Summary
우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.
Abstract
측 두 엽 간 질 (TLE)은 가장 일반적인 부분 복잡 한 간 질 증후군 및 약물 이상 반응. 깊은 두뇌 자극 (DBS) 때 유망한 접근 약물 치료 실패 또는 신경외과 권장 하지 않습니다. 급성 뇌 조각 microelectrode 배열 (MEAs)에 결합 된 전기 자극에 의해 신경 네트워크 상호 작용 및 그들의 변조를 공부 하는 유용한 도구를 나타냅니다. 기존의 세포 외 기록 하는 기술을, 비교 관찰 포인트와 알려진된 전극 간 거리, 전파 경로 속도 electrophysiological의 공부 수 있도록 더 많은 수의 추가 장점 제공 신호입니다. 그러나, 조직의 산소 MEA 기록, 감소 신호 대 잡음 비율 고 실험 온도에 높은 진동 오는 높은 관류 속도 요구 하는 동안에 크게 장애가 있을 수 있습니다. 전기 자극 더 장시간된 녹음/자극 신기를 추구 하 고 어려운 뇌 조직을 강조 한다. 또한, 뇌 조각 활동의 전기 변조 전극 매핑 쉽고 신속 하 게 수행 함을 라이브 실험 기간 동안 필요한 뇌 조각 내 특정 구조/경로 대상으로 해야 합니다. 여기, 우리는 4-aminopyridine (4AP)의 녹음 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 설명-설치류 뇌 조각 사용 하 여 평면 MEAs에에서 epileptiform 활동을 유도. 우리 쥐에서 얻은 뇌 조직의 능가 쥐 뇌 조직 및 MEA 실험에 대 한 더 적합 따라서 보여줍니다. 이 프로토콜 생성 및 유지 보수의 안정적인 epileptiform 패턴을 충실 하 게 재현 기존의 필드 잠재적인 기록 관찰 electrophysiological 기능, 몇 시간 동안 지속 하 고 outlasts 지속 보장 장시간된 신 기원에 대 한 전기 자극입니다. 실험을 통해 조직 생존 관류 속도 층 류 및 낮은 (1 mL/min) 에서도 빠른 해결책 교환을 위한 수 있도록 작은 볼륨 사용자 지정 녹음 챔버의 사용 덕분에 이루어집니다. 실시간 모니터링 및 자극 전극의 선택에 대 한 빠른 MEA 매핑은 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)에 의해 수행 됩니다.
Introduction
간 질은 뇌1;의 통제 활동을 일으키는 생명이 진보적인 장애 그것은 질병 및 중요 한 사회적인 낙인2,3의 가장 높은 부담 중 수행합니다. TLE은 가장 빈번한 증후군 (40%)와 가장 자주 (~ 30%)4항 간 질 약물 저항. Epileptogenic 직물의 외과 제거는 환자의 상태를 개량 수 있습니다, 그러나 그것은 모든 환자에서 가능 하지 않습니다 하 고 완전히 발작-무료 생활5하지 못할 수 있습니다. 전기 DBS에 의해 간 질 변 네트워크의 유망한 접근 때 약리 치료 또는 신경외과 적합 하지 않습니다.
그들은 보존, 적어도 부분, 원래 건축과 뇌의 연결 설치류 뇌 조각 전기 생리학 기술 시험관에 의해 건강과 질병6 어떻게 신경 네트워크 기능을 공부 하는 유용한 도구는 관심 (ROI)의 지구. 특히, 수평 결합 된 해 마 entorhinal 외피 (해 마-EC) 조각 TLE에 관련 된 필수적인 신경 네트워크를 구성 하 고는 따라서 정기적으로 TLE 연구7 체 외에서 .
발작 같은 활동 수 있습니다 심하게 유도 될 두뇌 조각에서 마그네슘 칼륨8,,910, 증가 하면서 감소 하는 등 인조 척수 (실제)의 이온 구성을 변경 하 여 또는 금지 GABAergic 활동을 차단 하는 등 약리 조작에 의하여 (종합적인 검토에 대 한11 참조). 그러나, 이러한 모델 기반 흥분 및 억제;의 불균형된 변경 따라서, 그들은 상호 작용 및 흥분 성의 억제 네트워크 ictogenesis의 공동된 기여를 공부 하 고 허용 하지 않습니다. 뇌 조각 convulsant 마약 4AP로 지속적인 관류 강화 흥분 성의 억제 neurotransmission, 그대로 유지 하면서 시 냅 스 활동이 전반적으로 급성 ictogenesis 공부 하 되므로12.
MEAs 기존의 extracellular 필드 잠재적인 녹음, 공간 제한 될 수 있는 전극의 수를 제한 하는 어디에 비교 하 여 관찰 포인트의 큰 숫자에서 신경 네트워크에 의해 생성 된 전기 활동을 기록 허용 뇌 조각 표면에 수용. 또한, MEA 칩 추적 전파를 매우 유용 하는 알려진된 전극 간 거리의 추가 된 이점을 제공 하 고 기록 된 신호의 이동 속도 평가. 처음 경작된 뉴런13,14에서 기록에 대 한 잉태, 비록 MEAs 지금 또한 사용 된다 설치류15 와 인간16에서 얻은 급성 뇌 조각의 electrophysiological 기능 하. 따라서, 간 질 연구의 맥락에서 MEAs ictogenesis16,,1718의 핵심에 신경 네트워크의 상호 작용을 정확 하 게 유용한 도구를 나타냅니다.
그러나, MEA 녹음 본질적으로 오랫동안 (몇 시간) 실험 프로토콜에 걸쳐 안정적인 epileptiform 패턴을 유지 하거나 기술 과제를 수행 합니다. 첫째, 조직의 산소 하지 큰 내에서 적절 한 및 수 불 쌍 한 신호 대 잡음 비율 및 온도 불안정성에 영향을 하는 동안 침수 형 녹음 실19,20 상용 MEAs의 전형적인 라운드 때 높은 관류 속도 (6-10 mL/min) 녹음의 품질 (난방 및 관류 장비21예 기술 노트를 참조) 뇌 조각에 산소 공급을 향상 하는 데 사용 됩니다. Epileptiform 방전 등의 높은 주파수 구성 요소를 갖춘 두 번째, 재발 성 방전은 거의 침수 형 녹음 실19;를 사용 하 여 관찰 이것은 특히 사건 때 급성 epileptiform 패턴 화학적으로 유도 된 ephaptic 메커니즘을 포함 4AP 모델22 의 경우 처럼 (11 에 대 한 포괄적인 개요 참조). 이러한 한계를 극복 하기 위해 몇 가지 전략 연구원에 의해 제안 되었습니다. 예를 들어 조직에 적절 한 산소 공급을 달성 하는 데 중요 한 요소는 두뇌 슬라이스 두께 (≤300 µ M) 및 지역17,18 줄이면서 관류 속도19,20 증가. 또한, 향상 된 뇌 조각 생존 모두 양쪽18에서 뇌 조직 perfusing 수 있도록 천공된 MEAs (pMEAs)를 사용 하 여 또한 수행할 수 있습니다.
설명된 방법을 크게 두뇌 조각에서 MEA 녹음의 가능성 향상, 반면 그들은 테스트 되지 않았습니다에 대 한 연장 (몇 시간)는 후자를 나타내는 중요 한 기록 및 전기 자극 세션 뇌 조직에 대 한 스트레스입니다. 장시간된 녹음 세션 단기 측정에 의해 정체 수 없습니다 epileptiform 패턴의 특정 기능의 시간에 진화를 연구 하 필요할 수 있습니다. DBS 연구의 맥락에서 장기간된 실험 프로토콜 평가 하 고 동일한 뇌 조각에 여러 자극 패러다임의 효과 비교 하 여 필요할 수 있습니다.
필요가 있을 때만 자발적인 전기 활동 기록, 투자 수익에 관하여 전극의 매핑 일반적으로 이루어집니다 귀납적은, 즉, 데이터 분석; 중 대신, 갖는 응답 또는 전기 neuromodulation 패러다임의 연구는 실험 기간 동안 신속 하 고 쉽게 라이브 전극 매핑 필요 지시 된 특정 ROI(s)에 자극 전달는 필요 합니다.
여기, 우리는 유도 및 설치류 뇌 조각에 안정적인 4AP 유도 epileptiform 패턴의 유지 보수에 대 한 허용 하는 간단한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 기존의 세포 외 전기 생리학 기술을 사용 하 여 특징 관찰된 활동 충실 하 게이 모델의 electrophysiological 기능을 재생산 한다. 그것은 몇 시간 동안 지속 되 고 반복된 장시간된 신 기원에 대 한 지속적인된 전기 자극을 outlasts. 유지 하 고 품 어 뇌 조각 하는 데 사용 하는 챔버 조립 될 수 있다 쉽게 표준 실험실 공급 (그림 1A)를 사용 하 여 있지만 최적 환율 및 층 류 흐름 (그림 1B)에 대 한 허용 하는 사용자 지정 녹음 실 상업적인 소스에서 얻을 수 또는 저렴 한 가격에 3D 인쇄 기술을 사용 하 여. 실시간 모니터링 및 자극 전극의 선택에 대 한 ROI(s)의 빠른 매핑 가능한 mapMEA, 요청에 따라 자유롭게 사용할 수 있는 명명 된 사용자 지정 사용자 친화적인 GUI에 의해 이루어집니다.
그림 1:이 프로토콜 사용 하는 사용자 정의 장비. (A) 복구, 미리 데우고는, 및 4AP 사전 보육에 대 한 실 비 커, 페 트리 접시를 사용 하 여 조립 하는 지주. 페 트리 접시 지름에서 보다 작아야 차단기 고 주사기 플런저에 의해 장소에서 개최 됩니다. 페 트리 접시의 바닥은 나일론 메쉬 (부드러운 스타킹)에서 페 트리 접시의 가장자리에 cyanoacrylate와 붙어으로 바뀝니다. 산소는 구부러진된 척추 바늘 (22 세대), 페 트리 접시의 벽과 비 커 사이 삽입을 통해 제공 됩니다. 거품 비 커와 결코 도달 뇌 조각 변위를 피하기 위해 나일론 메시의 측면에서 등장 한다. 페 트리 접시 위에 실제 증발을 방지 하 고 산소 포화를 유지 하는 뚜껑으로 사용할 수 있습니다. (B) 사용자 지정 녹화 챔버입니다. : 난방 정 및 참조 전극에 맞게 입구 저수지. 개: 흡입 바늘에 맞게 콘센트 저수지. rec: 녹화 챔버입니다. (C) 유리 파스퇴르 피 펫, 화재 연마 하 여 웅크리고 조직 처리 기록 챔버 내에서 위치를 조정 하는 데 사용. (D) 사용자 정의 슬라이스 고정 앵커. (E) 최종 조립 녹음 실의 MEA 칩에 장착. 뇌 조각 앵커에 의해 장소에서 개최 하는 하단에 달려있다. 빨간색 화살표는 반면 빨간색 원 참조 전극, 포화 KCl 펠 릿 실제 입구 저수지에 의해 잠긴 나타냅니다 난방 정 취재 PTFE 튜빙을 나타냅니다. 파란색 화살표는 콘센트 저수지에서 흡입 바늘을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 EU 지침 2010/63/EC 동물 복지에 준수 건강 (권한 부여 명. 860/2015-홍보)의 이탈리아 정부에 의해 승인 되었습니다 있다.
1. MEA/사용자 정의 챔버 어셈블리의 준비
참고: 시작 2 일 전에 실험. MEA는 반지 없이 사용 ( 자료 표참조).
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청소는 MEA (지속 시간: 35-40 분).
- 따뜻한 증류수로 enzymatic 청소기 분말을 디졸브. 따뜻한 표면에 MEA 솔루션을 청소 브러시 후 적어도 3 h에 대 한 솔루션을 청소 하는 따뜻한에는 MEA를 담가.
- MEA 증류수로 깨끗이 린스 하 고 보풀 없는 스크래치 조직을 사용 하 여 그것을 건조.
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녹음 챔버와 MEA 조립 (지속 시간: 10 분 + 하룻밤).
- 균등 하 게 확산 녹음 챔버의 하단 표면에 탄성 실 란 트. 아니 거품 있다 다는 것을 확인 하십시오.
- 족집게의 도움으로 MEA에 녹음 챔버 탑재 고 부드러운 압력을 적용 합니다. 어떤 거품 경우 약간 이동 챔버 원에서 모든 거품이 사라진 때까지 손가락으로 부드러운 압력을 적용 하는 동안. 줄곧 녹음 실의 외부 테두리 주위에 실 란 트 레이어를 확산.
참고: 중요! 실 란 트와 나 연락처를 커버 하지 마십시오. - MEA/챔버 어셈블리를 15 cm 배양 접시 안에 놓습니다. 페 트리 접시 5 mL 또는 10 mL 비 커는 MEA 가까이 증류수 가득합니다. 습 한 환경 유지 하기 위해 모든 것을 커버. 하룻밤 실 온에서 치료 하자.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
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친수성 수 있도록 MEA 코트 (기간: 5-10 분 + 하룻밤).
- 15 cm 배양 접시에는 MEA를 놓습니다. MEA 기록 영역에 폴 리-D-신의 50 µ L를 붓는 다. 페 트리 접시, 닫고, 영화, 씰링 함께 인감 4 ° c.에서 밤새 껏 저장
- MEA 증류수를 사용 하 여 철저 하 게 린스를 증류수에 4 ° C에서 나를 저장 합니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 코팅된 MEAs 저장 하 고 몇 가지 실험에 대 한 다시 사용할 수 있습니다. 정기적으로 청소 하 고 다시는 MEA 코팅 조직 파편을 제거 하 고 신호 대 잡음 비율을 향상 시킬 수 있습니다.
2입니다. 재고 솔루션의 준비
참고: 실험 전에 1 일 시작 (기간: ~ 2 h). 재고 솔루션 가속화 실험 실험 하루에 도움이 됩니다. 그들은 사전에 준비 고 저장 될 수 있습니다. 농도 요인 및 구성에 대 한 표 1 을 참조 하십시오. 최종 솔루션의 구성 표 2 를 참조 하십시오.
- 상 온에서 증류수에 화학 물질을 분해. 재고 솔루션 필터 병을 필터링 (필터 직경: 0.22 μ m).
- 4 ° C에 저장 (권장 최대 저장 시간에 대 한 표 1 참조).
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
3입니다. 한 천 준비
참고: 실험 전에 1 일 시작 (기간: ~ 1 h).
- 500 mL 비 커에 증류수 250 mL를 붓고 하 고 350 rpm에서 교 반 시작. 한 천 5 g을 추가 하 고 완전히 해산 될 때까지 기다립니다.
- 250-300 ° c.에 솔루션을 열 솔루션은 수익률 2.5 %w / v agar 솔루션 ~ 200 mL 때까지 증발 물 하자.
참고: 온도 물 버블링 없이 증발 하도록 충분히 높은 해야 합니다. - ~1.5의 200 mL 플라스틱 사각형 상자에 agar 솔루션 cm 높은 벽을 부 어 하 고 열기가 식도록 실 온에서 고체 될 때까지.
- 상자를 커버와 4 ° c.에 그것을 저장합니다 한 블록은 몇 주 동안 좋은.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
4입니다. 냉동된 면의 준비
참고: 실험 전에 1 일 시작 합니다.
- 0.5-1 cm 가장자리 아래까지 증류수에 평면 하단 스테인리스 그릇 채워.
- 하룻밤-20 ° C에서 저장 합니다.
5. 실제 절단 신경의 준비
참고: 시작 1 일전 실험 또는 실험의 같은 날 ( 표 1 및 표 2참조) (지속 시간: 30 분).
- 500 mL 비 커에 증류수 200ml를 부 어 하 고 350 rpm는 자력을 사용 하 여 교 반 시작.
- B 주식의 50 mL 및 50 mL 주식 C의 추가 ( 표 1참조).
- 3mm pyruvic 산, 208 mM 자당, 10 m m D-포도 당, 1mm L-아 스 코르 빈 산을 추가.
참고: 실제 볼륨 pyruvic 산의 밀도 순도에 따라 및 일괄 처리와 다를 수 있습니다. 새 일괄 처리를 열 때 항상 필요한 볼륨을 계산 합니다. - 씰링 필름 커버 그리고 30 분 동안 저 어.
- 500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 하 고 플라스 크를 채우기 위해 증류수를 추가 합니다.
- 씰링 영화와 부피 플라스 크를 밀봉 하 고 부드럽게 반전 3-5 번까지 솔루션은 균등 하 게 분명 하다.
- 모자와 유리 병에 실제 절단을 전송 합니다.
- 4 ° c.까지 냉각 절단 실제 또는 20-30 분-80 ° C에서 4 ° C에서 하룻밤을 저장합니다
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기 경우 하룻밤 냉각 하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 시간 마찬가지임 절단 실제 냉각 단계 6 추구 하 사용할 수 있습니다.
6. 준비 개최의 실제
참고: 실험 당일 솔루션 신선한 준비 (기간: 5-10 분). 실제 린스 조각화 절차 동안 실제 절단에서 뇌 조각 하는 데 사용할 것입니다 지주 (단계 8.16 참조)과 뇌 조각 장기 저장과 미리 온난화에 대 한. 두뇌 분할 영역을 씻어, 하 실제의 100 mL은 충분 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 보유 하 고 전 지구 온난화 실 주문 품 이며 300 mL 및 100 mL의 볼륨을 각각 포함 (cf. 그림 1A). 이 설정을 사용 하 여 실제의 500 mL 는 충분 합니다. 상업적인 소스에서 얻은 실 있는 경우 준비를 실제의 전체 양을 적절 하 게 조정 되어야 한다 다른 볼륨을 포함할 수 있습니다.
- 500 mL 부피 플라스 크에 증류수 200ml를 부 어.
- A 주식의 50 mL, B 주식의 50 mL, M, 주식의 6.5 mL 및 1 m m L-아 스 코르 빈 산을 추가 합니다. 부드럽게 회전 움직임을 사용 하 여 L-아 스 코르 빈 산 완전히 해산 될 때까지 교 반 하십시오.
- 마지막 볼륨에 도달, 영화, 씰링으로 부피 측정 플라스 크를 밀봉에 증류수를 추가 하 고 부드럽게 반전 3-5 번까지 솔루션은 균등 하 게 분명 하다. 실제 구성 지주 표 2 를 참조 하십시오.
7입니다. 실험 벤치의 준비
참고:이 분, 플러스 따뜻한 목욕의 꾸준한 온도를 30 분 필요 합니다.
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녹음 벤치
- 따뜻한 목욕을 시작 32 ° C에 그것을 설정 하 고 그것의 온도 유지 하기 위해 그것을 커버.
참고: 따뜻한 목욕이이 프로토콜에 사용 된 주문 품을 사용 하 여 단단한 플라스틱 상자와 원하는 온도에서 pre-set 수족관 온도 될 수 있습니다. 꾸준한 원하는 온도 실 온에서 시작 ~ 30 분에 도달 수 있습니다. 이후 전 지구 온난화 및 배양 챔버 플라스틱 상자 아래쪽에 앉아, 물 수준 해야 그냥 부동에서 챔버를 지키기 위하여 온도 커버 하기에 충분 합니다. - 개최와 (cf. 그림 1A), 미리 데우는 챔버 어셈블합니다 그리고 지주 실제 그들로 부 어. 실 온에서 지주 챔버를 유지 하 고 따뜻한 욕조 안에 미리 데우는 챔버를 놓습니다. 버블링 95% O2/5% CO2 가스 혼합 솔루션을 시작 하 고 거꾸로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 어떤 덫을 놓은 거품을 제거. 덮여 유지.
- 따뜻한 목욕을 시작 32 ° C에 그것을 설정 하 고 그것의 온도 유지 하기 위해 그것을 커버.
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조각화 벤치 및 vibratome
- Cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 견본 디스크의 중심에 작은 천 블록을 붙입니다.
- 250 mL 비 커를 얼음 양동이에 넣고 그것으로 실제 절단 부 어.
- 2 100 mL 비 커 고 각으로 실제의 50 mL를 붓고. 실 온에서 비 커를 둡니다. 이들은 헹 구는 비 커입니다.
- 버블링 95% O2/5% CO2 가스 혼합 솔루션을 시작 합니다.
- vibratome에 버퍼 트레이 탑재 하 고 얼음을 둘러싸고. 조각화 절차 동안 찬 온도 유지에서 원조 하는 얼음에 일부 에탄올을 붓는 다. 붓는 에탄올 후 필요에 따라 더 많은 얼음을 추가 합니다.
참고: 2 ° C의 온도 최적입니다. - 버퍼 트레이 내부 bubbler 다음 조립 놓고 vibratome 블레이드 블록을 탑재 합니다.
참고: 블레이드 ~ 10 °의 클리어런스 각도에 마운트되어 있는지 확인 합니다. - 볼륨 및 증류수와 칠의 2/3는 500 mL 비이 커에 얼음을 올려.
- 냉장고에서 냉동된 그릇을가지고, 그것은 거꾸로 조각화 벤치에 놓고 종이 타월 및 필터 종이 디스크 커버 합니다.
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마 취 벤치
- 얼음 가득 트레이에 작은 그릇을 놓고 실제 절단 부 어. 버블링 95% O2/5% CO2 가스 혼합물으로 시작 합니다.
8. 뇌 슬라이스 준비 및 유지 보수
참고:이 프로토콜 성인 (4-6 주 오래 된)의 사용 남성 CD1 마우스, 하지만 다른 긴장 (예를들면, c57/bl617,18)를 사용할 수 있습니다. 우리는 나중에 또한 같은 나이의 남성 Sprague-Dawley 쥐에서 얻은 뇌 조각에 의해 굴복 그 마우스 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 얻은 실험 출력을 비교 합니다. 다음 단계는 조각의 부분 분리 뇌 CA3 기반 빠른 interictal 같은 활동 적절 한 해 마를 제 지 하는 parahippocampal 외피가로 전파할 수 없습니다 준비를 참조 하십시오 23에서 설명합니다. 해 마 피 단절 해 마-EC 두뇌 슬라이스 준비를 사용 하 여 전기 변조 연구를 추구 하는 필수입니다. 사용 하는 vibratome 자료 테이블에 나열 된 모델을 말합니다. 다른 모델 다른 절차를 요구할 수 있습니다.
- 설치류 isoflurane를 사용 하 여 anesthetize는 carbogen에 5 %2 L/min에서 마 취 유도 실에 전달 하는 혼합 가스.
- 깊은 마 취 (없음 반사 발에 대 한 응답에 발 꼬 집),23에서 표준 절차를 수행 하는 1 분 이내 뇌를 추출. Equilibrated 얼음 절단 실제를 포함 하는 작은 그릇에 두뇌를 배치 하 고 90-120 s에 대 한 진정 하자.
참고: 너무 오래 진정 하는 두뇌 하지 마십시오, 그렇지 않으면 그것을 고정 수 있습니다. - 얼음 절단 실제 버퍼 쟁반에 부 어. 실제 냉동된 그릇에 필터 종이에 절단 확산. 필터 종이에 두뇌 놓고 필요한 뇌 조직 블록 소 뇌를 제거 하 고 바로 밖으로 정면 장 대를 절단 하 여 분리 합니다.
- 구부러진된 주걱의 도움으로 컷 정면 면 한 블록 및 vibratome 블레이드를 직면 하 고 후 두 극 견본 디스크에 뇌의 등 쪽 측을 접착제. Cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 사용 합니다. 표본 디스크 버퍼 트레이에 즉시 놓고 그것을 확보 합니다.
- 한 블록까지 조직에 걸쳐 줄곧 vibratome 블레이드를 이동 하기 위하여 단면 범위를 조정 합니다. 뇌 조직 블록 블레이드 수준에 도달 하려면 견본 디스크 높이 조정 합니다.
- 해 마는 명확 하 게 표시 될 때까지 조직 단면도 삭제 (보통 ~ 900 µ m). 그런 다음 400 µ m의 슬라이스 두께 설정 하 고 조직 단면도 유지 하는 깔 끔 히 시작. 각 뇌 섹션에 대 한 두 개의 반구를 분할 하 고 두 개의 뇌 조각을 얻기 위해 불필요 한 조직 트림. 버퍼 트레이 후속 섹션 동안 고조는,으로 채울 버퍼 트레이 lodgment 아이스 증류수 (단계 7.2.7 참조).
- 거꾸로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 뇌 조각 첫 번째 헹 구는 비 커에 옮기고 파스퇴르 피 펫, 비어 고 두 번째 헹 구는 비 커에 두뇌 분할 영역을 전송. 그리고, 뇌 조각을 들고 챔버로 전송 그들이 적어도 60 분 동안 복구.
참고: 일반적으로 6-8 두뇌 분할 영역 전체를 얻기 위해 가능 하다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
9. 4-AP (4AP-실제)을 포함 하는 실제의 준비
참고:이 준비를 위한 10 분 플러스 온난화의 20 분 필요합니다. 주의! 4 AP convulsant 마약 이며, 그것은 독성. 장갑과 처리 하며 유출 방지.
- 500 mL 부피 플라스 크에 증류수 200ml를 부 어.
- A 주식의 50 mL, B 주식의 50 mL, M, 주식의 5 mL 및 1 m m L-아 스 코르 빈 산을 추가 합니다. 부드럽게 회전 움직임을 사용 하 여 L-아 스 코르 빈 산 완전히 해산 될 때까지 교 반 하십시오.
- 4AP 주식의 500 µ L를 추가 합니다.
- 마지막 볼륨에 도달, 영화, 씰링으로 부피 측정 플라스 크를 밀봉에 증류수를 추가 하 고 부드럽게 반전 그것은 3-5 회까지 솔루션은 균등 하 게 분명 하다.
- 어셈블합니다 4AP incubating 챔버 (cf. 그림 1A)와 그것에 4AP-실제의 ~ 80 mL를 붓는 다. 챔버를 커버 하 고 따뜻한 목욕을 전송 95% O2/5% CO2 가스 혼합물으로 버블링 시작 합니다. 거꾸로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 어떤 덫을 놓은 거품을 제거 합니다. 덮여 유지.
- 4AP-실제 온도 30-32 ° C (~ 20 분) 때까지 기다립니다.
참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기 뇌 조각을 아직도 회복 하는 경우.
10. 미리 온난화와 4AP에 조각의 외피 (지속 시간: 90 분)
- 전 지구 온난화 실제와 4AP-실제 온도 30-32 ° c.
- 거꾸로 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 미리 데우는 챔버로 1 두뇌 슬라이스를 전송 하 고 25-30 분에 대 한 조직의 나머지. 다음 뇌 조각 4AP 실제 incubating 챔버로 전송 하 고 60 분 동안 휴식 하자.
11입니다. 잘못 설정 준비
참고: 녹음 하기 전에 15 분 시작 합니다.
- 500 mL 삼각 플라스 크에 4AP-실제의 나머지 볼륨을 전송.
- MEA 앰프 위의 선반에 삼각 플라스 크를 놓고 튜브를 사용 하 여 솔루션을 지속적으로 60 mL 주사기를 피드를 허용 합니다. 삼각 플라스 크와 1 mL/min의 중력 먹인 속도 있도록 주사기의 높이 조정 합니다.
참고: 올바른 높이 튜브 내경 (ID)에 따라 달라 집니다. 5/32 인치 ID의 튜빙, 30 cm는 충분 하다. - 버블링 4AP-실제 95% O2/5% CO2 가스 혼합물으로 주사기와 삼각 플라스 크에서 시작 합니다.
- 거기까지 비 커에 관류 튜브를 통해 하자 4AP-실제 흐름은 공기 내부; 다음 솔루션 흐름을 중지 합니다.
- 온도에 MEA 기지에서 난방 요소를 연결 합니다. MEA 앰프 내부 건조 MEA 칩 놓고 앰프 헤드를 확보 합니다. 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 입구와 녹음 실의 외부 저수지 4AP-실제 전송.
- 자석 홀더를 난방 정 고 녹음 실 입구 포트; 내부 팁 배치 MEA 앰프 헤드;에 자기띠를 자석 홀더를 연결 정;에 관류 튜브를 연결 온도에 정 맥을 연결 합니다.
주: 난방 정 경사진된 소계 (PTFE) 튜브 입구 포트 녹음 실에 도착 하 고는 정 맥의 금속 소재 때문에 잡음을 최소화 하 여 적용 한다. 입구 저수지는 4AP-실제와 채워집니다 적절 하 게 때 관류 시스템에서 떨어지는 방울 표시 됩니다. - 저수지 안에 흡입 바늘을 놓고 흡입 바늘 실제;에 잠수 하 여 부정적인 압력 인지 확인 일정-저주파 흡입 소음에 대 한 확인 하십시오.
참고: 흡입 바늘 4AP-실제 뇌 조각 표면 바로 위에 흐름 수 있도록 배치 되어야 합니다. 진공 라인 또는 저 잡음 진공 펌프를 사용할 수 있습니다. - 1 mL/min의 유량 및 perfusing 시작 흐름 레 귤 레이 터를 설정 합니다.
참고: 중력 먹인 관류; 연동 펌프에 의해 발생할 수 있는 잡음을 제거 한다. 연동 펌프는 기본, 저 잡음 모델은 필수입니다. - 4AP-실제는 정 맥을 통해 흐르는, 일단 온도 켭니다. 37 ° C와 32 ° C 기록 챔버 내부 32-34 ° C의 온도 달성 하기 위해 MEA 기지에 열 정을 설정 합니다.
참고: 주의! 결코 열 솔루션 그것 또는 그것 없이 정 돌이킬 수 없 손상 될 수 있습니다. 정은 내장 온도 오프셋 설정된 값과 난방 정의와 챔버 내에 녹음 끝에 실제 값에 대 한 계정 기록 온도 (즉, 32-34 ° C) 보다 더 높은 온도 설정 합니다. 유량, 환경 온도, 및 녹음의 볼륨 모든 영향 기록 솔루션의 온도 챔버. 설정 단계 11.9에서에서 보고 설명된 프로토콜 및 장비 최적화 되어 있다. 항상 실제 기록 온도 열전대를 사용 하 여 확인 하 고 필요에 따라 설정을 조정. 뇌 조각 과열 방지를 위해 34 ° C의 위 MEA 자료가 열 하지 마십시오. - 녹음 실 입구 저수지에 외부 기준 전극을 배치 합니다.
참고: MEA 칩 내부 기준 전극 갖추고 있습니다, 하지만이 사용자 지정 녹음 실에 의해 포함 된다. 따라서, 외부 기준 전극은 사용 되어야 한다. 포화 KCl 펠 릿 때문에 수돗물에 대 한 필요 없이 사용할 준비가 가장 실용적 이다.
12. MEA 라이브 매핑
- 일단 4AP 실제 수준 및 기록 온도 안정화 원하는 회전으로는 관류와 일시적으로 그들을 막으려고 off 위치에 흡입 stopcocks 합니다.
- 신속 하 게 거꾸로 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 잘못 녹음 실에 한 뇌 조각을 전송 합니다. 필요한 사용 하 여 한 불 세련 된 컬된 파스퇴르 피 펫 (그림 1C) 또는 부드러운 소형 작은 브러쉬를 잘못 기록 영역에 그것의 위치를 조정 합니다. 뇌 조각에 고정 앵커 (그림 1D)를 놓습니다. 그들의 stopcocks에 위치를 다시 설정 하 여는 관류와 흡입을 다시 시작 합니다.
참고: 중요! 분할 전송 한다 되었다가 관류 이내 s 또는 조직 죽을 수도 있습니다. 조각을 고정 앵커 4AP-실제 뇌 조각 표면 장력의 차이로 인해 뇌 조각에 앵커를 배치 하는 동안 이동 하지 않도록 하려면에서 유지 되어야 한다. 앵커는 MEA에 두뇌 슬라이스를 확보 하기 위해 스테인레스 스틸 와이어 나일론 스레드 (그림 1D)를 사용 하 여 주문 품 일 수 있다 또는 상업적인 소스에서 얻은. 그림 1E 쇼 MEA 칩 최종 실험 설정 앰프의 헤드에 연결: MEA 칩 기록 챔버 내에 뇌 조각 사용자 정의 앵커에 의해 개최 됩니다. 반면 흡입 바늘 (파란색 화살표) 콘센트 저수지에 위치 참조 전극 (빨간색 원)와 난방 정 (빨간색 화살표)을 덮고 튜브 PTFE 입구 저수지에 배치 됩니다.
- 신속 하 게 거꾸로 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 잘못 녹음 실에 한 뇌 조각을 전송 합니다. 필요한 사용 하 여 한 불 세련 된 컬된 파스퇴르 피 펫 (그림 1C) 또는 부드러운 소형 작은 브러쉬를 잘못 기록 영역에 그것의 위치를 조정 합니다. 뇌 조각에 고정 앵커 (그림 1D)를 놓습니다. 그들의 stopcocks에 위치를 다시 설정 하 여는 관류와 흡입을 다시 시작 합니다.
- 거꾸로 현미경 스테이지에 장착 된 카메라를 사용 하 여 뇌 조각의 사진을 찍을.
- 전극 지도에 GUI를 시작 하는 컴퓨터 소프트웨어에서 mapMEA 스크립트 실행 합니다.
참고: 맞춤 소프트웨어 선택 전극 뇌 조각의 특정 구조에 해당 하는 사용자를 수 있습니다. 이 단계는 정확한 경로 활성화 하 고 전기 자극을 사용 하 여 ictal 활동을 억제 하는 중요 한.
그림 2: GUI에 대 한 라이브 MEA 전극 매핑. (A)는 MEA에 결합 된 해 마-EC 슬라이스의 도식 적인 표현입니다. 이 프로토콜에 사용 되는 기본 구조는 뿔 ammonis 3 (CA3), enthorinal 피 질 (EC), perirhinal 피 질 (PC), 그리고 subiculum (하위). 기준 전극은 삼각형 표식으로 도식화. 전극 점선에 둘러 쌓여 있어 교정 하는 이미지에 대 한 XY 좌표를 나타냅니다. (B) 화면 라이브 MEA 매핑하는 동안 GUI의 캡처. 플로우 차트 캡처의 왼쪽에 따라 단계별 절차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 뇌 조각 그림 로드를 찾아보기 단추를 클릭 합니다. 참조 전극 반-왼쪽의 MEA (그림 2A, 삼각형 표시)의 위쪽 행에 표시 됩니다 있는지 확인 합니다. 포인터 활성화 단추를 클릭 다음 이미지 교정 및 전극 매핑을 위한 XY 좌표를 표시 하려면 배열의 왼쪽 행에 있는 위쪽 및 아래쪽 전극 선택 합니다.
- 분할 영역 유형 드롭 다운 메뉴에서 수평을 선택 합니다. 구조를 기본 확인란을 체크.
참고: 그것은 새로운 구조를 입력 버튼을 선택 하 여 구조를 사용자 정의할 수입니다. 수평 뇌 조각에 대 한 기본 구조는 그림 2A에서 묘사 된다. - 아래 뇌 조각 그림 번호 푸시버튼, 투자 수익에 해당 하는 전극 선택한 클릭 (그림 2B); 할당 구조 패널에서 해당 푸시버튼 각 투자 수익에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 저장 버튼을 누르면: #EXP_LabelledElectrodes 선택한 전극 및 ROIs를 보고 테이블을 포함 하는 결과 폴더를 생성 하는 소프트웨어.
13. 기록 및 전기 변조 Epileptiform 활동의
- 챔버 내에 녹음 녹음 하기 전에 5-10 분 동안 안정화 뇌 조각 허용.
- 자기 교정 및 안정화를 허용 하도록 자극 프로토콜 전에 자극 단위 적어도 10 분을 켭니다. 자극 제어 소프트웨어를 시작 하 고 자극 및 MEA 앰프 연결 되어 확인 제대로 자극 제어 소프트웨어의 주요 패널의 녹색 LED로 표시. 특정 악기와 자료 테이블 cf. 자세한 내용은 소프트웨어 설명서를 참조 하십시오.
- 바이 폴라 구성에서 자극을 설정 합니다. (Cf. 섹션 12) 스크립트 mapMEA 와 매핑된 것 들 가운데 CA1/인접 subiculum (cf.24,25)의 피라미드 세포 층 접촉 전극 쌍을 선택 합니다. 선택 된 전극 중 하나는 자극과 같은 자극 채널의 긍정적인 플러그 다른 전극의 부정적인 플러그를 연결 하는 와이어를 사용 합니다. 다른 와이어를 사용 하 여 앰프의 접지에는 자극의 접지를 연결.
- 레코딩 소프트웨어를 시작 합니다. 데이터를 얻기 위해 레코딩 소프트웨어의 주요 패널에서 재생 버튼을 누릅니다. 기록 적어도 4 ictal 출력.
참고: 2 kHz의 샘플링 주파수는 하드 디스크 공간 사용을 최소화 하면서 공정 해상도 필드 잠재력을 취득 수 있습니다. 5 분 녹화 파일 ~ 80 MB 걸립니다. 더 높은 샘플링 주파수가 필요할 수 있습니다 예를 들어, 레코드 자극 또는 멀티 유닛 활동을. 관찰 하기 위해 필드 전위만, 300 Hz에서 라이브 로우-패스 필터를 사용 하 여 멀티 유닛 활동을 차단. - 자극 강도 결정 합니다.
- 자극 제어 소프트웨어에서 주요 패널을 사용 하 여 평방 복 형 긍정적-부정적 현재 펄스의 지속 시간이 100 µs/단계 디자인.
참고: 주의! 직류 자극 균형된 충전 펄스를 장비 손상을 방지 해야 합니다. - 최고의 자극 강도 식별 하는 빠른 입력/출력 (I/O) 테스트를 실행 합니다. 5 간 펄스 간격을 추가 하 여 0.2 Hz 또는 낮은 13.5.1 단계에서 설계 된 자극 펄스를 전달 s 자극 제어 소프트웨어의 적절 한 형태로 이상. 펄스 진폭 탭에서 100 µ A/위상의 초기 펄스 진폭 입력 하 고 각 재판에서 50-100 µ A 단계까지 자극 parahippocampal 외피가에서 interictal와 같은 이벤트를 보여주고 안정적으로 수 증가 (확인 하 여 시각 신호는 녹음 소프트웨어)입니다.
- 자극 제어 소프트웨어에서 주요 패널을 사용 하 여 평방 복 형 긍정적-부정적 현재 펄스의 지속 시간이 100 µs/단계 디자인.
- 변 ictogenesis의 전기 변조
- 프로그램의 자극 프로토콜 제공 하 자극 단위. I/O 테스트 중 확인 된 자극 진폭을 사용 합니다.
참고: 갖는 응답의 실패 비율 ≤20% 이어야 한다. - 자극 중지 후 적어도 4 ictal 방전 (13.4 단계)로 기록 하 여 네트워크 복구 사전 자극 상태를 확인 합니다.
Representative Results
6 x 10 레이아웃과 500 µ m 전극 간격 평면 MEAs는 여기, 때문에 그들의 기록 영역에 걸쳐 뇌 조각 전체에 걸쳐 설명 실험 프로토콜에 대 한 이상적인 녹음 장치 (그림 3A,17참조). 구멍이 MEAs (pMEAs) 조직 산소를 개선 하는 것이 좋습니다 것입니다, 그들의 기록 영역 너무 작습니다 (~ 2 mm 직경). 이 해 마와 parahippocampal 외피가 생성 하는 전기 신호의 동시 시각화를 허용 하지 않습니다 (데이터 표시 되지 않습니다;18참조).
관찰된 4AP 유도 epileptiform 패턴 (그림 3A) 충실 하 게 재현 한 무슨이 생체 외에서 사용 하 여 모델 기존의 필드 잠재적인 기록에서에서 일반적으로 관찰 하 고 구성 하는 세 가지 유형의 활동7, 26: (나) ictal 같은 이벤트 (그림 3B, 화살촉)는 강력한 오래 견 딘 (> 20 s, 범위: 20-60 s) 토 닉와 clonic 부품 (그림 3C); 발작 활동의 electrographic 기능을 닮은 이벤트 그들은 모든 3-5 분 parahippocampal 외피가 내에서 생성 되 고 재입력 (3D 그림, 화살표);가 이랑 통해 hippocampal 형성 (ii) 느린 interictal 같은 방전 (그림 3B, EC 추적, 검은 바;에 확장 된 그림 3E)는 짧은 (< 1 s) 해 마-EC 두뇌 슬라이스 준비 내 편 ictal 이벤트 사이 생성 된 인구 이벤트 느린 속도 (범위 10-30 s)에서 발생 (iii) 빠른interictal 같은 방전 (그림 3B, CA3 추적, 검은 바; 그림 3E에 확장)는 되풀이 브리핑 (< 1 s) 인구 이벤트 CA3 hippocampal 하위;에 의해 생성 된 Schaffer 민간인 보존 빠른 CA3 기반 interictal 이벤트 hippocampal 루프를 따라 전파 하 고 발휘 한 안티-ictogenic 효과24 (데이터 표시 되지 않음); ictal 활동을 방지 하기 위해 설명된 프로토콜 위해 런다운 CA3 출력 중단 됩니다 (cf. 그림 3B, E). MEAs를 사용 하 여 기록 빨리 CA3 구동 interictal 활동 느린 속도로 발생 하는 것을 주목 해야 하는 데 필요한 (~ 0.4 Hz) 유리 펫과 녹음 하는 기존의 필드 잠재력을 사용 하 여 관찰은 무엇 보다 (~ 1 Hz, 범위: 0.5-2.0 Hz, 데이터 표시 되지 않음).
전기 neuromodulation 설치류 두뇌 조각에서의 성공적인 결과 준비24에 포함 하는 지역 간의 기본 연결 함께 특정 신경 통로27 의 활성화에 따라 다릅니다. 우리 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐에서 얻은 조각 테스트 하 고 CD1 마우스와 우리 나타났습니다 그 마우스 크기, 두께, 그리고 내장 연결 중 최상의 트레이드 오프를 제공 하는 쥐 두뇌 조각 보다는. 첫째, 그들의 더 작은 크기 덕분에 그들은 상업적으로 이용 가능한 MEAs의 작은 기록 영역 더 잘 맞는 (그림 4A, 왼쪽: 쥐, 오른쪽: 마우스); 둘째, 그들은 내장 MEA (cf. 소개) 기록 하는 불리 한 조건에 탄력: ictal 같은 방전이 두 조직 (그림 4B)에 의해 생성 된 있지만 의 유사한 기간 (그림 4C 왼쪽), 발생의 그들의 속도 상당히 짧은 마우스 뇌 조각에서 (n = 10 조각 각 종; 2 꼬리 짝이 없는 t-검정, p < 0.001; 그림 4C 오른쪽)입니다. 후자 과속 업 실험 프로토콜, 실험 하루 동안 뇌 조각 더 큰 수를 테스트 수 있습니다:이 대표 결과이 집합에 대 한 우리 두 종에서 뇌 조각 비슷한 수 테스트 수 (쥐: n = 58. 마우스: n = 52), 쥐의 수만 (n = 18) 2-fold 쥐의 수보다 작은 (n = 42).
또한, 마우스 뇌 조각 밀도가 연결 현재 표시 되 고 따라서 더 높습니다 더 나은 지속적인된 전기 neuromodulation (그림 4D)에 대응. 따라서,이 생체 외에서 의 모델에서 ictogenesis, ictal 활동을 제어 하기 위한 전기 자극에 대 한 생존 능력은 쥐 뇌 조직에 대 한 보다 마우스에 대 한 상당히 큰. 이 부분 또한 자극 실험 쥐 뇌 조각 대 마우스를 사용 하 여 여러 지속적인된 자극 프로토콜 (그림 4E를 추구 하는 경우에 수행의 상당히 높은 성공률에 의해 반영 됩니다). 사실, 마우스 뇌 조직 더 나은 테스트 실험 시간 프레임 내에-4 h (그림 4 층)의 높은 생존 율에 의해 제안으로 지속적인된 전기 자극을 견딜 수 있도록 나타납니다. 따라서, 기본 연결의 더 나은 보존 함께 작은 크기 게 마우스 뇌 조각 MEA hippocampal parahippocampal 네트워크 상호 작용을 공부 하 고 겨냥 녹화를 수행 하 고 평가 하는 가장 적합 한 후보 전기 TLE 관련이 있는 neuromodulation 프로토콜.
정기적인 성 CA1/subiculum 전달 4AP 취급 해 마-EC 슬라이스 준비24,25,27, 가장 효과적인 주파수27로 1 Hz와 변 ictogenesis 제어 알려져 있다. 따라서, 그것은 또한 (예를 들어25참조) 효능과 다른 neuromodulation 정책의 효율성을 평가 하는 긍정적인 컨트롤으로 유용. 위에서 설명 했 듯이, MEA (즉, 외부 자극 전극의 필요 없이)를 통해 직접 전달 하는 전기 펄스 설치류 뇌 조직에 인구 응답을 보여주고 있습니다 (28참조). 뇌 조각 내 신경 네트워크 연결의 충분 한 보존, MEA, 그리고 자극 전극 쌍의 적절 한 선택에 두뇌 분할의 정확한 위치 추구 수 있도록 전기 neuromodulation 실험을 ictogenesis는 효과적으로 제어 합니다. 그림 5A같이 정기적인 프로토콜 사용 하 여 평면 MEAs 모두 녹음으로 자극 장치, 전기 자극의 효과 통해 구상 될 수 있다 추가 혜택으로 서 정식 1 Hz를 재현 가능 하다는 기존의 필드 잠재적인 녹음에 비해 동등 하 게 간격 둔된 관찰 포인트의 높은 숫자와 함께 두뇌 조직 섹션. 그림 5B 는 n에 대 한 얻은 결과의 정량화를 보여줍니다 = 총 시간 (총 ictal 활동 기간/관찰 시간25) 자극 동안 압류의 상당한 감소를 나타내는 9 뇌 조각 (한 방법-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0.01, 피셔의 LSD 특별 게시물 테스트, 보호). 결과 외부 자극 전극24,25에 대 한 문학과 일치.
계산 시간, 관측 시간을 압류 총 ictal 이벤트 사이의 간격에 따라 달라 집니다 그리고 그것은 또한 자극 프로토콜의 최소 기간을 결정 합니다 자신 있게 neuromodulation의 효과 평가 해야 합니다. 우리 4 ictal 방전 (그리고 ictal 이벤트 사이 따라서 적어도 3 간격)을 기록 하는 것이 수집 된 샘플 및 필요한 컬렉션 시간 사이 좋은 트레이드 오프입니다 찾을. 제어 상태 (즉, 아무 자극), 관찰 시간은 첫 번째 측정된 ictal 이벤트의 개시와 마지막의 종료 사이의 지연입니다. Neuromodulation, 동안 관측 시간 측정의 목적은 척도 섭 동 시스템에 도입 시간에 걸쳐 발생 하는 현상 이므로 자극 프로토콜 기간을 같습니다. 컴퓨팅과 비교 하는 시간 보다는 기간 그리고 ictal 이벤트의 간격을 압류 총 유형 II 오류를 피하기 위해 가장 적절 한 매개 변수입니다. 사실, ictal 활동의 완전 한 억제, 함께 그것도 하나만 ictal 이벤트 여러 이벤트 반대 전기 자극 중에 생성 된 제어 상태에서 관찰 가능. 이 경우에, 이벤트 사이의 간격을 측정 하는 것은 불가능 하다, 반면 자극 효능의 견적으로 ictal 기간 측정 (즉, ictal 활동 감소) neuromodulation의 실제 결과 대표 하지 않는다.
전반적으로, 여기에 제시 된 결과 마우스 뇌 조각 MEAs에 결합 된 귀중 한 도구 간 질 연구에 대 한 사전 간 질 치료에 대 한 DB의 필드 관련 된 신뢰할 수 있는 neuromodulation 연구를 수행 하는 나타냅니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜 뇌 조각 생존 능력 향상과 필요할 수 있습니다., 예를 들어 다른 전기 자극의 효과 비교 하기 위해 몇 시간 (그림 6)에 대 한 실험 세션을 추구 하 고 있습니다. 패러다임입니다.
그림 3 : 평면 측정으로 시각화 하는 전형적인 4AP 유도 epileptiform 패턴 (A) 마우스 뇌 평면 6 x 10 MEA에 슬라이스 (전극 간격: 500 µ m) 및 MEA 녹음 시각 4AP 유도 epileptiform 패턴의 측면-의해-개요. 눈금에서 각 사각형 뇌 조각 내의 해당 위치에 기록 하는 활동을 수용 한다. 파란색 파선 보다 명확 대 한 전극 행을 참조 하십시오. 각 사각형의 왼쪽 위 모서리에 파란색에서 기록 전극 번호 식별 됩니다. 회색 사각 교차 참조 전극을 나타냅니다. (B) EC 및 CA3 패턴 빠른 시간 단위에서 시각의 대표적인 추적 세그먼트. 화살촉 ictal 이벤트를 나타냅니다. EC 추적에서 그것은 느린의 발생을 감사 수 interictal 방전 (검은 막대), CA3 하위 전형적인 지속적인된 fastinterictal 패턴 (검은 막대)를 생성 하는 반면. (C) 일반적인 강장제 clonic 패턴을 보여주는 ictal 방전의 기록 확장. (D) EC (빨강) 및 CA3 (검정) 추적 세그먼트에 해당 하는 사전-ictal-하-ictal 전환의 빠른 규모 시각화 (B)에서 붉은 막대로 표시. 화살표 ictal 방전의 개시를 나타냅니다. 겹쳐 추적 ictal 이벤트는 EC에서 유래 하 고 이후에 CA3 하위 필드에 전파를 강조 표시 합니다. (E) (B)에 검정색 막대로 표시 interictal 기간의 확장 된 보기는 느린 사이 상호 관계의 부족을 강조 및 fastinterictal에서 생성 된 패턴 EC (빨강) 및 CA3 (검정), 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 쥐 뇌 조각 보다는 더 높은 실험 출력을 제공 하는 마우스 뇌 조각. (A) 뇌 쥐 (왼쪽)와 일치 된 나가의 (오른쪽) 마우스에서 슬라이스. 쥐 뇌 조각 MEA 기록 영역 보다 훨씬 더 큰 이며, 그것의 전기 활동 전체에 구상 될 수 없습니다. (B) 마우스 및 쥐 enthorinal 피 (EC)에 의해 생성 된 재발 ictal 활동의 직접적인 시각적 비교. (C) 쥐 및 쥐 두뇌 분할 영역 생성 비슷한 기간의 ictal 출력 이러한 이벤트 사이의 간격 이지만 거의 2-fold에 쥐 뇌 조직. * p < 0.05. (D) 쥐, 쥐에 비해 제공 가능한 전기 자극 실험에 대 한 뇌 조각의 2-fold 높은 수익률 ictogenesis 제어 목적으로 합니다. 전기 자극은 subiculum의 20 58 (34%) 쥐 뇌 조각, 52 (63%)의 33 반대로 마우스 뇌 조각에에서 parahippocampal 외피가에 인구 응답 연상 수 (치2: 9.22; p = 0.002). p < 0.05. (E) 가능한 조각 사이 ictal 활동 제어에 성공률은 2-fold 쥐 뇌 조각 대 마우스 (마우스: 33 뇌 조각, 60%의 20: 쥐: 6 20 뇌 조각, 30%; 치2: 4.67; p = 0.03). p < 0.05. (F) 마우스 뇌 조각 견딜 수 있는 지속적인된 전기 자극 (회색 음영 지역)의 장시간된 신 기원 반복. 자극 철수 시 마우스 뇌 조직 전시 epileptiform 패턴의 전체 복구 쥐 뇌 조직 생존 3 헤에서 극적으로 떨어지는 반면 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 ictogenesis의 전기 변조의 대표적인 실험 측정을 결합 4AP 유도 ictal 활동의 EC 및 PC에서 정기적인 1 Hz에 (PP)를 서 성 제어 상태 (자극), (A) 녹화 (자극 유물 잘립니다), 그리고 자극 철수 시 복구 하는 동안. (B) 시간을 점유 하는 총에 1 Hz에서 PP의 효과의 정량화. p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 4AP 유도 ictal 활동의 대표적인 장기 기록. (A) 추적 절차를 자르는 뇌 후 기록된 8 h와 4AP 응용 프로그램의 다음 2 시간 세그먼트. (B) 확장 된 추적 세그먼트에 해당 하는 편지는 는, b및 c 패널에 의해 식별 된 박스형된 ictal 출력 (A) 표시 장기간된 관찰 시간-과 부에 걸쳐 생성 된 ictal 활동의 일관성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 주식 A | 화학 | 분자량 | 농도 (mM) |
| NaCl | 58.44 | 1150 | |
| 용 매: 물 소 주 | KCl | 74.55 | 20 |
| 집중: 10 x | KH2포4 | 136.1 | 12.5 |
| 저장 온도: 4 ° C | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 20 |
| 최대 저장 시간: 1 주 | D-포도 당 | 180.2 | 250 |
| 참고: 50mm 멤브레인 필터를 사용 하 여 필터링 | |||
| 주식 B | 화학 | 분자량 | 농도 (mM) |
| NaHCO3 | 84.01 | 260 | |
| 용 매: 물 소 주 | |||
| 집중: 10 x | |||
| 저장 온도: 4 ° C | |||
| 최대 저장 시간: 1 주 | |||
| 참고: 50mm 멤브레인 필터를 사용 하 여 필터링 | |||
| 주식 C | 화학 | 분자량 | 농도 (mM) |
| KCl | 74.55 | 20 | |
| 용 매: 물 소 주 | KH2포4 | 136.1 | 12.5 |
| 집중: 10 x | MgCl2* 6 H2O | 203.3 | 50 |
| 저장 온도: 4 ° C | MgSO4* 6 H2O | 246.47 | 20 |
| 최대 저장 시간: 2 wks | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 5 |
| 참고: 50mm 멤브레인 필터를 사용 하 여 필터링 | |||
| 주식 M | 화학 | 분자량 | 농도 (mM) |
| MgSO4* 6 H2O | 246.47 | 100 | |
| 용 매: 물 소 주 | |||
| 집중: 100 x | |||
| 저장 온도: 4 ° C | |||
| 최대 저장 시간: 4 wks | |||
| 4AP 주식 | 화학 | 분자량 | 농도 (mM) |
| 4-aminopyridine | 94.11 | 250 | |
| 용 매: 물 소 주 | |||
| 집중: 1000 x | |||
| 저장 온도: 4 ° C | |||
| 최대 저장 시간: 2 wks | |||
| 참고: 2-3 분 또는 30-60 분에 대 한 stirr에 대 한 소용돌이 | |||
| 참고: 주의! 4 AP는 독성 및 cinvulsant. 장갑을 사용 하 고 확산 또는 유출 방지. | |||
표 1: 주식 솔루션입니다.
| 실제 들고 | 녹음 실제 | 절단의 실제 | |||||
| 화학 | C [m m] | 화학 | C [m m] | 화학 | C [m m] | ||
| NaCl | 115 | NaCl | 115 | 자당 | 208 | ||
| KCl | 2 | KCl | 2 | KCl | 2 | ||
| KH2PO4 | 1.25 | KH2PO4 | 1.25 | KH2PO4 | 1.25 | ||
| MgSO4 | 1.3 | MgSO4 | 1 | MgCl2 | 5 | ||
| CaCl2 | 2 | CaCl2 | 2 | MgSO4 | 2 | ||
| D-포도 당 | 25 | D-포도 당 | 25 | CaCl2 | 0.5 | ||
| NaHCO3 | 26 | NaHCO3 | 26 | D-포도 당 | 10 | ||
| L-아 스 코르 빈 산 | 1 | L-아 스 코르 빈 산 | 1 | NaHCO3 | 26 | ||
| L-아 스 코르 빈 산 | 1 | ||||||
| pH | 7.4 | pH | 7.4 | Pyruvic 산 | 3 | ||
| Osmolality | 300 mOsm/Kg | Osmolality | 300 mOsm/Kg | ||||
| pH | 7.4 | ||||||
| Osmolality | 300 mOsm/Kg | ||||||
표 2: 솔루션 구성입니다.
| 문제 해결 | |||||
| 문제 | 대책 | ||||
| '청크' ictal 출력 보기 | 관류 속도 감소 또는 흡입 바늘 위치를 조정 하 여 뇌 조각 위에 실제 볼륨을 낮추십시오. | ||||
| 아니 ictal 활동 | CA3 기반 빠른 interictal 이벤트는 피 질에 전파 되지 않습니다 (1) 확인 작은 메스 블레이드 (예: n.10)를 사용 하 여 또는 경우 Schaffer Collaterals를 끊을 수 바늘, 하지만 슬라이스 고정 앵커의 나일론 스레드를 절단 하지 않도록 주의 하십시오. 거꾸로 한 현미경이이 작업이 매우 어려운 반면 스테레오-또는 똑바로 현미경은 가장 적합 합니다. | ||||
| (2) 슬라이스 생존 확인: 강한 전기 자극 ictal 활동을 일으킬 수 있다? 4AP 응용 프로그램의 약 2 시간까지 기다립니다 다음 ictal 활동 발생 하지 않으면 뇌 조각을 변경 합니다. | |||||
| 뇌 조각 이동 때 고정 앵커 | (1) 부드럽게 조각 앵커를 제거 하 고 뇌 조각 위치. | ||||
| (2) 슬라이스 앵커 4AP-실제의 균등 하 게 젖은 있는지 확인 합니다. | |||||
| (3) 선호는 MEA 뇌 조각을 접착 하 녹음 실에서 4AP-실제를 제거 합니다. | |||||
| (4) 조각 고정 앵커를 재조 정할. | |||||
| 두뇌 분할 전송 후 MEA 칩에 수레 | (1) 부드럽게 파스퇴르 피 펫과 초과 실제 발음. | ||||
| (2)는 MEA 칩 다시 코팅 되도록 해야 합니다. | |||||
| 네트워크 응답을 유도 하지 않는 전기 자극 | 자극 강도 증가, 전극 쌍을 변경. | ||||
| 전기 자극 인접 하지만 하지 말 초 피 질 영역에 인구 응답을 이끌어 낼 수 있습니다. | 문제는 불 쌍 한 연결 또는 너무 낮은 자극 강도 ikely. 전기 자극 대뇌 피 질의 일부분만 되거나 효과가 있을 수 있습니다. 뇌 조각을 변경 하는 것이 좋습니다. | ||||
| 신호는 시끄러운 | (1) 확인 참조 전극: 시끄러운 기준 시간에 의해 발생할 수 있습니다 입구 저수지의 불완전 한 채우기를 참조 전극은 완전히는 실제 깊은. | ||||
| (2) 장비의 전반적인 접지 확인. | |||||
| 상수, 부드러운 흡입 소리가 그래서 (3) 조정 흡입 바늘 위치 땅 흡입 바늘입니다. | |||||
| (4) 면봉을 사용 하 여 에탄올과 MEA 외부 연락처를 청소. | |||||
| (5)는 MEA 칩 손상 될 수 있습니다: MEA 칩을 변경 하 고 확인 유물과 신호 대 잡음 비율. | |||||
표 3: 문제 해결.
Discussion
MEAs 신경 생리학 조사에 대 한 귀중 한 도구 이며, 수십 년간의 탐사 및 개발 덕분에 최근 몇 년 동안에 성숙에 도달 했습니다. 기존의 필드 잠재적인 녹음에 비해 MEAs 관찰 포인트와 알려진된 전극 간 거리는 정확 하 게 신경 네트워크 상호 작용을 정확 하 게 중요 한의 높은 숫자의 큰 이점을 제공 합니다.
MEA 녹음 기술 또한 패치 클램프 기록15, 단일 신경 세포와 신경 네트워크 활동 사이의 관계를 조사 등 다른 전기 생리학 방법에 결합 될 수 있습니다. 또한, 필드 전위와 멀티 유닛 활동을 동시에 시각화의 가능성의 작은 신경 앙상블 활동 및 집단 신경 네트워크 간의 상관 관계에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 전압에 민감한 염료, 칼슘 이미징, 및 optogenetics29 함께 신경 생리학 현상 다면체 접근을 사용 하 여 추론 수 있습니다. 약리 연구 뿐만 아니라 녹화와 같은 시스템 자극의 가능성은 MEA 녹음 기술은 매우 강력 하 고 다재 다능 한: 예, 그것은에 시 냅 스가 소성 현상을 공부 하는 코어 메모리 형성30, 여기, neuromodulation 프로토콜을 사용 하 여 간 질 및 다양 한 뇌 질환을 치료 하는 DBS와 관련 있는. MEA 녹음 기술을 적용할 수 있는 성공적으로 인간의 간 질 뇌 조직16 최근 증거 보여 둘이 치명적인 질병을 기본 기본 메커니즘을 이해 하는 간 질 연구에 귀중 한 유용성 그리고 그것을 개량 하는 DBS 알고리즘을 미세 조정 합니다.
그러나 MEAs 뇌 조각, 침수 녹음 챔버의 요구와 뇌의 필요성에 대 한 '제한' 조건 하에서 전기 생리학 실험의 추구를 강제 하는, 고체 기판에 나머지 부분을 슬라이스 어디 마이크로 전극 통합 되어 있다. 따라서, 뇌 조직에 충분 한 산소 공급, 차례로 녹음의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다 받을 수 없습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 수 안정적으로 기록 하 고 MEAs 급성 체 외 4AP 모델을 사용 하 여 결합 하는 설치류 변 네트워크에 ictogenesis 연구 및 평가 대 한 관련 정보를 제공 하는 전기 자극의 장시간된 신 기원 추구 하 DBS 정책의.
기존의 필드 잠재적인 기록의 사용에 따라 간 질 변 네트워크의 전기 neuromodulation에 이전 연구 비슷한 결과24,25; 마우스 또는 쥐 뇌 조각 사용 그러나 쥐 뇌 조직을 사용 하 여 더 많은 도전, 합리적으로 마우스7에서 얻은 뇌 조직에 비해 약한 연결 때문. MEA 기술 관련 마우스 뇌 조각 그들의 더 작은 크기의 덕택으로 가장 적합 하다. 또한, 쥐 뇌 조직 대 마우스 ictal 같은 방전의 발생의 더 높은 속도 감안할 때, 그것은 차례로 데이터 수집 빠르고 효율적이 게, 하나의 실험 하루 동안 훨씬 더 많은 두뇌 분할 영역을 테스트 하 여 수 있습니다. 사용 하는 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여 의미:
여기 설명 하는 사용자 지정 챔버를 사용 하 여 기록 ictal 출력 기간 및 기존의 MEA 반지 챔버와 동일한 MEA 형식 (평면 마이크로 전극, cf. 17)를 사용 하 여 관찰 하는 그 발생의 비율에 유사한 것 처럼. 그러나, 그것은 인해 실험 neuromodulation의 성공적인 추구를 방해 수 있습니다 낮은 관류 속도 (1 mL/min)와 함께 기존의 라운드 기록 챔버를 사용 하 여 때 뇌 슬라이스 두께 현저 하 게 감소 되어야 한다 강조 될 필요가 하 불 쌍 한 연결입니다.
이 프로토콜에는 낮은 볼륨 사용자 지정 녹음 실 패치 클램프 기록 챔버 디자인에 의해 영감된는 MEA 녹음;의 성공적인 추구에 대 한 중요 안정적이 고 신뢰할 수 있는 층 흐름을 제공 합니다. 그것은 또한 조직 생존 능력 및 기본 연결 사이 공정한 교환을 달성 하기 위하여 400 µ m 두뇌 슬라이스 두께 증가 수 있습니다. 그것은 참으로 인식 챔버 내에 기록 솔루션의 층 류 흐름은 온도, 산소에 의해 영향을 받지 않습니다 원형 흐름에서 관찰 된다 pH 기온 변화도 라운드 기록 때문에 뇌 조각 전기 생리학에 대 한 매우 바람직한 (사람)과 같은 상용 MEA 제공19,,2031 실 이러한 그라디언트 실험적인 바이어스를 소개 하 고 또한 뇌 조각에 해로운. 높은 관류 속도 (5-6 mL/min)16,31 함께 상대적으로 작은 볼륨 (~1.5 mL)의 녹음 실 관류 매체의 적절 한 교환에 대 한 허용 (≥3 시간 / 분). 사용자 지정 챔버 쉽게 될 수 있는 저렴 한 가격에 상용 소스에서 얻은 또는 3D 인쇄 기술을 사용 하 여 자체 생산. 다른 연구는 저 잡음 연동 펌프의 도움으로 MEA 녹음 400 µ m 두께 인간의 두뇌, 조각16 1 mL에 실제 볼륨을 유지 하 고 높은 관류 속도 (5-6 mL/min)를 시행 하면서 기존의 MEA 반지 챔버를 사용 하 여를 보고 있다. 그러나, 저자는 모델을 사용 다른 ictogenesis, 즉, 낮은 마그네슘2 +, 어떤은 더 적은 4AP 모델 보다 extracellular K+ 농도에 상당한 증가 포함 하는 ephaptic 메커니즘에 의해 영향을 가능성이 11 , 22. 우리 높은 관류 속도 크게 녹음 실제16에 증가 될 필요가 있을 수도 축적 된 세포 외 K+의 밖으로 빠른 세척으로 인해 4AP 모델에 없습니다 것으로 나타났습니다. 사실, ictal 이벤트 등장 더 '청크' ASCF 관류 속도 2-3 mL/min로 증가 하 고 뇌 슬라이스 두꺼운 실제 층에 의해 가라앉아 있었고 반면 강력한 강장제 clonic 구성 요소를 전시 하는 본격적인 방전을 반환 시 복원할 수 있습니다. 낮은 관류 속도 (1 mL/min)와 얇은 실제 계층 조직 표면 수준 (데이터 표시 되지 않음)에서 권리. 이 프로토콜에서 설명 하는 사용자 지정 녹음 챔버 수 교환 관류 매체 3-5 시간 / 1 mL/min의 유량에 분. 따라서, 전체 산소 공급 뇌 조각을 여전히 안정 온도 및 높은 신호 대 잡음 비율을 보장 하면서도 상대적으로 낮은 관류 속도에서 향상 강하게 됩니다. 가장 중요 한 것은, 생리 적인 가치에 extracellular K+ 농도 유지 가능 하다.
Ictogenesis의 4AP 모델 낮추는 Mg2 + 또는 증가 K+, 같은 실제 이온 구성의 중요 한 수정 필요 하지 않습니다 그리고 흥분 성의 억제 전송을 그대로 유지의 독특한 장점을 제공 합니다. 12, 높은 glutamatergic 및 epileptiform 동기화 (cf. 7)에 GABAergic 네트워크의 중요 한 역할에 비추어 간 질 연구에 관련 된 부분입니다. 4AP-실제가이 프로토콜에 사용 되는 생리 적 K+ 농도 (3.25 m m)와 지주 실제 (1.3 m m와 1 m m) 보다 약간 낮은 Mg2 + 농도 포함 되어 있습니다. 이 농도 아직도 쥐 CSF에에서 Mg2 + 농도의 보고 생리 적인 값에 폭포와 많은 실험실 (예17,18참조)에 사용 됩니다. 설명된 프로토콜의 목적에 우리는이 약간 감소 4AP의 효과에 도움을 선호 발견.
이전 작업에서는 4AP 적용 되었습니다 뇌 조각에 때 그것은 이미 녹음 실17,18안으로 배치 했다. 4AP 응용 프로그램 epileptiform 패턴의 시작 간의 시간 대기 시간을 관찰 하는 실험 필요 하지 않는 한 우리가 찾을이 방법은 오히려 시간이 많이 걸리는 이며 장시간된 녹화 및 자극 세션을 추구 하는 적합 하지 않습니다. 이 프로토콜에서 설명합니다. 사전 부 화 뇌 조각 4AP 32 ° C에서의 뇌 조각을 다른 조직 단면도 사용 하 여 실험을 추구 하면서 시리즈에서 사전 처리 될 수 있으므로 많은 실험 시간을 살려주는 수 있습니다.
뇌 조각의 장기 생존 능력 장기에 네트워크 기능을 분석 유용할 수 있습니다. 또한, 반복적인 전기 자극에 그들의 향상 된 복구 큰 장점은 실험 통계 견고성에 대 한 동일한 두뇌 조각에서 수행 해야 하는 여러 자극 프로토콜을 비교 하고자 하는 경우입니다. 우리의 손에서 3 자극 프로토콜을 테스트 하는 경우 각 컨트롤 단계 앞 하 고 복구 단계 이어서, 실험 3-5 시간 지속 될 수 있습니다. 이러한 맥락에서 라이브 MEA 매핑 올바른 경로 활성화 하 고 억제 보다는 전기 자극을 통해 ictogenesis를 부탁 하기 위해 결정적 이다. 우리의 사용자 친화적인 GUI 매핑할 다른 뇌 구조의 전극 신속, 간단 하 고 유연한 도구를 나타냅니다. 상용 소프트웨어에 반대 그것은 기본적인 프로그래밍 기술도 함께 MEA 레이아웃 사용자 지정을 추가할 수입니다. 이미지는 밝은 분야에서 취득 될 수 있다 따라서, 범용 카메라 어떤 좋은 해상도 현미경에 적당 하다. 거꾸로 한 현미경 똑바로 현미경을 사용 하는 경우이 조직 아래 숨겨져 있을 것 이라고 이후 뇌 슬라이스는 microelectrodes 위치를 시각화 하는 필수적 이다. 그러나, 스테레오 현미경 좋습니다 거꾸로 종류는 실험 수행 칼-인하 특정 신경 경로 방해 하는 경우.
마지막으로,는 더 제안 된 방식의 장점은 대부분의 필요한 도구는 비용이 많이 드는의 불필요 한 사용 뿐만 아니라 사용자 지정 녹음 실 및 지주 챔버, 따뜻한 목욕과 슬라이스 앵커 같은 저렴 하 고 상대적으로 쉬운 조립 저소음 연동 펌프입니다.
기술의 한계:
MEA 녹음 매우 느린 파도, 즉시각화를 허용 하지 않습니다, 그리고 DC 신호에 있는 이동. 이러한 초기 심한 ictal 출력 기간의 점근 측정을 도움이 될 수 있으며, 가장 중요 한, 그들은 근본적인 외피 퍼지는 불경기 (현상 간 질32 에서 갑자기 예기치 않은 죽음에 관한 공유 하를 공부 하는 사이 간 질과 편두통33).
전기 neuromodulation 관련 여기에 설명 된 프로토콜 뇌 조각 생존 능력을 영향을 주지 않고 여러 자극 세션을 수행할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 20-45 분, 어떤 이전 작품25에 보고 유사한의 3 자극 세션을 수행할 수 있습니다. 뇌 조각 아마 자극 세션 또는 더 이상 자극 프로토콜의 높은 수를 견딜 수 있습니다, 비록 우리가 않았다 테스트 하지 뇌 조각 이와. 3 자극 프로토콜 수를 제한 하 고 피하 자극 철수 시 회복의 부족까지 이러한 제한 조건에서 유지 하는 뇌 조직 스트레스 크게 수 있습니다 (≥60 분) 자극 세션 연장 하는 것이 좋습니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계:
몇 가지 중요 한 요소는 녹음의 성공적인 추격과 뇌 조각 MEA에 결합 된 epileptiform 활동의 방해 수 있습니다. 게다가 사용 설치류 종 뇌 조각, 기록 하는 동안 관류 속도의 품질과 실제 흐름의 역학 (즉,., 층 류 원형 대) 챔버 내에 기록, 우리는 발견 복구의 조건 및 4AP 응용 프로그램의 모드 뿐만 아니라 뇌 조각의 장기적인 유지 관리에서 가장 중요 한 단계가 있습니다.
침수 지주 챔버를 사용 하 여 때 뇌 조직 네트워크 활동을 보존 4AP 응용 프로그램에 의해 ictal 같은 방전의 유도 부탁을 실 온에서 두뇌 분할 영역을 저장 하는 데 결정적 이다. 우리의 손에서 복구 및 32 ° C에서 유지 보수 조각화의 3-4 h 이내 뇌 조직의 악화.
그러나 4AP-실제 실내 온도에에서 부 화 뇌의 조각와 32 ° C에서 녹음은,, 아닙니다 바람직한. 우리는이 조건에서 강력한 재발 ictal 출력을 관찰에서 많은 어려움을 발견 했다. 사실, 20-24 ° C 범위에서 낮은 온도 저해할 또는 심지어 방지 4AP 유도 ictogenesis 모두 에 체 외34 그리고 vivo에서35보고 되었습니다. 따라서, 4AP 인큐베이션 및 기록 온도 30-34 ° C에 속하는 해야 합니다와 일치 해야 합니다. 않도록 하기 위해 hyperexcitability의 동시 유도 인해 너무 많은 스트레스를 받고 뇌 조직의 4AP 및 뇌 조각의 갑자기 노출에 의해 실내 온도에서 따뜻한 (32 ° C) 4AP-실제에, 그것은 수행 하는 중간 사전 온난화 기본적 이다 단계 및 하자 뇌 조각 길 들 32 ° C에서 실제 지주에 대 한 20-30 분이이 단계를 건너뛰는 4AP로 ictogenesis 유도 영향을 미칠 수 있습니다.
언급 하는 또 다른 측면은 슬 라이 싱 후에 실제 D-포도 당 농도의 중요성. 25 mM 농도 뇌 조각 많은 실험실에서 사용 하는 10mm 농도 보다 더 보존 하 고 또한 빠릅니다 2-fold ictal 활동의 발생의 속도 향상 (따라서, 쉽게 실험의 긴 시리즈를 추구 하 여러 뇌 조각 매일 프로토콜).
마지막으로, 조각화 절차 동안 몇 가지 중요 한 세부 묘사가 언급 될 필요가 있다. 첫째, 허용 하지 않습니다는 그대로 뇌와 뇌 조각 절단 실제 추위에 얼어. 재미를 위한 두뇌 < 2 분은 충분 한 마우스 뇌의 작은 크기를 주어진. 조직 섹션 해야 전송 즉시 버퍼 용지함에서 실내 온도에 헹 구는 비 커. 절단을 rinsing 실제 그렇지 않으면 높은 자당 농도 뇌 조각 지주 챔버의 나일론 메쉬에 충실 할 것입니다 매우 중요 하다. 효과적으로 조직 린스, 그것이 지나치게 지주 실제를 오염 하지 있도록 전송 피 펫 내에서 절단 실제 콘텐츠를 최소화 하기 위해 중요 합니다. 2 단계 rinsing 오염 최소화에 에이즈. 완료 되 면 잘리는 절차, 조직 섹션 해야 전송 즉시 헹 구는 비 커에서 지주 챔버, 어디 부드러운 나일론 메쉬 정지 도중 실제 양쪽 모두에 조직의 산소 수 지주에. 조각화 절차에 따라 모든 단계에서 동일한 원리를 적용 한다: 두뇌 분할 한다 결코 비 커의 하단에, 그들은 지주 챔버의 측면 접촉 해서는 안 앉아서 그들은 결코 서로 접촉 해야도 오버랩.
수정 및 문제 해결:
실제 구성 실험의 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어 약물의 특정 신경 전달 물질 또는 이온 채널 전기 neuromodulation의 효능에 기여를 해 부를 추가할 수 있습니다. 또한, pyruvic 및 의약품 (cf. 표 2) 생략할 수 있습니다, 비록 우리가 그들은 강력한 신경 역할 발휘 찾을. 우리 보고 표 3 이 프로토콜에 그들과 함께 처리 하는 방법을 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제.
결론:
MEA 녹음은 의심할 여 지 없이 건강 및 질병에 신경 네트워크의 상호 작용을 해결 하기 위해 귀중 한 기술입니다. 약리 연구 이외에 간 질 및 다른 신경 성 질환에 적용 하는 DBS와 관련 된 전기 neuromodulation 프로토콜 평가 가능 하다. 이 프로토콜에서 우리는 그것이 기존의 extracellular 필드 잠재적인 녹음으로 얻은 그 비슷한 결과 함께 전형적인 정기적인 자극 실험을 재현 가능 하 고 외부 전극을 자극 것으로 나타났습니다. 상업 사용자 친화적인 장비 및 고급 소프트웨어 툴의 증가 가용성 MEA 녹음 기술 또한 폐쇄 루프 자극 실험, 뇌 조직 하 고 임시 자극을 제공 하기에 적합 하 게 신경 네트워크 응답을 피드백 메커니즘의 기여를 조사 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
G.P.는 Marie Skłodowska 퀴리 동료 유럽 연합 MSCA-IF-2014 프로젝트 Re.B.Us, 프레임 워크 프로그램 H2020 조지아 n.660689에 의해 자금입니다. GUI mapMEA ilaria.colombi@iit.it을 요청 시 무료로 제공 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
References
- Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
- WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
- Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
- Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
- Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
- Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
- Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
- Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
- Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
- Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
- Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
- Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
- MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
- Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
- Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
- Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
- Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
- D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
- Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
- Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
- Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
- MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
- Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
- Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).
