zu konstruieren, wenn Sie eine begrenzte Anzahl von Zellen für Immunopräzipitation27zu verwenden. Die bisher verwendete standard ChIP-Protokoll erfordert 10 ng von Immunoprecipitated DNA-ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung1,28. Allerdings erzeugt das Protokoll beschrieben hier normalerweise 2 ng von Immunoprecipitated DNA durch Olig2 Antikörper von 20.000 OPCs. DNA wird verwendet, um bereiten die ChIP-Seq-Bibliothek durch einen einstufigen Adapter Methode, die es ermöglicht verbesserte Empfindlichkeit ermöglicht Pikogramm Immunoprecipitated DNA verstärkt werden. Durch die Kombination von kommerziellen Kits, bietet dieses Protokoll eine praktische Lösung um ChIP-Seq für transcriptional Faktoren basierend auf eine kleine Anzahl von Zellen zu vollziehen.

Wichtig ist, ist die niedrige Zelle ChIP-Seq-Protokoll beschrieben für ChIP-Seq von anderen Transkriptionsfaktoren in Primärzellen oder seltene Zellpopulationen sowie anwendbar. In diesem Protokoll verwendeten Antikörper müssen experimentell überprüft werden, um eine spezifische IP-Experiment zuerst. Unspezifische Bindung von Antikörpern führt zu schlechten Ergebnissen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, dieses niedrige Zelle ChIP-Seq-Experiment in Zellen mit einem hohe Expression des Transkriptionsfaktors Interesse durchzuführen.

Für die Datenanalyse kann es schwierig zu entscheiden, welche Werte als trenngrenzen nach dem Aufruf von Peak-Filterung zu benutzen sein. Je nach Zielsetzung der Analyse können strengere oder entspannter Parameter verwendet werden. In der Regel wird eine Kombination von Fach-Anreicherung und p-Wert oder FDR verwendet. Wenn einige Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors unter Studie zuvor bekannt waren, kann dies helfen bei der Bestimmung der Filterung Schwellen. Transkription Faktor Bindung Website Datenbanken aus öffentlich verfügbaren ChIP-Seq-Experimente in verschiedenen Zelllinien und Bedingungen wurden kompilierte29,30. Man könnte ein Gen suchen und prüfen, ob Transkription Faktor Bindungsstellen zuvor gefunden wurden. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass Transkription Faktor Bindungsstellen unterscheiden sich je nach Zelltypen und Bedingungen.

In Silico ergänzende Methoden zur ChIP-Seq-Experiment sind Motiv Anreicherung Analyse und de Novo Motiv Suche mit MEME-ChIP20 oder ähnlichen Programmen. Die Motiv-Suche erfordert ein umfassendes bekannt und de Novo abgeleitet Motiv-Datenbank z. B. ENCODE Motive25 oder die Hocomoco-Datenbank-31. Hocomoco ist eine Datenbank mit Motiven aus öffentlich zugänglichen Mensch und Maus ChIP-Seq-Experimente entdeckt. Wenn Motive für das vermutlich Protein unbekannt sind, könnten die de Novo Motiv Suche repetitiven Sequenz Muster in ein erheblicher Anteil der Gipfel als neue Motive zeigen. Die kombinatorische Handlungsmöglichkeiten von Transkriptionsfaktoren kann vorgestellt werden, wenn Motive von anderen Transkriptionsfaktoren auch gefunden werden, in den sich daraus ergebenden Gipfeln bereichert werden.

Angereicherte Peak Regionen können experimentell validiert werden, indem das Chromatin der mutierten oder Knockout-Zellen als Steuerelemente verwenden. Durchführung von ChIP-Seq mit Zellen, die nicht mit dem Ausdruck der Transkriptionsfaktor dienen zur Identifizierung von falsch positiven Gipfel, auch bezeichnet als "phantom Peaks"32. Falsch positive Ergebnisse herausgefiltert werden.

Es ist auch interessant, die daraus resultierende ChIP-Seq-Spitzen mit transkriptomischen Daten zu vergleichen. Die PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq-Gipfel wurden mit der Expression von Genen in OPCs aus einer früheren Veröffentlichung18verglichen. Diese Strategie kann eingeschränkt sein, da Mechanismen als Olig2 Transkription Faktor Bindung exprimierten Genen in OPCs gesteuert werden können. Darüber hinaus Olig2 Transkriptionsfaktor kann ein Gen regulatorischen Region binden aber das Gen möglicherweise niedrige Gen-Ausdruck-Ebene durch mögliche hemmende Mechanismen oder der Mangel an Co Faktoren für Gentranskription notwendig.

ChIP-Seq ist eine Methode zur Identifizierung von genomweite DNA Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und andere Proteine verwendet. Jedoch durch Analyse der gleichzeitige Auftreten von Transkriptionsfaktoren fanden Forscher, dass Transkriptionsfaktoren sind in der Regel mit anderen Proteinen bilden Co Module33zuordnen. Das bedeutet einige Bindungen zwischen transcriptional Faktoren und genomischer DNA revealed von ChIP-Seq sind indirekte und überbrückte durch andere Proteine. Daher, um aussagekräftigere Ergebnisse zu erzielen Forscher sollten mehrere Transkriptionsfaktor gleichzeitig zu studieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

JQW, XD, RCDD und YY wurden durch Zuschüsse aus den nationalen Instituten der Gesundheit R01 NS088353 gestützt; NIH Grant 1R21AR071583-01; die Staman Ogilvie Fonds-Memorial Hermann Foundation; die UTHealth Gehirn Initiative und CTSA UL1 TR000371; und ein Stipendium an der University of Texas System Neurowissenschaften und Neurotechnologie Research Institute (Grant #362469).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/ Equipment
Banderiaea simplicifolia lectin 1 Vector Laboratories # L-1100
Rat anti-PDGFRa antibody BD Bioscience # 558774
Neural tissue dissociation Kit (P) MACS Miltenyi Biotec # 130-092-628
Accutase STEMCELL technologies # 07920
TRIzol Thermo Fisher # 15596026
Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody Millipore # AB5320
Bioruptor Pico sonication device Diagenode # B01060001
True MicroChIP kit Diagenode # C01010130
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher # 15593031
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit MACHEREY-NAGEL # 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher # P11496
DNA SMART ChIP-Seq kit Clontech Laboratories # 634865
Agencourt AMPure XP Beckman Voulter # A63880
GlycoBlue Thermo Fisher # AM9516
pico-green Thermo Fisher # P11496
D-PBS Thermo Fisher # 14190-144
SYBR Green master mix Bio-Rad Laboratories # 1725124
DMEM/F12 Fisher Scientific # 11-320-033
Penicillin-Streptomycin (P/S) Fisher Scientific # 15140122
N-2 Supplement Fisher Scientific # 17502048
B-27 Supplement Fisher Scientific # 17504044
insulin Sigma # I6634 Prepare 0.5 mg/ml insulin solution by dissolving 5 mg insulin in 10 ml water and 50 μl of 1 N HCl.
Bovine Serum Albumin, suitable for cell culture (BSA) Sigma # A4161 Prepare 4% BSA solution by dissolving 4 g BSA in 100 ml D-PBS and adjust the pH to 7.4
Fibroblast Growth Factor basic Protein, Human recombinant (bFGF) EMD Millipore # GF003
HUMAN PDGF-AA VWR # 102061-188
poly-D-lysine VWR # IC15017510 Prepare 1 mg/ml poly-D-lysine solution by dissolving 10 mg poly-D-lysine in 10 ml water and dilute 100 times when using.
Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 100x15mm VWR # 25373-100
Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning, 150x15mm VWR # 25373-187
HBSS, 10X, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red Fisher Scientific # 14185-052
Trypan Blue Stemcell Technologies # 07050
protease inhibitor cocktail Sigma # 11697498001
Software
FastQC [10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Obtaining quality control metrics of raw and trimmed reads
Trimmomatic 0.33 [11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic Trimming and filtering raw reads
GENCODE mm10 ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz Mouse reference genome
Bowtie2 2.2.4 [12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml Aligning reads to a reference genome
SAMTools 1.5 [13] http://samtools.sourceforge.net/ Converting SAM file into BAM format
HOMER 4.9.1 [14] http://homer.ucsd.edu/homer/ Creating a tag directory and annotating enriched genomic regions with gene symbols
R 3.2.2 [15] https://www.R-project.org/ Programming scripts and running functions
SPP 1.13 [16] https://github.com/hms-dbmi/spp Creating a strand cross-correlation plot
MACS2 2.2.4 [17] https://github.com/taoliu/MACS Finding regions of ChIP enrichment over control
BEDTools 2.25 [18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Genome arithmetics
bedGraphToBigWig http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/ Converting bedGraph file into bigwig
IGV browser 2.3.58 [19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/ Visualization and browsing of significant ChIP-seq peaks
Microsoft Excel Spreasheet program
ENCODE's blacklist https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists Filtering peaks
mm10.chrom.sizes http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes. Converting bedGraph file into bigwig
ENCODE's motif database [25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/ Comprehensive motif database required for motif enrichment
MEME-ChIP [20] http://meme-suite.org/index.html Motif enrichment analysis and motif discovery
Primer names used for qPCR Primer sequences used for qPCR
Mbp-F: CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R: AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F: ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R: GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F: GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R: TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-F ATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-R CATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-F TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-R GATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-F AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-R GTCCCTCCACGGTACTCCT

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References

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565 (2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669 (2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562 (2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

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Neurowissenschaften Ausgabe 134 OPCs Olig2 Low-Cell ChIP-Seq transkriptionelle Regulation Immunopanning MACS2
Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt
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Dong, X., Cuevas-Diaz Duran, R.,… More

Dong, X., Cuevas-Diaz Duran, R., You, Y., Wu, J. Q. Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRα+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis. J. Vis. Exp. (134), e57547, doi:10.3791/57547 (2018).

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