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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57548
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Rehab Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Abstract

Temporallappen-Epilepsie (TLE) ist die am häufigsten teilweise komplexe epileptische Syndrome und am wenigsten reagiert auf Medikamente. Tiefe Hirnstimulation (DBS) ist ein vielversprechender Ansatz, wenn pharmakologische Behandlung fehlschlägt oder Neurochirurgie wird nicht empfohlen. Akute Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays (MEAs) stellen ein wertvolles Instrument zur neuronalen Netzes Interaktionen und deren Modulation durch elektrische Stimulation zu studieren. Im Vergleich zu herkömmlichen extrazelluläre Aufnahmetechniken geben sie die zusätzlichen Vorteile einer größeren Anzahl von Beobachtungspunkten und einem bekannten Inter Elektrodenabstand wodurch Studium der Ausbreitungsweg und Geschwindigkeit der elektrophysiologischen Signale. Gewebe-Oxigenierung kann jedoch stark beeinträchtigt bei MEA Aufnahme, erfordern eine hohe Perfusion Rate, die auf Kosten der geringeren Signal-Rausch-Verhältnis und höheren Schwingungen in die experimentelle Temperatur kommt. Elektrischer Stimulation weiter betont, dass das Hirngewebe, macht es schwierig, längere Aufnahme/Stimulation Epochen zu verfolgen. Darüber hinaus muss die elektrische Modulation der Aktivität des Gehirns Slice gezielt bestimmte Strukturen/wegen innerhalb der Gehirn-Scheibe, wonach Elektrode Zuordnung schnell und einfach live während des Experiments aufgeführt werden. Hier veranschaulichen wir die Aufnahme und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine (4AP) durchführen-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit planaren MEAs. Wir zeigen, dass das Hirngewebe aus Mäusen gewonnen Ratte Hirngewebe übertrifft und sich somit besser für MEA Experimente eignet. Dieses Protokoll gewährleistet, dass die Erzeugung und Aufrechterhaltung eines stabilen epileptiformen Musters, die originalgetreu reproduziert die elektrophysiologischen Eigenschaften mit konventionellen Bereich mögliche Aufnahme beobachtet, für mehrere Stunden anhält und überdauert aufrecht erhalten elektrische Stimulation für längere Epochen. Lebensfähigkeit der Gewebe im gesamten das Experiment wird durch den Einsatz einer kleinvolumigen benutzerdefinierte Aufnahme Kammer ermöglicht Perfusion Preise für laminare Strömung und schnelle Lösung Austausch auch bei niedrigen (1 mL/min) erreicht. Schnelles MEA-Mapping für Echtzeit-Überwachung und Auswahl der stimulierenden Elektroden erfolgt durch eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche (GUI).

Introduction

Epilepsie ist eine lebensbedrohliche progressive Erkrankung verursacht unkontrollierte Aktivität des Gehirns1; Es trägt unter der höchsten Belastung durch Krankheit und erhebliche soziale Stigmatisierung2,3. TLE ist das häufigste Syndrom (40 %) und die meisten häufig (~ 30 %) resistent gegen Antiepileptika Medikamente4. Während chirurgische Ablation des epileptogenen Gewebes den Zustand des Patienten zu verbessern kann, es ist nicht bei allen Patienten möglich und kann keine Garantie für eine völlig anfallsfrei Leben5. Modulation der epileptischen limbischer Netzwerke durch elektrische DBS ist ein vielversprechender Ansatz, wenn pharmakologische Behandlung oder Neurochirurgie sind nicht geeignet.

Nagetier Gehirnscheiben sind ein wertvolles Werkzeug, wie neuronale Netzwerke funktionieren in Gesundheit und Krankheit6 mittels in-vitro- Elektrophysiologie-Techniken zu studieren, wie sie, mindestens im Teil, die ursprüngliche Architektur und Vernetzung des Gehirns erhalten Region(en) Interest (ROI). Insbesondere horizontale kombinierte Hippocampus-entorhinalen Kortex (Hippocampus-EG) Scheiben umfassen die wesentlichen neuronalen Netzwerke TLE beteiligt und sind daher routinemäßig in in-vitro- TLE Forschung7beschäftigt.

Beschlagnahme-ähnliche Aktivität kann akut in Hirnschnitten verursacht werden, durch eine Änderung der Ionischen Zusammensetzung der künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS), z. B. abnehmende Magnesium und Kalium8,9,10, erhöht oder durch pharmakologische Manipulationen, wie inhibitorischen Gabaergen Aktivität zu blockieren (siehe11 für eine umfassende Überprüfung). Diese Modelle basieren jedoch auf die einseitige Veränderung der Hemmung und Erregung; So ist es nicht möglich, die Untersuchung der Interaktion und konzertierte Beitrag von erregenden und hemmenden Netzwerken zum Ictogenesis. Kontinuierliche Perfusion der Gehirnscheiben mit convulsant Medikament 4AP verbessert exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmission, wodurch akute Ictogenesis zu studieren, während intakt zu halten synaptische Aktivität insgesamt12.

MEAs ermöglichen Aufzeichnung der elektrischen Aktivität erzeugt durch neuronale Netze aus einer größeren Anzahl von Beobachtungspunkten im Vergleich zu konventionellen extrazellulären Bereich mögliche Aufnahme, wo räumliche Beschränkungen begrenzen die Anzahl der Elektroden, die sein können auf der Gehirn-Scheibe-Oberfläche untergebracht. Darüber hinaus MEA Chips bieten den zusätzlichen Vorteil des bekannten Inter Elektrodenabstand, ist sehr nützlich, um Spur Ausbreitung und die Reisende Geschwindigkeit der aufgezeichneten Signale zu beurteilen. Obwohl ursprünglich konzipiert für die Aufnahme von kultivierten Neuronen13,14, MEAs jetzt dienen auch die elektrophysiologischen Eigenschaften von akuten Hirnschnitten von Nagetieren Menschen15 und16erhalten zu charakterisieren. So, im Rahmen der Epilepsie-Forschung, MEAs stellen ein wertvolles Werkzeug, neuronale Netze Interaktionen im Mittelpunkt des Ictogenesis16,17,18genau zu bestimmen.

MEA-Aufnahme trägt jedoch von Natur aus technischen Herausforderungen bei der Erlangung oder Aufrechterhaltung einer stabilen epileptiformen Musters in experimentelle Protokolle lange (mehrere Stunden). Erstens Sauerstoffversorgung der Gewebe nicht ausreichend in den großen und runden getaucht-Typ Aufnahme Kammer19,20 typisch für handelsübliche MEAs, während schlechten Signal-Rausch-Verhältnis und temperaturinstabilität auswirken könnte die Qualität der Aufnahme, wenn eine hohe Perfusion Rate (6-10 mL/min) wird verwendet, um die Sauerstoffzufuhr zum Gehirn-Scheibe zu verbessern (siehe zum Beispiel die technischen Hinweise auf Heizung und Perfusion Ausrüstung-21). Zweite, wiederkehrende Entladungen mit Hochfrequenz-Komponenten, wie z. B. epileptiformen Entladungen, eingehalten werden kaum Verwendung unter Wasser-Typ Aufnahme Kammern19; Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn das akute epileptiformen Muster chemisch induzierte ist und Ephaptic Mechanismen beinhaltet, wie es der Fall für die 4AP Modell22 ist (siehe11 für eine umfassende Darstellung). Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere Strategien von Forschern vorgeschlagen. Zum Beispiel sind erhöht die Perfusion Preis19,20 und gleichzeitig Gehirn Scheibendicke (≤300 µM) und Bereich17,18 entscheidende Faktoren zur Erreichung ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes. Darüber hinaus kann verbesserte Gehirn Slice Lebensfähigkeit auch mithilfe von perforierten MEAs (pMEAs), wodurch das Hirngewebe von beiden Seiten18Vorrichtung erreicht werden.

Während die beschriebenen Ansätze die Machbarkeit der MEA-Aufnahme von Gehirnscheiben erheblich verbessert haben, sie wurden nicht getestet gegen verlängert (mehrere Stunden) Aufnahme- und elektrische Stimulationssitzungen, die letzteren repräsentiert einen bedeutenden Stress für das Hirngewebe. Längere Aufnahmen müssen gegebenenfalls die Entwicklung in der Zeit der Besonderheiten von epileptiformen Mustern zu untersuchen, das wäre nicht möglich, zu entlarven von kurzzeitmessungen. Im Rahmen des DBS Forschung möglicherweise längere experimentelle Protokolle müssen bewerten und vergleichen die Auswirkungen von mehreren Stimulation Paradigmen in der gleichen Gehirn-Scheibe.

Wenn nur spontane elektrischer Aktivität werden, Zuordnung der Elektroden in Bezug auf den ROI aufgezeichnet muss erfolgt in der Regel a Posteriori, d. h.während der Datenanalyse; Stattdessen erfordert die Untersuchung der evozierten Antworten oder elektrische Neuromodulation Paradigmen, dass Stimulation diktiert die Notwendigkeit des schnellen und einfachen live Elektrode Mapping während des Experiments zu bestimmten ROI(s) geliefert werden.

Hier zeigen wir ein einfaches experimentelle Protokoll, das der Induktion und Aufrechterhaltung eines stabilen 4AP-induzierte epileptiformen Musters in Erwachsenen Nagetier Gehirnscheiben ermöglicht. Die beobachteten Aktivität reproduziert treu die elektrophysiologischen Eigenschaften dieses Modells wie mit herkömmlichen extrazelluläre Elektrophysiologie Techniken charakterisiert. Es bleibt für mehrere Stunden und nachhaltige elektrischen Stimulation für wiederholte längere Epochen überdauert. Die Kammern verwendet, um beizubehalten und die Gehirnscheiben inkubieren können leicht montiert werden mit standard Laborbedarf (Abbildung 1A), während eine benutzerdefinierten Aufnahme Kammer ermöglicht optimale Lösung Wechselkurs und Laminar-Flow (Abbildung 1 b) können aus kommerziellen Quellen bezogen werden oder mit Hilfe von 3D Drucktechnologie zu einem erschwinglichen Preis. Schnelle Zuordnung des ROI(s) zur Echtzeit-Überwachung und für die Auswahl der stimulierenden Elektroden erfolgt durch eine benutzerdefinierte Benutzerfreundliches GUI namens MapMEA, frei verfügbar auf Anfrage möglich.

Figure 1
Abbildung 1: Custom-Ausrüstung für dieses Protokoll verwendet. (A) im Betrieb, die Kammern für Erholung, Vorwärmen und Vorinkubation im 4AP montiert werden mit einem Becher und einer Petrischale. Die Petrischale sollte im Durchmesser kleiner als der Breaker und ist mittels einer Spritzenkolben in Position gehalten. Der Boden der Petrischale wird ersetzt durch eine Nylon-Mesh (aus weichen Strümpfe) mit Cyanacrylat auf die Felge der Petrischale geklebt. Sauerstoff wird über eine verbogene Wirbelsäule Nadel (22 G), eingefügt zwischen den Wänden der Petrischale und den Becher geliefert. Bläschen sollte von der Seite des Bechers und nie erreichen die Nylon-Netzgewebe, Gehirn Slice Vertreibung zu vermeiden abzuzeichnen. Oben auf einer Petrischale kann als Deckel verwendet werden, zu vermeiden ACFS Verdunstung und Sauerstoffsättigung zu erhalten. (B) Custom Aufnahme Kammer. in: Einlass Behälter zur Aufnahme der Heizung-Kanüle und die Referenzelektrode. aus: Outlet-Reservoir, die Absaugung Nadel unterzubringen. REC: Aufnahme Kammer. (C) Glas Pasteurpipette, gelockt durch Feuer-Polieren, verwendet, um das Gewebe zu behandeln und ihre Position innerhalb der Aufnahme-Kammer. (D) Custom Scheibe Niederhalter Anker. (E) Endmontage der Aufnahme Kammer auf der MEA-Chip montiert. Ein Stück Gehirn ruht auf den Boden durch den Anker gehalten. Der rote Pfeil zeigt die PTFE-Schläuche für die Heizung-Kanüle, während der rote Kreis die Bezugselektrode eine gesättigte KCl-Pellet durch ACFS im Zulauf Behälter getaucht zeigt. Der blaue Pfeil zeigt die Saug Nadel in den Outlet-Stausee. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden sind durch das italienische Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 860/2015-PR) in Übereinstimmung mit der EU Richtlinie 2010/63/EG im Bereich des Tierschutzes genehmigt worden.

1. Vorbereitung des MEA/Custom Kammerversammlung

Hinweis: Beginnen Sie 2 Tage vor dem Experiment. Verwenden Sie ein MEA ohne Ring (siehe Materialtabelle).

  1. Reinigen Sie die MEA (Dauer: 35-40 min.).
    1. Eine enzymatische Reiniger Pulver in warmem destilliertem Wasser auflösen. Bürsten Sie die Reinigungslösung auf den MEA-Oberfläche Warm dann Einweichen Sie die MEA in die warme Reinigungslösung für mindestens 3 Stunden.
    2. Spülen Sie die MEA gründlich mit destilliertem Wasser und trocknen Sie es mit einem fusselfreien keine-Kratz-Gewebe.
  2. Montieren Sie die MEA mit der Aufnahme-Kammer (Dauer: 10 min + Übernachtung).
    1. Die Elastomere Dichtmittel auf der unteren Fläche der Aufnahme Kammer gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie sicher, es gibt keine Bläschen.
    2. Montieren Sie die Aufnahme-Kammer auf der MEA mit Hilfe der Pinzette und üben Sie sanften Druck. Gibt es Luftblasen, bewegen Sie leicht die Kammer im Kreis während der Anwendung von sanften Druck mit Fingern, bis die Bläschen verschwunden sind. Verteilen Sie eine Versiegelung Schicht rundherum am äußeren Rand der Aufnahme Kammer.
      Hinweis: kritische! Die MEA-Kontakte mit der Versiegelung nicht abdecken.
    3. Platzieren Sie die MEA/kammerversammlung innerhalb einer 15 cm Petrischale. Statt einer 5 mL Petrischale oder einen 10-mL-Becherglas gefüllt mit destilliertem Wasser in der Nähe von MEA. Decken Sie alles, um eine feuchte Umgebung zu gewährleisten. Lassen Sie Heilung bei Raumtemperatur über Nacht.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  3. Die MEA zu machen, hydrophile Beschichtung (Dauer: ca. 5-10 min + Übernachtung).
    1. Legen Sie die MEA in eine 15 cm Petrischale. Gießen Sie Poly-D-Lysin 50 µL auf den MEA-Aufnahmebereich. In der Nähe der Petrischale, versiegeln Sie es mit Abdichtung Film und über Nacht bei 4 ° c Lagern
    2. Die MEA gründlich mit destilliertem Wasser spülen und die MEA bei 4 ° C in destilliertem Wasser zu speichern.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Beschichtete MEAs werden gespeichert und für mehrere Experimente wiederverwendet. Routinemäßig Reinigung und Neubeschichtung der MEA hilft Gewebe Verschmutzungen entfernen und Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

2. Vorbereitung der Stammlösungen

Hinweis: Beginnen Sie 1 Tag vor dem Experiment (Dauer: ~ 2 h). Stammlösungen helfen beschleunigen das Experiment auf die experimentelle Tag. Sie können im Voraus vorbereitet und gespeichert werden. Siehe Tabelle 1 für Konzentrationsfaktor und Komposition. Zusammensetzung der endgültige Lösungen finden Sie in Tabelle 2 .

  1. Lösen Sie die Chemikalien in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Die Stammlösungen mit einer Flasche Filter Filtern (Filter-Durchmesser: 0,22 µm).
  2. Shop bei 4 ° C (siehe Tabelle 1 für maximale Speicherdauer empfohlen).
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Vorbereitung des Nährbodens

Hinweis: Beginnen Sie 1 Tag vor dem Experiment (Dauer: ~ 1 h).

  1. Eine 500 mL-Becherglas 250 mL destilliertem Wasser gießen und start bei 350 u/min rühren. Fügen Sie 5 g Agar-Agar hinzu und warten Sie, bis es vollständig aufgelöst ist.
  2. Erhitzen Sie die Lösung bei 250-300 ° C. Lassen Sie das Wasser verdunsten, bis die Lösung ~ 200 mL um 2,5 % w/V Agar Lösung zu erzielen ist.
    Hinweis: Die Temperatur sollte hoch genug, um Wasser ohne Blasenbildung verdunsten zu lassen.
  3. Gießen Sie die Agar-Lösung auf 200 mL Kunststoff-Kästchen des ~1.5 cm hohe Wände und Abkühlen Sie lassen auf Raumtemperatur bis es fest wird.
  4. Das Feld abdecken und bei 4 ° c Lagern Der Agar-Block ist gut für mehrere Wochen.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Vorbereitung der gefrorene Ebene

Hinweis: Beginnen Sie 1 Tag vor dem Experiment.

  1. Füllen Sie eine flach-Boden Edelstahlschüssel mit destilliertem Wasser bis zu 0,5 - 1 cm unter den Rand.
  2. Über Nacht bei-20 ° C lagern.

5. Vorbereitung des neuroprotektive ACFS schneiden

Hinweis: Starten Sie 1 Tag vor dem Experiment oder am selben Tag des Experiments (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2) (Dauer: 30 min).

  1. 200 mL destilliertes Wasser in einen 500-mL-Becherglas gießen und start mit einem Magnetrührer bei 350 u/min rühren.
  2. Hinzufügen der Aktie B 50 mL und 50 mL Lager C (siehe Tabelle 1).
  3. 3 mM Brenztraubensäure Säure, Saccharose 208 mM, 10 mM D-Glukose und 1 mM L-Ascorbinsäure Säure hinzufügen.
    Hinweis: Das tatsächliche Volumen der Brenztraubensäure Säure hängt von der Dichte und Reinheit und kann mit der Charge variieren. Berechnen Sie das erforderliche Volumen immer wenn Sie einen neuen Stapel öffnen.
  4. Mit Abdichtung Film abdecken und für 30 min rühren lassen.
  5. Übertragen Sie die Lösung auf eine Volumetrische 500 mL-Flasche und fügen Sie destilliertes Wasser um die Flasche zu füllen.
  6. Versiegeln des volumetrischen Kolbens mit Dichtung Film und sanft invertieren 3 - 5 Mal, bis die Lösung gleichmäßig klar ist.
  7. Übertragen Sie das Schneiden ACFS in eine Glasflasche mit Kappe.
  8. Speichern Sie das Schneiden ACFS bei-80 ° C für 20-30 min oder bei 4 ° C über Nacht um bis zu 4 ° c zu kühlen
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden, wenn über Nacht kühlen bevorzugt wird. Ansonsten die benötigte Zeit für das Schneiden ACFS Kühlung verwendet werden dürfen, zu Schritt 6.

6. Vorbereitung des Betriebs ACFS

Hinweis: Die Lösung frisch zubereiten, am Tag des Experiments (Dauer: ca. 5-10 min). Die Abhaltung ACFS verwendet wird, um Gehirnscheiben vom Schneiden ACFS während das slicing Verfahren zu spülen (siehe Schritt 8.16) und für Gehirn Slice langfristige Speicherung und Vorwärmen. Um den Gehirnscheiben zu spülen, ist 100 mL der holding ACFS ausreichend. Die Holding und vor Erwärmung Kammern, die in diesem Protokoll verwendeten sind maßgeschneidert und enthalten ein Volumen von 300 mL und 100 mL bzw. (vgl. Abb. 1A). Mit dieser Einstellung ist 500 mL der holding ACFS ausreichend. Kammern stammen aus kommerziellen Quellen enthalten ein anderes Volume, in dem Fall den Gesamtbetrag der holding ACFS vorbereitet werden entsprechend angepasst werden sollte.

  1. Gießen Sie 200 mL destilliertes Wasser in einem 500 mL volumetrischen Kolben.
  2. Lager A 50 mL, 50 mL der Aktie B, 6,5 mL Lager M und 1 mM L-Ascorbinsäure hinzufügen. Schütteln Sie sanft, mit rotierenden Bewegungen bis L-Ascorbinsäure vollständig gelöst ist.
  3. Fügen Sie destilliertes Wasser zu erreichen das Endvolumen, versiegeln den volumetrischen Kolben mit Dichtung Film und invertieren Sie sanft 3 - 5 Mal, bis die Lösung gleichmäßig klar ist. Siehe Tabelle 2 für die Abhaltung ACFS Zusammensetzung.

7. Vorbereitung der experimentellen Bänke

Hinweis: Hierzu muss 15 Minuten plus 30 min, eine Konstante Temperatur des warmen Bades zu erhalten.

  1. Aufnahme-Bank
    1. Starten Sie das warme Bad, setzen Sie ihn auf 32 ° C und decken Sie es um seine Temperatur zu halten.
      Hinweis: Das warme Bad in diesem Protokoll verwendeten kann nach Maß mit einer harten Kunststoff-Box und ein Aquarium Thermostat auf die gewünschte Temperatur eingestellt werden. Stetiger gewünschte Temperatur erreichen Sie in ca. 30 min von der Raumtemperatur ab. Da die Pre-wärmenden und Inkubation Kammern am unteren Rand der Kunststoff-Box sitzen, sollte der Wasserstand gerade genug, um das Thermostat um die Kammern von schwimmenden halten zu decken sein.
    2. Montieren Sie die Holding und die Pre-Erwärmung Kammern (vgl. Abb. 1A), und Gießen Sie die Abhaltung ACFS hinein. Die aufnahmekammer bei Zimmertemperatur aufbewahren und vor Erwärmung Kammer in die warme Badewanne legen. Starten Sie sprudeln die Lösungen mit 95 % O25 % CO2 -Gas-Gemisch und entfernen Sie eventuell eingeschlossenen Luftblasen mit einer invertierten Pasteurpipette. Halten Sie bedeckt.
  2. Slicing Bank und vibratome
    1. Kleben Sie einen kleinen Agar Block in die Mitte von der Objektplatte mit Cyanacrylat-Klebstoff.
    2. Ein 250-mL-Becherglas in einem Eiskübel und Gießen Sie ACFS einschneiden.
    3. Nehmen Sie zwei Bechergläser 100 mL und Gießen Sie 50 mL der holding ACFS in jedem. Lassen Sie die Becher bei Raumtemperatur. Dies sind die Spülung Becher.
    4. Starten Sie sprudeln die Lösungen mit einer 95 % O25 % CO2 Gas-Gemisch.
    5. Montieren Sie das Puffer-Tablett auf der Vibratome und mit gestoßenem Eis umgeben. Gießen Sie etwas Ethanol auf crushed Ice zur Unterstützung bei der Aufrechterhaltung der kalter Temperaturen während der slicing Verfahrens. Fügen Sie nach Gießen Ethanol mehr Eis nach Bedarf hinzu.
      Hinweis: Eine Temperatur von 2 ° C ist optimal.
    6. Die Wäscher im Inneren des Siebes Puffer dann montieren aufgelegt und des Vibratome Klinge Blocks.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Messer bei Freiwinkel von ~ 10 ° montiert ist.
    7. Aufmachungen Sie zerstoßenem Eis in einen 500 mL-Becher zu 2/3 des Volumens und mit destilliertem Wasser füllen.
    8. Nehmen Sie die gefrorene Schüssel aus der Tiefkühltruhe, legen Sie es kopfüber auf der Schneid Bank und bedecken Sie es mit einem Papiertuch und Filterpapier Scheibe.
  3. Anästhesie-Bank
    1. Legen Sie eine kleine Schüssel in einem eisgefüllten Fach und Gießen Sie schneiden ACFS drin. Beginnen Sie mit einer 95 % O25 % CO2 Gas-Gemisch sprudelt.

(8) des Gehirns Slice Vorbereitung und Wartung

Hinweis: Dieses Protokoll nutzt der Erwachsenen (4 - 6 Wochen alt) männliche CD1 Mäuse, aber andere Sorten (z.B. c57/bl617,18) verwendet werden. Wir vergleichen auch später die experimentelle Ausgabe erhalten mit Maus Gehirnscheiben mit, die von Hirnschnitten von männlichen Sprague-Dawley Ratten im gleichen Alter erhalten. Die folgenden Schritte beziehen sich auf die Vorbereitung der teilweise getrennt Gehirnscheiben in denen CA3-driven schnell interiktale Tätigkeit ist zurückhaltend, richtige Hippocampus und kann nicht auf die Parahippocampal Rinde als propagieren in23beschrieben. Hippocampus-Kortex Trennung ist eine Voraussetzung für elektrische Modulation im Umgang mit der Hippocampus-EG Gehirn Slice Vorbereitung studieren. Die Vibratome verwendet, bezieht sich auf das Modell in der Materialtabelleaufgeführt. Andere Modelle erfordern ein anderes Verfahren.

  1. Das Nagetier mit Isofluran zu betäuben 5 % in einem Carbogen Gasgemisch an einer Anästhesie Induktion Kammer bei 2 L/min geliefert.
  2. In Tiefe Betäubung (keine Reflexe in Reaktion auf Fuß und Pfoten Kneifen), das Gehirn innerhalb von 1 min. nach Standardverfahren wie23zu extrahieren. Das Gehirn in die kleine Schüssel mit ausgewogenen eiskalte schneiden ACFS und lassen Sie für 90-120 s kalt stellen.
    Hinweis: Lassen Sie nicht das Gehirn für zu lange kalt stellen, sonst kann es einfrieren.
  3. Gießen Sie das eiskalte schneiden ACFS in der Pufferwanne. Verbreitete ACFS auf dem Filterpapier gelegt auf die gefrorene Schüssel schneiden. Legen Sie das Gehirn auf dem Filterpapier und isolieren Sie die erforderlichen Gehirn Gewebe Block durch Entfernen des Kleinhirns und den frontalen Pol gerade heraus schneiden.
  4. Mit Hilfe einer gebogenen Spachtel Kleben der dorsalen Seite des Gehirns auf die Objektplatte mit der geschnittenen frontal zugewandten der Agar-Block und dem okzipitalen Pol mit Blick auf die Vibratome Klinge. Verwenden Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat-Klebstoff. Legen Sie die Objektplatte in den Puffer Fach sofort und sichern.
  5. Passen Sie den Schneidevorgang an um die Vibratome Klinge ganz über das Gewebe bis zu den Agar-Block zu bewegen. Die Höheneinstellung Probe CD um die Klinge mit dem Gehirn Gewebe Block zu erreichen.
  6. Die Gewebeschnitte zu verwerfen, bis der Hippocampus deutlich sichtbar ist (in der Regel ~ 900 µm). Dann legen Sie eine Scheibendicke von 400 µm und schneiden um die Gewebeschnitte behalten. Für jeden Abschnitt des Gehirns die beiden Hemisphären aufgeteilt und schneiden Sie das überflüssige Gewebe um zwei Gehirnscheiben zu erhalten. Wie die Pufferwanne in nachfolgenden Abschnitten erhöht wird, füllen die Puffer-Tablett-Einreichung mit vereisten destilliertem Wasser (siehe Schritt 7.2.7).
  7. Verwenden Sie ein umgekehrtes Pasteurpipette vorsichtig übertragen Gehirnscheiben im ersten Becherglas spülen, Entleeren der Pasteurpipette und übertragen die Gehirnscheiben auf die zweite Spülung Becher. Dann übertragen Sie die Gehirnscheiben in die aufnahmekammer und lassen Sie sie mindestens 60 Minuten zu erholen.
    Hinweis: In der Regel ist es möglich, 6-8 Gehirnscheiben insgesamt zu erhalten. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

9. Vorbereitung der ACFS mit 4-AP (4AP-ACFS)

Hinweis: Hierzu muss 10 min Vorbereitung, plus 20 min Erwärmung. Vorsicht! 4-AP ist ein convulsant Medikament, und es ist giftig. Mit Handschuhen verarbeiten und verschütten zu vermeiden.

  1. Gießen Sie 200 mL destilliertes Wasser in einem 500 mL volumetrischen Kolben.
  2. Lager A 50 mL, 50 mL der Aktie B, 5 mL Lager M und 1 mM L-Ascorbinsäure hinzufügen. Schütteln Sie sanft, mit rotierenden Bewegungen, bis die L-Ascorbinsäure vollständig gelöst ist.
  3. Fügen Sie 500 µL 4AP Lager.
  4. Fügen Sie destilliertes Wasser zu erreichen das Endvolumen, versiegeln den volumetrischen Kolben mit Dichtung Film und sanft invertiere es 3-5 Mal, bis die Lösung gleichmäßig klar ist.
  5. Montieren der 4AP Inkubation Kammer (vgl. Abb. 1A) und ca. 80 mL 4AP ACFS Gießen. Die Kammer zu decken, überträgt es auf das warme Bad und beginnen mit einer 95 % O25 % CO2 -Gas-Gemisch sprudelt. Entfernen Sie eventuell eingeschlossenen Luftblasen mit einer invertierten Pasteurpipette. Halten Sie bedeckt.
  6. Warten Sie, bis die 4AP ACFS Temperatur 30-32 ° C (~ 20 min) ist.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden, wenn Gehirnscheiben noch wiederherstellen.

10. Vorwärmen und Inkubation von Scheiben in 4AP (Dauer: 90 min.)

  1. Überprüfen Sie die Pre-Erwärmung ACFS und die 4AP ACFS Temperatur 30-32 ° C.
  2. Verwenden Sie eine umgekehrte Glas Pasteurpipette 1 Gehirn-Scheibe in die Pre-Erwärmung Kammer übertragen und die Gewebe 25-30 min. ruhen lassen. Dann transfer der Gehirn-Scheibe in die 4AP ACFS Inkubation Kammer und 60 min. ruhen lassen.

11 Vorbereitung des Aufbaus MEA

Hinweis: Starten Sie 15 min vor der Aufnahme.

  1. Übertragen Sie das restliche Volumen des 4AP ACFS in einen 500-mL-Erlenmeyerkolben.
  2. Legen Sie den Erlenmeyerkolben auf einem Regal über dem MEA-Verstärker und Schläuche mit der Lösung kontinuierlich eine 60 mL-Spritze füttern können. Die Höheneinstellung der Erlenmeyerkolben und die Spritze eine Schwerkraft-gefütterten Rate von 1 mL/min ermöglichen.
    Hinweis: Die korrekte Höhe richtet sich nach der Schlauch-Innendurchmesser (ID). Für Schlauch ID 5/32 Zoll sind 30 cm ausreichend.
  3. Starten Sie sprudeln die 4AP ACFS in den Erlenmeyerkolben und in der Spritze mit einer 95 % O25 % CO2 Gas-Gemisch.
  4. Lassen Sie die 4AP ACFS Durchströmung der Perfusion Schlauch in ein Becherglas bis dort ist keine Luft im Inneren; dann stoppen Sie die Lösung.
  5. Verbinden Sie das Heizelement an der MEA-Basis an den Thermostaten. Platzieren Sie den trockenen MEA-Chip im Inneren des Verstärkers MEA und sichern Sie die Verstärker-Kopf. Verwenden Sie einen Kunststoff Pasteurpipette 4AP ACFS auf den Einlass und äußeren Reservoir der Aufnahme Kammer übertragen.
  6. Sichern Sie die Heizung Kanüle ein Magnethalter und legen Sie seine Spitze in der Ansaugöffnung Aufnahme Kammer; Befestigen Sie die Magnethalterung auf einem Magnetstreifen auf der MEA-Verstärker-Kopf; Schließen Sie die Perfusion Schläuche an die Kanüle; Verbinden Sie die Kanüle mit Thermostat.
    Hinweis: Die Heizung Kanüle sollte abgeschrägte Polytetrafluorethylen (PTFE) Schläuche, die Aufnahme Kammer Einlassstutzen erreichen und Lärm durch das metallische Material der Kanüle zu minimieren gelten. Wenn der Einlass-Stausee mit 4AP ACFS ausreichend gefüllt ist, sollte Tropfen fallen von der Perfusion System nicht sichtbar sein.
  7. Legen Sie die Saug Nadel in das Reservoir und prüfen Sie, ob Unterdruck durch Eintauchen der saugen-Nadel in der ACFS; Suchen Sie ein konstantes Niederfrequenz-Saug-Geräusch.
    Hinweis: Saug Nadel sollten gespeichert werden, damit die 4AP ACFS oberhalb der Gehirn-Scheibe-Oberfläche fließen kann. Eine Vakuumleitung oder leise Vakuumpumpe kann verwendet werden.
  8. Der Durchflussregler ermöglichen einen Durchfluss von 1 mL/min und Vorrichtung gesetzt.
    Hinweis: Schwerkraft-gefütterten Perfusion beseitigt das Geräusch, das von Schlauchpumpen verursacht werden könnte; Wenn Schlauchpumpen bevorzugt werden, sind geräuscharm Modelle obligatorisch.
  9. Sobald durch die Kanüle 4AP ACFS fließt, schalten Sie das Thermostat. Legen Sie die Heizung Kanüle auf 37 ° C und der MEA-Basis auf 32 ° C, eine Temperatur von 32-34 ° C in der Aufnahme-Kammer zu erreichen.
    Hinweis: Vorsicht! Nie kann Hitze die Kanüle ohne Lösung in es oder es irreversibel beschädigt werden. Stellen Sie die Temperatur der Kanüle höher als die Aufnahme-Temperatur (d. h., 32-34 ° C), um die innere Temperatur ausgeglichen , zwischen dem Sollwert und Istwert an der Spitze der Kanüle Heizung und innerhalb der Aufnahme Kammer zu berücksichtigen. Die Durchflussmenge, Umgebungstemperatur und Volumen der Aufnahme Kammer alle Einfluss der Temperatur der Recording-Lösung. Die Einstellungen in Schritt 11,9 berichtet sind optimiert für die beschriebene Protokoll und Ausrüstung. Immer überprüfen Sie die eigentliche Aufnahme Temperatur mit einem Thermoelement und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf. Erhitzen Sie die MEA-Basis über 34 ° C zur Vermeidung von Überhitzung der Gehirn-Scheibe nicht.
  10. Legen Sie die externe Referenz-Elektrode in die Aufnahme Kammer Einlass Reservoir.
    Hinweis: Obwohl MEA-Chips mit einer internen Referenzelektrode ausgestattet sind, wird dies durch die individuelle Aufnahme Kammer behandelt. So muss eine externe Referenz-Elektrode verwendet werden. Ein gesättigter KCl-Pellet ist am praktischsten, da es ohne Notwendigkeit für Chlorierung einsatzbereit ist.

12. MEA Leben Mapping

  1. Einmal werden die 4AP ACFS und die Aufzeichnung Temperatur als gewünscht, Turn die Durchblutung und das Saugen Hähne in der aus-Stellung, sie vorübergehend zu stoppen stabilisiert.
    1. Schnelle Übertragung von einer Gehirn-Scheibe auf der MEA Aufnahme Kammer mit einer umgekehrten Glas Pasteurpipette. Stellen Sie seine Position auf den MEA-Aufnahmebereich wie benötigte eine feuerpolierte gewellt Pasteurpipette (Abbildung 1) oder eine weiche kompakte kleine Bürste. Den Niederhalter Anker (Abbildung 1) auf die Gehirn-Scheibe zu platzieren. Starten Sie die Durchblutung und die Saugkraft durch ihre Hähne wieder in die Position drehen.
      Hinweis: kritische! Die Scheibe übertragen werden sollen, und die Perfusion neu gestartet, innerhalb von 60 s oder das Gewebe könnte sterben. Der Slice Niederhalter Anker sollte in 4AP ACFS zu verhindern, dass die Gehirn-Scheibe bewegt während des Einsetzens des Ankers auf die Gehirn-Scheibe aufgrund von Unterschieden in oberflächliche Spannung gehalten werden. Der Anker, die Gehirn-Scheibe auf der MEA sichern kann nach Maß mit einem Edelstahl Draht und Nylon Faden (Abbildung 1) sein oder aus kommerziellen Quellen gewonnen. Abbildung 1E zeigt der endgültigen Versuchsaufbau mit dem MEA-Chip an den Verstärker Kopf angeschlossen: eine Gehirn-Scheibe ruht auf der MEA-Chip innerhalb der Aufnahme Kammer gedrückt wird durch die benutzerdefinierte Anker. Die Referenzelektrode (roter Kreis) und die PTFE Schläuche deckt die Heizung Kanüle (roter Pfeil) in das Einlass-Reservoir befinden sich hingegen die Saug Nadel (blauer Pfeil) in die Steckdose Reservoir angebracht.
  2. Nehmen Sie ein Bild des Gehirns Slice mit einer Kamera auf einem inversen Mikroskop-Stadium.
  3. Führen Sie das Skript MapMEA auf der Computer-Software, startet die GUI um die Elektroden zuzuordnen.
    Hinweis: Die maßgeschneiderte Software ermöglicht den Benutzer die Elektroden, die an bestimmte Strukturen des Gehirns Slice entsprechen. Dieser Schritt ist entscheidend für den richtigen Weg zu aktivieren und die iktale Aktivität mithilfe elektrischen Stimulation zu unterdrücken.

Figure 2
Abb. 2: GUI für Leben MEA Elektrode Zuordnung. (A) schematische Darstellung der kombinierten Hippocampus-EG Slice auf der MEA positioniert. Die Standardstrukturen verwendet für dieses Protokoll sind Cornu Ammonis 3 (CA3), Enthorinal Kortex (EC), Perirhinal Rinde (PC) und Subiculum (SUB). Die Bezugselektrode ist als Dreieck Marker schematisiert. Elektroden umgeben in gepunkteten Linien repräsentieren die XY-Koordinaten für Bild begradigen. (B) Bildschirmaufnahme der GUI während des live MEA-Mappings. Das Flussdiagramm auf der linken Seite der Aufnahme zeigt das Schritt für Schritt Verfahren zu folgen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Durchsuchen , um das Bild des Gehirns Slice zu laden. Stellen Sie sicher, dass die Bezugselektrode in der oberen Reihe von halb-links der MEA (Abbildung 2A, Dreieck markieren erscheint). Klicken Sie auf Aktivieren Sie Zeiger , dann wählen Sie die oberen und unteren Elektroden in der linken Zeile des Arrays auf die XY-Koordinaten zum Bild richten und Elektrode Zuordnung markieren.
  2. Der Slice-Typ Drop-Down-Menü wählen Sie Horizontal. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen " Standard-Strukturen ".
    Hinweis: Es ist möglich, die Strukturen anpassen, indem Sie die Schaltfläche Geben Sie neue Strukturen . Die Standardstrukturen für die horizontale Gehirn-Scheibe sind in Abbildung 2Adargestellt.
  3. Wählen Sie die Elektroden entsprechend den ROI mit nummerierten Tasten unter dem Gehirn-Scheibe-Bild, und klicken Sie auf die entsprechende Taste im Bedienfeld "Strukturen" zugewiesen (Abb. 2 b); Wiederholen Sie diesen Schritt für jede ROI.
  4. Drücken Sie die Schaltfläche " Speichern ": die Software generiert einen Ergebnis-Ordner mit dem Namen #EXP_LabelledElectrodes , enthält eine Tabelle, die Berichterstattung der ausgewählten Elektroden und ROIs.

13. Aufzeichnung und elektrische Modulation der Epileptiformen Aktivität

  1. Lassen Sie das Gehirn Segment innerhalb der Aufnahme Kammer für 5 bis 10 min vor der Aufnahme zu stabilisieren.
  2. Schalten Sie Anregung Einheit mindestens 10 min vor der Stimulation Protokoll Selbstkalibrierung und Stabilisierung ermöglichen. Starten Sie die Impuls-Steuerungs-Software und überprüfen Sie, ob Stimulator und MEA Verstärker richtig angeschlossen sind, wie durch eine grüne LED im Hauptbereich der Steuerungssoftware Reiz. Entnehmen Sie bitte den Handbüchern spezifischer Instrumente und Software für weitere Details Siehe Materialtabelle.
  3. Die Stimulation in bipolar-Konfiguration einrichten. Wählen Sie Elektrodenpaare in Kontakt mit dem pyramidenförmigen Zellschicht der CA1/proximalen Subiculum (vgl.24,25), unter denen das Skript MapMEA (vgl. Ziff. 12) zugeordnet. Verwenden Sie einen Draht Verbindung eine der ausgewählten Elektroden zu den negativen Stecker von den Stimulator und der anderen Elektrode mit dem positiven Stecker im gleichen Kanal Stimulator. Verwenden Sie einen anderen Draht auf den Boden der Stimulator auf den Boden des Verstärkers anschließen.
  4. Starten Sie die Aufnahmesoftware. Um Daten zu erhalten, drücken Sie den PLAY -Button im Hauptbereich der Recording-Software. Datensatz mindestens 4 iktalen entlädt.
    Hinweis: Eine Sampling-Frequenz von 2 kHz ermöglicht Feld Potentiale mit faire Lösung bei gleichzeitiger Minimierung der Festplatte Speicherplatz zu erwerben. Eine 5-min Aufnahme-Datei dauert ~ 80 MB. Höhere Sampling-Frequenzen ist möglicherweise erforderlich, z. B.Rekord Reiz Artefakte oder Multi-Unit-Aktivität. Um Feld Potenziale nur zu beobachten, verwenden Sie einen live-Tiefpass-Filter bei 300 Hz mehrgliedrige Aktivität abzuschneiden.
  5. Die Reizintensität zu bestimmen.
    1. Verwenden Sie in der Impuls-Steuersoftware den Hauptbereich "" um eine quadratische biphasische positiv-negativ aktuelle Impulsdauer von 100 µs/Phase zu entwerfen.
      Hinweis: Vorsicht! Gleichstrom Stimulation erfordert eine ausgewogene ladeimpuls zur Beschädigung des Gerätes zu vermeiden.
    2. Führen Sie einen schnell ein-/Ausgabe (e/a) Test, um die besten Reizintensität zu identifizieren. Liefern die Stimulation Puls bei Schritt 13.5.1 auf 0,2 Hz oder niedriger entwickelt, durch das Hinzufügen einer Inter Impulsabstand von 5 s oder länger in die geeignete Form der Steuerungssoftware Reiz. Geben Sie in der Registerkarte " Pulse Amplitude " eine anfänglichen Impuls-Amplitude von 100 µA/Phase und erhöhen von 50-100 µA Schritten bei jeder Verhandlung bis Stimulation zuverlässig interiktale-ähnliche Ereignisse in der Parahippocampal Rinde hervorrufen kann (überprüfen Sie die Signale visualisiert, indem die Recording-Software).
  6. Elektrische Modulation des limbischen ictogenesis
  7. Programmieren Sie Reiz, das Protokoll der Stimulation von Interesse zu liefern. Verwenden Sie die Impuls-Amplitude während des I/O-Tests identifiziert.
    Hinweis: Die Ausfallrate der evozierten Antworten ≤20 % betragen.
  8. Überprüfen Sie nach Stimulation anhält, Netzwerk Erholung vor Reiz Zustand durch Aufzeichnung mindestens 4 iktale Entladungen (wie in Schritt 13,4).

Representative Results

Planare MEAs mit 6 x 10 Layout und 500 µm Elektrode Abstand sind das ideale Aufnahmegerät für das experimentelle Protokoll beschrieben hier, da ihr Aufnahmebereich in der Gehirn-Scheibe in seiner Gesamtheit umfasst (Abbildung 3A, siehe auch17). Obwohl perforierte MEAs (pMEAs) zur Verbesserung der Sauerstoffversorgung der Gewebe vorzuziehen wäre, ihre Aufnahmebereich ist zu klein (~ 2 mm Durchmesser). Dies erlaubt nicht die gleichzeitige Visualisierung von elektrischen Signalen erzeugt durch den Hippocampus und Parahippocampal Rinde (Daten nicht gezeigt; siehe18).

Die beobachteten 4AP-induzierte epileptiformen Muster (Abbildung 3A) reproduziert originalgetreu Was ist in der Regel in dieser in-vitro- Modell mit konventionellen Bereich mögliche Aufnahme beobachtet und umfasst drei Typen von Aktivität7, 26: (ich) iktalen-ähnliche Ereignisse (Abb. 3 b, Pfeilspitzen) sind robust langlebig (> 20 s, Reichweite: 20-60 s) Ereignisse, die ähnlich wie die elektrographischen Merkmale der Anfallsaktivität mit tonischen und klonischen Komponenten (Abbildung 3); Sie sind innerhalb der Parahippocampal Rinde alle 3-5 min erzeugt und geben Sie die hippocampale Bildung durch den dentate Gyrus (Abbildung 3D, Pfeil); (Ii) langsamere interiktale-ähnlichen Einleitungen (Abb. 3 b, EG Spur, schwarzer Balken; erweiterte in Abbildung 3E) sind kurz (< 1 s) Bevölkerung Ereignisse generiert zwischen iktalen Ereignissen ubiquitär in der Hippocampus-EG Gehirn Slice Vorbereitung und treten in einem langsamen Tempo (Bereich 10-30 s); (Iii) schnellekorreliert wie Einleitungen (Abbildung 3 b, CA3 verfolgen, schwarzen Balken; erweitert in Abbildung 3E) sind wiederkehrende kurze (< 1 s) Bevölkerung Ereignisse generiert durch das hippocampal CA3-Unterfeld; Wenn die Schaffer Sicherheiten erhalten bleiben, schnell CA3-driven interiktale Veranstaltungen entlang der hippocampalen Schleife zu propagieren und üben eine Anti-Ictogenic Wirkung24 (Daten nicht gezeigt); um zu verhindern, dass die iktale Aktivität ist heruntergekommen, im Sinne der beschriebenen Protokolls CA3 Ausgabe (vgl. Abb. 3 b, E) gestört. Es muss darauf hingewiesen werden, dass in einem langsameren Tempo schnell CA3-driven interiktale Aktivitäten aufgezeichnet, mit MEAs auftritt (~ 0,4 Hz) als was beobachtet wird mit konventionellen Bereich Potenzial Aufnahme mit glaspipetten (~ 1 Hz, Reichweite: 0,5 - 2,0 Hz, Daten nicht gezeigt).

Der erfolgreiche Ausgang der elektrische Neuromodulation im Nagetier Gehirnscheiben richtet sich nach der Aktivierung von bestimmten neuronalen Bahnen27 zusammen mit der intrinsischen Konnektivität zwischen den Regionen in der Vorbereitung24enthalten. Wir haben getestet, Scheiben aus erwachsenen männlichen Sprague-Dawley Ratten gewonnen und CD1 Mäuse und wir fanden, dass Maus anstatt Ratte Gehirnscheiben das optimale Verhältnis zwischen Größe, Dicke und intrinsische Konnektivität bieten. Zunächst Dank ihrer kleinen Größe passen sie besser den kleinen Aufnahmebereich von im Handel erhältlichen MEAs (Abbildung 4A, Links: Ratte, rechts: Maus); Zweitens sind sie weniger anfällig für die nachteiligen Bedingung, die untrennbar mit MEA Aufnahme (vgl. Einleitung) ist: Obwohl iktalen wie Einleitungen durch diese zwei Gewebe (Abbildung 4 b) erzeugt sind von ähnlicher Dauer ()Abb. 4 Links), die Rate des Auftretens ist wesentlich kürzer in Maus Gehirnscheiben (n = 10 Scheiben Arten; 2-tailed ungepaarten t-Test, p < 0,001; Abbildung 4 rechts). Letzteres ermöglicht die Beschleunigung der experimentelle Protokolle, die es ermöglichen, eine größere Anzahl von Gehirnscheiben während eines einzigen Tages experimentell zu testen: für diesen Satz von repräsentative Ergebnisse konnten wir eine ähnliche Anzahl von Hirnschnitten von den zwei Arten testen (Ratte: n = 58; Maus: n = 52), aber die Anzahl der Mäuse (n = 18) war 2-fach kleiner als die Anzahl der Ratten (n = 42).

Darüber hinaus Maus Gehirnscheiben erscheinen, mit Dichter Verbindungen zu präsentieren und sind daher eher reagieren besser auf nachhaltige elektrische Neuromodulation (Abbildung 4). So ist in diesem in-vitro- Modell der Ictogenesis, die Lebensfähigkeit für elektrische Stimulation zur Steuerung iktale Aktivität deutlich mehr für die Maus als für die Ratte Hirngewebe. Dieser Aspekt spiegelt sich auch durch die deutlich höhere Erfolgsquote bei der Stimulation Experimente mit Maus versus Ratte Gehirnscheiben, selbst wenn mehrere nachhaltige Stimulation Protokolle ()Abbildung 4Everfolgt). In der Tat scheint Maus Hirngewebe, nachhaltige elektrischen Stimulation wie vorgeschlagen, durch die höhere Überlebensrate innerhalb der getesteten experimentelle Zeitrahmen von 4 h (Abb. 4F) besser zu widerstehen. So macht die kleinere Größe zusammen mit den besseren Schutz der intrinsischen Konnektivität Maus Gehirnscheiben der beste Kandidat MEA Aufnahme zur Untersuchung hippocampal Parahippocampal Netzwerk Wechselwirkungen durchzuführen und zu bewerten elektrische Neuromodulation Protokolle, die für TLE relevant sind.

Periodische Tempo in die CA1/Subiculum geliefert ist bekannt, limbische Ictogenesis in der 4AP behandelt Hippocampus-EG Slice Vorbereitung24,25,27, mit 1 Hz als die wirksamste Frequenz27zu kontrollieren. So ist es auch sinnvoll als Positivkontrolle, die Effektivität und Effizienz anderer Neuromodulation Politiken zu bewerten (siehe z. B.25). Wie bereits erwähnt, können elektrische Impulse geliefert direkt durch die MEA (d.h., ohne die Notwendigkeit einer externen anregende Elektrode) Bevölkerung Antworten im Nagetier Gehirngewebe hervorrufen (siehe auch28). Ausreichende Konservierung der neuronalen Netzwerkkonnektivität innerhalb der Gehirn-Scheibe, genaue Positionierung des Gehirns Slice auf der MEA und die passende Wahl des anregenden Elektrodenpaare Verfolgung ermöglichen elektrische Neuromodulation experimentiert, die Steuern Sie effektiv Ictogenesis. Wie in Abbildung 5Agezeigt, es ist möglich, reproduzieren die kanonische 1Hz periodische Tempo Protokoll mit planaren MEAs als Aufzeichnung und als anregende Gerät, mit dem zusätzlichen Vorteil, die die Wirkung der elektrischen Stimulation im gesamten visualisiert werden kann die Gehirn Gewebe mit einer höheren Anzahl von gleichmäßig verteilte Aussichtspunkten im Vergleich zu den konventionellen Bereich mögliche Aufnahme Abschnitt. Abbildung 5 b zeigt die Quantifizierung der Ergebnisse für n = 9 Gehirnscheiben zeigt eine signifikante Reduktion der gesamten Beschlagnahme Zeit (iktalen Gesamtaktivität Dauer/Beobachtung Zeit25) während der Stimulation (eine Art und Weise-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0,01, Fisher LSD post Hoc Test geschützt). Die Ergebnisse stehen im Einklang mit der Literatur für externe stimulierenden Elektroden24,25.

Berechnet die Summe, die Beschlagnahme der Beobachtung Zeit hängt das Intervall zwischen iktalen Ereignisse, und sie bestimmt auch die Mindestdauer des Protokolls Stimulation erforderlich, um selbstbewusst die Bewertung der Auswirkungen der Neuromodulation. Wir finden, dass die Aufnahme mindestens 4 iktalen Einleitungen (und daher mindestens 3 Intervalle zwischen iktalen Ereignisse) ist ein guter Kompromiss zwischen gesammelten Proben und gewünschte Abholzeit. In der Kontrollbedingung (d.h. keine Stimulation) ist die Beobachtungszeit die Verzögerung zwischen dem Beginn des ersten gemessenen iktalen Ereignisses und die Beendigung des letzten. Während der Neuromodulation entspricht die Beobachtungszeit die Stimulus-Protokoll Dauer, da das Ziel der Messung zur Quantifizierung der Phänomene, die im Laufe der Zeit, die die Störung im System eingeführt wird. Computing und vergleicht die Summe Beschlagnahme Zeit anstatt die Dauer und Intervall der iktalen Ereignisse ist der am besten geeigneten Parameter Typ II-Fehler zu vermeiden. In der Tat zusammen mit vollständigen Unterdrückung der iktale Aktivität ist es auch möglich, dass nur ein iktalen Ereignis, während der elektrische Stimulation im Gegensatz zu mehreren Veranstaltungen generiert wird in der Kontrollgruppe beobachtet. In diesem Fall während Messen das Intervall zwischen den Ereignissen nicht möglich ist, stellt iktalen Dauer als ein Schätzer der Stimulation Wirksamkeit messen nicht das eigentliche Ergebnis der Neuromodulation (d.h., iktale Aktivität Reduktion) dar.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zufolge insgesamt Maus Gehirnscheiben mit MEAs gekoppelt sind wertvolle Werkzeuge für die Epilepsie-Forschung und zuverlässige Neuromodulation Studien durchführen, die für das Feld der DBS für Epilepsie-Behandlung voraus sind. Darüber hinaus das hier beschriebene Protokoll verbessert Gehirn Slice Lebensfähigkeit und ermöglicht die Verfolgung experimentelle Sessions für mehrere Stunden (Abbildung 6), die, zum Beispiel erforderlich sind, um die Auswirkungen der verschiedenen elektrischen Stimulation zu vergleichen Paradigmen.

Figure 3
Abbildung 3 : Typische 4AP-induzierte epileptiformen Muster visualisiert mit planaren MEAs (A) Maus brain Slice positioniert auf einer planaren 6 x 10-MEA (Elektroden-Abstand: 500 µm) und Side-by-Side-Übersicht des Musters 4AP-induzierte epileptiformen visualisiert mit MEA-Aufnahme. Jedes Quadrat im Raster bietet Platz für Aktivitäten an der entsprechenden Stelle im Gehirn-Scheibe aufgezeichnet. Gestrichelten blaue Linien beziehen sich auf die Elektrode Zeilen für mehr Klarheit. Die Aufnahme-Elektrode-Anzahl wird in blau an der oberen linken Ecke jedes Quadrats identifiziert. Das graue Quadrat gekreuzt repräsentiert die Referenzelektrode. (B) repräsentative Spur Segmente der EG und CA3 Muster auf eine schnellere Zeitskala visualisiert. Pfeilspitzen zeigen iktale Veranstaltungen. In der EG-Ablaufverfolgung ist es möglich, das Auftreten von langsam zu schätzen interiktale Entladungen (schwarz bar), während das CA3 Unterfeld die typische nachhaltige Fastinterictal Muster (schwarze Balken) erzeugt. (C) erweiterte Aufnahme einer iktalen Entladung zeigt das typische Tonikum-klonischen Muster. (D) schnell-Skala Visualisierung von den pre-ictal-zu-iktalen Übergang entspricht der EG (rot) und CA3 (schwarz) Spur Segmente gekennzeichnet durch den roten Balken (b). Der Pfeil zeigt den Beginn der iktalen Entlastung. Die übereinanderliegenden Spuren betonen, dass die iktale Veranstaltung hat seinen in der EG Ursprung und breitet sich anschließend um das CA3 Unterfeld. (E) die erweiterte Ansicht der interiktale Perioden gekennzeichnet durch schwarzen Balken (b) betont die fehlende Korrelation zwischen den langsamen und Fastinterictal Muster erzeugt durch die EG (rot) und CA3 (schwarz), beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Maus Gehirnscheiben bieten eine experimentelle Mehrleistung als Ratte Gehirnscheiben. (A) Gehirn slice aus einer Ratte (links) und einer Maus (rechts) abgestimmte Alters. Die Ratte-Gehirn-Scheibe ist viel größer als die MEA Aufnahmebereich und seine elektrische Aktivität kann nicht in vollem Umfang sichtbar gemacht werden. (B) direkten visuellen Vergleich der wiederkehrenden iktale Aktivität von Maus und Ratte Enthorinal Cortex (EG) generiert. (C) Maus und Ratte Gehirnscheiben erzeugen iktale Einleitungen von ähnlichen Dauer, aber das Intervall zwischen diesen Ereignissen ist fast 2-fold in Ratte Hirngewebe. * p < 0,05. (D) im Vergleich zu Ratten, Mäuse bieten eine 2-fold höhere Ausbeute an Hirnschnitten für elektrische Stimulation Experimente darauf abzielen, Ictogenesis zu kontrollieren. Die elektrische Stimulation von der Subiculum könnte Bevölkerung Antworten in die Parahippocampal Rinde in nur 20 von 58 (34 %) Ratte Gehirn Scheiben, im Gegensatz zu 33 52 (63 %) Maus Gehirnscheiben hervorrufen (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0,05. (E) unter tragfähige Scheiben ist die Erfolgsquote bei der Kontrolle der iktale Aktivität 2-fold mit Maus versus Gehirnscheiben Ratte (Maus: 20 von 33 Gehirnscheiben, 60 %: Ratte: 6 von 20 Gehirnscheiben, 30 %; Chi2: 4,67; p = 0,03). p < 0,05. (F) Maus Gehirnscheiben standhalten können wiederholt längere Epochen der nachhaltige elektrische Stimulation (grau schattierten Bereiche). Nach Anregung Zurücknahme, Maus Hirngewebe zeigt vollständige Genesung des Musters epileptiformen während Ratte Gehirn Gewebe Lebensfähigkeit dramatisch um 3 Uhr fällt Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Repräsentative Experiment der elektrische Modulation des Ictogenesis mit Gehirnscheiben gekoppelt mit MEAs (A) Aufnahmen von 4AP-induzierte iktale Aktivität in der EG und der PC während der Kontrollbedingung (keine Stimulation), regelmäßige Stimulation (PP) mit 1 Hz (Stimulus Artefakt wird abgeschnitten), und während der Wiederherstellung auf Reiz-Entzug. (B) Quantifizierung der Wirkung von PP bei 1 Hz auf der Summe der Beschlagnahme Zeit. p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Repräsentative Langzeitaufzeichnung 4AP-induzierte iktale Aktivität. (A) Trace Segmente aufgezeichneten 8 h nach das Gehirn schneiden Verfahren und folgende 2 h 4AP Anwendung. (B) Expanded zeichnen Segmente entsprechend der Box iktalen Einleitungen durch die Buchstaben ein, bund c im Bedienfeld "identifiziert (A) zeigen die Konsistenz der generierten iktale Aktivität während der längeren Beobachtung Zeit-Witwe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Lager A Chemische Molekulargewicht Konzentration (mM)
NaCl 58.44 1150
Lösungsmittel: destilliertes Wasser KCl 74.55 20
Konzentrat: 10 x  KH2PO4 136,1 12.5
Lagertemperatur: 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147.02 20
Maximale Speicherdauer: 1 wk D-Glucose 180,2 250
Hinweis: mit einem 50 mm-Membran-Filter Filtern
Lager B Chemische Molekulargewicht Konzentration (mM)
Nahco33 84.01 260
Lösungsmittel: destilliertes Wasser
Konzentrat: 10 x 
Lagertemperatur: 4 ° C
Maximale Speicherdauer: 1 wk
Hinweis: mit einem 50 mm-Membran-Filter Filtern
Lager C Chemische Molekulargewicht Konzentration (mM)
KCl 74.55 20
Lösungsmittel: destilliertes Wasser KH2PO4 136,1 12.5
Konzentrat: 10 x MgCl2* 6 H2O 203.3 50
Lagertemperatur: 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246.47 20
Maximale Speicherdauer: 2 Wochen CaCl2* 2 H2O 147.02 5
Hinweis: mit einem 50 mm-Membran-Filter Filtern
Aktie M Chemische Molekulargewicht Konzentration (mM)
MgSO4* 6 H2O 246.47 100
Lösungsmittel: destilliertes Wasser
Konzentrat: 100 x
Lagertemperatur: 4 ° C
Maximale Speicherdauer: 4 Wochen
4AP Lager Chemische Molekulargewicht Konzentration (mM)
4-aminopyridine 94,11 250
Lösungsmittel: destilliertes Wasser
Konzentrat: 1000 x
Lagertemperatur: 4 ° C
Maximale Speicherdauer: 2 Wochen
Hinweis: Wirbel für 2-3 min oder gereizt für 30-60 min
Hinweis: Vorsicht! 4-AP ist giftig und Cinvulsant. Benutzen Sie Handschuhe und Verbreitung oder verschütten zu vermeiden.

Tabelle 1: Lager-Lösungen.

HALTEN ACFS AUFNAHME ACFS SCHNEIDEN ACFS
Chemische C [mM] Chemische C [mM] Chemische C [mM]
NaCl 115 NaCl 115 Saccharose 208
KCl 2 KCl 2 KCl 2
KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25
MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5
CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2
D-glucose 25 D-glucose 25 CaCl2 0,5
Nahco33 26 Nahco33 26 D-glucose 10
L-Ascorbinsäure 1 L-Ascorbinsäure 1 Nahco33 26
L-Ascorbinsäure 1
pH 7.4 pH 7.4 Brenztraubensäure Säure 3
Osmolalität 300 mOsm/Kg Osmolalität 300 mOsm/Kg
pH 7.4
Osmolalität 300 mOsm/Kg

Tabelle 2: Lösungen Zusammensetzung.

Fehlerbehebung
PROBLEM GEGENMAßNAHMEN
Iktale Entladungen aussehen "chunked" Die Perfusion Rate zu verringern und/oder leiser ACFS oberhalb des Gehirns Schnitts durch die Absaugung Nadelposition einstellen.
Keine iktale Aktivität (1) überprüfen, die CA3-driven schnell interiktale Ereignisse nicht zum Kortex weitergegeben. Verwenden Sie einen kleinen Skalpellklinge (z. B. n.10) oder eine Nadel, die Schaffer Sicherheiten zu trennen, wenn brauchen werden, aber achten Sie darauf, schneiden Sie die Nylonfäden von der Scheibe Niederhalter Anker. Eine Stereoanlage oder aufrechte Mikroskop eignen sich am besten, während der inversen Mikroskop diese Aufgabe sehr schwierig macht.
(2) prüfen Sie die Slice-Lebensfähigkeit: starke elektrischer Stimulation iktale Aktivität auslösen kann? Warten Sie, bis etwa 2 h 4AP Anwendung, dann ändern Sie Gehirn Slice zu, wenn iktale Aktivität nicht auftritt.
Die Gehirn-Scheibe bewegt sich beim Platzieren des Niederhalter Ankers (1) vorsichtig den Slice-Anker zu entfernen und das Gehirn-Segment zu positionieren.
(2) prüfen Sie, dass der Slice-Anker der 4AP ACFS gleichmäßig feucht ist.
(3) Entfernen der 4AP ACFS aus der Aufnahme Kammer zugunsten Gehirn Slice Adhäsion an den MEA.
(4) Positionieren des Slice-Niederhalter-Ankers.
Die Gehirn-Scheibe schwimmt auf der MEA-Chip nach der zu übertragenden Aspirieren Sie (1) vorsichtig überschüssige ACFS mit einer Pasteurpipette.
(2) die MEA Chip müssen möglicherweise neu beschichtet werden.
Elektrischer Stimulation nicht Netzwerk Reaktionen hervorrufen. Erhöhen Sie reizstärke zu, ändern Sie Elektrodenpaare.
Elektrischer Stimulation kann Bevölkerung Reaktionen in den proximalen aber nicht distalen kortikalen Bereichen hervorrufen. Das Problem ist Ikely durch schlechte Konnektivität oder zu niedrig reizstärke. Elektrischer Stimulation kann in Teilbereichen kortikalen wirksam oder unwirksam sein. Es wird empfohlen, Gehirn-Scheibe zu ändern.
Signal ist laut (1) überprüfen Sie die Referenzelektrode: Laut Basislinie kann zeitweise durch die unvollständige Füllung des Reservoirs Einlass verursacht werden, so dass die Referenzelektroden tut nicht ganz tief in der ACFS.
Überprüfen Sie (2) allgemeine Erdung der Geräte.
(3) Einstellen der Saug Nadelposition um eine Konstante, weiche Saug Sound zu hören. Boden saugen Nadel.
Reinigen Sie (4) die Außenkontakten MEA mit Ethanol mit einem Wattestäbchen.
(5) die MEA Chip beschädigt werden: MEA Chip zu ändern und überprüfen Sie Artefakte und das Signal-Rausch-Verhältnis.

Tabelle 3: Problembehandlung.

Discussion

MEAs sind ein unverzichtbares Werkzeug für Neurophysiologie Untersuchungen und Reife erreicht haben, in den letzten Jahren dank jahrzehntelanger Forschung und Entwicklung. Im Vergleich zu konventionellen Bereich mögliche Aufnahme bieten MEAs den großen Vorteil eine höhere Anzahl von Beobachtungspunkten und bekannten Inter Elektrodenabstand für neuronale Netzwerk Interaktionen genau zu lokalisieren.

Die MEA-Aufnahmetechnik kann auch andere Elektrophysiologie Ansätze, wie z.B. Patch-Clamp Aufnahme15, zu untersuchen, die Beziehung zwischen einzelnen Nervenzelle und neuronalen Netzwerk-Aktivität gekoppelt werden. Darüber hinaus bieten die Möglichkeit der Visualisierung Feld Potenziale und mehrgliedrige Aktivität gleichzeitig wertvolle Einblicke in den Zusammenhang zwischen der Aktivität der kleinen neuronaler Ensembles und kollektive neuronale Netze. Die Kombination mit Spannung-empfindlichen Farbstoffen, Kalzium-Bildgebung und optogenetik29 ermöglicht Neurophysiologie Phänomene mit polyedrischen Ansätzen ableiten. Neben der pharmakologischen Studien, die Möglichkeit der Durchführung, Aufzeichnung und Stimulation mit dem gleichen System macht die MEA-Aufnahmetechnik sehr leistungsstark und vielseitig: zum Beispiel ist es möglich, die Synaptische Plastizität Phänomene zu studieren die Kern des Speicher Bildung30, über das hier vorgestellte Neuromodulation-Protokolle, DBS, Epilepsie und eine Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns zu behandeln sind. Der jüngste Beweis dafür, dass die MEA-Aufnahmetechnik auf epileptischen Gehirn Gewebe16 erfolgreich angewendet werden kann zeigt seine unschätzbare Nützlichkeit in der Epilepsie-Forschung, beide, die grundlegenden Mechanismen dieser verheerenden Krankheit zu verstehen und zur Feinabstimmung der DBS-Algorithmen, um es zu verbessern.

MEAs zwingt jedoch die Ausübung der Elektrophysiologie Experimente unter "begrenzen" Bedingungen für Gehirnscheiben durch das Erfordernis einer versunkenen Aufnahme Kammer und die Notwendigkeit der lassen des Gehirns Rest in Scheiben schneiden, auf dem festen Untergrund wo die Mikro-Elektroden integriert sind. So erhalten Hirngewebe nicht ausreichende Sauerstoffversorgung, die wiederum die Qualität der Aufnahmen beeinträchtigen können.

Die hier beschriebenen Protokoll ermöglicht zuverlässig erfassen und studieren Ictogenesis in Nagetier limbischer Netze gekoppelt mit MEAs mit dem akuten 4AP in-vitro-Modell und längere Epochen der elektrischen Stimulation zu verfolgen, die relevanten für die Bewertung Informationen der DBS-Politik.

Frühere Studien über elektrische Neuromodulation epileptischen limbischer Netze basiert auf der Verwendung von konventionellen Bereich mögliche Aufnahme habe entweder mit Maus oder Ratte Gehirnscheiben mit ähnlichen Ergebnissen24,25; aber die Verwendung des Gehirngewebes Ratte erwies sich als schwieriger, einigermaßen aufgrund der schwächeren Konnektivität im Vergleich zu Hirngewebe von Mäusen7erhalten. Im Hinblick auf die MEA-Technik eignen sich Maus Gehirnscheiben aufgrund ihrer geringeren Größe. Darüber hinaus ist die höhere Rate des Auftretens von iktalen wie Einleitungen in Maus versus Ratte Hirngewebe gegeben, es möglich, deutlich mehr Gehirnscheiben ganztägig eine experimentelle, die wiederum die Datensammlung schneller und effizienter macht, zu testen und können reduzieren Sie die Anzahl der verwendeten Tiere.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:

Iktale Entladungen erfasst mithilfe der benutzerdefinierten Kammer beschrieben hier scheinen ähnlich in Dauer und Rate des Auftretens, die mit der herkömmlichen MEA Ring Kammer und dem gleichen MEA-Typ (planare Mikro-Elektroden, vgl. 17) beobachtet. Es muss jedoch betont werden, dass Gehirn Scheibendicke deutlich reduziert werden, muss bei Verwendung der herkömmlichen Runde Aufnahme zusammen mit einer geringer Perfusion-Rate (1 mL/min), die die erfolgreiche Ausübung der Neuromodulation behindern kann durch Experimente schlechte Konnektivität.

In diesem Protokoll bietet eine Kleinserie benutzerdefinierte Aufnahme Kammer inspiriert vom Patch-Clamp Aufnahme Kammer Design stabile und zuverlässige Laminar-Flow, die entscheidend für die erfolgreiche Ausübung der MEA-Aufnahmen; Es erlaubt auch das Gehirn Schnittstärke bis 400 µm zu erhöhen, um einen fairen Kompromiss zwischen Gewebe Lebensfähigkeit und intrinsische Konnektivität zu erreichen. Es ist in der Tat erkannt, dass Laminar-Flow der Aufnahme-Lösung innerhalb der Kammer ist sehr wünschenswert für Gehirn Slice Elektrophysiologie, da es nicht durch Temperatur, Sauerstoff beeinflusst ist und pH-Gradienten, die im Rundschreiben-Flow zu beobachten sind Aufnahme Runde Kammern19,20,31 (wie die, die mit im Handel erhältlichen MEA zur Verfügung gestellt). Solche Steigungen führen experimentelle Voreingenommenheit und sind auch schädlich für das Gehirn-Scheibe. Aufnahme und Handelskammern ein relativ kleines Volumen (~1.5 mL) zusammen mit einer hohen Durchblutung Rate (5-6 mL/min)16,31 ermöglichen ausreichende Austausch des Mediums Perfusion (≥3 Mal / min). Die benutzerdefinierte Kammer lässt sich leicht aus kommerziellen Quellen zu einem erschwinglichen Preis gewonnen oder hergestellt im eigenen Haus 3D-Drucktechnologie. Andere Studien haben MEA Aufnahmen von 400 µm dicken menschliche Gehirn Scheiben16 mit der konventionellen MEA Ring Kammer, unter Beibehaltung der ACFS Volumen bis 1 mL und Durchsetzung einer hohen Durchblutung Rate (5-6 mL/min) mit Hilfe einer geräuscharmen Peristaltische Pumpe berichtet. Jedoch haben die Autoren verwendet ein anderes Modell der Ictogenesis, d. h., die niedrigen Mg2 +, das ist wahrscheinlich weniger als das Modell 4AP Ephaptic Mechanismen, bei denen erhebliche Zunahme extrazellulärer K+ Konzentration beeinflusst 11 , 22. Wir haben festgestellt, dass eine hohe Perfusion Rate nicht wünschenswert im 4AP Modell, möglicherweise aufgrund der schnellen Auswaschen von angesammelten extrazelluläre K+, die möglicherweise in der Aufnahme ACFS16deutlich erhöht werden. In der Tat erschien iktale Veranstaltungen "chunked" Wenn ASCF Perfusion Geschwindigkeit auf 2-3 mL/min erhöht wurde und die Gehirn-Scheibe wurde durch eine dicke Schicht der ACFS überflutet während ausgewachsene Entladungen präsentiert robuste Tonikum-klonischen Komponenten nach der Rückkehr nach wiederhergestellt werden konnte eine niedrigere Rate der Perfusion (1 mL/min) und ein dünner ACFS Schicht direkt an dem Gewebe Oberflächenniveau (Daten nicht gezeigt). Die individuelle Aufnahme Kammer beschrieben in diesem Protokoll ermöglicht den Austausch der Perfusion Medium 3-bis 5-Mal / min bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min. So wird die gesamte Sauerstoffversorgung der Gehirnscheiben stark auch bei relativ geringer Perfusion verbessert, noch garantieren eine stabile Aufzeichnung von Temperatur und hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Am wichtigsten ist, ist es möglich, die extrazelluläre K+ -Konzentration auf einen physiologischen Wert zu halten.

Das 4AP Modell des Ictogenesis ist nicht erforderlich, jede wesentliche Änderung der ACFS Ionische Zusammensetzung, wie Senkung Mg2 + oder zunehmende K+, und bietet den einzigartigen Vorteil des exzitatorischen und inhibitorischen Getriebe intakt zu halten 12, ein Aspekt, der in der Epilepsie-Forschung im Hinblick auf die entscheidende Rolle der glutamatergen und Gabaergen Netzwerke in epileptiformen Synchronisation (vgl. 7) von hoher Relevanz ist. Die in diesem Protokoll verwendeten 4AP-ACFS enthält eine physiologische Konzentration K+ (3,25 mM) und eine etwas geringere Mg2 + Konzentration als die Abhaltung ACFS (1 mM im Vergleich zu 1,3 mM). Diese Konzentration fällt noch unter den physiologischen Werten der Mg2 + -Konzentration in der Nager CSF und dient in vielen Laboratorien (siehe zum Beispiel17,18). Mit dem Zweck des Protokolls beschrieben haben wir festgestellt, dass diese leichte Abnahme bevorzugt wird, um die Wirkung der 4AP zu unterstützen.

In früheren Arbeiten wurde 4AP Gehirn Slice angewandt, wenn es bereits innerhalb der Aufnahme Kammer17,18positioniert wurde. Es sei denn, der Experimentator die Wartezeit zwischen der 4AP Anwendung und das Auftreten von epileptiformen Mustern zu beobachten muss, finden wir, dass dieser Ansatz ziemlich zeitaufwändig ist und eignet sich nicht für die längere Aufnahme und Stimulationssitzungen verfolgen in diesem Protokoll beschrieben. Vorinkubation von Gehirnscheiben in 4AP bei 32 ° C ermöglicht viel experimentelle Zeit zu schonen, da Gehirnscheiben Serie vorbehandelt werden können, während der Verfolgung des Experiments mit anderen Gewebeschnitten.

Die verlängerte Lebensfähigkeit der Gehirnscheiben nützlich Netzwerkfunktionen auf lange Sicht analysieren. Darüber hinaus ist ihre Verbesserte Widerstandsfähigkeit gegen repetitive Elektrostimulation von großem Vorteil, wenn der Experimentator will mehrere Stimulation Protokolle zu vergleichen, die in der gleichen Gehirn-Scheibe für statistische Robustheit ausgeführt werden müssen. In unseren Händen beim Testen von 3 Stimulation Protokolle jeweils eine Kontrolle Phase vorangestellt und gefolgt von einer Phase der Erholung, das Experiment dauert 3-5 h. Live MEA-Zuordnung ist in diesem Zusammenhang entscheidend, um den richtigen Weg zu aktivieren und zu unterdrücken, anstatt Ictogenesis über elektrische Stimulation zu begünstigen. Unsere benutzerfreundliche GUI stellt eine schnelle, einfache und flexible Tool die Elektroden der verschiedenen Gehirnstrukturen zugeordnet. Im Gegensatz zu kommerzieller Software ist es möglich, benutzerdefinierte MEA Layouts auch mit grundlegende Programmierkenntnisse hinzufügen. Bilder können im Hellfeld erworben werden; Damit eignet sich jede Allzweck-Kamera, die guten Auflösung und am Mikroskop passt. Einem inversen Mikroskop ist unerlässlich zur Visualisierung der Mikroelektroden-Position relativ zu der Gehirn-Scheibe, da diese unter das Gewebe verdeckt werden würde, wenn eine aufrechte Mikroskop verwenden. Jedoch ist ein Stereo-Mikroskop neben dem invertierten Typ empfohlen, der Experimentator Messer-Kürzungen um bestimmte neuronale Bahnen stören durchführen muss.

Schließlich ist ein weiterer Vorteil der vorgeschlagene Ansatz relativ einfach und billig Montage für den Großteil der benötigten Werkzeuge, wie benutzerdefinierte Aufnahme Kammer und die Holding-Kammern, das warme Bad sowie der Slice-Anker und die unnötige Verwendung von eine kostspielige Geräuscharme Peristaltische Pumpe.

Grenzen der Technik:

MEA-Aufnahme nicht erlaubt Visualisierung von sehr langsamen Wellen, d. h., DC verschiebt sich in das Signal. Diese Grundlinie Umlenkungen können helfen, asymptotische Messung des iktalen Entlastung Dauer und am wichtigsten ist, sie sind von grundlegender Bedeutung, kortikale ausbreitende Depression (ein Phänomen, das bezieht sich auf plötzliche unerwartete Todesfälle bei Epilepsie32 und teilen zu studieren zwischen Epilepsie und Migräne33).

In Bezug auf elektrische Neuromodulation erlaubt das hier beschriebene Protokoll mehrere Stimulationssitzungen ohne Gehirn Slice Lebensfähigkeit. Wir konnten erfolgreich führen bis zu 3 Stimulationssitzungen von 20-45 min, ähnlich, was in der früheren Arbeit25berichtet. Obwohl Gehirnscheiben wahrscheinlich eine höhere Anzahl von Stimulationssitzungen oder längere Stimulation Protokolle standhalten können, haben wir nicht in dieser Hinsicht Gehirnscheiben getestet. Wir empfehlen, Begrenzung der Anzahl der Stimulation Protokolle auf 3 und die Vermeidung von Stimulationssitzungen (≥60 min), verlängert die deutlich Hirngewebe unter diese Grenzbedingungen aufrechterhalten, bis der Mangel an Erholung nach Reiz Zurücknahme betonen kann.

Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls:

Mehrere kritische Faktoren behindern das erfolgreiche Streben nach der Aufnahme und Modulation der epileptiformen Aktivität in Hirnschnitten an MEA gekoppelt. Neben der Nagetierarten verwendet und die Qualität der den Gehirnscheiben, die Perfusion Rate während der Aufnahme und die Dynamik der ACFS Strömung (i.e., laminar versus Rundschreiben) innerhalb der Aufnahme Kammer, haben wir festgestellt, dass die Bedingungen für Erholung und langfristige Erhaltung der Gehirnscheiben sowie die Art der 4AP Anwendung sind die wichtigsten Schritte.

Bei Verwendung einer versunkenen aufnahmekammer ist es wichtig, die Gehirnscheiben bei Raumtemperatur zu erhalten Gehirn Gewebe Netzwerkaktivität und begünstigen die Induktion von iktalen wie Einleitungen von 4AP Anwendung zu speichern. In unseren Händen verschlechtert Wiederherstellung und Wartung bei 32 ° C das Hirngewebe innerhalb von 3-4 h des Schneidens.

Inkubation des Gehirns Scheiben in 4AP ACFS bei Raumtemperatur und Aufnahme bei 32 ° C ist jedoch nicht wünschenswert. Wir haben viele Schwierigkeiten bei der Beobachtung robuste wiederkehrende iktalen Entladungen in diesem Zustand gefunden. In der Tat haben niedrige Temperaturen im Bereich von 20 – 24 ° C gemeldet, Dämpfen oder sogar verhindern 4AP-induzierte Ictogenesis sowohl in Vitro34 und in-Vivo-35. Damit die 4AP Inkubation und Aufnahme Temperaturen müssen innerhalb der 30-34 ° C fallen und müssen aufeinander abgestimmt sein. Um zu vermeiden, das Hirngewebe unter zu viel Stress wegen der gleichzeitigen Induktion der Übererregbarkeit 4AP und die plötzliche Exposition von Hirnschnitten von Raumtemperatur zu Warm (32 ° C) 4AP-ACFS setzen, ist es unerlässlich, eine fortgeschrittene Vorwärmen durchführen Schritt und lassen Sie die Gehirnscheiben in der Holding ACFS bei 32 ° C für 20-30 min., überspringen diesen Schritt gewöhnen können Ictogenesis Induktion durch 4AP auswirken.

Ein weiterer Aspekt erwähnt werden muss ist die Bedeutung der D-Glucose-Konzentration in der ACFS nach schneiden. Eine 25 mM-Konzentration bewahrt die Gehirnscheiben besser als die 10 mM-Konzentration in vielen Laboren verwendet und es verbessert auch die Rate des Auftretens von iktale Aktivität, die 2-fold schneller ist (, wodurch es leichter zu einer langen Reihe von experimentellen verfolgen Protokolle in mehreren Gehirnscheiben jeden Tag).

Zu guter Letzt einige wichtigeren Feinheiten während das slicing Verfahren erwähnt werden müssen. Erstens lassen Sie nicht die intakten Gehirn und Hirnschnitten zu frieren in der Kälte ACFS schneiden. Kühlung des Gehirns für < 2 min reicht angesichts der geringen Größe des Mäusegehirns. Gewebeschnitte sollte sofort aus dem Puffer-Fach auf die Spülung Becher bei Raumtemperatur übertragen werden. Spülen das Schneiden ist ACFS sehr wichtig, sonst die hohen Saccharose-Konzentration im Gehirn machen wird, die Scheiben auf das Nylon-Netz von der aufnahmekammer stick. Um das Gewebe effektiv zu spülen, ist es wichtig, die schneiden ACFS Inhalte innerhalb der transferpipette um die Abhaltung ACFS nicht übermäßig zu verunreinigen zu minimieren. Die 2-stufige Spülung hilft bei der Minimierung der Verschmutzung. Nach Abschluss des Verfahrens slicing sollte Gewebeschnitte von der Spülung Becher sofort übertragen werden, um die aufnahmekammer, wo die weichen Nylon mesh abgehängte halb in der Holding ACFS ermöglicht Gewebe-Oxigenierung auf beiden Seiten. Das gleiche Prinzip auf allen Stufen nach dem Aufschneiden Verfahren angewandt werden: Gehirnscheiben sollte niemals auf den Boden des Bechers sitzen, sie sollte nicht in Kontakt mit den Seiten der Kammern halten und sie sollten nie miteinander in Kontakt sein, noch überschneiden sich.

Modifikationen und Fehlerbehebung:

ACFS Zusammensetzung kann der Experimentator Bedürfnissen geändert werden. Beispielsweise können Medikamente hinzukommen, die Einbringung von bestimmten Neurotransmittern oder Ionenkanäle, die Wirksamkeit von elektrische Neuromodulation sezieren. Darüber hinaus können Brenztraubensäure und Ascorbinsäure (vgl. Tabelle 2) weggelassen werden, obwohl wir feststellen, dass sie eine starke neuroprotektive Rolle ausüben. Wir berichten in Tabelle 3 die häufigsten Probleme, die in diesem Protokoll und wie man damit umgeht angetroffen werden können.

Schlussfolgerungen:

MEA-Aufnahme ist zweifellos eine wertvolle Technik um die Wechselwirkungen von neuronalen Netzwerken in Gesundheit und Krankheit anzugehen. Neben pharmakologischen Studien ist es auch möglich, elektrische Neuromodulation Protokolle zu bewerten, die für DBS angewendet, Epilepsie und anderen neurologischen Erkrankungen sind. In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass es möglich, typische periodische Anregung Experimente mit ähnlichen Ergebnissen zu denen, die mit konventionellen extrazellulären Bereich mögliche Aufnahme zu reproduzieren und externe Elektroden stimulieren. Die zunehmende Verfügbarkeit von benutzerfreundlichen Handelsausrüstung und erweiterte Software-Tools machen die MEA-Aufnahmetechnik auch geeignet für geschlossene Stimulation Experimente, um ad-hoc- Stimulation um das Hirngewebe und bieten den Beitrag der Feedback-Mechanismen zu neuronalen Netzes Antworten zu untersuchen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

G.P ist Marie Skłodowska-Curie Fellow finanzierten Projekts Europäische Union MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A n.660689, unter dem Rahmenprogramm H2020. Die GUI-MapMEA ist frei verfügbar auf Anfrage, ilaria.colombi@iit.it zu erstellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine  Sigma-Adrich P7886 Needed for MEA coating
NaCl Sigma-Adrich S9888 Chemical
KCl Sigma-Adrich P9541 Chemical
KH2PO4 Sigma-Adrich 795488 Chemical
CaCl2*2 H2O Sigma-Adrich C3306 Chemical
D-Glucose Sigma-Adrich RDD016 Chemical
NaHCO3 Sigma-Adrich S5761 Chemical
MgCl2*6 H2O Sigma-Adrich M2670 Chemical
MgSO4*6 H2O Sigma-Adrich M5921 Chemical
Sucrose Sigma-Adrich RDD023 Chemical
Pyruvic Acid, 98%  Sigma-Adrich 107360 Chemical
4-aminopyridine Sigma-Adrich A78403 Convulsant drug
STG-2004 Multichannel System STG4004-1.6mA 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060 Multichannel System N/A MEA amplifier
planar MEA Multichannel System 60MEA500/30iR-Ti w/o ring Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack Multichannel System Recording software
McStimulus II Multichannel System STG4004 control software
TC02 Multichannel System TC02 2-channel thermostat
PH01 Multichannel System PH01 Heating perfusion canula
MPH  Multichannel System MPH  Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43 Wacker E43 Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber Crisel Instrument SKE-chamber MEA Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm  Crisel Instrument 64-1309 Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme Sigma-Adrich Z273287-1EA Enzymatic cleaner
MATLAB The Mathworks Programming environment for electrodemapping
VT1000S Leica Biosystems VT1000S Vibratome
Warner Instruments 64-1309 Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 135 Epilepsie 4-Aminopyridine Gehirn-Scheibe Maus multielectrode Array neuromodulation
Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays
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Panuccio, G., Colombi, I.,… More

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

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