Summary
نحن لتوضيح كيفية إجراء تعديل التسجيل والكهربائية النشاط الناجم عن 4-أمينوبيريديني صرعية في الدماغ القوارض الشرائح باستخدام صفائف ميكرويليكترودي. وتحتفظ دائرة تسجيل مخصص صلاحية الأنسجة طوال دورات تجريبية طويلة. يعيش القطب رسم الخرائط واختيار أزواج حفز يؤديها واجهة مستخدم رسومية مخصصة.
Abstract
صرع الفص الصدغي (TLE) هو مرض الصرع المعقدة الجزئية الأكثر شيوعاً وأقل استجابة للأدوية. تحفيز الدماغ العميق (DBS) نهج واعدة عند فشل العلاج الدوائي أو لا يوصي بجراحه الأعصاب. شرائح الدماغ الحادة بالإضافة إلى ميكروليكترودي صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) تمثل أداة قيمة لدراسة التفاعلات شبكة الخلايا العصبية والتحوير واسطة التحفيز الكهربائي. مقارنة بتقنيات تسجيل خارج الخلية التقليدية، وأنها توفر مزايا إضافة عدد أكبر من نقاط المراقبة ومسافة بين قطب معروفة، والتي تسمح لدراسة مسار الدعوة وسرعة الكهربية الإشارات. ومع ذلك، قد يكون الأوكسجين الأنسجة تضعف إلى حد كبير أثناء طيران الشرق الأوسط تسجيل، والتي تتطلب معدل التروية عالية، والتي تأتي على حساب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وذبذبات أعلى في درجة حرارة التجريبية. التحفيز الكهربائي كذلك تشدد على أنسجة المخ، مما يجعل من الصعب متابعة التسجيل المطول/التحفيز الأزمان. وعلاوة على ذلك، يحتاج التحوير الكهربائية لنشاط الدماغ شريحة لاستهداف الهياكل/مسارات محددة ضمن شريحة الدماغ، التي تتطلب أن قطب كهربائي يمكن بسهولة وسرعة تنفيذ التعيين لايف خلال التجربة. نحن هنا، لتوضيح كيفية إجراء تعديل التسجيل والكهربائية من 4-أمينوبيريديني (4AP)-التي يسببها النشاط صرعية في الدماغ القوارض الشرائح باستخدام مستو الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. نظهر أن أنسجة المخ التي تم الحصول عليها من الفئران يتفوق أنسجة المخ الفئران، وهكذا أكثر ملاءمة لتجارب طيران الشرق الأوسط. ويضمن هذا البروتوكول الاستمرار في توليد والحفاظ على نمط مستقر صرعية إخلاص يستنسخ الميزات الكهربية لاحظ مع تسجيل المحتملة في الميدان التقليدي، واستمرت لعدة ساعات، وأووتلاستس التحفيز الكهربائي لفترات طويلة. صلاحية الأنسجة في جميع أنحاء التجربة يتحقق بفضل استخدام دائرة تسجيل مخصص صغيرة الحجم مما يتيح معدلات التروية الاندفاق الصفحي وتبادل الحلول السريعة حتى في منخفض (1 مل/دقيقة). تعيين شركة طيران الشرق الأوسط سريعة للرصد في الوقت الحقيقي والتحديد لتحفيز كهربائي يقوم بواجهة مستخدم مخصصة رسومات (GUI).
Introduction
الصرع اضطراب تقدمية مهددة للحياة تسبب النشاط غير المنضبط ل الدماغ1؛ وهو يحمل بين أعلى عبء المرض والوصمة الاجتماعية الهامة2،3. TLE هو متلازمة الأكثر شيوعاً (40 ٪) والأكثر في كثير من الأحيان (~ 30 ٪) مقاومة للأدوية المضادة للصرع4. بينما يمكن تحسين الاستئصال الجراحي للأنسجة ابيليبتوجينيك حالة المريض، ليس ممكناً في جميع المرضى وقد لا تضمن حياة خالية تماما من الاستيلاء على5. التحوير للصرع الشبكات الكهربائية DBS الحوفي نهج واعدة عند العلاج الدوائي أو جراحة الأعصاب ليست مناسبة.
شرائح الدماغ القوارض أداة قيمة لدراسة وظيفة الشبكات العصبية كيف في الصحة والمرض6 عن طريق تقنيات في المختبر الكهربية، كما أنهم الاحتفاظ، على الأقل في جزء الهندسة المعمارية والربط في الدماغ الأصلي region(s) للفائدة (العائد على الاستثمار). على وجه الخصوص، الحصين مجتمعة الأفقية-انتورهينال اللحاء (الحصين-EC) شرائح تشمل الشبكات العصبية الأساسية المشتركة في TLE ولذلك تستخدم بشكل روتيني في المختبر TLE البحث7.
قد يتسبب نشاط مثل الاستيلاء حادة في شرائح المخ بتغيير تكوين السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام)، مثل انخفاض المغنيسيوم مع زيادة البوتاسيوم8،،من910، الأيونية أو عن طريق التلاعب الدوائية، مثل حظر المثبطة جابايرجيك النشاط (انظر11 لإجراء استعراض شامل). ومع ذلك، هذه النماذج تستند إلى تحوير غير متوازن من الإثارة وتثبيط؛ وهكذا، لا تسمح دراسة تفاعل وتضافر مساهمة الشبكات عليه والمثبطة إيكتوجينيسيس. يحسن التروية المستمرة من شرائح المخ مع 4AP المخدرات الاختلاج كبيرة عليه والمثبطة على حد سواء، مما يسمح بدراسة إيكتوجينيسيس الحاد مع إبقاء نشاط متشابك عموما سليمة12.
الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف السماح لتسجيل النشاط الكهربائي إنشاؤها بواسطة الشبكات العصبية من عدد أكبر من نقاط المراقبة بالمقارنة مع تسجيل الحقل خارج الخلية التقليدية المحتملة، حيث تحد القيود المكانية عدد الأقطاب الكهربائية التي يمكن أن تكون إيواء على سطح شريحة الدماغ. وعلاوة على ذلك، رقائق طيران الشرق الأوسط توفر ميزة إضافية من المعروفة بين القطب المسافة، وهو أمر مفيد جداً لنشر تتبع وتقييم سرعة السفر من الإشارات المسجلة. على الرغم من أن تصور في البداية للتسجيل من الخلايا العصبية مثقف13،14، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الآن تستخدم أيضا لوصف الميزات الكهربية من شرائح المخ الحادة التي تم الحصول عليها من القوارض15 والبشر16. وهكذا، في سياق البحوث الصرع، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تمثل أداة قيمة لتحديد التفاعلات الشبكات العصبية في صميم إيكتوجينيسيس16،،من1718.
ومع ذلك، يحمل تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط أصلاً التحديات التقنية في الحصول على أو المحافظة على نمط صرعية مستقرة في جميع أنحاء البروتوكولات التجريبية منذ فترة طويلة (عدة ساعات). أولاً، الأوكسجين الأنسجة قد لا تكون كافية داخل الكبيرة والجولة تسجيل نوع أغرقت الدائرة19،20 النموذجية المتاحة تجارياً الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، في حين قد تؤثر على نسبة الإشارة إلى الضوضاء الفقراء وعدم استقرار درجة الحرارة جودة التسجيل عندما يتم استخدام معدل التروية عالية (6-10 مل/دقيقة) لتحسين إمدادات الأكسجين بشريحة الدماغ (انظر على سبيل المثال الملاحظات التقنية على معدات التدفئة ونضح21). التصريفات المتكررة، والثاني يضم المكونات ذات تردد عال، مثل التصريفات صرعية، لا يكاد يلاحظ عند استخدام تسجيل نوع المغمورة الدوائر19؛ هذا هو الحال بصفة خاصة عندما نمط صرعية الحادة هي التي يسببها كيميائيا وينطوي على آليات افابتيك، كما هو الحال بالنسبة لنموذج 4AP22 (انظر11 لنظره شاملة). للتغلب على هذه القيود، اقترحت عدة استراتيجيات للباحثين. على سبيل المثال، زيادة في معدل التروية19،20 مع تقليل سمك شريحة الدماغ (دي ثري زيرو زيرو ميكرومتر) ومنطقة،من1718 عوامل حاسمة في تحقيق إمدادات الأكسجين الكافي للأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تحقيق صلاحية شريحة الدماغ تحسين باستخدام مثقب الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (بمياس)، التي تسمح بيرفوسينج أنسجة المخ من كلا الجانبين18.
بينما وصف النهج التي تحسنت كثيرا إمكانية تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط من شرائح المخ، أنهم لم يتم اختبارها ضد لفترات طويلة (عدة ساعات) دورات تنشيط التسجيل والكهربائية، تمثل هذه الأخيرة كبيرة الإجهاد لانسجة المخ. قد يلزم دورات التسجيل المطول لدراسة التطور في الوقت المناسب سمات المحددة لأنماط صرعية أن عدم التمكن من كشف بالقياسات القصيرة الأجل. قد يلزم في سياق البحوث DBS، البروتوكولات التجريبية المطول لتقييم ومقارنة آثار عدة نماذج التحفيز في شريحة الدماغ نفسه.
عندما يحتاج فقط النشاط الكهربائي العفوية التي سيتم تسجيلها، رسم الخرائط من أقطاب فيما يتعلق بالعائد على الاستثمار عادة ما يتم اللاحق، أيأثناء تحليل البيانات؛ بدلاً من ذلك، يتطلب دراسة الاستجابات مقولة أو نماذج neuromodulation الكهربائية أن التحفيز تسليمها إلى ROI(s) محددة، يملي ضرورة تعيين مسرى حية سهلة وسريعة أثناء التجربة.
وهنا، نحن توضيح بروتوكول تجريبي بسيط يسمح للاستقراء والحفاظ على نمط مستقر صرعية 4AP المستحثة في شرائح الدماغ القوارض الكبار. النشاط الملاحظ إخلاص يستنسخ الكهربية ميزات هذا الطراز كما يتميز باستخدام التقنيات التقليدية خارج الخلية الكهربية. أنها استمرت لعدة ساعات وأووتلاستس التحفيز الكهربائي المتواصل للعهود الطويلة المتكررة. الدوائر المستخدمة للحفاظ على واحتضان الشرائح المخ يمكن بسهولة تجميع باستخدام اللوازم المختبرية القياسية (الشكل 1A)، بينما يمكن دائرة تسجيل مخصص يسمح لسعر الصرف الحل الأمثل وتدفق الصفحي (الشكل 1B) يمكن الحصول عليها من مصادر تجارية أو باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد بسعر في متناول. تعيين سريعة من ROI(s) للرصد في الوقت الحقيقي واختيار أقطاب محفزة بفضل واجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام مخصص المسمى مابميا، متاحة عند الطلب.
رقم 1: معدات مخصصة تستخدم هذا البروتوكول. (أ) عقد الدوائر للإنعاش وقبل الاحترار، ومرحلة ما قبل الاحتضان في 4AP يتم تجميعها باستخدام كوب وطبق بيتري. يجب أن تكون أقل في القطر قواطع طبق بيتري ويقام في مكان عن طريق المكبس المحاقن. يتم استبدال الجزء السفلي من صحن بيتري شبكة نايلون (من جوارب ناعمة) لاصق مع cyanoacrylate على حافة الطبق بيتري. يتم توفير الأوكسجين عن طريق إبرة العمود الفقري بنت (22 ز)، تدخل بين جدران صحن بتري والكأس. وينبغي أن الناشئة فقاعات من جانب الكأس والوصول إلى شبكة النايلون لتجنب تشريد شريحة الدماغ ابدأ. يمكن استخدام الجزء العلوي من طبق بيتري كغطاء لتجنب التبخر قام والحفاظ على تشبع الأكسجين. (ب) دائرة تسجيل مخصص. في: مدخل الخزان لاستيعاب قنية تدفئة ومسرى مرجع. بها: منفذ خزان لاستيعاب إبرة الشفط. تفصيل: تسجيل الدائرة. ماصة "باستور" (ج) الزجاج، كرة لولبية من الحريق وتلميع، تستخدم للتعامل مع الأنسجة وتعديل موقفها داخل قاعة تسجيل. الربط هولددوون شريحة مخصصة (د). (ﻫ) التجميع النهائي لدائرة تسجيل المركبة على رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط. شريحة الدماغ تقع على الجزء السفلي الذي عقد في مكان بالمرساة. السهم الأحمر يشير إلى الأنبوب PTFE تغطي قنية التدفئة، بينما تشير الدائرة الحمراء إلى مسرى مرجع، بيليه بوكل مشبعة المغمورة التي قام في مدخل الخزان. السهم الأزرق يشير إلى إبرة شفط في الخزان منفذاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها الوزارة الإيطالية للصحة (إذن أ. 860/2015-PR) امتثالا الاتحاد الأوروبي توجيه 2010/63/EC على الرفق بالحيوان.
1-التحضير للجمعية دائرة الشرق الأوسط وأفريقيا/مخصص
ملاحظة: بدء تشغيل 2 أيام قبل التجربة. استخدام طيران الشرق الأوسط دون خاتم (انظر الجدول المواد).
-
تنظيف في شركة طيران الشرق الأوسط (المدة: 35-40 دقيقة).
- يذوب مسحوق أنظف الانزيمية في الماء المقطر الدافئ. فرشاة الحارة تنظيف الحل على سطح طيران الشرق الأوسط ثم نقع في شركة طيران الشرق الأوسط إلى الحارة تنظيف الحل على الأقل 3 ح.
- شطف اتفاق بيئي متعدد الأطراف جيدا بالماء المقطر والجاف باستخدام أنسجة الصفر لا خالية من الوبر.
-
تجميع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع دائرة التسجيل (المدة: 10 دقيقة + بين عشية وضحاها).
- موزعة بالتساوي تسرب المرنة على السطح السفلي لدائرة التسجيل. تأكد من أن هناك لا فقاعات.
- جبل في دائرة التسجيل على شركة طيران الشرق الأوسط بمساعدة الملقط وتطبيق ضغط لطيف. إذا كان هناك أي فقاعات، طفيفة نقل الدائرة في دائرة أثناء تطبيق ضغط لطيف مع الأصابع حتى اختفت جميع الفقاعات. انتشار طبقة لتسرب على طول الطريق حول الحد الخارجي لدائرة التسجيل.
ملاحظة: الحرجة! ولا تغطي الاتصالات اتفاق بيئي متعدد الأطراف مع التسرب. - مكان الجمعية اتفاق بيئي متعدد الأطراف/الدائرة داخل 15 سم طبق بيتري. مكان طبق بيتري 5 مل أو 10 مل كوب مملوءة بالماء المقطر قريبة اتفاق بيئي متعدد الأطراف. وتغطي كل شيء من أجل الحفاظ على بيئة رطبة. واسمحوا علاج في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
-
معطف اتفاق بيئي متعدد الأطراف تجعل من ماء (المدة: 5-10 دقيقة + بين عشية وضحاها).
- ضع شركة طيران الشرق الأوسط إلى 15 سم طبق بيتري. من أجل 50 ميليلتر من بولي-د-يسين على مجال تسجيل اتفاق بيئي متعدد الأطراف. أغلق طبق بتري وختم عليه بختم الفيلم، وتخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف اتفاق بيئي متعدد الأطراف دقة باستخدام الماء المقطر وتخزينها في الشرق الأوسط وأفريقيا في 4 درجات مئوية في الماء المقطر.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن تخزين المغلفة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وإعادة استخدامها لعدة تجارب. بشكل روتيني تنظيف وإعادة طلاء اتفاق بيئي متعدد الأطراف يساعد على إزالة الحطام الأنسجة وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
2-إعداد حلول الأسهم
ملاحظة: تبدأ يوم 1 قبل التجربة (المدة: ح ~ 2). تساعد حلول الأسهم تسريع التجربة في يوم التجريبية. ويمكن إعدادها مسبقاً وتخزينها. انظر الجدول 1 لمعامل التركيز وتكوينها. الرجوع إلى الجدول 2 لتكوين الحلول النهائية.
- حل المواد الكيميائية في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. تصفية الحلول الأسهم مع زجاجة تصفية (تصفية القطر: 0.22 ميكرومتر).
- مخزن عند 4 درجة مئوية (انظر الجدول 1 أوصت الوقت الحد الأقصى لسعة التخزين).
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
3-إعداد أجار
ملاحظة: تبدأ يوم 1 قبل التجربة (المدة: ~ 1 ح).
- صب 250 مل ماء المقطر في كوب 500 مل وتبدأ إثارة في 350 دورة في الدقيقة. إضافة 5 غ أجار والانتظار حتى أنه يذوب تماما.
- الحرارة الحل في 250-300 درجة مئوية. واسمحوا الماء يتبخر حتى يصبح الحل ~ 200 مل أن تسفر عن حل أجار 2.5% w/v.
ملاحظة: يجب أن تكون درجة الحرارة مرتفعة بما يكفي للسماح للمياه تتبخر دون محتدما. - صب محلول أجار على مربع مربعة بلاستيك 200 مل من ~1.5 سم ارتفاع الجدران وندعه يبرد في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح صلبا.
- تغطية المربع وتخزينها في 4 درجات مئوية. كتلة أجار جيدة لعدة أسابيع.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
4-إعداد الطائرة المجمدة
ملاحظة: تبدأ يوم 1 قبل التجربة.
- ملء وعاء مسطحة القاع فولاذ المقاوم للصدأ مع الماء المقطر حتى 0.5-1 سم تحت الحافة.
- تخزين في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
5-إعداد قطع قام محصن
ملاحظة: تبدأ يوم 1 قبل التجربة أو في نفس اليوم من التجربة (انظر الجدول 1 و الجدول 2) (المدة: 30 دقيقة).
- صب 200 مل ماء المقطر في كوب 500 مل وتبدأ إثارة استخدام محرض مغناطيسية 350 لفة في الدقيقة.
- إضافة 50 مل أسهم ب و 50 مل من الأسهم ج (انظر الجدول 1).
- إضافة حمض بيروفك 3 مم السكروز 208 مم، 10 مم د-الجلوكوز وحمض الأسكوربيك L 1 مم.
ملاحظة: الحجم الفعلي لحمض بيروفك يعتمد على كثافة والنقاء وقد تختلف مع المجموعة. حساب حجم المطلوب دائماً عند فتح دفعة جديدة. - تغطية مع ختم الفيلم وترك إثارة لمدة 30 دقيقة.
- نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل وإضافة الماء المقطر لملء في قارورة.
- ختم دورق حجمي مع ختم الفيلم، وعكس بلطف 3-5 مرات حتى الحل الواضح بالتساوي.
- نقل قطع قام في زجاجة زجاج مع غطاء.
- تخزين قطع قام في-80 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها لتبريد وصولاً إلى 4 درجات مئوية.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا إذا بين عشية وضحاها التبريد المفضل. إلا أن الوقت اللازم لتبريد قطع قام يمكن استخدامها لمتابعة الخطوة 6.
6-إعداد عقد قام
ملاحظة: تعد الطازجة الحل اليوم للتجربة (المدة: 5-10 دقيقة). عقد ستستخدم قام شطف شرائح الدماغ من قطع قام أثناء إجراء تشريح (راجع الخطوة 8.16) والدماغ شريحة التخزين الطويل الأجل والاحترار مسبقاً. شطف شرائح المخ، 100 مل عقد قام كافية. الدوائر عقد وقبل ارتفاع درجات الحرارة المستخدمة في هذا البروتوكول هي مصنوعة خصيصا وتحتوي على كمية من 300 مل و 100 مل، على التوالي (انظر الشكل 1A). باستخدام هذا الإعداد، 500 مل عقد قام كافية. الدوائر التي تم الحصول عليها من مصادر تجارية قد يحتوي على وحدة تخزين مختلفة، التي ينبغي تعديل الحالة المبلغ الإجمالي لعقد قام إعداد وفقا لذلك.
- صب 200 مل ماء المقطر في دورق حجمي 500 مل.
- إضافة 50 مل أسهم A 50 مل من الأسهم ب، 6.5 مل من الأسهم م و 1 ملم حمض الأسكوربيك L. بلطف تحرض استخدام الحركات الدورية حتى يذوب حمض الأسكوربيك L تماما.
- إضافة المقطر المياه من الوصول إلى وحدة التخزين النهائي، ختم دورق حجمي مع ختم الفيلم، وعكس بلطف 3-5 مرات حتى الحل الواضح بالتساوي. الرجوع إلى الجدول 2 لإجراء التكوين قام.
7-إعداد مقاعد التجريبية
ملاحظة: هذا يتطلب 15 دقيقة، بالإضافة إلى 30 دقيقة للحصول على درجة حرارة ثابتة لحمام دافئ.
-
تسجيل البدلاء
- بدء حمام دافئ وتعيينها إلى 32 درجة مئوية، وتغطية ذلك للحفاظ على درجة الحرارة.
ملاحظة: يمكن حمام دافئ المستخدمة في هذا البروتوكول مصنوعة خصيصا باستخدام مربع بلاستيكية الصلبة وحوض السمك الحرارة المحددة مسبقاً في درجة الحرارة المطلوبة. قد بلغت درجة الحرارة المرغوبة المطرد في ~ 30 دقيقة بدءاً من درجة حرارة الغرفة. منذ الجلوس الدوائر قبل الاحترار وتحضين في الجزء السفلي من مربع البلاستيك، منسوب المياه ينبغي أن يكون ما يكفي لتغطية الحرارة بغية إبقاء الدوائر من العائمة. - التجمع بعقد والدوائر قبل الاحترار (انظر الشكل 1A)، ومن أجل عقد قام فيها. تبقى الدائرة عقد في درجة حرارة الغرفة ومكان قاعة الاحترار مسبقاً داخل حمام دافئ. بدء محتدما الحلول مع س 95%2CO 5%2 خليط الغازات وإزالة أي فقاعات المحاصرين ماصة باستور مقلوب باستخدام. تبقى مغطاة.
- بدء حمام دافئ وتعيينها إلى 32 درجة مئوية، وتغطية ذلك للحفاظ على درجة الحرارة.
-
تشريح مقاعد البدلاء وفيبرتوم
- الصق كتلة أجار صغير في وسط القرص العينة باستخدام الغراء cyanoacrylate.
- وضعت كوب 250 مل دلو الجليد وصب قطع قام في ذلك.
- تأخذ اثنين 100 مل قنينة وصب 50 مل عقد قام في كل منهما. ترك قنينة في درجة حرارة الغرفة. هذه هي قنينة الشطف.
- بدء محتدما الحلول مع س 95%2CO 5%2 مزيج غاز.
- جبل علبة المخزن المؤقت على فيبرتوم وتحيط بها مع الثلج المجروش. من أجل بعض الإيثانول على الجليد المجروش للمساعدة في الحفاظ على درجات حرارة باردة أثناء إجراء تشريح. بعد صب الإيثانول، إضافة مزيد من الجليد حسب الحاجة.
ملاحظة: درجة حرارة 2 درجة مئوية الأمثل. - ضع بوبلير داخل علبة المخزن المؤقت، ثم تجميع وتحميل كتلة بليد فيبرتوم.
ملاحظة: تأكد من أن الشفرة محمل في زاوية إزالة ~ 10 °. - طرح الثلج المجروش في كوب 500 مل إلى 2/3 من حجم وملء مع الماء المقطر.
- تأخذ وعاء المجمدة من الثلاجة ووضعه رأسا على مقاعد البدلاء تشريح، وتغطية ذلك مع منشفة ورقية وقرص ورق الترشيح.
-
مقاعد البدلاء التخدير
- وضع وعاء صغير في علبة مليئة بالجليد وصب قطع قام بذلك. بدء محتدما مع س 95%2CO 5%2 مزيج غاز.
8-الدماغ شريحة الإعداد والصيانة
ملاحظة: هذا البروتوكول يجعل استخدام من الكبار (4-6 أسابيع من العمر) يمكن استخدام الفئران الذكور CD1، لكن سلالات أخرى (مثلاً،،c57/bl61718). ونحن أيضا في وقت لاحق مقارنة الإخراج التجريبية المتحصل عليها باستخدام شرائح المخ الماوس مع أن تسفر عن حلول شرائح الدماغ التي تم الحصول عليها من الفئران سبراغ داولي الذكور من نفس الفئة العمرية. الخطوات التالية تشير إلى إعداد جزئيا قطع شرائح الدماغ التي يحركها CA3 سريعة إينتيريكتال مثل النشاط مقيدة الحصين الصحيح ولا يمكن أن تنتشر إلى كورتيسيس باراهيبوكامبال، ووصف في23. قطع اللحاء الحصين هو شرط مسبق متابعة الدراسات التحوير الكهربائية باستخدام إعداد شريحة الدماغ الحصين-المفوضية الأوروبية. فيبرتوم تستخدم يشير إلى نموذج المسرودة في الجدول المواد. نماذج أخرى قد تتطلب إجراءات مختلفة.
- تخدير القوارض استخدام إيسوفلوراني 5% في كاربوجين الغاز خليط تسليمها إلى دائرة تحريض تخدير في 2 لتر في الدقيقة.
- تحت التخدير العميق (لا ردود الفعل في الاستجابة للقدم وآثار أقدام قرصه)، استخراج المخ داخل 1 دقيقة باتباع الإجراءات القياسية كما هو الحال في23. ضع الدماغ في وعاء صغير يحتوي على قطع الجليد متوازن قام وترك البرد عن 90-120 ثانية.
ملاحظة: لا تدع الدماغ البرد لفترة طويلة جداً، إلا أنها قد تجمد. - من أجل قطع الجليد قام داخل علبة المخزن المؤقت. انتشار قطع قام على ورق الترشيح على وعاء المجمدة. ضع المخ على الورق تصفية وعزل كتلة أنسجة الدماغ المطلوبة عن طريق إزالة المخيخ والاستغناء القطب أمامي مباشرة.
- بمساعدة ملعقة عازمة، الصق الجانب الظهرية الدماغ على القرص العينة مع الجانب أمامي قطع تواجه الكتلة أجار والقطب والقفويه تواجه بليد فيبرتوم. استخدام طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate. ضع القرص العينة في علبة المخزن المؤقت فورا وضمان الحصول عليها.
- ضبط نطاق تقطيع بغية نقل بليد فيبرتوم طوال الطريق عبر الأنسجة تصل إلى كتلة أجار. ضبط ارتفاع القرص العينة للوصول إلى مستوى شفرة مع كتلة أنسجة الدماغ.
- تجاهل المقاطع الأنسجة حتى الحصين مرئية بوضوح (عادة ~ 900 ميكرومتر). ثم تعيين سمك شريحة من 400 ميكرون وابدأ تقطيع للاحتفاظ بأقسام الأنسجة. لكل قسم الدماغ انقسام نصفي وقطع الأنسجة لا لزوم لها للحصول على شريحتين الدماغ. كما يتزايد علبة المخزن المؤقت خلال الأجزاء اللاحقة، ملء إتاحته علبة المخزن المؤقت مع الماء المقطر المثلج (راجع الخطوة 7.2.7).
- استخدام ماصة باستور مقلوب نقل الشرائح الدماغ في الكأس الشطف الأولى بلطف وإفراغ ماصة باستور، ونقل شرائح المخ للكأس الشطف الثانية. ثم نقل الشرائح الدماغ في قاعة عقد والسماح لهم باستعادة لمدة 60 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: عادة من الممكن الحصول على 6-8 شرائح المخ عموما. قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا.
9-إعداد قام تحتوي على 4-AP (4AP-قام)
ملاحظة: هذا يتطلب 10 دقيقة للتحضير، بالإضافة إلى 20 دقيقة من الاحترار. تنبيه! 4-AP دواء الاختلاج وأنها سامة. التعامل مع القفازات وتجنب إراقة.
- صب 200 مل ماء المقطر في دورق حجمي 500 مل.
- إضافة 50 مل أسهم A 50 مل من الأسهم ب، 5 مل من الأسهم م و 1 ملم حمض الأسكوربيك L. بلطف تحرض استخدام الحركات الدورية حتى يذوب حمض الأسكوربيك L تماما.
- إضافة 500 ميليلتر 4AP المخزون.
- إضافة المقطر المياه من الوصول إلى وحدة التخزين النهائي، ختم دورق حجمي مع ختم الفيلم، ولطف عكس ذلك 3-5 مرات حتى الحل الواضح بالتساوي.
- تجميع الدائرة تحضين 4AP (انظر الشكل 1A) وصب ~ 80 مل من 4AP-قام في ذلك. تغطية الدائرة وأنه نقل إلى حمام دافئ وبدء محتدما مع خليط غاز 95% O25% أول أكسيد الكربون2 . قم بإزالة أي فقاعات المحاصرين ماصة باستور مقلوب باستخدام. تبقى مغطاة.
- انتظر حتى درجة الحرارة 4AP-قام 30-32 درجة مئوية (~ 20 دقيقة).
ملاحظة: البروتوكول قد يكون مؤقتاً هنا إذا هي ما زالت تتعافى شرائح المخ.
10-قبل الاحترار والحضانة لشرائح في 4AP (المدة: 90 دقيقة)
- تحقق من أن قام قبل الاحترار ودرجة الحرارة 4AP-قام 30-32 درجة مئوية.
- استخدام زجاج مقلوب ماصة باستور لنقل شريحة الدماغ 1 في الدائرة قبل الاحترار وترك بقية الأنسجة لمدة 25-30 دقيقة. ثم نقل شريحة الدماغ في غرفة تحضين 4AP-قام والسماح لها بالراحة لمدة 60 دقيقة.
11-التحضير لإنشاء شركة طيران الشرق الأوسط
ملاحظة: تبدأ مدة 15 دقيقة قبل أن يسجل.
- نقل وحدة التخزين المتبقية من 4AP-قام إلى 500 مل قارورة Erlenmeyer.
- ضع قارورة Erlenmeyer على رف فوق مكبر للصوت اتفاق بيئي متعدد الأطراف، واستخدام أنابيب للسماح للحل باستمرار تغذية حقنه 60 مل. ضبط ارتفاع قارورة Erlenmeyer والمحاقن للسماح بمعدل 1 مل/دقيقة بالجاذبية.
ملاحظة: الارتفاع الصحيح يعتمد على قطر الأنبوب الداخلي (ID). لأنابيب معرف 5/32 بوصة، تكفي 30 سم. - بدء محتدما 4AP قام في قارورة Erlenmeyer والمحاقن مع س 95%2CO 5%2 مزيج غاز.
- تدفق اسمحوا 4AP-قام من خلال الأنبوب التروية في كوب حتى هناك هو لا الهواء الداخل؛ ثم وقف تدفق الحل.
- قم بتوصيل عنصر التدفئة في قاعدة طيران الشرق الأوسط للحرارة. ضع رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط الجافة داخل شركة طيران الشرق الأوسط مكبر للصوت وتأمين رأس مكبر للصوت. استخدام ماصة باستور بلاستيكية لنقل 4AP-قام بمدخل والخزان الخارجي لدائرة التسجيل.
- تأمين قنية تدفئة لحامل مغناطيسية ووضع طرفها داخل دائرة تسجيل مدخل الميناء؛ إرفاق حامل المغناطيسي على شريط مغناطيسي على رأسه مكبر للصوت الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف؛ توصيل أنابيب نضح القنية؛ قم بتوصيل القنية الحرارة.
ملاحظة: ينبغي أن يشمل قنية تدفئة بأنابيب مشطوف تترافلوروايثيلين (PTFE) للوصول إلى قاعة تسجيل مدخل الميناء ولتقليل الضوضاء بسبب المواد المعدنية من القنية. عند مدخل الخزان على نحو كاف مليئة 4AP-قام، ينبغي أن لا تكون القطرات المتساقطة من نظام التروية مرئية. - ضع إبرة الشفط داخل الخزان والتحقق من عدم وجود ضغط سلبي بغمر إبرة الشفط إلى قام؛ تحقق من وجود ضوضاء شفط منخفضة التردد مستمر.
ملاحظة: يجب وضع إبرة شفط كي يتسنى 4AP-قام بالتدفق فقط فوق سطح شريحة الدماغ. ويمكن استخدام خط فراغ أو مضخة فراغ منخفضة الضوضاء. - تعيين منظم تدفق للسماح بتدفق معدل 1 مل/دقيقة وبدء بيرفوسينج.
ملاحظة: نضح الجاذبية يزيل الضوضاء التي يمكن أن تسببها المضخات المتمعجة؛ في حالة المضخات المتمعجة المفضل، منخفضة الضوضاء نماذج إلزامية. - متى قام 4AP تتدفق من خلال القنية، بدوره على الحرارة. تعيين قنية التدفئة إلى 37 درجة مئوية وقاعدة طيران الشرق الأوسط إلى 32 درجة مئوية لتحقيق درجة حرارة 32-34 درجة مئوية داخل غرفة التسجيل.
ملاحظة: تنبيه! ابدأ الحرارة القنية دون حل في أنه أو أنها قد تكون معطوبة لا رجعة فيه. تعيين درجة حرارة أعلى من تسجيل درجة الحرارة (أي، 32-34 درجة مئوية) لمراعاة يعوض درجة الحرارة الجوهرية بين تعيين القيمة والقيمة الفعلية في تلميح قنية تدفئة وداخل قاعة تسجيل القنية. معدل تدفق ودرجة حرارة البيئة، وحجم التسجيل دائرة نفوذ كل درجة حرارة الحل تسجيل. الإعدادات الموجودة في الخطوة 11.9 هي الأمثل لوصف البروتوكول والمعدات. دائماً التحقق من درجة حرارة التسجيل الفعلي باستخدام الحرارية وضبط الإعدادات حسب الحاجة. الحرارة لا قاعدة طيران الشرق الأوسط أعلاه 34 درجة مئوية لتجنب الانهاك شريحة الدماغ. - ضع مسرى مرجع خارجي في الخزان مدخل غرفة التسجيل.
ملاحظة: على الرغم من أن رقائق طيران الشرق الأوسط مجهزة بقطب مرجع داخلي، هذا مشمول بدائرة تسجيل مخصص. وهكذا، يجب أن تستخدم قطب مرجع خارجي. بيليه بوكل مشبعة هو الأكثر عملية، أنها جاهزة للاستخدام دون الحاجة للمعالجة بالكلور.
12-شركة طيران الشرق الأوسط يعيش رسم الخرائط
- متى استقرت مستوى 4AP-قام وتسجيل درجة الحرارة حسب المطلوب، بدوره نضح وستوبكوكس الشفط إلى وضع إيقاف التشغيل بشكل مؤقت وقف لهم.
- بسرعة نقل شريحة الدماغ واحدة على الدائرة تسجيل اتفاق بيئي متعدد الأطراف باستخدام زجاج مقلوب ماصة باستور. وتعديل موقفها في مجال تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط كما يلزم استخدام مصقول النار الكروشيه باستور ماصة (الشكل 1) أو فرشاة ناعمة صغيرة مدمجة. وضع الربط هولددوون (الشكل 1) على شريحة الدماغ. إعادة تشغيل التروية والشفط بتحول ستوبكوكس على العودة إلى الموضع على.
ملاحظة: الحرجة! ينبغي نقل الشريحة وإعادة تشغيل التروية خلال 60 ثانية أو الأنسجة قد يموت. ينبغي أن تظل مرساة هولددوون شريحة في 4AP-قام لمنع شريحة الدماغ من التحرك أثناء وضع المرساة على شريحة الدماغ بسبب الاختلافات في التوتر السطحي. نقطة ارتساء لتأمين شريحة الدماغ على شركة طيران الشرق الأوسط يمكن أن يكون حسب الطلب باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ أسلاك والنايلون الخيط (الشكل 1)، أو التي تم الحصول عليها من مصادر تجارية. يظهر الشكل 1E الإعداد التجريبية النهائية مع رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط متصلاً بالرأس في مكبر للصوت: شريحة الدماغ يستريح على رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط داخل قاعة التسجيل باستمرار بالمرسى المخصص. مسرى مرجع (دائرة حمراء) و PTFE أنابيب تغطي قنية تدفئة (السهم الأحمر) المتوضعة في مدخل الخزان، بينما يتم وضع إبرة الشفط (السهم الأزرق) في الخزان منفذاً.
- بسرعة نقل شريحة الدماغ واحدة على الدائرة تسجيل اتفاق بيئي متعدد الأطراف باستخدام زجاج مقلوب ماصة باستور. وتعديل موقفها في مجال تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط كما يلزم استخدام مصقول النار الكروشيه باستور ماصة (الشكل 1) أو فرشاة ناعمة صغيرة مدمجة. وضع الربط هولددوون (الشكل 1) على شريحة الدماغ. إعادة تشغيل التروية والشفط بتحول ستوبكوكس على العودة إلى الموضع على.
- التقاط صورة لشريحة الدماغ باستخدام كاميرا محمولة على مرحلة مجهر مقلوب.
- تشغيل البرنامج النصي مابميا في برامج الكمبيوتر لبدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية لتعيين الأقطاب.
ملاحظة: البرنامج مصنوعة خصيصا يسمح للمستخدم بتحديد أقطاب تتوافق مع هياكل محددة من شريحة الدماغ. تعد هذه الخطوة الحاسمة لتنشيط المسار الصحيح وقمع النشاط إيكتال باستخدام التحفيز الكهربائي.
التين 2: واجهة المستخدم الرسومية للعيش طيران الشرق الأوسط القطب الخرائط. (أ) التمثيل التخطيطي من شريحة مجتمعة الحصين-المفوضية الأوروبية المتمركزة على شركة طيران الشرق الأوسط. بنيات الافتراضي المستخدم لهذا البروتوكول قرن أمونيس 3 (CA3)، انثورينال اللحاء (الجماعة الأوروبية)، قشرة بيريرهينال (PC)، وسوبيكولوم (جنوب). قطب مرجعي هو المخططة كعلامة مثلث. تمثل أقطاب المحاصرة في الخطوط المنقطة الإحداثيات س وص للصورة استقامة. التقاط الشاشة (ب) واجهة المستخدم الرسومية أثناء التعيين شركة طيران الشرق الأوسط حية. الرسم البياني على الجهة اليسرى القبض على الإشارة إلى الإجراء خطوة بخطوة لمتابعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- انقر فوق الزر استعراض لتحميل صورة شريحة الدماغ. تأكد من ظهور قطب مرجعي في الصف العلوي من النصف-الجانب الأيسر من شركة طيران الشرق الأوسط (الشكل 2A، علامة المثلث). انقر فوق الزر تنشيط المؤشر ، ثم حدد أقطاب العلوية والسفلية في الصف الموجود في أقصى اليمين من الصفيف بمناسبة إحداثيات س وص لاستقامة الصورة ورسم الخرائط للقطب.
- اختر من القائمة المنسدلة نوع الشريحة الأفقية. ضع علامة على خانة الاختيار الافتراضي الهياكل .
ملاحظة: من الممكن تخصيص الهياكل عن طريق تحديد الزر إدخال هياكل جديدة . ويرد هياكل الافتراضي لشريحة الدماغ الأفقي في الشكل 2 ألف. - استخدام pushbuttons مرقمة أسفل الصورة شريحة الدماغ، حدد الأقطاب المقابلة للعائد على الاستثمار، وانقر فوق الزر المقابل في لوحة هياكل لتعيينها (الشكل 2)؛ كرر هذه الخطوة لكل عائد الاستثمار.
- اضغط على زر حفظ : البرنامج يولد نتيجة مجلد مسمى #EXP_LabelledElectrodes التي تحتوي على جدول الإبلاغ عن أقطاب مختارة ورويس.
13-التسجيل والكهربائية التشكيل النشاط صرعية
- تتيح شريحة الدماغ لتحقيق الاستقرار داخل قاعة تسجيل لمدة 5-10 دقائق قبل التسجيل.
- قم بتشغيل دقيقة وحدة على الأقل 10 التحفيز قبل البروتوكول التحفيز للسماح للمعايرة الذاتية وتحقيق الاستقرار. بدء تشغيل البرنامج تحكم التحفيز والتحقق من أن مشجعا وشركة طيران الشرق الأوسط مكبر للصوت بشكل صحيح متصل كما هو مبين بالصمام خضراء في اللوحة الأساسية لبرامج التحكم التحفيز. يرجى الرجوع إلى أدلة صكوك محددة وبرامج للحصول على تفاصيل إضافية، راجع جدول المواد.
- إعداد التحفيز في التكوين بين القطبين. حدد أزواج الكهربائي على اتصال مع طبقة الخلايا الهرمية سوبيكولوم CA1/الدانية (قارن24،25) من بين تلك التي تم تعيينها مع البرنامج النصي مابميا (انظر المادة 12). استخدام سلك لتوصيل أحد أقطاب مختارة للمكونات السلبية مشجعا ومسرى أخرى للمكونات الإيجابية لنفس القناة مشجعا. استخدام سلك آخر للاتصال بسبب مشجعا على الأرض من مكبر للصوت.
- بدء تشغيل برنامج التسجيل. للحصول على البيانات، اضغط على زر اللعب في الفريق الرئيسي لبرنامج التسجيل. سجل على الأقل 4 إيكتال التي يضطلع بها.
ملاحظة: يسمح بتردد أخذ عينات من 2 كيلو هرتز اكتساب الإمكانات الميدانية مع حل عادل مع التقليل من استخدام مساحة القرص الثابت. ملف تسجيل 5-مين يأخذ ~ 80 ميغا بايت. قد يلزم أخذ العينات ترددات أعلى، مثلاً، إلى حافز تسجيل القطع الأثرية أو نشاط وحدة متعددة. مراعاة الإمكانات الميدانية فقط، استخدم عامل تصفية المنخفضة تمرير يعيش في 300 هرتز لقطع نشاط وحدة متعددة. - تحديد كثافة التحفيز.
- في برنامج تحكم التحفيز، استخدام اللوحة الرئيسية لتصميم إيجابي-سلبي مربعا ثنائية الطور الحالي مدة نبض المايكروثانيه 100/المرحلة.
ملاحظة: تنبيه! يتطلب تنشيط التيار المباشر نبض تهمة متوازن لتجنب الأضرار بالمعدات. - قم بتشغيل اختبار إدخال/إخراج (الإدخال/إخراج) سريع لتحديد كثافة حافز أفضل. يسلم نبض التحفيز المصممة في خطوة 13.5.1 في 0.2 هرتز أو أقل عن طريق إضافة فاصل زمني بين نبض من 5 s أو أطول في شكل برامج التحكم التحفيز المناسب. في علامة التبويب مطال النبض أدخل سعة أولية نبض µA 100/المرحلة وزيادة 50-100 µA الخطوات في كل محاكمة حتى التحفيز موثوق بها يمكن أن تثير الأحداث مثل إينتيريكتال في كورتيسيس باراهيبوكامبال (التحقق من الإشارات التي تصور تسجيل البرامج).
- في برنامج تحكم التحفيز، استخدام اللوحة الرئيسية لتصميم إيجابي-سلبي مربعا ثنائية الطور الحالي مدة نبض المايكروثانيه 100/المرحلة.
- الكهربائية تحوير إيكتوجينيسيس الحوفي
- البرنامج وحدة حافز لتقديم البروتوكول التحفيز للفائدة. استخدام السعة التحفيز التي تم تحديدها خلال اختبار الإدخال/الإخراج.
ملاحظة: يجب أن يكون معدل فشل الاستجابات مقولة % دي تو زيرو. - بعد توقف عن التحفيز، التحقق من استرداد الشبكة للتحفيز قبل الشرط عن طريق تسجيل على الأقل 4 تصريفات ictal (كما هو الحال في الخطوة 13.4).
Representative Results
مستو الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع تخطيط 6 × 10 وتباعد قطب كهربائي 500 ميكرومتر هي جهاز تسجيل مثالية للبروتوكول التجريبي الموصوفة هنا، حيث يمتد مجال تسجيل في جميع أنحاء شريحة الدماغ بأكمله (الشكل 3 ألف، انظر أيضا17). على الرغم من أن ثقب الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (بمياس) سيكون من الأفضل لتحسين الأوكسجين الأنسجة، مجال تسجيل صغير جداً (~ 2 مم). لا يسمح هذا التصور متزامنة من الإشارات الكهربائية التي تولدها في قرن آمون وكورتيسيس باراهيبوكامبال (البيانات لا تظهر؛ انظر18).
يستنسخ نمط الملحوظة الناجمة عن 4AP صرعية (الشكل 3A) صدق ما يلاحظ عادة في نموذج هذا في المختبر باستخدام تسجيل المحتملة في الميدان التقليدي، وتضم ثلاثة أنواع من النشاط7، 26: (أنا) إيكتال مثل الأحداث (الشكل 3B، رؤوس الأسهم) هي قوية طويلة الأمد (> 20 ثانية، النطاق: s 20-60) أحداث تشبه ملامح اليكتروجرافيك الاستيلاء على النشاط مع منشط ومكونات رمعي (الشكل 3)؛ فتولد داخل كورتيسيس باراهيبوكامبال كل 3-5 دقائق وإعادة إدخال تشكيل هيبوكامبال عن طريق المغزلي المسنن (الشكل 3D، السهم)؛ (ثانيا) البطيئة التصريف إينتيريكتال مثل (الشكل 3B، تتبع المفوضية الأوروبية، شريط أسود؛ الموسعة في الشكل 3E) قصيرة (< 1 s) السكان الأحداث التي تم إنشاؤها بين الأحداث إيكتال أوبيكويتوسلي ضمن إعداد شريحة الدماغ الحصين-الجماعة الأوروبية وتحدث بطء (مجموعة 10-30 ثانية)؛ (ثالثا) سريعةإينتيريكتال مثل التصريفات (الشكل 3B، CA3 تتبع، شريط أسود؛ والتوسع في الشكل 3E) قصيرة متكررة (< 1 s) السكان الأحداث التي تم إنشاؤها بواسطة حقلاً فرعياً هيبوكامبال CA3؛ عندما يتم الحفاظ على "الضمانات شافر"، سريع CA3 يحركها الأحداث إينتيريكتال تنتشر على طول الحلقة هيبوكامبال وممارسة مكافحة إيكتوجينيك تأثير24 (البيانات لا تظهر)؛ لمنع نشاط ictal المتهدمة، غرض البروتوكول وصف، وإخراج CA3 معطلة (انظر الشكل 3B، الإلكترونية). من الضروري الإشارة إلى أن حدوث النشاط إينتيريكتال سريعة CA3 يحركها تسجيلها باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بوتيرة أبطأ (~ هرتز 0.4) من ما لوحظ استخدام الإمكانات التقليدية مجال تسجيل مع الزجاج الماصات (~ 1 هرتز، النطاق: 0.5-2.0 هرتز، المعطيات غير معروضة).
النتيجة الناجحة نيورومودوليشن الكهربائية في الدماغ القوارض شرائح يعتمد على تفعيل مسارات الخلايا العصبية المحددة27 جنبا إلى جنب مع الاتصال الجوهرية بين المناطق المدرجة في إعداد24. لدينا اختبار الشرائح التي تم الحصول عليها من الكبار ذكور الفئران سبراغ داولي والفئران CD1 ونحن قد وجدت أن الماوس بدلاً من شرائح المخ الفئران تقدم أفضل المفاضلة بين حجم وسمك والاتصال الجوهرية. أولاً، وبفضل صغر حجمها، أنها تناسب مجال تسجيل الصغيرة المتاحة تجارياً الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف أفضل (الشكل 4A، اليسار: الفئران، الحق: الماوس)؛ وثانيا، فأكثر مرونة لحالة الحرمان الذي جوهري لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط (انظر المقدمة): على الرغم من أن إيكتال مثل التصريفات الناتجة عن هذه الأنسجة اثنين (الشكل 4 باء) لمدة مماثلة (4 الشكل الأيسر)، معدل التكرار أقصر بكثير في شرائح المخ الماوس (n = 10 شرائح كل الأنواع؛ والذيل 2 مزاوج اختبار t, p < 0.001؛ حق الشكل 4 ). هذا الأخير يسمح مسرعة حتى البروتوكولات التجريبية، مما يجعل من الممكن لاختبار عدد أكبر من شرائح المخ خلال يوم واحد تجريبي: لهذه المجموعة من النتائج التمثيلية، يمكن أن نقوم باختبار عدد مماثل من شرائح المخ من النوعين (الفئران: n = 58؛ الماوس: n = 52)، لكن عددا الفئران (n = 18) 2-fold أصغر من عدد الفئران (n = 42).
وعلاوة على ذلك، شرائح المخ الماوس تظهر أن يقدم مع اتصالات أكثر كثافة ولذلك من المرجح أن تستجيب على نحو أفضل المطرد نيورومودوليشن الكهربائية (الشكل 4). وهكذا، في هذا المختبر في نموذج إيكتوجينيسيس، صلاحية للتحفيز الكهربائي التي تهدف إلى السيطرة على النشاط إيكتال أكبر بكثير للماوس من لانسجة المخ الفئران. ويتجلى هذا الجانب أيضا معدل نجاح أعلى بكثير من تجارب تحفيز إجراء باستخدام الماوس مقابل شرائح المخ الفئران حتى عند اتباع العديد من البروتوكولات التحفيز المستمر (4E الشكل). وفي الواقع، يبدو أنسجة المخ الماوس تحمل التحفيز الكهربائي المتواصل كما اقترح بارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة داخل اختبار تجريبي الإطار الزمني من ح 4 (الشكل 4F) بشكل أفضل. وهكذا، أصغر حجم جنبا إلى جنب مع الحفاظ على أفضل اتصال جوهري يجعل شرائح المخ الماوس أفضل مرشح لأداء شركة طيران الشرق الأوسط تسجيل تهدف إلى دراسة التفاعلات شبكة هيبوكامبال باراهيبوكامبال وتقييم الكهربائية نيورومودوليشن البروتوكولات ذات الصلة TLE.
الدوري سرعة تسليمها في CA1/سوبيكولوم المعروف للتحكم في إيكتوجينيسيس الحوفي في تعامل 4AP الحصين-EC شريحة إعداد24،25،27، مع 1 هرتز ك التردد الأكثر فعالية27. وهكذا، كما أنها مفيدة كعنصر إيجابي لتقييم كفاءة وفعالية السياسات نيورومودوليشن الأخرى (انظر على سبيل المثال25). وكما ذكر أعلاه، النبضات الكهربائية مباشرة من خلال الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (أي، دون الحاجة القطب تحفيز خارجي) يمكن أن تثير استجابات السكان في أنسجة الدماغ القوارض (انظر أيضا28). يكفي المحافظة على الاتصال بالشبكة العصبية ضمن شريحة الدماغ، دقيقة لتحديد المواقع من شريحة الدماغ على شركة طيران الشرق الأوسط، والاختيار المناسب لتحفيز القطب أزواج السماح بمتابعة نيورومودوليشن الكهربائية والتجارب التي التحكم بفعالية في إيكتوجينيسيس. كما هو موضح في الشكل 5A، فمن الممكن لاستخراج الكنسي 1 هرتز الدوري سرعة بروتوكول استخدام مستو الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف كتسجيل وجهاز محفزة، مع فائدة إضافية تتمثل في أنه يمكن تصور تأثير التحفيز الكهربائي في جميع أنحاء قسم أنسجة الدماغ مع عدد أكبر من نقاط المراقبة متباعدة بالتساوي بالمقارنة مع تسجيل المحتملة في الميدان التقليدي. 5B الرقم يظهر التحديد الكمي للنتائج المحققة لقيم n = 9 شرائح المخ، مما يشير إلى انخفاض كبير في مجموع اغتنام الوقت (مجموع النشاط ictal المدة/مراقبة الوقت25) خلال التحفيز (طريقة واحدة-ANOVA، F(df): 6.84(2)، ف < 0.01، اختبار وظيفة المخصص LSD فيشر، المحمية). النتائج تتسق مع الأدب لتحفيز خارجي أقطاب24،25.
لحساب مجموع اغتنام الوقت، وقت الملاحظة يعتمد على الفاصل الزمني بين أحداث ictal، وكما أنها تحدد الحد الأدنى لفترة البروتوكول التحفيز اللازمة لتقييم آثار نيورومودوليشن ثقة. أننا نجد أن تسجيل التصريفات ictal 4 على الأقل (وفواصل ومن ثم على الأقل 3 بين الأحداث ictal) مفاضلة جيدة بين العينات التي تم جمعها ووقت جمع المطلوبة. في حالة عنصر التحكم (أي، لا يوجد تحفيز)، هو وقت الملاحظة الفترة الفاصلة بين البداية من أول حدث ictal المقاسة وإنهاء آخر واحد. أثناء نيورومودوليشن، يساوي وقت الملاحظة مدة البروتوكول حافزا، نظراً لهدف القياس هو بالتحديد الكمي للظواهر التي تحدث طوال الوقت الذي هو الأخذ اضطراب في النظام. الحوسبة ومقارنة مجموع اغتنام الوقت بدلاً من مدة والفاصل الزمني للأحداث ictal هو المعلمة الأكثر ملاءمة لتجنب النوع الثاني خطأ. وفي الواقع، جنبا إلى جنب مع كامل قمع النشاط ictal، من الممكن أيضا التقيد بواحد فقط يتم إنشاء الحدث ictal خلال التحفيز الكهربائي بدلاً من العديد من الأحداث في حالة عنصر التحكم. وفي هذه الحالة، بينما لا يمكن قياس الفاصل الزمني بين الأحداث، قياس مدة ictal كما مقدر لفعالية التحفيز لا تمثل النتيجة الفعلية من نيورومودوليشن (أي، الحد من نشاط إيكتال).
وعموما، النتائج المعروضة هنا تشير إلى أن شرائح المخ الماوس بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف أدوات قيمة للبحوث الصرع والقيام بدراسات نيورومودوليشن موثوق بها ذات الصلة بالنهوض بميدان DBS لعلاج الصرع. وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكول الموصوفة هنا يحسن بقاء شريحة الدماغ ويسمح لاتباع دورات تجريبية لعدة ساعات (الشكل 6)، قد تتطلب، على سبيل المثال، لمقارنة آثار مختلفة من التحفيز الكهربائي نماذج.
الشكل 3 : نمط نموذجي صرعية المستحثة 4AP تصور مع مستو القياس الماوس (A) الدماغ شريحة المتمركزة في شركة طيران الشرق الأوسط 6 × 10 مستو (تباعد القطب: 500 ميكرومتر) جنبا بجنب نظرة عامة على نمط المستحثة 4AP صرعية تصور مع تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط و. كل مربع في الشبكة يستوعب النشاط المسجلة في موقع المقابلة داخل شريحة الدماغ. خطوط زرقاء متقطعة تشير إلى صفوف قطب كهربائي لمزيد من الوضوح. يتم تحديد عدد القطب تسجيل باللون الأزرق في الزاوية اليسرى العليا من كل مربع. يمثل الرمادية عبروا ساحة مسرى مرجع. (ب) شرائح تتبع ممثل المفوضية الأوروبية و CA3 أنماط تصور في أسرع وقت-مقياس. رؤوس الأسهم تشير إلى أحداث إيكتال. في تتبع المفوضية الأوروبية من الممكن أن نقدر حدوث بطء إينتيريكتال تصريفات (أسود بار)، بينما يولد حقلاً فرعياً CA3 نمط نموذجي فاستينتيريكتال المستدام (شريط أسود). (ج) توسيع نطاق التسجيل التفريغ ictal عرض نمط منشط رمعي نموذجية. (د) التصور مقياس سريع الانتقال قبل-إيكتال-إلى-ictal المقابلة للمفوضية الأوروبية (أحمر) و CA3 (أسود) تتبع قطاعات تتسم بشريط أحمر في (ب). يشير السهم إلى بداية التفريغ إيكتال. وتبرز آثار فرضه أن الحدث ictal ينشأ في الجماعة الأوروبية، ونشر في وقت لاحق إلى فروع CA3. (ه) عرض موسع لفترات إينتيريكتال تميزت بأشرطة سوداء في (ب) تؤكد على عدم وجود ترابط بين البطيء وأنماط فاستينتيريكتال المتولدة عن المفوضية الأوروبية (أحمر) و CA3 (أسود)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : عرض شرائح المخ الماوس على إخراج تجريبية أعلى من شرائح المخ الفئران. شريحة الدماغ (A) من الفئران (يسار) وماوس (يمين) من الإعمار المتطابقة. شريحة الدماغ الفئران أكبر بكثير من منطقة تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط ولا يمكن تصور نشاطها الكهربائية بالكامل. (ب) مقارنة بصرية مباشرة النشاط ictal المتكررة إنشاؤها بواسطة الماوس وفار انثورينال القشرة (الجماعة الأوروبية). (ج) الماوس وفار من شرائح المخ تولد التصريفات ictal لمدة مماثلة، ولكن الفاصل الزمني بين هذه الأحداث أنسجة المخ الفئران في إضعاف تقريبا. * ف < 0.05. (د) مقارنة بالجرذان، الفئران العرض إضعاف عائد أعلى من شرائح المخ قابلة للاستمرار لتجارب التحفيز الكهربائي الرامية إلى السيطرة على إيكتوجينيسيس. التحفيز الكهربائي سوبيكولوم يمكن أن تثير استجابات السكان في كورتيسيس باراهيبوكامبال في 20 فقط من الفئران (34 في المائة) 58 الدماغ شرائح، مقابل 33 52 (63 في المائة) الماوس الدماغ شرائح (تشي2: 9.22؛ p = 0.002). ف < 0.05. (ه) بين شرائح قابلة للحياة، أن معدل النجاح في السيطرة على النشاط ictal إضعاف مع الماوس مقابل شرائح المخ الفئران (الماوس: 20 شرائح المخ 33، 60%: الفئران: 6 شرائح المخ 20، 30 في المائة؛ تشي2: 4.67؛ p = 0.03). ف < 0.05. الماوس (F) يمكن أن تحمل شرائح المخ تتكرر الأزمان المطول للتحفيز الكهربائي المستمر (المناطق المظللة غراي). عند سحب الحافز، يسلك أنسجة المخ الماوس الاسترداد الكامل لنمط صرعية، بينما يقع بقاء أنسجة الدماغ الفئران هائلا في حاء 3 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تجربة تمثيلية من التحوير الكهربائية من إيكتوجينيسيس باستخدام شرائح المخ بالإضافة إلى القياس تسجيلات (أ) النشاط ictal 4AP المستحثة في المفوضية الأوروبية والكمبيوتر أثناء حالة عنصر التحكم (لا تحفيز)، الدوري سرعة (PP) في 1 هرتز (التحفيز قطعة أثرية يتم اقتطاع)، وأثناء الاسترداد عند انسحاب التحفيز. (ب) التحديد الكمي لأثر PP في 1 هرتز على مجموع اغتنام الوقت. ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : الممثل تسجيل طويلة الأجل الناجمة عن 4AP ictal النشاط. تتبع (أ) عدد الأجزاء ح 8 مسجل بعد الدماغ التقطيع الداخلي وح 2 التالية لتطبيق 4AP. (ب) توسيع نطاق تتبع الأجزاء المقابلة للإفرازات ictal محاصر حددها الأحرف و ب ج في لوحة (أ) إظهار اتساق النشاط الذي تم إنشاؤه إيكتال طوال الوقت-أرملة المراقبة طويلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| أ الأسهم | المادة الكيميائية | الوزن الجزيئي | تركيز (مم) |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | 1150 | |
| المذيبات: الماء المقطر | بوكل | 74.55 | 20 |
| التركيز: 10 x | خ2ص4 | 136.1 | 12.5 |
| درجة حرارة التخزين: 4 درجة مئوية | كاكل2* 2 ح2س | 147.02 | 20 |
| الوقت الأقصى للتخزين: 1 أسبوع | د-الجلوكوز | 180.2 | 250 |
| ملاحظة: عامل التصفية باستخدام عامل تصفية غشاء 50 مم | |||
| الأسهم ب | المادة الكيميائية | الوزن الجزيئي | تركيز (مم) |
| ناكو3 | 84.01 | 260 | |
| المذيبات: الماء المقطر | |||
| التركيز: 10 x | |||
| درجة حرارة التخزين: 4 درجة مئوية | |||
| الوقت الأقصى للتخزين: 1 أسبوع | |||
| ملاحظة: عامل التصفية باستخدام عامل تصفية غشاء 50 مم | |||
| الأسهم ج | المادة الكيميائية | الوزن الجزيئي | تركيز (مم) |
| بوكل | 74.55 | 20 | |
| المذيبات: الماء المقطر | خ2ص4 | 136.1 | 12.5 |
| التركيز: 10 x | مجكل2*2ح 6 س | 203.3 | 50 |
| درجة حرارة التخزين: 4 درجة مئوية | مجسو4* 6 ح2س | 246.47 | 20 |
| الوقت الأقصى للتخزين: 2 أسابيع أو أقل | كاكل2* 2 ح2س | 147.02 | 5 |
| ملاحظة: عامل التصفية باستخدام عامل تصفية غشاء 50 مم | |||
| الأسهم M | المادة الكيميائية | الوزن الجزيئي | تركيز (مم) |
| مجسو4* 6 ح2س | 246.47 | 100 | |
| المذيبات: الماء المقطر | |||
| التركيز: 100 x | |||
| درجة حرارة التخزين: 4 درجة مئوية | |||
| الحد الأقصى لسعة التخزين الوقت: 4 أسابيع أو أقل | |||
| الأسهم 4AP | المادة الكيميائية | الوزن الجزيئي | تركيز (مم) |
| 4-أمينوبيريديني | 94.11 | 250 | |
| المذيبات: الماء المقطر | |||
| التركيز: 1000 x | |||
| درجة حرارة التخزين: 4 درجة مئوية | |||
| الوقت الأقصى للتخزين: 2 أسابيع أو أقل | |||
| ملاحظة: دوامة 2-3 دقيقة أو stirr لمدة 30-60 دقيقة | |||
| ملاحظة: تنبيه! 4-AP هو السامة وسينفولسانت. استخدام قفازات وتجنب انتشار أو تسرب. | |||
الجدول 1: تقييم الحلول.
| عقد قام | قام تسجيل | قام قطع | |||||
| المادة الكيميائية | ج [مم] | المادة الكيميائية | ج [مم] | المادة الكيميائية | ج [مم] | ||
| كلوريد الصوديوم | 115 | كلوريد الصوديوم | 115 | السكروز | 208 | ||
| الماليزية | 2 | الماليزية | 2 | الماليزية | 2 | ||
| PO42خ | 1.25 | PO42خ | 1.25 | PO42خ | 1.25 | ||
| مجسو4 | 1.3 | مجسو4 | 1 | مجكل2 | 5 | ||
| كاكل2 | 2 | كاكل2 | 2 | مجسو4 | 2 | ||
| د-الجلوكوز | 25 | د-الجلوكوز | 25 | كاكل2 | 0.5 | ||
| NaHCO3 | 26 | ناكو3 | 26 | د-الجلوكوز | 10 | ||
| حمض الأسكوربيك L | 1 | حمض الأسكوربيك L | 1 | ناكو3 | 26 | ||
| حمض الأسكوربيك L | 1 | ||||||
| الأس الهيدروجيني | 7.4 | الأس الهيدروجيني | 7.4 | حمض بيروفك | 3 | ||
| أوسمولاليتي | موسم 300/كغ | أوسمولاليتي | موسم 300/كغ | ||||
| الأس الهيدروجيني | 7.4 | ||||||
| أوسمولاليتي | موسم 300/كغ | ||||||
الجدول 2: تكوين الحلول.
| استكشاف الأخطاء وإصلاحها | |||||
| القضية | التدابير المضادة | ||||
| تصريفات ictal تبدو 'المقسم' | خفض معدل التروية و/أو تخفيض حجم قام فوق شريحة الدماغ بضبط موضع إبرة الشفط. | ||||
| أي نشاط إيكتال | (1) التحقق من أن لا تنشر يحركها CA3 الأحداث سريعة إينتيريكتال للقشرة. استخدام شفرة مشرط صغير (مثلاً، n.10) أو إبرة بقطع "ضمانات شافر" إذا حاجة تكون، ولكن يجب الحرص على عدم قطع خيوط النايلون مرساة هولددوون شريحة. ستيريو--أو المجهر تستقيم الأنسب، بينما المجهر المقلوب يجعل هذه المهمة صعبة للغاية. | ||||
| (2) التحقق من صلاحية الشريحة: يمكن أن تؤدي إلى حفز القوى الكهربائية النشاط ictal؟ الانتظار حتى حوالي 2 ح 4AP التطبيق، ثم قم بتغيير شريحة الدماغ إذا لم يحدث نشاط إيكتال. | |||||
| شريحة الدماغ يتحرك عند وضع مرساة هولددوون | (1) إزالة نقطة ارتساء شريحة بلطف وتغيير موضع شريحة الدماغ. | ||||
| (2) تأكد من أن نقطة ارتساء شريحة الرطب بالتساوي من قام 4AP. | |||||
| (3) إزالة 4AP-قام من دائرة التسجيل لصالح انضمام شريحة الدماغ لشركة طيران الشرق الأوسط. | |||||
| (4) قم بتغيير موضع نقطة ارتساء هولددوون الشريحة. | |||||
| شريحة الدماغ يطفو على رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط بعد نقله | (1) نضح بلطف قام الزائدة مع ماصة باستور. | ||||
| (2) شريحة "شركة طيران الشرق الأوسط" قد يلزم إعادة المغلفة. | |||||
| التحفيز الكهربائي عدم الحصول على ردود الشبكة | زيادة كثافة التحفيز، وتغيير أزواج قطب كهربائي. | ||||
| التحفيز الكهربائي يمكن الحصول على ردود السكان في المناطق القشرية الدانية ولكن لا القاصي | والمسألة إيكيلي بسبب سوء الاتصال أو كثافة حافز منخفض جداً. التحفيز الكهربائي قد تكون فعالة أو غير فعالة في بعض المناطق القشرية فقط. من المستحسن تغيير شريحة الدماغ. | ||||
| إشارة صاخبة | (1) التحقق من مسرى الإشارة: في بعض الأحيان يمكن أن يكون سبب الأساس صاخبة بتعبئة الخزان مدخل غير مكتملة أن أقطاب المرجعية هل لا تماما عمق قام. | ||||
| (2) فحص تأريض الإجمالية للمعدات. | |||||
| (3) ضبط موضع إبرة شفط بغية سماع صوت شفط المستمر، والناعمة. الأرض إبرة الشفط. | |||||
| (4) تنظيف جهات خارجية في شركة طيران الشرق الأوسط مع مسحه القطن باستخدام الإيثانول. | |||||
| (5) قد يكون معطوباً رقاقة "شركة طيران الشرق الأوسط": تغيير رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط، والتحقق من التحف ونسبة الإشارة إلى الضجيج. | |||||
الجدول 3: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Discussion
الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هي أداة لا تقدر بثمن للتحقيقات العصبية، وقد وصلت إلى مرحلة النضج في السنوات الأخيرة بفضل عقود الاستكشاف والتنمية. مقارنة بتسجيل الحقل التقليدية المحتملة، وتوفر الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والميزة الكبرى لعدد أكبر من نقاط المراقبة، والمسافة بين القطب المعروفة، التي تعتبر حاسمة بالنسبة لدقة تحديد التفاعلات شبكة الخلايا العصبية.
يمكن أيضا إضافة تقنية لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط إلى النهج الكهربية الأخرى، مثل المشبك التصحيح تسجيل15، للتحقيق في العلاقة بين نشاط شبكة الخلايا العصبية والخلايا العصبية وحيدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن توفر إمكانية تصور الإمكانات الميدانية والنشاط وحدة متعددة في نفس الوقت رؤى الثمينة في العلاقة بين نشاط الفرق الصغيرة الخلايا العصبية والشبكات العصبية الجماعية. المزيج مع الأصباغ المراعية للجهد وتصوير الكالسيوم أوبتوجينيتيكس29 يسمح استنتاج الظواهر العصبية باستخدام النهج بوليهيدرال. بالإضافة إلى الدراسات الدوائية، يجعل إمكانية القيام بتسجيل والتحفيز مع نفس النظام تقنية لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط تنوعاً وقوية للغاية: فعلى سبيل المثال، من الممكن لدراسة الظواهر اللدونة متشابك في لب الذاكرة تشكيل30، استخدام بروتوكولات neuromodulation المعروضة هنا، التي ذات الصلة إلى DBS لعلاج الصرع، ومجموعة متنوعة من اضطرابات الدماغ. الأخيرة دليل على أن تقنية تسجيل اتفاق بيئي متعدد الأطراف يمكن تطبيقها بنجاح على أنسجة المخ الصرع البشرية16 يوضح فائدتها لا تقدر بثمن في الصرع للبحث، على حد سواء لفهم الآليات الأساسية الكامنة وراء هذا المرض المدمر وأن ضبط خوارزميات DBS التخفيف من ذلك.
بيد قوة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف السعي إلى التجارب الكهربية تحت ظروف 'تحد' لشرائح المخ، بسبب اشتراط دائرة تسجيل المغمورة، وضرورة السماح للدماغ شريحة باقي على الركازة الصلبة حيث الصغرى-أقطاب كهربائية وقد أدمجت. وبالتالي، قد لا تتلقى أنسجة المخ إمدادات الأكسجين الكافي، مما قد يؤثر بدوره على جودة التسجيلات.
يسمح البروتوكول الموصوفة هنا سجل موثوق بها، ودراسة إيكتوجينيسيس في شبكات الحوفي القوارض بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف باستخدام نموذج 4AP الأنبوبي الحاد ومتابعة الحقبات الطويلة للتحفيز الكهربائي، التي توفر المعلومات ذات الصلة لتقييم DBS السياسات.
استخدمت الدراسات السابقة في نيورومودوليشن الكهربائية شبكات الحوفي الصرع استناداً إلى استخدام تسجيل المحتملة في الميدان التقليدي لشرائح المخ الفأر أو الجرذ مع نتائج مماثلة24،25؛ ولكن استخدام أنسجة المخ الفئران أثبتت أنها أكثر تحديا، معقول بسبب اتصال أضعف بالمقارنة مع أنسجة الدماغ التي تم الحصول عليها من الفئران7. فيما يتعلق بأسلوب اتفاق بيئي متعدد الأطراف، شرائح المخ الماوس الأنسب بحكم صغر حجمها. وعلاوة على ذلك، نظراً لارتفاع معدل حدوث إيكتال مثل التصريفات في الماوس مقابل أنسجة المخ الفئران، فمن الممكن لاختبار شرائح المخ أكثر بشكل ملحوظ طوال يوم التجريبي، الذي بدوره يجعل جمع البيانات أسرع وأكثر كفاءة، ويمكن خفض عدد الحيوانات المستخدمة.
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة:
تصريفات ictal تسجيلها باستخدام الدائرة المخصصة الموصوفة هنا يبدو مماثلة في المدة ومعدل الحدوث لتلك التي لوحظت في استخدام قاعة خاتم شركة طيران الشرق الأوسط التقليدية ونفس نوع اتفاق بيئي متعدد الأطراف (أقطاب الصغرى مستو، قارن 17). ومع ذلك، فإنه يلزم التشديد على أن سماكة شريحة الدماغ يجب أن تخفض إلى حد كبير عند استخدام قاعة تسجيل جولة التقليدية جنبا إلى جنب مع معدل انخفاض التروية (1 مل/دقيقة)، التي قد تعوق السعي الناجح إلى neuromodulation التجارب الواجب للاتصال بالفقراء.
في هذا البروتوكول، تقدم دائرة تسجيل مخصص الحجم المنخفض مستوحاة من تصميم غرفة تسجيل التصحيح-المشبك الاندفاق الصفحي مستقر وموثوق بها أمر بالغ الأهمية لتحقيق نجاح تسجيلات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف؛ كما أنه يتيح زيادة سماكة شريحة الدماغ إلى 400 ميكرون بغية تحقيق الموازنة عادلة بين صلاحية الأنسجة والربط الجوهرية. من المسلم به في الواقع هذا التدفق الصفحي الحل تسجيل داخل الدائرة مرغوب فيه للغاية لشريحة الدماغ الكهربية، نظراً لأنها لا تتأثر بدرجة الحرارة، والأكسجين، والتدرجات درجة الحموضة التي لوحظت في تدفق دائري الجولة تسجيل الدوائر20،،من1931 (مثل تلك التي قدمت مع الشرق الأوسط وأفريقيا متوفرة تجارياً). إدخال التحيز التجريبية مثل التدرجات وتضر أيضا بشريحة الدماغ. دوائر تسجيل كمية صغيرة نسبيا (مل ~1.5) جنبا إلى جنب مع نضح ارتفاع معدل (5-6 مل/دقيقة)16،31 يسمح بتبادل المتوسطة نضح كاف (إيه ثري مرات/دقيقة). قاعة مخصصة يمكن بسهولة الحصول عليها من مصادر تجارية بسعر في متناول أو المنتجة داخليا باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد. وأفادت الدراسات الأخرى تسجيلات شركة طيران الشرق الأوسط من الدماغ البشري ميكرومتر سميكة 400 شرائح16 استخدام قاعة خاتم شركة طيران الشرق الأوسط التقليدية، مع إبقاء حجم قام إلى 1 مل وإنفاذها بمعدل التروية عالية (5-6 مل/دقيقة) بمساعدة مضخة تمعجية منخفضة الضوضاء. ومع ذلك، استخدمت المؤلفون نموذجا مختلفاً من إيكتوجينيسيس، أي، انخفاض Mg2 +، التي من المرجح أن تتأثر أقل من طراز 4AP بالآليات افابتيك التي تنطوي على زيادات كبيرة في تركيز ك+ خارج الخلية 11 , 22-وقد وجدنا أن نسبة عالية من نضح غير مرغوب فيه في نموذج 4AP، ربما بسبب الغسيل السريع خارج كخارج الخلية المتراكمة+، التي قد تحتاج إلى زيادة كبيرة في التسجيل قام16. وفي الواقع، الأحداث ictal ظهرت أكثر 'المقسم' عندما زادت سرعة نضح المهرجان إلى 2-3 مل/دقيقة وشريحة الدماغ كانت مغمورة بطبقة سميكة من قام، بينما يمكن استعادة كاملة التصريفات نستعرض مكونات منشط بهلوانية قوية لدى عودته إلى انخفاض معدل التروية (1 مل/دقيقة) وقام أرق طبقة حق على مستوى الأنسجة السطحية (البيانات لا تظهر). قاعة تسجيل مخصص الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح تبادل المتوسطة نضح 3-5 مرات/دقيقة بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة. وهكذا، بقوة تحسين إمدادات الأكسجين عموما إلى شرائح المخ حتى في معدلات التروية منخفضة نسبيا، بينما لا يزال ضمان مستقر تسجيل درجة الحرارة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. الأهم من ذلك، فمن الممكن للحفاظ على تركيز ك+ خارج الخلية إلى قيمة فسيولوجية.
نموذج 4AP إيكتوجينيسيس لا يتطلب أي تعديل كبير في تكوين قام الأيونية، مثل ملغ خفض2 + أو زيادة ك+، ويوفر ميزة فريدة من نوعها للمساس الإرسال عليه والمثبطة على حد سواء 12، أحد جوانب التي ترتبط ارتباطاً وثيقا بالصرع للبحث في ضوء الدور الحاسم لكل من جلوتاماتيرجيك والشبكات جابايرجيك في المزامنة صرعية (انظر 7). 4AP-قام المستخدمة في هذا البروتوكول يحتوي على تركيز ك+ فسيولوجية (3.25 ملم) وملغ2 + تركيز أقل قليلاً من عقد قام (1 مم مقابل 1.3 ملم). هذا التركيز لا يزال يندرج ضمن القيم المبلغ عنها الفسيولوجية Mg2 + التركيز في مكافحة القوارض السائل الدماغي النخاعي، ويتم استخدامه في العديد من المختبرات (انظر على سبيل المثال17،18). أن غرض البروتوكول هو موضح، وجدنا أن هذا الانخفاض الطفيف هو المفضل للمعونة في أثر 4AP.
في الأعمال السابقة، طبق 4AP بشريحة الدماغ عند أنه تم فعلا المتمركزة داخل ال17،الدائرة تسجيل18. إلا المجرب يحتاج إلى مراقبة الكمون الوقت بين تطبيق 4AP وظهور أنماط صرعية، نجد أن هذا النهج مضيعة للوقت وليست مناسبة لمتابعة التسجيل المطول ودورات التحفيز المبينة في هذا البروتوكول. الحضانة قبل شرائح المخ في 4AP عند 32 درجة مئوية يسمح تدخر الوقت كثير التجريبية، يمكن أن تكون شرائح المخ ما قبل المعالجة في سلسلة مع السعي إلى تحقيق التجربة باستخدام مقاطع الأنسجة الأخرى.
صلاحية مدة طويلة من شرائح المخ قد تكون مفيدة لتحليل ميزات الشبكة على المدى الطويل. وعلاوة على ذلك، مرونتها محسنة للتحفيز الكهربائي المتكرر لميزة كبيرة إذا كان يريد المجرب لمقارنة عدة بروتوكولات التحفيز، الذي يجب أن يتم في نفس شريحة الدماغ لمتانة الإحصائية. في أيدينا، عند اختبار 3 تحفيز البروتوكولات، كل تسبقها مرحلة مراقبة وتليها مرحلة انتعاش، قد تستمر التجربة ح 3-5. وفي هذا السياق، يعيش طيران الشرق الأوسط التعيين بالغ الأهمية من أجل تنشيط المسار الصحيح وقمع بدلاً من إيكتوجينيسيس عن طريق التحفيز الكهربائي لصالح. لدينا سهلة الاستخدام واجهة المستخدم الرسومية يمثل أداة سريعة وبسيطة ومرنة لخريطة أقطاب هياكل الدماغ المختلفة. خلافا للبرمجيات التجارية، فمن الممكن لإضافة تخطيطات مخصصة من شركة طيران الشرق الأوسط حتى مع مهارات البرمجة الأساسية. يمكن الحصول على الصور في حقل مشرق؛ وهكذا، أي الكاميرا للأغراض العامة بقرار جيد ويناسب على مجهر مناسبة. مجهر مقلوب ضروري لتصور موقف ميكروليكتروديس بالنسبة لشريحة الدماغ، منذ هذه سوف تكون مخفية تحت الأنسجة إذا كان استخدام مجهر تستقيم. مع ذلك، ينصح ستيريو-مجهر بالإضافة إلى نوع مقلوب إذا المجرب يحتاج إلى إجراء تخفيضات سكين لتعطيل مسارات الخلايا العصبية المحددة.
أخيرا، ثمة ميزة أخرى للنهج المقترح هو تجميع معظم الأدوات اللازمة، مثل قاعة تسجيل مخصص والدوائر القابضة، وحمام دافئ ومرساة شريحة، فضلا عن استخدام لا لزوم لها تكلفة رخيصة وسهلة نسبيا مضخة تمعجية منخفضة الضوضاء.
القيود المفروضة على هذه التقنية:
تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط لا تسمح بتصور موجات بطيئة جداً، أي، DC تحولات في الإشارة. قد تساعد هذه الانحرافات الأساس قياس مقارب لمدة التفريغ ictal، والأكثر أهمية، أساسية لدراسة الاكتئاب نشر القشرية (ظاهرة تتعلق بالوفاة المفاجئة غير المتوقعة في الصرع32 ومشتركة بين الصرع والصداع النصفي33).
فيما يتعلق نيورومودولاتيون الكهربائية، يسمح بروتوكول الموصوفة هنا إجراء عدة دورات التحفيز دون التأثير على بقاء شريحة الدماغ. ويمكن أن نقوم بنجاح يصل إلى 3 دورات التحفيز من 20-45 دقيقة، مماثلة لما ذكر في السابق العمل25. على الرغم من أن قد تحمل شرائح المخ ربما عدد أكبر من دورات التحفيز أو بروتوكولات تحفيز أطول، ونحن لا اختبار شرائح المخ في هذا الصدد. نحن نوصي بالحد من عدد البروتوكولات التحفيز على 3 وتجنب إطالة دورات التحفيز (إيه سيكس زيرو دقيقة)، الذي قد يؤكد إلى حد كبير أنسجة المخ الاحتفاظ بها ضمن هذه الشروط الحد، حتى عدم الاسترداد عند سحب الحافز.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول:
وقد تعوق العديد من العوامل الحاسمة السعي الناجح إلى تسجيل وتعديل النشاط صرعية في الدماغ شرائح بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. وإلى جانب أنواع القوارض المستخدمة ونوعية الشرائح المخ، ومعدل التروية أثناء التسجيل وديناميات تدفق قام (أي., الصفحي مقابل التعميم) داخل قاعة تسجيل، وجدنا أن ظروف الانتعاش و الصيانة على المدى الطويل من شرائح المخ وكذلك طريقة تطبيق 4AP هي الخطوات الأكثر أهمية.
عند استخدام دائرة عقد مغمورة من الأهمية بمكان لتخزين شرائح المخ في درجة حرارة الغرفة الحفاظ على نشاط شبكة أنسجة المخ وصالح تقلد ictal مثل التصريفات قبل تطبيق 4AP. في أيدينا، تدهورت الانتعاش والصيانة عند 32 درجة مئوية أنسجة المخ داخل ح 3-4 من التقطيع.
شرائح الحضانة للدماغ في 4AP-قام في درجة حرارة الغرفة والتسجيل على 32 درجة مئوية، ومع ذلك، غير مرغوب فيه. وقد وجدنا العديد من الصعوبات في مراقبة قوية من التصريفات ictal المتكررة في هذا الشرط. في الواقع، أبلغ عن انخفاض درجات الحرارة في حدود 20-24 درجة مئوية إخماد أو حتى منع المستحثة 4AP إيكتوجينيسيس على حد سواء في المختبر34 و في فيفو35. وهكذا، 4AP الاحتضان وتسجيل درجات الحرارة يجب أن تندرج 30-34 درجة مئوية، ويجب أن تكون مطابقة. لتجنب وضع أنسجة المخ تحت الكثير من الضغط بسبب تحريض متزامنة من hyperexcitability 4AP والتعرض المفاجئ من شرائح المخ من درجة حرارة الغرفة إلى الحارة (32 درجة مئوية) 4AP-قام، أساسي لأداء وسيطة قبل الاحترار الخطوة واسمحوا روض الشرائح الدماغ في عقد قام عند 32 درجة مئوية عن 20-30 دقيقة تخطي هذه الخطوة قد تؤثر على تحريض إيكتوجينيسيس من 4AP.
هو الجانب الآخر الذي يحتاج إلى ذكر أهمية تركيز د-الجلوكوز في قام بعد تشريح. يحتفظ بتركيز 25 مم شرائح الدماغ أفضل من تركيز 10 ملم المستخدمة في العديد من المختبرات ويحسن أيضا أن معدل حدوث النشاط ictal، وإضعاف أسرع (وهكذا، مما يجعل من الأسهل متابعة سلسلة طويلة من التجريبية البروتوكولات في عدة شرائح الدماغ كل يوم).
وأخيراً، تحتاج بعض التفاصيل الدقيقة الهامة أثناء إجراء تشريح الجدير بالذكر. أولاً، لا تسمح الدماغ سليمة وشرائح المخ لتجميد في البرد قطع قام. تقشعر لها اﻷبدان في الدماغ < 2 دقيقة بما يكفي نظراً لصغر حجم الدماغ الماوس. ينبغي نقل أقسام الأنسجة مباشرة من علبة المخزن المؤقت لقنينة الشطف في درجة حرارة الغرفة. الشطف القطع قام من المهم جداً إلا تركيز السكروز عالية سوف تجعل الدماغ شرائح التمسك بشبكة نايلون من قاعة عقد. فعالية شطف الأنسجة، من المهم تقليل محتوى قام قطع داخل ماصة نقل كي لا يلوث عقد قام مفرطة. 2-مرحلة الإيدز الشطف في التقليل من التلوث. عند انتهاء إجراء تشريح، أقسام الأنسجة ينبغي نقل فورا من قنينة الشطف إلى قاعة عقد، حيث النايلون لينة مش معلقة في منتصف الطريق في عقد قام يسمح الأوكسجين الأنسجة على كلا الجانبين. ينبغي تطبيق نفس المبدأ في جميع مراحل بعد إجراء تشريح: شرائح المخ ينبغي أن تجلس ابدأ في الجزء السفلي من الكأس، لا ينبغي أن تكون على اتصال مع الجانبين لعقد الدوائر، وينبغي ابدأ أن تكون على اتصال ببعضهم البعض ولا التداخل.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
قد يتم تعديل تكوين قام وفقا لاحتياجات المجرب. على سبيل المثال، يمكن إضافة الأدوية تشريح مساهمة محددة العصبية أو قنوات أيون بفعالية نيورومودوليشن الكهربائية. وعلاوة على ذلك، بيروفك وحمض الأسكوربيك (انظر الجدول 2) قد حذف، على الرغم من أننا نجد أنها تمارس دوراً محصن قوية. ونحن التقرير في الجدول 3 القضايا الأكثر شيوعاً التي يمكن أن تصادف في هذا البروتوكول وكيفية التعامل معها.
الاستنتاجات:
تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط بلا شك أسلوب لا تقدر بثمن لمعالجة التفاعلات بين الشبكات العصبية في الصحة والمرض. بالإضافة إلى الدراسات الدوائية، ومن الممكن أيضا لتقييم البروتوكولات neuromodulation الكهربائية ذات الصلة ب DBS المطبقة للصرع وغيره من الاضطرابات العصبية. في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا أنه من الممكن استنساخ التجارب النموذجية التحفيز الدوري مع نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع تسجيل الحقل خارج الخلية التقليدية المحتملة وتحفيز كهربائي خارجي. زيادة توافر معدات سهلة الاستعمال التجاري وأدوات البرامج المتقدمة تجعل تقنية لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط مناسبة أيضا لتجارب التحفيز حلقة مغلقة، لتوفير التحفيز المخصصة لانسجة المخ، التحقيق مساهمة آليات التغذية المرتدة إلى استجابات شبكة الخلايا العصبية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
سباق الجائزة الكبرى هو زميل كوري Skłodowska ماري يموله "الاتحاد الأوروبي" مسكاً-لو-2014 المشروع Re.B.Us، G.A. n.660689، ضمن إطار برنامج "أفق 2020". مابميا واجهة المستخدم الرسومية متاحة بحرية بناء على طلبها للكاتب ilaria.colombi@iit.it.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
References
- Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
- WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
- Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
- Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
- Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
- Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
- Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
- Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
- Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
- Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
- Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
- Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
- MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
- Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
- Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
- Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
- Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
- D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
- Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
- Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
- Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
- MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
- Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
- Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).
