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Neuroscience

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57548
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Rehab Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Abstract

Epilepsia del lóbulo temporal (ELT) es el síndrome epiléptico complejo parcial más común y menos sensible a los medicamentos. Estimulación cerebral profunda (DBS) es un enfoque prometedor cuando falla el tratamiento farmacológico o Neurocirugía no se recomienda. Rebanadas de cerebro agudo juntados a arreglos de microelectrodos (MEAs) representan una herramienta valiosa para el estudio de las interacciones de la red neuronal y su modulación por el estímulo eléctrico. En comparación con técnicas convencionales de grabación extracelular, que proporcionan las ventajas agregadas de un número mayor de puntos de observación y conocida distancia entre electroda, que permite estudiar la trayectoria de la propagación y velocidad de electrofisiológicos señales. Sin embargo, oxigenación tisular puede reducirse considerablemente durante el MEA de grabación, que requieren una tasa alta de perfusión, que viene a costa de disminución cociente signal-to-noise y mayores oscilaciones en la temperatura experimental. Estimulación eléctrica más destaca el tejido cerebral, lo que hace difícil seguir épocas de grabación/estimulación prolongada. Además, modulación eléctrica de actividad de la rebanada del cerebro necesita atacar estructuras/vías específicas dentro de la rebanada del cerebro, que requieren que asignación de electrodo ser rápidamente y fácilmente interpretada en directo durante el experimento. Aquí ilustramos cómo llevar a cabo la modulación grabación y eléctrica de la 4-aminopiridina (4AP)-inducida por la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor con MEAs planares. Nos muestran que el tejido cerebral de ratones supera a tejido cerebral de rata y por lo tanto es más adecuado para los experimentos MEA. Este protocolo garantiza la generación y el mantenimiento de un patrón epileptiforme estable que fielmente reproduce las características electrofisiológicas observadas con la grabación de potenciales de campo convencional, persiste durante varias horas y dura más tiempo sostenido estimulación eléctrica para épocas prolongadas. Viabilidad del tejido durante todo el experimento se logra gracias al uso de una cámara de grabación personalizada de pequeño volumen teniendo en cuenta flujo laminar y de intercambio de solución rápida incluso en baja (1 mL/min) las tasas de perfusión. Rápida asignación de MEA para monitoreo en tiempo real y selección de electrodos de estimulación se realiza mediante una interfaz de usuario gráfica (GUI).

Introduction

La epilepsia es un desorden progresivo mortal causando actividad incontrolada del cerebro1; lleva entre la mayor carga de enfermedad y estigma social significativo2,3. TLE es el síndrome más frecuente (40%) y más con frecuencia (~ 30%) resistente a medicamentos antiepilépticos4. Mientras que la ablación quirúrgica del tejido epileptogénico puede mejorar la condición del paciente, no es factible en todos los pacientes y no pueden garantizar una vida completamente libre de crisis5. Modulación de la epilepsia límbicas redes DBS eléctrico es un enfoque prometedor tratamiento farmacológico o Neurocirugía no son adecuados.

Rebanadas de cerebro de roedores son una valiosa herramienta para estudiar cómo neuronal función de redes en salud y la enfermedad6 mediante técnicas de electrofisiología en vitro , como conservar, al menos en parte, original arquitectura y Conectividad del cerebro regiones de interés (ROI). En particular, rodajas de corteza (hipocampo-CE) hipocampo combinado horizontal-entorrinal conforman las redes neuronales esenciales en TLE y por lo tanto se emplean rutinariamente en vitro TLE investigación7.

Actividad de asimiento-como puede ser agudo inducida en rebanadas de cerebro cambiando la composición iónica del líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), tales como disminución de magnesio aumentando potasio8,9,10, o mediante manipulaciones farmacológicas, como el bloqueo de la actividad inhibitoria GABAérgica (véase11 para una revisión exhaustiva). Sin embargo, estos modelos se basan en la alteración desbalanceada de excitación e inhibición; por lo tanto, no permiten el estudio de la interacción y contribución concertada de las redes inhibitorias y excitatorias a ictogenesis. Perfusión continua de rebanadas de cerebro con la droga convulsiva 4AP mejora la neurotransmisión tanto excitatoria como inhibitoria, permitiendo estudiar ictogenesis aguda manteniendo actividad sináptica general intacta12.

MEAs permiten registrar la actividad eléctrica generada por las redes neuronales de un mayor número de puntos de observación en comparación con grabación potencial campo extracelular convencional, donde las restricciones espaciales limitan el número de electrodos que pueden ser acomodan en la superficie de corte de cerebro. Por otra parte, MEA chips ofrecen la ventaja de la distancia entre electrodo conocida, que es muy útil para la propagación de seguimiento y evaluación la velocidad de viaje de señales grabadas. Aunque inicialmente se concibió para la grabación de las neuronas cultivadas13,14, MEAs ahora sirven también para caracterizar las características electrofisiológicas de rebanadas cerebrales agudas de roedores15 y seres humanos16. Así, en el contexto de la investigación en epilepsia, AMUMA representan una herramienta valiosa para identificar las interacciones de redes neuronales en el centro de ictogenesis16,17,18.

Sin embargo, la grabación de MEA lleva inherentemente desafíos técnicos en la obtención o el mantenimiento de un patrón epileptiforme estable a lo largo de los protocolos experimentales de largo (varias horas). En primer lugar, oxigenación tisular no puede ser adecuado dentro de la gran y redondo tipo sumergido grabación cámara19,20 típica de los AMUMA disponible comercialmente, mientras que pobres cociente signal-to-noise y la inestabilidad de la temperatura podrían afectar la calidad de la grabación cuando se utiliza una tasa de alta perfusión (6-10 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno a la rebanada del cerebro (véase por ejemplo las notas técnicas en equipos de calefacción y perfusión21). Descargas en segundo lugar, recurrentes, con componentes de alta frecuencia, como las descargas epileptiformes, apenas se observan al usar cámaras de grabación de tipo sumergido19; Esto es particularmente el caso cuando el patrón epileptiforme aguda es inducido químicamente e implica ephaptic mecanismos, como es el caso de la 4AP modelo22 (ver11 para una descripción completa). Para superar estas limitaciones, varias estrategias han sido propuestas por los investigadores. Por ejemplo, aumento de la tasa de perfusión19,20 reduciendo el grosor de corte de cerebro (≤300 μm) y zona17,18 es factores cruciales para lograr el suministro de oxígeno adecuado a los tejidos. Además, también puede lograrse cerebro mejor rebanada viabilidad utilizando MEAs perforadas (pMEAs), que inunda el tejido cerebral de ambos lados18.

Mientras que los enfoques descritos han mejorado significativamente la viabilidad de la grabación de la MEA de rebanadas de cerebro, no han sido probados contra prolongada (varias horas) grabación y eléctricos sesiones de estimulación, el último que representa a un importante estrés para el tejido cerebral. Las sesiones de grabación prolongada pueden ser requeridas para estudiar la evolución en el tiempo de características específicas de patrones epileptiformes que no sería posibles desenmascarar por medidas a corto plazo. En el contexto de la investigación DBS, se requiera prolongados protocolos experimentales para evaluar y comparar los efectos de varios paradigmas de estimulación en el mismo segmento del cerebro.

Cuando sólo la actividad eléctrica espontánea debe grabarse, mapeo de los electrodos en relación con el retorno de la inversión se realiza a posteriori, es decir, durante el análisis de los datos; en cambio, el estudio de las respuestas evocadas o paradigmas de neuromodulación eléctrica requiere que estímulo entregarse a ROI(s) específicas, dictan la necesidad de asignación de electrodo vivo rápida y fácil durante el experimento.

Aquí ilustramos un sencillo protocolo experimental que permite la inducción y el mantenimiento de un patrón epileptiforme inducida por 4AP estable en rebanadas de cerebro de roedores adultos. La actividad observada reproduce fielmente las características electrofisiológicas de este modelo como caracterizado mediante técnicas de electrofisiología extracelular convencional. Persiste durante varias horas y dura más tiempo sostenida estimulación eléctrica para repetidas épocas prolongadas. Las cámaras usadas para mantener e incubar las rebanadas de cerebro se pueden montar fácilmente con suministros de laboratorio estándar (figura 1A), mientras que una cámara de grabación personalizada permitiendo la solución óptima el tipo de cambio y de flujo laminar (figura 1B) puede obtenerse de fuentes comerciales o utilizando tecnología de impresión 3D a un precio asequible. Asignación rápida de la ROI(s) para monitoreo en tiempo real y para la selección de electrodos estimulantes es hecha posible por un GUI fácil de usar personalizado denominado mapMEA, libremente disponible bajo petición.

Figure 1
Figura 1: equipo de medida utilizado para este protocolo. (A) la tenencia de cámaras de recuperación, precalentamiento y preincubación en 4AP son ensambladas con un vaso y un plato de Petri. El plato de Petri debe ser más pequeño en diámetro que el interruptor y se lleva a cabo en lugar por medio de un émbolo de la jeringa. La parte inferior de la caja Petri se sustituye por una malla de nylon (de medias suaves) pegada con cianocrilato en el borde de la placa de Petri. Oxígeno es suministrado a través de una aguja espinal doblada (22 G), insertada entre las paredes de la caja Petri y el vaso de precipitados. Burbujas deben estar surgiendo desde el lado del vaso y nunca alcance la malla de nylon para evitar el desplazamiento de corte de cerebro. La parte superior de una placa de Petri puede utilizarse como una tapa para evitar evaporación ACSF y mantener la saturación de oxígeno. (B) cámara de grabación personalizada. en: Reserva de entrada para la cánula de la calefacción y el electrodo de referencia. salida: embalse de salida para acomodar la aguja de aspiración. REC: grabación cámara. Pipeta Pasteur de cristal (C), encrespado por el fuego-pulido, utilizado para manejar el tejido y ajustar su posición dentro de la cámara de grabación. Ancla de sujeción (D) Custom rebanada. Montaje Final (E) de la cámara de grabación montado en el chip MEA. Un trozo de cerebro se apoya en la parte inferior sujeta por el ancla. La flecha roja indica el tubo de PTFE cubriendo la cánula de la calefacción, mientras que el círculo rojo indica que el electrodo de referencia de un pellet de KCl saturado por ACSF en el depósito de entrada. La flecha azul indica la aguja de aspiración en el depósito de salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Ministerio de salud (autorización n. 860/2015-PR) en cumplimiento de la UE la Directiva 2010/63/CE sobre el bienestar animal.

1. preparación de la Asamblea de la cámara MEA/Custom

Nota: Comenzar 2 días antes del experimento. Utilizar un MEA sin un anillo (véase Tabla de materiales).

  1. Limpiar el MEA (duración: 35-40 min).
    1. Un polvo limpiador enzimático se disuelven en agua destilada tibia. Cepillo caliente solución sobre la superficie MEA luego remoje el MEA en el caliente solución durante al menos 3 h de limpieza.
    2. Enjuague el MEA cuidadosamente con agua destilada y secar con un pañuelo de papel sin pelusa no scratch.
  2. Montar el MEA con la cámara de grabación (duración: 10 min + alojamiento).
    1. Distribuida uniformemente sellador elastomérico en la superficie inferior de la cámara de grabación. Asegúrese de que no hay burbujas.
    2. Montar la cámara de grabación en la MEA con la ayuda de pinzas y aplique una presión suave. Si hay burbujas, mueva ligeramente la cámara en un círculo mientras se aplica presión suave con los dedos hasta que han desaparecido todas las burbujas. Aplique una capa de sellador alrededor del borde exterior de la cámara de grabación.
      Nota: crítico! No cubra los contactos de la MEA con el sellador.
    3. Coloque el ensamblaje MEA/cámara dentro de una caja de Petri de 15 cm. Lugar un plato de Petri de 5 mL o un vaso de precipitados de 10 mL llena de agua destilada, cerca del MEA. Cubrir todo lo posible para mantener un ambiente húmedo. Que cura a temperatura ambiente durante la noche.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
  3. Capa del MEA para hacerla hidrofílica (duración: 5-10 min + alojamiento).
    1. Coloque el MEA en una placa de Petri de 15 cm. Verter 50 μl de poly-D-lisina sobre la zona de grabación de MEA. Cierre la caja Petri, sellar con lacre de la película y almacenar durante la noche a 4 ° C.
    2. Enjuague el MEA minuciosamente con agua destilada y guardar el MEA a 4 ° C en agua destilada.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. MEAs revestidos pueden almacenados y reutilizados para varios experimentos. Rutina de limpieza y decubrir el MEA ayuda a eliminar los residuos de tejido y mejorar la relación señal a ruido.

2. preparación de soluciones madre

Nota: Iniciar 1 día antes del experimento (duración: ~ 2 h). Soluciones stock ayudan a acelerar el experimento el día experimental. Puede preparar con antelación y almacenados. Vea la tabla 1 para la composición y el factor de concentración. Consulte la tabla 2 para composición de soluciones finales.

  1. Disolver los productos químicos en agua destilada a temperatura ambiente. Filtrar las soluciones stock con una botella de filtro (diámetro de filtro: 0,22 μm).
  2. Conservar a 4 ° C (ver tabla 1 para el tiempo máximo de almacenamiento recomendado).
    Nota: El protocolo se puede detener aquí.

3. preparación de Agar

Nota: Iniciar 1 día antes del experimento (duración: ~ 1 h).

  1. Verter 250 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 500 mL y empezar a revolver a 350 rpm. Añadir 5 g de agar y espere hasta que esté completamente disuelta.
  2. Calentar la solución a 250-300 ° C. Deje que el agua se evapore hasta que la solución es de ~ 200 mL para producir una solución de agar 2.5% w/v.
    Nota: La temperatura debe ser lo suficientemente alta para que deje que el agua se evapore sin burbujear.
  3. Vierta la solución de agar sobre una caja cuadrada de plástico de 200 mL de ~1.5 cm de altura paredes y deje que se enfríe a temperatura ambiente hasta que se convierte en sólido.
  4. Cubrir la caja y almacenar a 4 ° C. El bloque de agar es bueno para varias semanas.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí.

4. elaboración del plano congelado

Nota: Iniciar 1 día antes del experimento.

  1. Llene un recipiente de fondo plano de acero inoxidable con agua destilada hasta 0.5 - 1 cm por debajo del borde.
  2. Almacenar a-20 ° C durante la noche.

5. preparación de neuroprotectores corte ACSF

Nota: Iniciar 1 día antes del experimento o el mismo día del experimento (ver tabla 1 y tabla 2) (duración: 30 min).

  1. Verter 200 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 500 mL y empezar a revolver con un agitador magnético a 350 rpm.
  2. Añadir 50 mL de stock B y 50 mL de stock C (ver tabla 1).
  3. Añadir ácido pirúvico de 3 mM, sacarosa de 208 mM, 10 mM D-glucosa y el ácido L-ascórbico de 1 mM.
    Nota: El volumen real de ácido pirúvico depende de la densidad y pureza y puede variar con el lote. Siempre calcular el volumen requerido cuando se abre un nuevo lote.
  4. Cubra con película y deje de agitar durante 30 minutos.
  5. Transferir la solución a un matraz aforado de 500 mL y añadir agua destilada para llenar el frasco.
  6. Sellar el frasco volumétrico con película e invierta suavemente 3 - 5 veces hasta que la solución es uniformemente clara.
  7. Traslado la corte ACSF en una botella de vidrio con tapa.
  8. Almacenar el corte ACSF a-80 ° C durante 20-30 min o a 4 ° C durante la noche para enfriar a 4 ° C.
    Nota: El protocolo puede pausarse aquí si prefiere refrescarse durante la noche. De lo contrario el tiempo requerido para enfriamiento corte ACSF podrá utilizarse para seguir paso 6.

6. preparación de la explotación ACSF

Nota: Preparar la solución fresca en el día del experimento (duración: 5-10 min). La explotación ACSF se usará para enjuagar las rebanadas de cerebro del corte ACSF durante el procedimiento de corte (ver paso 8.16) y para el almacenamiento a largo plazo de la tajada de cerebro y precalentamiento. Para enjuagar las rebanadas de cerebro, basta con 100 mL de celebrar ACSF. Las cámaras sosteniendo y precalentamiento usadas en este protocolo son por encargo y contienen un volumen de 300 mL y 100 mL, respectivamente (véase figura 1A). Con esta configuración, basta con 500 mL de celebrar ACSF . Cámaras procedentes de fuentes comerciales pueden contener un volumen diferente, en que caso la cantidad total de tenencia ACSF estar preparado debe ajustarse en consecuencia.

  1. Verter 200 mL de agua destilada en un matraz aforado de 500 mL.
  2. Añadir 50 mL de caldo A, 50 mL de stock B, 6,5 mL de caldo M y 1 mM de ácido L-ascórbico. Frote suavemente con movimientos giratorios hasta que el ácido L-ascórbico se haya disuelto completamente.
  3. Añadir agua destilada agua para alcanzar el volumen final, sello de la Fiola con película e invierta suavemente 3 - 5 veces hasta que la solución es uniformemente clara. Consulte la tabla 2 para la celebración composición ACSF.

7. preparación de los bancos Experimental

Nota: Esto requiere 15 minutos, más 30 minutos para obtener una temperatura estable del baño caliente.

  1. Banco de grabación
    1. Iniciar el baño caliente, situado a 32 ° C y cubrir para mantener su temperatura.
      Nota: El baño caliente utilizado en este protocolo puede ser por encargo utilizando una caja de plástico duro-a y un termostato de acuario previamente fijado en la temperatura deseada. Temperatura constante se puede llegar en 30 minutos a partir de la temperatura ambiente. Puesto que las cámaras de precalentamiento e incubación sentarse en la parte inferior de la caja de plástico, el nivel de agua debe ser suficiente para cubrir el termostato para mantener las cámaras de flotación.
    2. Montar la celebración y las cámaras de precalentamiento (véase figura 1A) y vierta la celebración ACSF en ellos. Mantenga la cámara de retención a temperatura ambiente y coloque la cámara de precalentamiento en el baño caliente. Empezar a burbujear las soluciones con mezcla de 95% O25% CO2 gas y eliminar las posibles burbujas atrapadas con una pipeta Pasteur invertida. Mantenga cubierto.
  2. Vibratome y Banco de corte
    1. Pegar un bloque de agar pequeño en el centro del disco de muestra usando pegamento de cianocrilato.
    2. Poner un vaso de precipitados de 250 mL en un cubo de hielo y vierta cortar ACSF.
    3. Tomar dos vasos de precipitado de 100 mL y vierte 50 mL de celebrar ACSF en cada uno. Deje los vasos a temperatura ambiente. Estos son los vasos enjuague.
    4. Empezar a burbujear las soluciones con una mezcla 5% CO2 gas de 95% O2.
    5. Montar la bandeja de búfer en el vibratome y lo rodean con hielo picado. Verter algunos etanol sobre el hielo picado para ayudar en el mantenimiento de temperaturas frías durante el procedimiento de corte. Después de verter de etanol, agregue más hielo cuando sea necesario.
      Nota: Una temperatura de 2 ° C es óptima.
    6. Coloque el grifo dentro de la bandeja de buffer, luego montar y montar el bloque de hoja vibratome.
      Nota: Asegúrese de que la hoja se monta en el ángulo de separación de ~ 10°.
    7. Poner hielo picado en un vaso de precipitados de 500 mL a 2/3 del volumen y llenado con agua destilada.
    8. Tome el tazón de fuente congelado del congelador, colóquelo boca abajo sobre la mesa de corte y cubierta con una toalla de papel y un disco de papel de filtro.
  3. Banco de anestesia
    1. Colocar un recipiente en una bandeja llena de hielo y vierta corte ACSF en él. Empezar a burbujear con una mezcla 5% CO2 gas de 95% O2.

8. mantenimiento y preparación de la rebanada del cerebro

Nota: Este protocolo hace uso de adulto (4 - 6 semanas de edad) masculinos ratones CD1, pero otras cepas (por ejemplo, c57/bl617,18) pueden ser utilizado. También más adelante comparar el resultado experimental obtenido con rodajas de cerebro de ratón rindió por rodajas de cerebro de ratas Sprague-Dawley macho de la misma edad. Los pasos siguientes se refieren a la preparación de rodajas de cerebro parcialmente desconectado que CA3-conducido rápido interictal es refrenado que el hipocampo apropiado y no se puede propagar a las cortezas parahippocampal, como descrito en el23. Desconexión de la corteza hipocampo es un requisito previo para cursar estudios de modulación eléctrica en el uso de la preparación de corte de cerebro hipocampo-CE. El vibratome utilizado se refiere al modelo de la Tabla de materiales. Otros modelos pueden requerir un procedimiento diferente.

  1. Anestesiar el roedor con isoflurano mezcla entregado a una cámara de inducción de la anestesia en 2 L/min de gas de 5% en un carbogen.
  2. Bajo anestesia profunda (reflejos en respuesta a los pies y patas no pellizcar), extraer el cerebro en 1 minuto siguiendo procedimientos estándar como en23. Ponga el cerebro en el recipiente pequeño con corte medio helada ACSF y deje enfriar durante 90-120 s.
    Nota: No deje que el cerebro relajarse demasiado, de lo contrario se puede congelar.
  3. Vierta el helado corte ACSF en la bandeja del almacenador intermediario. Corte extendió ACSF sobre el papel de filtro colocado en el tazón de fuente congelado. Colocar el cerebro en el papel de filtro y aislar el bloque de tejido de cerebro necesario quitando el cerebelo y cortando el poste frontal derecho.
  4. Con la ayuda de una espátula doblada, pegue el lado dorsal del cerebro sobre el disco de muestra con el corte frontal hacia el bloque de agar y el polo occipital hacia la hoja vibratome. Use una capa fina de pegamento de cianocrilato. Coloque el disco de espécimen en la bandeja del tampón inmediatamente y asegúrelo.
  5. Ajuste la gama seccionamiento con el fin de mover la hoja vibratome por todo el tejido hasta el bloque de agar. Ajuste la altura del disco de muestra para alcanzar el nivel de la lámina con el bloque de tejido de cerebro.
  6. Deseche las secciones de tejido hasta que el hipocampo es claramente visible (generalmente ~ 900 μm). Entonces, fijar un espesor de corte de 400 μm y empezar a cortar para mantener las secciones de tejido. Para cada sección del cerebro divide los dos hemisferios y recorte el tejido innecesario para obtener dos rebanadas de cerebro. Como la bandeja de tampón es mayor en secciones posteriores, llenar el alojamiento de bandeja de tampón con agua destilada helada (ver paso 7.2.7).
  7. Utilice una pipeta de Pasteur invertida suavemente transferir las rebanadas de cerebro en el primer vaso de lavado, vacíe la pipeta de Pasteur, y transferir las rebanadas de cerebro en el segundo vaso de enjuague. Transfiera las rebanadas de cerebro en la cámara de explotación y que recupera de al menos 60 minutos.
    Nota: Generalmente es posible obtener 6-8 rebanadas de cerebro total. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

9. preparación de la ACSF que contiene 4-AP (4AP-ACSF)

Nota: Esto requiere 10 minutos para la preparación, más 20 minutos de calentamiento. PRECAUCIÓN! 4-AP es un fármaco convulsiva y es tóxico. Manejar con guantes y evitar el derrame.

  1. Verter 200 mL de agua destilada en un matraz aforado de 500 mL.
  2. Añadir 50 mL de caldo A, 50 mL de stock B, 5 mL de caldo M y 1 mM de ácido L-ascórbico. Frote suavemente con movimientos giratorios hasta que el ácido L-ascórbico se haya disuelto completamente.
  3. Añadir 500 μl de 4AP stock.
  4. Añadir agua destilada agua para alcanzar el volumen final, sello de la Fiola con película y lo invierta suavemente 3 - 5 veces hasta que la solución es uniformemente clara.
  5. Montar la cámara de incubación 4AP (véase figura 1A) y vierta ~ 80 mL de 4AP ACSF. Cubrir la cámara, transferencia a la bañera caliente y empezar a burbujear con una mezcla de 95% O25% CO2 gas. Eliminar las posibles burbujas atrapadas con una pipeta Pasteur invertida. Mantenga cubierto.
  6. Espere hasta que la temperatura de la ACSF 4AP 30-32 ° C (~ 20 min).
    Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí si rebanadas de cerebro todavía se están recuperando.

10. precalentamiento e incubación de rebanadas en 4AP (duración: 90 min)

  1. Compruebe que la ACSF precalentamiento y la temperatura de la ACSF 4AP es 30-32 ° C.
  2. Utilice un pipeta Pasteur de vidrio invertido transferencia 1 rebanada del cerebro en la cámara de precalentamiento y dejar que el resto de tejido durante 25-30 minutos. Transfiera la rebanada del cerebro en la cámara de incubación 4AP ACSF y déjela en reposo durante 60 minutos.

11. preparación de la configuración MEA

Nota: Iniciar 15 minutos antes de grabar.

  1. Transferir el volumen restante de 4AP ACSF en un erlenmeyer de 500 mL.
  2. Colocar el erlenmeyer en un estante sobre el amplificador MEA y utilice la tubería para permitir que la solución alimentar continuamente una jeringa de 60 mL. Ajuste la altura de la jeringa para permitir que un índice de gravedad de 1 mL/min y el matraz Erlenmeyer.
    Nota: La altura correcta depende del diámetro interno del tubo (ID). Para la tubería de 5/32 pulgadas ID, 30 cm son suficientes.
  3. Empezar a burbujear la ACSF 4AP en el matraz Erlenmeyer y en la jeringa con una mezcla 5% CO2 gas de 95% O2.
  4. Deje la ACSF 4AP flujo a través del tubo de perfusión en un vaso de precipitados hasta allí es no hay aire en el interior; entonces detenga el flujo de la solución.
  5. Conecte la resistencia en la base en MEA al termostato. Colocar la viruta seca de MEA dentro del amplificador MEA y asegure la cabeza de amplificador. Utilizar una pipeta Pasteur plástica para transferir ACSF 4AP a la entrada y el depósito exterior de la cámara de grabación.
  6. Asegurar la cánula de calefacción a un soporte magnético y colocar la punta dentro del puerto de entrada de cámara de grabación; Instale el soporte magnético para una banda magnética en la cabeza de amplificador MEA; Conecte el tubo de perfusión a la cánula; conectar la cánula al termostato.
    Nota: La cánula de calefacción debe cubrirse por tubo biselado politetrafluoroetileno (PTFE) para llegar a la cámara de grabación de entrada y para minimizar el ruido debido al material metálico de la cánula. Cuando el depósito de entrada se llena adecuadamente con 4AP ACSF, gotas cayendo desde el sistema de perfusión no deben ser visibles.
  7. Coloque la aguja de aspiración dentro del depósito y comprobar que hay presión negativa sumergiendo la aguja de aspiración en la ACSF; Si hay un ruido de succión constante de baja frecuencia.
    Nota: La aguja de aspiración debe colocarse para permitir la ACSF 4AP fluir justo por encima de la superficie de corte del cerebro. Puede utilizar una línea de vacío o una bomba de vacío de bajo ruido.
  8. Coloque el regulador de flujo permite un caudal de 1 mL/min y comenzar perfundiendo.
    Nota: La perfusión gravedad elimina el ruido que pueda ser causado por bombas peristálticas; Si se prefieren bombas peristálticas, modelos de ruido son obligatorios.
  9. 4AP ACSF está fluyendo a través de la cánula, una vez en el termostato. Fijar la cánula del calentamiento a 37 ° C y la base MEA a 32 ° C para lograr una temperatura de 32-34 ° C dentro de la cámara de grabación.
    Nota: atención! Nunca calor la cánula sin solución o puede dañarse irreversiblemente. Ajuste la temperatura de la cánula más alta que la temperatura de grabación (es decir, 32-34 ° C) para tener en cuenta para la compensación de temperatura intrínseca entre el valor ajustado y el valor real en la punta de la cánula de la calefacción y dentro de la cámara de grabación. El volumen de la grabación, caudal y temperatura del ambiente cámara de toda influencia de la temperatura de la solución de grabación. Los valores registrados en el paso 11.9 están optimizados para el protocolo descrito y equipo. Siempre verifique la temperatura de grabación mediante un termopar y ajuste la configuración según sea necesario. No caliente la base MEA por encima de 34 ° C para evitar el sobrecalentamiento de la rebanada del cerebro.
  10. Coloque el electrodo de referencia externa en el tanque de entrada de cámara de grabación.
    Nota: Aunque MEA chips cuentan con un electrodo de referencia interno, esto es cubierto por la cámara de grabación personalizada. Por lo tanto, debe utilizarse un electrodo de referencia externa. Una pelotilla de KCl saturada es el más práctico, ya que está listo para usar sin necesidad de cloración.

12. MEA vivo mapas

  1. Una vez el nivel de la ACSF 4AP y la temperatura de grabación se estabilizan como desee, a su vez la perfusión y las llaves de paso de succión a la posición de apagado para detener temporalmente.
    1. Transferir rápidamente una rebanada del cerebro en la sala de grabación MEA utilizando un pipeta Pasteur de vidrio invertido. Ajustar su posición en el área de grabación de MEA como necesarios utilizando una pipeta Pasteur rizada fuego pulido (figura 1) o un pincel pequeño compacto. Coloque el ancla de sujeción (figura 1) en el segmento del cerebro. Reiniciar la perfusión y la succión colocando sus llaves de paso de regreso a la posición de encendido.
      Nota: crítico! El segmento debe ser transferido, y reinicia la perfusión dentro de 60 s o el tejido puede morir. El anclaje de sujeción rebanada debe tener 4AP ACSF para evitar que la rebanada del cerebro se mueva al colocar el anclaje en el segmento del cerebro debido a las diferencias de tensión superficial. El anclaje para garantizar la rebanada del cerebro en la MEA puede ser por encargo con hilo de alambre y nylon de acero inoxidable (figura 1) o procedentes de fuentes comerciales. Figura 1E muestra el montaje experimental final con el chip MEA conectado al cabezal del amplificador: un trozo de cerebro en el chip MEA dentro de la cámara de grabación se mantiene presionado por el anclaje personalizado. El electrodo de referencia (círculo rojo) y el PTFE tubos cubriendo la cánula de la calefacción (flecha roja) se colocan en el depósito de entrada, mientras que la aguja de aspiración (flecha azul) se coloca en el depósito de salida.
  2. Tomar una foto de la rebanada del cerebro usando una cámara montada en un escenario de microscopio invertido.
  3. Ejecute el script mapMEA en el software de computadora para iniciar la GUI para asignar a los electrodos.
    Nota: El software a la medida permite al usuario seleccionar los electrodos que se corresponden con estructuras específicas de la rebanada del cerebro. Este paso es crucial para activar la vía correcta y suprimir la actividad ictal mediante el uso de estimulación eléctrica.

Figure 2
Fig 2: GUI para vivir mapeo de electrodo MEA. (A) representación esquemática de la rebanada de hipocampo combinado-CE en el MEA. Las estructuras por defecto usadas por este protocolo son cornu ammonis 3 (CA3), corteza de enthorinal (CE), perirrinales corteza (PC) y subiculum (SUB). El electrodo de referencia es schematized como un marcador de triángulo. Electrodos rodeados en las líneas de puntos representan las coordenadas XY para enderezar la imagen. Captura de pantalla de (B) de la interfaz durante el mapeo directo de MEA. El diagrama de flujo de la captura de la izquierda indica el procedimiento paso a paso a seguir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Haga clic en el botón examinar para cargar la foto de la rebanada del cerebro. Asegúrese de que el electrodo de referencia aparece en la fila superior de la mitad izquierda de la MEA (figura 2A, la marca de triángulo). Haga clic en el botón Activar puntero , luego seleccione los electrodos superiores e inferiores en la fila de la izquierda de la matriz para marcar las coordenadas XY para enderezar la imagen y la asignación de electrodo.
  2. Rodaja tipo menú desplegable seleccione Horizontal. Marque la casilla por defecto de las estructuras .
    Nota: Es posible personalizar las estructuras seleccionando el botón de Entrar en nuevas estructuras . Las estructuras por defecto para el segmento horizontal del cerebro están representadas en la figura 2A.
  3. Usando los pulsadores numerados debajo de la imagen del trozo de cerebro, seleccionar los electrodos correspondientes al ROI y haga clic en el botón correspondiente en el panel de estructuras para asignarlos (figura 2B); Repita este paso para cada ROI.
  4. Presione el botón de Guardar : el software genera una carpeta de resultados llamada #EXP_LabelledElectrodes que contiene una tabla de informes los electrodos seleccionados y ROIs.

13. grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme

  1. Permiten la rebanada del cerebro se estabilice dentro de la cámara de grabación de 5-10 minutos antes de grabar.
  2. Encienda el estímulo unidad al menos 10 min antes del Protocolo de estimulación para permitir la calibración automática y estabilización. Inicie el software de control de estímulos y verificar que estimulador y MEA amplificador estén correctamente conectados como se indica por un LED verde en el panel principal del software de control de estímulo. Por favor refiérase a los manuales de los instrumentos específicos y software para obtener más detalles, véase Tabla de materiales.
  3. Establecer la estimulación en configuración bipolar. Seleccionar pares de electrodos en contacto con la capa de células piramidales del CA1/proximal subiculum (CF.24,25) entre los que con el script mapMEA (CF. artículo 12). Utilice un cable para conectar uno de los electrodos seleccionados al conector negativo del estimulador y el otro electrodo al enchufe positivo del mismo canal estimulador. Utilice otro cable para conectar la tierra del estimulador a la tierra del amplificador.
  4. Inicie el software de grabación. Para adquirir datos, presione el botón PLAY en el panel principal del software de grabación. Registro por lo menos 4 descargas ictal.
    Nota: Una frecuencia de muestreo de 2 kHz permite adquirir potenciales de campo con la resolución justa y reducir al mínimo el uso de espacio de disco duro. Un archivo de grabación de 5 minutos toma ~ 80 MB. Frecuencias de muestreo más altas pueden requeridas, por ejemplo, artefactos de estímulo récord o actividad de varias unidades. Para observar sólo los potenciales de campo, utilice un filtro de paso bajo vivo a 300 Hz para cortar actividad Multi-unit.
  5. Determinar la intensidad del estímulo.
    1. En el software de control de estímulo, utilice el panel principal para una duración del pulso actual bifásica cuadrada positiva-negativa de 100 μs/fase de diseño.
      Nota: atención! Estimulación por corriente directa requiere un pulso de carga equilibrada para evitar dañar el equipo.
    2. Ejecutar una prueba de (E/S) de entrada y salida rápida para identificar la intensidad óptima del estímulo. Entregar el pulso de estimulación diseñado en Paso 13.5.1 0,2 Hz o inferior mediante la adición de un intervalo entre pulso de 5 s o más en la forma apropiada del software de control de estímulo. En la pestaña de amplitud de pulso entrar una amplitud de pulso inicial de 100 μA/fase y aumentar en pasos de 50-100 μA en cada ensayo hasta estimulación fiable puede evocar eventos interictal en las cortezas parahippocampal (Compruebe las señales visualizadas por la software de grabación).
  6. Modulación eléctrica de ictogenesis límbica
  7. Programa de la unidad de estímulo para entregar el protocolo de estimulación de interés. Use la amplitud de estímulo identificada durante la prueba de I/O.
    Nota: La tasa de fracaso de las respuestas evocadas debe ≤20%.
  8. Después de la estimulación se detiene, verifique recuperación de la red a condición de estímulo previo mediante el registro de al menos 4 descargas ictal (como en el paso 13.4).

Representative Results

MEAs planares con la disposición y el espaciamiento de electrodo de 500 μm 6 x 10 están el dispositivo de grabación ideal para el protocolo experimental descrito aquí, ya que su área de grabación se extiende a lo largo de la rebanada del cerebro en su totalidad (Figura 3A, véase también17). Si MEAs perforadas (pMEAs) sería preferibles mejorar la oxigenación tisular, su área de grabación es demasiado pequeña (~ 2 mm de diámetro). Esto no permite la visualización simultánea de las señales eléctricas generadas por el hipocampo y las cortezas parahippocampal (datos no mostrados; ver18).

El patrón observado epileptiforme 4AP-inducida (Figura 3A) reproduce fielmente lo que típicamente se observa en este modelo en vitro mediante grabación de potenciales de campo convencional y consta de tres tipos de actividad7, 26: () ictal como eventos (figura 3B, puntas de flecha) son sólidos de larga duración (> 20 s, rango: 20-60 s) eventos que se asemejan a las características electrográficas de actividad convulsiva tónica y clónicos componentes (figura 3); son generados dentro de las cortezas parahippocampal cada 3-5 min y volver a entrar en la formación hippocampal a través de la convolución del cerebro dentada (figura 3D, flecha); (ii) lento como interictal descargas (figura 3B, rastro de la CE, barra negra; ampliado en figura 3E) son cortas (< 1 s) eventos de población generados entre acontecimientos ictales ubicuo en la preparación de corte de cerebro hipocampo-CE y ocurrir en un lento ritmo (rango 10-30 s); (iii) rápidodescargas interictales-como (figura 3B, CA3 trace, barra negra; ampliado en la figura 3E) son breve recurrente (< 1 s) eventos de población generados por el subcampo hippocampal CA3; Cuando se conservan los Collaterals de Schaffer, eventos interictales rápido impulsado por CA3 propagan a lo largo del circuito hippocampal y ejercen un efecto de anti-convulsivógenos24 (datos no mostrados); para evitar la actividad ictal destartalado, con el fin del protocolo descrito, CA3 salida se interrumpe (CF. figura 3B, E). Hay que señalar que la actividad interictal rápido impulsado por CA3 grabada con MEAs se produce a un ritmo más lento (~ 0,4 Hz) que lo que se observa con el potencial de campo convencional de grabación con pipetas de vidrio (~ 1 Hz, rango: 0,5 - 2,0 Hz, datos no mostrados).

El resultado exitoso de neuromodulación eléctrica en rebanadas de cerebro de roedor depende de la activación de vías neuronales específicas27 junto con la conectividad intrínseca entre las regiones en la preparación de24. Hemos probado rebanadas obtenidas de ratas Sprague-Dawley macho adultas y ratones CD1 y nos hemos encontrado ratón en lugar de rodajas de cerebro de rata ofrecen el mejor compromiso entre tamaño, espesor y la conectividad intrínseca. En primer lugar, gracias a su menor tamaño, encajan el área de grabación pequeño de medidas disponibles en el mercado mejor (Figura 4A, izquierda: rata, derecha: ratón); en segundo lugar, son más resistentes a las condiciones desventajosas que es intrínseca a la grabación de MEA (CF. Introducción): aunque las descargas ictal como generan por estos dos tejidos (Figura 4B) son de duración similar ()Figura 4 izquierda), su tasa de ocurrencia es significativamente más corta en rebanadas de cerebro de ratón (n = 10 rebanadas especies; cola 2 impar t-test, p < 0.001; Figura 4 derecha). Este último permite acelerar los protocolos experimentales, lo que es posible probar un mayor número de sectores del cerebro durante un solo día experimental: para este conjunto de resultados representativos, hemos podido probar un número similar de rebanadas del cerebro de las dos especies (rata: n = 58; ratón: n = 52), pero el número de ratones (n = 18) era 2 más pequeño que el número de ratas (n = 42).

Por otra parte, rodajas de cerebro de ratón parecen que presentan conexiones más densas y por lo tanto tienen más probabilidades de responder mejor a la neuromodulación eléctrica sostenida (figura 4). Así, en este en vitro la modelo de ictogenesis, la viabilidad para el estímulo eléctrico para controlar la actividad ictal es significativamente mayor para el ratón que para el tejido cerebral de rata. Este aspecto también se refleja en la tasa de éxito significativamente mayor de estimulación experimentos llevados a cabo usando ratón versus rodajas de cerebro de rata incluso cuando persigue varios protocolos de estimulación sostenida ()figura 4E). De hecho, tejido de cerebro de ratón parece soportar mejor sostenida estimulación eléctrica según lo sugerido por la mayor tasa de supervivencia en el probado experimental-marco de tiempo de 4 h (figura 4F). Así, el tamaño más pequeño junto a la mejor conservación de la conectividad intrínseca hace rodajas de cerebro de ratón el mejor candidato para realizar grabación dirigida a estudiar las interacciones de red hipocampo circunvolución MEA y evaluar eléctrico protocolos de neuromodulación que son relevantes para TLE.

Estimulación periódica en el CA1/subiculum es conocida por controlar ictogenesis límbica en los tratados con 4AP hipocampo-CE rebanada preparación24,25,27, con 1 Hz como la frecuencia más eficaz27. Así, también es útil como control positivo para evaluar la eficacia y la eficiencia de otras políticas de Neuromodulación (véase por ejemplo25). Como se mencionó anteriormente, los impulsos eléctricos directamente a través del MEA (es decir, sin la necesidad de un electrodo de estimulación externa) pueden evocar las respuestas de la población en el tejido cerebral de roedor (ver también28). Suficiente preservación de conectividad de la red neuronal dentro de la rebanada del cerebro, colocación exacta de la rebanada del cerebro en el MEA y la adecuada selección de pares de electrodos estimulantes permiten perseguir neuromodulación eléctrica experimentos que controlar ictogenesis. Como se muestra en la figura 5A, es posible reproducir la canónica 1 Hz protocolo usando MEAs planares como una grabación y un dispositivo estimulante, con la ventaja que el efecto de la estimulación eléctrica puede visualizarse a través de la estimulación periódica del sección de tejido cerebral con un mayor número de puntos de observación espaciados igualmente en comparación con la grabación de potenciales de campo convencionales. La figura 5B muestra la cuantificación de los resultados obtenidos para n = 9 rebanadas de cerebro, lo que indica una reducción significativa del total agarrar el tiempo (tiempo de duración/observación actividad ictal total25) durante el estímulo (una manera-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0.01, prueba de post hoc LSD de Fisher, protegido). Los resultados son consistentes con la literatura para electrodos estimulantes externos24,25.

Para calcular el total que agarra a tiempo, el tiempo de observación depende el intervalo entre los acontecimientos ictales, y también determina la duración mínima del Protocolo de estimulación necesaria para evaluar con confianza los efectos de la neuromodulación. Nos encontramos con que la grabación de al menos 4 descargas ictal (y por lo tanto, al menos 3 intervalos entre acontecimientos ictales) es un buen compromiso entre muestras colectadas y colección requiere tiempo. En la condición de control (es decir, sin estimulación), el tiempo de observación es el desfase entre el inicio del primer evento ictal medido y la terminación de la última. Durante la neuromodulación, el tiempo de observación es igual a la duración del Protocolo de estímulo, puesto que el objetivo de la medición debe cuantificar los fenómenos que ocurren durante todo el tiempo que la perturbación se introduce en el sistema. Computación y comparando el total agarrar el tiempo en lugar de la duración y el intervalo de acontecimientos ictales son el parámetro más adecuado para evitar el tipo error II. De hecho, junto con la supresión completa de la actividad ictal, también es posible que sólo uno se genera el evento ictal durante la estimulación eléctrica frente a los varios acontecimientos observados en la condición control. En este caso, considerando que no es posible medir el intervalo entre eventos, duración ictal como un estimador de la eficacia de la estimulación de la medición no representa el resultado real de Neuromodulación (es decir, reducción de la actividad ictal).

En general, los resultados presentados aquí indican que rodajas de cerebro de ratón acoplados a MEAs son herramientas valiosas para la investigación de la epilepsia y para realizar estudios de neuromodulación confiable que son relevantes para avanzar en el campo de la DBS para el tratamiento de la epilepsia. Además, el protocolo descrito aquí mejora la viabilidad de rebanada del cerebro y permite perseguir sesiones experimentales durante varias horas (figura 6), que se requiera, por ejemplo, para comparar los efectos de la estimulación eléctrica de diversa paradigmas.

Figure 3
Figura 3 : Patrón epileptiforme típica inducida por 4AP visualizada con la medidas planar (A) ratón cerebro corte colocado sobre un plano MEA 6 x 10 (espaciamiento de electrodo: 500 μm) y Resumen de side-by-side del patrón epileptiforme inducida por 4AP visualizado con grabación de MEA. Cada cuadrado de la cuadrícula acomoda la actividad registrada en el lugar correspondiente dentro de la rebanada del cerebro. Las líneas azules punteadas se refieren a las filas de electrodo para más claridad. El número de electrodos de registro se identifica en azul en la esquina superior izquierda de cada casilla. El gris cruzado cuadrado representa el electrodo de referencia. (B) los segmentos del rastro representante de CE y CA3 visualizado en una escala de tiempo más rápida. Puntas de flecha indican acontecimientos ictales. En el rastro de la CE es posible apreciar la aparición de lento descargas interictales (negras de la barra), mientras que el subcampo CA3 genera el patrón típico fastinterictal sostenida (barra negra). (C) amplió la grabación de una descarga ictal muestra el típico patrón tónico-clónicas. (D) visualización rápida escala de transición pre-ictal-a-ictal correspondiente a la EC (rojo) y CA3 (negro) traza segmentos marcados por la barra roja en (B). La flecha indica el inicio de la descarga ictal. Las huellas superpuestas destacan que el evento ictal se origina en la CE y posteriormente se propaga al subcampo CA3. (E) la vista ampliada de los períodos interictales marcada por las barras negras en (B) hace hincapié en la falta de correlación entre el lento y fastinterictal patrones generados por la CE (rojo) y CA3 (negro), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Rodajas de cerebro de ratón ofrecen una mayor salida experimental que rodajas de cerebro de rata. Cortar (A) cerebro de una rata (izquierda) y un ratón (derecha) de edades coincidentes. La rebanada del cerebro de rata es mucho mayor que el área de grabación de MEA y su actividad eléctrica no se pueden visualizar en su totalidad. (B) comparación visual directa de la actividad ictal recurrente generada por la corteza de enthorinal de ratón y rata (CE). (C) Rebanadas de cerebro de ratón y rata generan descargas ictal de duración similar, pero el intervalo entre estos eventos es el tejido de cerebro de rata en casi 2 veces. * p < 0.05. (D) en comparación con las ratas, ratones ofrecen un rendimiento superior 2 veces de rebanadas de cerebro viables para los experimentos de estimulación eléctrica para controlar ictogenesis. Estimulación eléctrica de la subículo podría evocar las respuestas de la población en las cortezas parahippocampal en solamente 20 de rebanadas de cerebro de ratón de cerebro de rata (34%) 58 láminas, frente a 33 de 52 (63%) (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0.05. (E) entre sectores viables, la tasa de éxito en el control de la actividad ictal es 2 veces con el ratón y rebanadas de cerebro de rata (ratón: 20 de 33 rebanadas de cerebro, 60%: rata: 6 de 20 rebanadas de cerebro, 30%; Chi2: 4.67; p = 0,03). p < 0.05. Ratón (F) rebanadas de cerebro pueden soportar repetidas prolongadas épocas de constante estimulación eléctrica (las áreas sombreadas de gris). Sobre el retiro del estímulo, tejido de cerebro de ratón presenta recuperación completa del patrón epileptiforme, considerando que la viabilidad de tejido de cerebro de rata cae drásticamente a 3 h. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Experimento representativo de modulación eléctrica de ictogenesis con rebanadas de cerebro junto a medidas (A) grabaciones de actividad ictal inducida por 4AP en las CE y PC durante la condición de control (sin estimulación), periódica (PP) la estimulación a 1 Hz (artefacto de estímulo se trunca) y durante la recuperación sobre el retiro del estímulo. (B) cuantificación del efecto de PP a 1 Hz sobre el total de agarrar el tiempo. p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Registro a largo plazo representativa de actividad ictal inducida por 4AP. (A) traza segmentos grabado 8 h después del cerebro rebanado procedimiento y siguiente 2 h de 4AP aplicación. Ampliado (B) trazar segmentos correspondientes a las descargas ictales en caja identificadas por la Letras a, by c en el panel (A) Mostrar la consistencia de la actividad ictal generado a lo largo de la prolongada observación tiempo-viuda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Un stock Producto químico Peso molecular Concentración (mM)
NaCl 58.44 1150
Solvente: agua destilada KCl 74.55 20
Concentrado: 10 x  KH2PO4 136.1 12.5
Temperatura de almacenamiento: 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147.02 20
Tiempo de almacenaje máximo: 1 semana D-glucosa 180.2 250
Nota: filtrar usando un filtro de membrana de 50 mm
Stock B Producto químico Peso molecular Concentración (mM)
NaHCO3 84.01 260
Solvente: agua destilada
Concentrado: 10 x 
Temperatura de almacenamiento: 4 ° C
Tiempo de almacenaje máximo: 1 semana
Nota: filtrar usando un filtro de membrana de 50 mm
Acción C Producto químico Peso molecular Concentración (mM)
KCl 74.55 20
Solvente: agua destilada KH2PO4 136.1 12.5
Concentrado: 10 x MgCl2* 6 H2O 203.3 50
Temperatura de almacenamiento: 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246.47 20
Tiempo de almacenamiento máximo: 2 semanas CaCl2* 2 H2O 147.02 5
Nota: filtrar usando un filtro de membrana de 50 mm
Stock M Producto químico Peso molecular Concentración (mM)
MgSO4* 6 H2O 246.47 100
Solvente: agua destilada
Concentrado: 100 x
Temperatura de almacenamiento: 4 ° C
Tiempo de almacenaje máximo: 4 semanas
4AP stock Producto químico Peso molecular Concentración (mM)
4-aminopiridina 94.11 250
Solvente: agua destilada
Concentrado de: 1000 x
Temperatura de almacenamiento: 4 ° C
Tiempo de almacenamiento máximo: 2 semanas
Nota: vortex por 2-3 min o agitar durante 30-60 min.
Nota: PRECAUCIÓN! 4-AP es tóxica y cinvulsant. Utilizar guantes y evitar que se separa o se derrame.

Tabla 1: Soluciones de Stock.

SOSTENIENDO LA ACSF GRABACIÓN ACSF CORTE ACSF
Producto químico C [mM] Producto químico C [mM] Producto químico C [mM]
NaCl 115 NaCl 115 Sacarosa 208
KCl 2 KCl 2 KCl 2
KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25
MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5
CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2
D-glucosa 25 D-glucosa 25 CaCl2 0.5
NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-glucosa 10
Ácido L-ascórbico 1 Ácido L-ascórbico 1 NaHCO3 26
Ácido L-ascórbico 1
pH 7.4 pH 7.4 Ácido pirúvico 3
Osmolalidad de la 300 mOsm/Kg Osmolalidad de la 300 mOsm/Kg
pH 7.4
Osmolalidad de la 300 mOsm/Kg

Tabla 2: Composición de las soluciones.

Solución de problemas
TEMA CONTRAMEDIDAS
Las descargas ictal buscar 'cortado' Disminuyen la velocidad de perfusión o bajar el volumen de la ACSF por encima de la rebanada del cerebro mediante el ajuste de la posición de la aguja de aspiración.
Ninguna actividad ictal (1) Compruebe que CA3-conducido rápido interictales eventos no se propagan a la corteza. Utilice una hoja de bisturí pequeño (p. ej., n.10) o una aguja para romper los Collaterals de Schaffer si necesita ser, pero tenga cuidado de no cortar los hilos de rosca de nylon del ancla loncha sujeción. Un estéreo o microscopio vertical son los más adecuados, mientras que el microscopio invertido hace esta tarea muy difícil.
¿(2) Compruebe la viabilidad de la rebanada: fuerte estimulación eléctrica puede desencadenar la actividad ictal? Esperar aproximadamente 2 horas de aplicación 4AP, luego cambiar la rebanada del cerebro si no se produce actividad ictal.
La rebanada del cerebro que se mueve al colocar el anclaje de sujeción (1) quitar el ancla de la rebanada y vuelva a colocar la rebanada del cerebro.
(2) Compruebe que el ancla de la rebanada es uniformemente húmedo de 4AP ACSF.
(3) Retire la ACSF 4AP de la cámara de grabación a favor de la adhesión de rebanada del cerebro a la MEA.
(4) vuelva a colocar el anclaje de sujeción de la rebanada.
La rebanada del cerebro flota en el chip MEA después de ser trasladado (1) Aspire suavemente ACSF exceso con una pipeta Pasteur.
(2) chip la MEA deba ser volver a cubierto.
Estimulación eléctrica no provocan respuestas de red Aumentar la intensidad del estímulo, cambio pares de electrodos.
Estimulación eléctrica puede provocar respuestas de la población en las áreas corticales proximal sino distales no El tema es ikely debido a la mala conectividad o intensidad del estímulo insuficiente. Estimulación eléctrica puede ser eficaz o ineficaz en algunas áreas corticales sólo. Se recomienda cambiar la rebanada del cerebro.
Señal es ruidosa (1) Compruebe el electrodo de referencia: base ruidosa a veces puede ser causada por el llenado incompleto de la reserva de entrada tal que los electrodos de referencia no no totalmente en la ACSF.
(2) Verifique la puesta a tierra general del equipo.
(3) ajuste la posición de la aguja de aspiración para oír un sonido de succión constante y suave. Baja la aguja de aspiración.
(4) Limpie los contactos externos de la MEA con etanol utilizando un hisopo de algodón.
(5) puede dañar la viruta de la MEA: cambiar chip MEA y controlar artefactos y la relación señal a ruido.

Tabla 3: resolución de problemas.

Discussion

AMUMA es una valiosa herramienta para las investigaciones de Neurofisiología y ha alcanzado la madurez en los últimos años gracias a décadas de exploración y desarrollo. En comparación con la grabación de potenciales de campo convencionales, MEAs ofrecen la gran ventaja de un mayor número de puntos de observación y conocida distancia entre electrodo, que son cruciales para identificar con precisión las interacciones de la red neuronal.

La técnica de grabación MEA también se puede acoplar a otros métodos de electrofisiología, como abrazadera del remiendo grabación15, para investigar a la relación entre una neurona y actividad de la red neuronal. Por otra parte, la posibilidad de visualizar potenciales de campo y la actividad de varias unidades al mismo tiempo puede proporcionar penetraciones precioso en la correlación entre la actividad de pequeños grupos neuronales y redes neuronales colectivas. La combinación con colorantes sensibles al voltaje, proyección de imagen de calcio y optogenetics29 permite inferir fenómenos Neurofisiología mediante aproximaciones poliédricas. Además de los estudios farmacológicos, la posibilidad de realizar grabación y estímulo con el mismo sistema hace que la técnica de grabación MEA muy potente y versátil: por ejemplo, es posible estudiar los fenómenos de plasticidad sináptica en la base de memoria formación30, utilizando los protocolos de neuromodulación presentados aquí, que son relevantes para DBS para tratar la epilepsia y una amplia variedad de trastornos cerebrales. La prueba reciente de que la técnica de grabación MEA puede aplicarse con éxito al cerebro epiléptico humano tejido16 demuestra su utilidad invaluable en la investigación de la epilepsia, tanto para comprender los mecanismos básicos subyacentes a esta devastadora enfermedad y algoritmos DBS para mejorarlo de afinar.

Sin embargo, MEAs fuerza la búsqueda de los experimentos de electrofisiología bajo condiciones de 'limitar' para rebanadas de cerebro, debido a la exigencia de una cámara de grabación sumergida y la necesidad de dejar el cerebro rebana el resto sobre el sustrato sólido donde los micro-electrodos están integrados. Así, el tejido cerebral no puede recibir suministro de oxígeno adecuado, que a su vez puede afectar la calidad de las grabaciones.

El protocolo aquí descrito permite registrar confiablemente y estudio ictogenesis en las redes límbicas roedores juntadas a MEAs utilizando el modelo agudo 4AP in vitro y épocas prolongadas de la estimulación eléctrica, que proporcionan información relevante para la evaluación de las políticas DBS.

Estudios anteriores realizados sobre neuromodulación eléctrica de epilépticas límbicas redes basadas en el uso de la grabación de potenciales de campo convencional han utilizado rodajas de cerebro de ratón o rata con similares resultados24,25; pero el uso de tejido cerebral de rata resultó más difícil, razonablemente debido a la conexión más débil en comparación con el tejido cerebral de ratones7. Con respecto a la técnica MEA, rodajas de cerebro de ratón son los más adecuados en virtud de su tamaño más pequeño. Por otra parte, dada la mayor tasa de ocurrencia de descargas ictal como en ratón versus tejido cerebral de rata, es posible probar más rebanadas de cerebro a lo largo de un día experimental, que a su vez hace la recopilación de datos más rápida y eficaz, y puede reducir el número de animales utilizados.

Importancia con respecto a los métodos existentes:

Grabado con la cámara de medida descrita aquí las descargas ictal parecen ser similares en duración y la frecuencia de ocurrencia a los observados con la cámara convencional de anillo MEA y el mismo tipo MEA (micro-electrodos planares, CF. 17). Sin embargo, debe ser acentuado que grosor de corte de cerebro debe reducirse significativamente cuando la cámara de grabación redondo convencional junto con un ritmo de perfusión baja (1 mL/min), que puede dificultar a la búsqueda exitosa de neuromodulación experimentos debido a la pobre conectividad.

En este protocolo, una cámara de grabación personalizada bajo volumen inspirada en abrazadera del remiendo grabación cámara diseño ofrece flujo de laminar estable y confiable que es crucial para la búsqueda exitosa de grabaciones MEA; también permite aumentar el grosor de corte de cerebro a 400 μm para alcanzar un justo equilibrio entre la viabilidad del tejido y la conectividad intrínseca. De hecho se reconoce que flujo laminar de la solución de grabación dentro de la cámara es altamente deseable para la electrofisiología de la rebanada del cerebro, ya que no es afectado por temperatura, oxígeno, y gradientes de pH que se observan en el flujo circular redondo de grabación cámaras de19,20,31 (como unos provistos con MEA comercialmente disponible). Tales gradientes introducen sesgo experimental y también son perjudiciales para la rebanada del cerebro. Cámaras de la grabación de un volumen relativamente pequeño (~1.5 mL) junto con una perfusión alta frecuencia (5-6 mL/min)16,31 permitan intercambio adecuado del medio de perfusión (≥ 3 veces / min). La cámara de medida puede ser fácilmente obtenidas de fuentes comerciales a un precio asequible o producidas internamente utilizando tecnología de impresión 3D. Otros estudios han divulgado grabaciones de MEA de 400 μm de espesor cerebro humano rodajas16 utilizando la cámara convencional de anillo MEA, mientras mantiene el volumen de la ACSF a 1 mL y aplicar una tasa de alta perfusión (5-6 mL/min) con la ayuda de una bomba peristáltica bajo nivel de ruido. Sin embargo, los autores han utilizado un modelo diferente de ictogenesis, es decir, el bajo Mg2 +, que es probable que menos influencia que el modelo 4AP ephaptic mecanismos que implican un aumento significativo en la concentración extracelular de K+ 11 , 22. hemos encontrado que una tasa alta de perfusión no es deseable en el modelo 4AP, posiblemente debido al rápido lavado fuera de K extracelular acumulado+, que puede necesitar ser aumentado significativamente en la grabación de la ACSF16. De hecho, acontecimientos ictales aparecieron más 'troceadas' cuando la velocidad de perfusión ASCF fue aumentado a 2-3 mL/min y la rebanada del cerebro fue sumergida por una capa gruesa de la ACSF, considerando que la descargas completos exhibiendo robustos componentes tónico-clónicas podrían restaurarse el regreso a una menor tasa de perfusión (1 mL/min) y un diluyente ACSF capa derecha en el nivel superficial del tejido (datos no mostrados). La cámara de grabación personalizada se describe en este protocolo permite intercambiar el medio de perfusión 3 - 5 veces / min a un flujo de 1 mL/min. Así, el suministro de oxígeno global a las rebanadas de cerebro es mejorado fuertemente incluso en tasas de perfusión relativamente baja, mientras que todavía garantiza una estable temperatura y alto cociente signal-to-noise de la grabación. Lo más importante, es posible mantener la concentración extracelular de K+ a un valor fisiológico.

El modelo 4AP de ictogenesis no requiere ninguna modificación significativa de la composición iónica de la ACSF, tales como descenso Mg2 + o mayor K+y ofrece la ventaja de mantener intacta las transmisiones tanto excitatorias como inhibitorias 12, un aspecto muy relevante en la investigación de la epilepsia a la luz el papel crucial de glutamatérgicos y GABAérgicos redes de sincronización epileptiformes (CF. 7). La ACSF 4AP utilizado en este protocolo contiene una concentración fisiológica de K+ (3,25 mM) y Mg2 + concentración ligeramente inferior que la explotación ACSF (1 mM versus 1,3 mM). Esta concentración todavía cae dentro de los valores fisiológicos reportados de concentración de Mg2 + en el roedor CSF y se utiliza en muchos laboratorios (véase por ejemplo17,18). El propósito del protocolo descrito, hemos hallado que este leve descenso es preferido para ayudar en el efecto de 4AP.

En trabajos anteriores, 4AP se ha aplicado a la rebanada del cerebro cuando ya se coloca dentro de la cámara de grabación17,18. A menos que el experimentador debe observar la latencia tiempo entre la aplicación 4AP y la aparición de patrones epileptiformes, encontramos que este enfoque es algo lento y no es conveniente seguir la grabación prolongada y sesiones de estimulación se describe en este protocolo. Preincubación de las rebanadas de cerebro en 4AP a 32 ° C permite ahorrar tiempo tanto experimental, desde rebanadas de cerebro pueden ser previamente tratados en la serie mientras el experimento utilizando otras secciones de tejido.

La prolongada viabilidad de rebanadas de cerebro puede ser útil para analizar características de la red a largo plazo. Además, su resistencia mejorada a la estimulación eléctrica repetitiva es de gran ventaja si el experimentador desea comparar varios protocolos de estimulación, que deben realizarse en el mismo segmento de cerebro de robustez estadística. En nuestras manos, cuando se prueba 3 protocolos de estimulación, cada uno precedido por una fase de control y seguido por una fase de recuperación, el experimento puede durar 3-5 h. En este contexto, mapeo de MEA vivo es fundamental para activar la vía correcta y suprimir en lugar de favorecer ictogenesis mediante la estimulación eléctrica. Nuestra GUI fácil de usar representa una herramienta rápida, sencilla y flexible para los electrodos de las estructuras cerebrales diferentes. Contrario a software comercial, es posible añadir diseños personalizados de MEA incluso con habilidades de programación básicas. Imágenes pueden ser adquiridas en campo brillante; así, cualquier cámara de propósito general que tiene buena resolución y se ajusta en un microscopio es conveniente. Un microscopio invertido es esencial visualizar la posición de microelectrodos en relación con la rebanada del cerebro, ya que estos se oculta debajo el tejido si se utiliza un microscopio vertical. Sin embargo, un estéreo microscopio se recomienda además del tipo invertido si el experimentador necesita realizar cortes de cuchillo para interrumpir las vías neuronales específicas.

Por último, otra ventaja del enfoque propuesto es el montaje barato y relativamente fácil de la mayoría de las herramientas necesarias, como la cámara de grabación personalizada y las cámaras de explotación, el baño caliente y el anclaje del sector, así como el uso innecesario de un costoso bomba peristáltica de bajo nivel de ruido.

Limitaciones de la técnica:

Grabación de MEA no permite visualizar las ondas muy lentas, es decir, cambios de DC en la señal. Tales desviaciones de la línea de base pueden ayudar asintótica medición de duración de la descarga ictal y, más importante, son fundamentales para el estudio de la depresión que se separa cortical (un fenómeno que se relaciona con muerte súbita inesperada en epilepsia32 y es compartida entre epilepsia y migraña33).

Con respecto a la neuromodulación eléctrica, el protocolo descrito aquí permite la realización de varias sesiones de estimulación sin afectar la viabilidad del segmento de cerebro. Con éxito podríamos realizar hasta 3 sesiones de estimulación de 20-45 min, similar a lo reportado en el anterior trabajo25. Aunque probablemente, rebanadas de cerebro pueden soportar un mayor número de sesiones de estimulación o más protocolos de estimulación, no probamos rebanadas de cerebro en este sentido. Se recomienda limitar el número de protocolos de estimulación a 3 y evitar prolongadas sesiones de estimulación (≥60 minutos), que pueden tensionar mucho tejido cerebral mantenido bajo estas condiciones de límite, hasta la falta de recuperación sobre el retiro del estímulo.

Pasos críticos dentro del Protocolo:

Varios factores críticos pueden dificultar la búsqueda acertada de la grabación y la modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro juntada a MEA. Además de los roedores utilizados y la calidad de los cortes de cerebro, la tasa de perfusión durante la grabación y la dinámica del flujo ACSF (es decir., laminar versus circular) dentro de la cámara de grabación, hemos encontrado que las condiciones de recuperación y mantenimiento a largo plazo de las rebanadas de cerebro, así como el modo de aplicación 4AP son los pasos más críticos.

Cuando se utiliza una cámara espaciadora sumergida es crucial a guardar las rebanadas de cerebro a temperatura ambiente para preservar la actividad de red de tejido cerebral y favorecer la inducción de las descargas ictal como 4AP aplicación. En nuestras manos, recuperación y mantenimiento a 32 ° C deterioraron el tejido de cerebro dentro de 3-4 h de corte.

Incubación del cerebro rebana en 4AP ACSF a temperatura ambiente y grabación a 32 ° C, sin embargo, no deseable. Hemos encontrado muchas dificultades en la observación de descargas ictal recurrentes robustas en esta condición. De hecho, las bajas temperaturas en el rango de 20 – 24 ° C se han divulgado para humedecer o incluso prevenir ictogenesis 4AP-inducida ambos in vitro34 y en vivo35. Así, las temperaturas de incubación y grabación de 4AP deben caer dentro de los 30-34 ° C y deben coincidir. Para evitar poner el tejido cerebral bajo demasiado estrés debido a la inducción simultánea de hiperexcitabilidad por 4AP y la súbita exposición de rebanadas del cerebro de la temperatura ambiente a la tibia (32 ° C) 4AP-ACSF, es fundamental realizar un previo calentamiento intermedio paso y deje que las rebanadas de cerebro habituarse en la explotación ACSF a 32 º C durante 20-30 min saltando este paso pueden afectar la inducción de ictogenesis por 4AP.

Otro aspecto que debe mencionarse es la importancia de la concentración de d-glucosa en la ACSF después de rebanar. Una concentración de 25 mM conserva las rebanadas de cerebro mejores que la concentración de 10 mM utilizada en muchos laboratorios y también mejora la tasa de ocurrencia de la actividad ictal, que es 2 veces más rápido (por lo tanto, haciendo más fácil seguir una larga serie de experimental protocolos en varias rebanadas de cerebro cada día).

Por último, algunos detalles importantes durante el procedimiento de corte necesitan ser mencionado. En primer lugar, no permitir que el cerebro intacto y las rebanadas de cerebro para congelar en el frío corte ACSF. Enfriar el cerebro para < 2 min es suficiente Dado el pequeño tamaño del cerebro del ratón. Las secciones de tejido deben ser transferidas inmediatamente de la bandeja del buffer a los vasos enjuague a temperatura ambiente. Aclara la corte ACSF es muy importante, de lo contrario la concentración de sacarosa alta hará que el cerebro rebanadas se adhieren a la malla de nylon de la cámara de retención. Para enjuagar eficazmente el tejido, es importante minimizar el contenido de la ACSF de corte dentro de la pipeta para no contaminar la celebración ACSF excesivamente. El enjuague de 2 etapas ayuda a minimizar la contaminación. Al finalizar el procedimiento de corte, cortes de tejido deben transferirse inmediatamente de los vasos enjuague a la cámara de retención, donde el suave nylon de malla suspendida a medio camino en la explotación ACSF permite la oxigenación del tejido en ambos lados. El mismo principio debe aplicarse en todas las etapas siguiendo el procedimiento de corte: rodajas de cerebro nunca deben sentarse en la parte inferior del vaso, no deben estar en contacto con los lados de las cámaras de explotación, y nunca estén en contacto entre sí ni se superponen.

Modificaciones y resolución de problemas:

Composición de la ACSF podrá modificarse según las necesidades del experimentador. Por ejemplo, pueden agregarse medicamentos a diseccionar la contribución de determinados neurotransmisores o canales del ion para la eficacia de la neuromodulación eléctrica. Por otra parte, pirúvico y el ácido ascórbico (CF. tabla 2) pueden ser omitidos, aunque encontramos que ejercen un papel neuroprotector potente. Se presenta en la tabla 3 los problemas más comunes que se encuentran en este protocolo y cómo lidiar con ellos.

CONCLUSIONES:

Grabación de la MEA es sin duda una técnica inestimable para abordar las interacciones de redes neuronales en salud y enfermedad. Además de los estudios farmacológicos, también es posible evaluar protocolos de neuromodulación eléctrica que son relevantes para DBS aplicada a la epilepsia y otros desórdenes neurológicos. En este protocolo, hemos demostrado que es posible reproducir los experimentos de estimulación periódica típica con resultados similares a los obtenidos con la grabación de potenciales de campo extracelular convencional y estimulación de electrodos externos. La creciente disponibilidad de equipamiento comercial fácil de usar y herramientas de software avanzadas realizar la técnica de grabación MEA también conveniente para los experimentos de estimulación de circuito cerrado, que estimulará ad hoc para el tejido cerebral y investigar la contribución de los mecanismos de retroalimentación a las respuestas de la red neuronal.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

G.P. es Marie Skłodowska-Curie Fellow financiado por el proyecto de Unión Europea MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, bajo el programa marco del H2020. El mapMEA GUI está disponible gratuitamente bajo petición al autor ilaria.colombi@iit.it.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine  Sigma-Adrich P7886 Needed for MEA coating
NaCl Sigma-Adrich S9888 Chemical
KCl Sigma-Adrich P9541 Chemical
KH2PO4 Sigma-Adrich 795488 Chemical
CaCl2*2 H2O Sigma-Adrich C3306 Chemical
D-Glucose Sigma-Adrich RDD016 Chemical
NaHCO3 Sigma-Adrich S5761 Chemical
MgCl2*6 H2O Sigma-Adrich M2670 Chemical
MgSO4*6 H2O Sigma-Adrich M5921 Chemical
Sucrose Sigma-Adrich RDD023 Chemical
Pyruvic Acid, 98%  Sigma-Adrich 107360 Chemical
4-aminopyridine Sigma-Adrich A78403 Convulsant drug
STG-2004 Multichannel System STG4004-1.6mA 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060 Multichannel System N/A MEA amplifier
planar MEA Multichannel System 60MEA500/30iR-Ti w/o ring Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack Multichannel System Recording software
McStimulus II Multichannel System STG4004 control software
TC02 Multichannel System TC02 2-channel thermostat
PH01 Multichannel System PH01 Heating perfusion canula
MPH  Multichannel System MPH  Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43 Wacker E43 Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber Crisel Instrument SKE-chamber MEA Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm  Crisel Instrument 64-1309 Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme Sigma-Adrich Z273287-1EA Enzymatic cleaner
MATLAB The Mathworks Programming environment for electrodemapping
VT1000S Leica Biosystems VT1000S Vibratome
Warner Instruments 64-1309 Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

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Neurociencia número 135 epilepsia 4-aminopiridina rebanada del cerebro ratón matriz micropozo-microcanal neuromodulación
Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos
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Panuccio, G., Colombi, I.,… More

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

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