Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Inspelning och modulering av Epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor kopplat till mikroelektrod matriser

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57548

Summary

Vi illustrerar hur du utför inspelningen och elektriska modulering av 4-aminopyridin-inducerad epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor med mikroelektrod matriser. En anpassad inspelning kammare upprätthåller vävnad livskraft i hela långvarig experimentella sessioner. Bor elektrod kartläggning och urval av stimulerande par utförs av ett anpassat grafiskt användargränssnitt.

Abstract

Tinningloben epilepsi (TLE) är det vanligaste partiella komplexa epileptiska syndromet och den minst följsamma till mediciner. Djup hjärnstimulering (DBS) är en lovande strategi när farmakologisk behandling misslyckas eller neurokirurgi rekommenderas inte. Akut hjärnskada skivor kopplat till mikroelektrod matriser (MEAs) utgör ett värdefullt verktyg att studera neuronala nätverk interaktioner och deras modulering av elektrisk stimulering. Jämfört med konventionella extracellulära inspelning tekniker ger de de extra fördelarna med ett större antal observationspunkter och kända mellan elektrod avstånd, vilka studerar förökning sökvägen och hastigheten av Elektrofysiologisk signaler. Dock försämras vävnad syresättningen kraftigt under MEA inspelning, som kräver en hög perfusion hastighet, vilket sker på bekostnad av minskad signal-brus-förhållande och högre svängningar i experimentell temperaturen. Elektrisk stimulering ytterligare betonar hjärnvävnad, vilket gör det svårt att bedriva långvarig inspelning/stimulering epoker. Dessutom måste elektriska modulering av hjärnans slice aktivitet att rikta specifika strukturer/vägar inom hjärnan slice, som kräver att elektroden kartläggning vara enkelt och snabbt framförd live under experimentet. Här, vi visar hur du utför inspelningen och elektriska moduleringen av 4-aminopyridin (4AP)-inducerad epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor med planar MEAs. Vi visar att hjärnvävnaden erhållits från möss överträffar råtta hjärnvävnad och därmed är bättre lämpad för MEA experiment. Detta protokoll garanterar generering och underhåll av en stabil epileptiform mönster som troget återger de elektrofysiologiska funktioner som observerats med konventionella fält potentiella inspelning, kvarstår i flera timmar och outlasts ihållande elektrisk stimulering för långvarig epoker. Vävnaden livskraft i hela experimentet uppnås tack vare användningen av en små volymer anpassad inspelning kammare ger laminär och snabb lösning exchange även vid låg (1 mL/min) för perfusion priser. Snabb MEA mappning för realtidsövervakning och urval av stimulerande elektroder utförs av ett anpassat grafiskt användargränssnitt (GUI).

Introduction

Epilepsi är en livshotande progressiv sjukdom som orsakar okontrollerad aktivitet i hjärnan1. Det bär bland de högsta bördan av sjukdom och betydande sociala stigmat2,3. TLE är det vanligaste syndromet (40%) och mest ofta (~ 30%) resistenta mot antiepileptiska mediciner4. Medan Kirurgisk ablation av epileptogena vävnad kan lindra patientens tillstånd, det är inte möjligt i alla patienter och kan inte garantera en helt anfallsfria liv5. Modulering av epileptiska limbiska nätverk av elektriska DBS är en lovande strategi när farmakologisk behandling eller neurokirurgi inte är lämpliga.

Gnagare hjärnan skivor är ett värdefullt verktyg för att studera hur neuronala nätverk funktion i hälsa och sjukdom6 genom in vitro- elektrofysiologi tekniker, som de bevara, åtminstone i en del, den ursprungliga arkitekturen och anslutning av hjärnan regioner av intresse (ROI). I synnerhet horisontella kombinerade hippocampus-entorhinal cortex (hippocampus-EG) skivor omfatta de väsentliga neuronala nätverk involverade i TLE och används därför rutinmässigt i in vitro- TLE forskning7.

Beslag-liknande aktivitet kan induceras akut i hjärnan skivor genom att ändra den joniska sammansättningen av den konstgjorda cerebrospinalvätskan (ACSF), som minskar magnesium samtidigt öka kalium8,9,10, eller med hjälp av farmakologiska manipulationer, till exempel blockera hämmande GABAergic aktivitet (se11 för en omfattande översyn). Dessa modeller bygger dock på obalanserad förändringen av excitation och hämning; de tillåter således inte studera samspelet och samordnade bidrag av retande och hämmande nät till ictogenesis. Kontinuerlig genomblödning av hjärnan skivor med den konvulsiva drog 4AP förbättrar både retande och hämmande neurotransmissionen, vilket möjliggör för att studera akut ictogenesis samtidigt hålla synaptisk aktivitet övergripande intakt12.

MEAs tillåter inspelning av den elektriska aktiviteten som genereras av neuronala nätverk från ett större antal observationspunkter jämfört med konventionella extracellulära fält potentiella inspelning, där rumsliga begränsningar begränsa antalet elektroder som kan vara bo på hjärnan slice ytan. Dessutom MEA marker erbjuder fördelen av kända mellan elektrod avstånd, vilket är mycket användbart för att spåra förökning och bedöma resor hastigheten av inspelade signaler. Även ursprungligen tänkt för inspelning från odlade nervceller13,14, används MEAs nu också för att karakterisera de elektrofysiologiska funktionerna av akut hjärnskada skivor från gnagare15 och människor16. Sålunda, i samband med epilepsi forskning, MEAs representerar ett värdefullt verktyg att lokalisera neuronala nätverk interaktioner kärnan ictogenesis16,17,18.

Dock bär MEA inspelning inneboende tekniska utmaningar i att erhålla eller bibehålla en stabil epileptiform mönster i hela lång (flera timmar) experimentella protokoll. Först, vävnad syresättning kan inte vara tillräckligt inom de stora och runda nedsänkt-typ inspelning kammare19,20 typiska för kommersiellt tillgängliga åtgärder, medan dålig signal-brus-förhållande och temperatur instabilitet kan påverka kvaliteten på inspelningen när en hög perfusion hastighet (6-10 mL/min) används för att förbättra syretillförseln till hjärnan slice (se till exempel de tekniska noteringarna på värme och perfusion utrustning21). Andra, återkommande urladdningar med hög frekvens komponenter, såsom epileptiform utsläpp, observeras knappast när du använder nedsänkt-typ inspelning chambers19; Detta är särskilt fallet när akut epileptiform mönstret är kemiskt inducerad och involverar ephaptic mekanismer, som det är fallet för den 4AP modell22 (se11 för en omfattande översikt). För att övervinna dessa begränsningar, har flera strategier föreslagits av forskare. Exempelvis är öka perfusionen kurs19,20 samtidigt minska hjärnan slice tjocklek (≤300 µM) och området17,18 avgörande faktorer för att uppnå tillräcklig syretillförsel till vävnaden. Dessutom kan förbättrad hjärnan slice livskraft också utföras med hjälp perforerade MEAs (pMEAs), som tillåter startas hjärnvävnad från båda sidor18.

Medan de beskrivna metoderna har avsevärt förbättrat genomförbarheten av MEA inspelning från hjärnan skivor, de har inte testats mot långvarig (flera timmar) inspelning och elektrisk stimulering sessioner, den senare representerar en betydande stress för hjärnvävnaden. Långvarig inspelning sessioner kan krävas att studera utvecklingen i tid till epileptiform mönster som inte vore möjligt att avslöja särdrag av kortsiktiga mätningar. I samband med DBS forskning, kan långvarig experimentella protokoll krävas för att utvärdera och jämföra effekterna av flera stimulering paradigm i samma hjärnan segment.

När bara spontana elektriska aktivitet behöver registreras, kartläggning av elektroderna med avseende på ROI görs vanligen a posteriori, dvsunder dataanalys; studien av evoked Svaren eller elektriska neuromodulation paradigm kräver istället att stimulering levereras till specifika ROI(s), dikterar behovet av snabb och enkel live elektrod kartläggning under experimentet.

Här, illustrera vi ett enkelt experimentella protokoll som möjliggör för induktion och underhåll av en stabil 4AP-inducerad epileptiform mönster i vuxna gnagare hjärnan skivor. Observerade aktiviteten återger troget elektrofysiologiska funktioner i denna modell som kännetecknas med konventionella extracellulära elektrofysiologi tekniker. Det kvarstår i flera timmar och outlasts ihållande elektrisk stimulering för upprepad långvarig epoker. Kamrarna används för att upprätthålla och inkubera hjärnan skivor kan enkelt monteras med hjälp av standard laboratorium leveranser (figur 1A), medan en anpassad inspelning kammare möjliggör optimal lösning växelkurs och laminärt flöde (figur 1B) kan erhållas från kommersiella källor eller med 3D tryckteknik till ett överkomligt pris. Snabb kartläggning av ROI(s) för realtidsövervakning och för val av stimulerande elektroder görs möjligt genom en anpassad användarvänligt GUI som heter mapMEA, fritt tillgänglig på begäran.

Figure 1
Figur 1: anpassad utrustning för detta protokoll. (A) anläggningen kammare för återställning, före uppvärmningen och före inkubering i 4AP monteras med hjälp av en bägare och en petriskål. Petriskål bör vara mindre i diameter än brytaren och hålls på plats med hjälp av en sprutkolven. Botten av petriskål ersätts av en nylon mesh (från mjuka strumpor) limmade med cyanoakrylat på kanten av petriskål. Syre levereras via en böjd spinal nål (22 G), införas mellan väggarna i petriskål och bägaren. Bubblorna bör framväxande från sidan av bägaren och aldrig nå den nylon mesh att undvika hjärnan slice förskjutning. Upp i en petriskål kan användas som lock för att undvika ACSF avdunstning och underhålla syremättnad. (B) anpassad inspelning kammare. i: inlopp reservoar att rymma värme kanylen och referenselektroden. ut: outlet reservoar att rymma sug nålen. REC: inspelning kammare. (C) glas Pasteur pipett, kröp genom brand-polering, används för att hantera vävnaden och justerar dess position inom inspelning kammaren. (D) anpassade segment hold-down ankare. (E) slutmontering av inspelning kammaren monterade på MEA chip. Lite hjärna vilar på botten hålls på plats av ankaret. Den röda pilen visar PTFE-slangen som omfattar uppvärmning kanylen, medan den röda cirkeln visar referenselektroden, en mättad KCl pellet begravda ACSF i reservoaren inlopp. Den blå pilen visar sug nålen i reservoaren utlopp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av det italienska hälsoministeriet (auktorisering n. 860/2015-PR) i enlighet med EU-direktiv 2010/63/EG om djurskydd.

1. beredning av MEA/anpassad kammare församlingen

Obs: Starta 2 dagar innan experimentet. Använda en MEA utan en ring (se Material tabell).

  1. Rengöra MEA (varaktighet: 35-40 min).
    1. Lös en enzymatisk renare pulver till varmt destillerat vatten. Borsta den varma rengöring lösning på MEA ytan sedan tränga MEA in den varma rengöringslösning för minst 3 h.
    2. Skölj MEA noggrant med destillerat vatten och torka den med en luddfri nr scratch vävnad.
  2. Montera MEA med inspelning kammare (längd: 10 min + övernattning).
    1. Jämnt fördelade elastomeriska tätningsmedlet på bottenytan av inspelning kammaren. Kontrollera att det finns inga bubblor.
    2. Montera inspelning kammaren på MEA med hjälp av pincett och mild tryck. Om det finns eventuella bubblor, något flytta kammaren i en cirkel samtidigt ansöker lätt tryck med fingrarna tills alla bubblor försvunnit. Sprida ett tätningsmedel lager hela vägen runt den yttre gränsen av inspelning kammaren.
      Obs: kritiska! Täck inte MEA kontakterna med tätningsmedel.
    3. Placera den MEA/chamber församlingen inuti en 15 cm petriskål. Plats en 5 mL petriskål eller en 10 mL-bägare fylld med destillerat vatten nära MEA. Täck allt för att upprätthålla en fuktig miljö. Låt botemedel i rumstemperatur över natten.
      Obs: Protokollet kan pausas här.
  3. Coat MEA för att göra det hydrofila (varaktighet: 5-10 min + övernattning).
    1. Placera MEA i en 15 cm petriskål. Häll 50 µL av poly-D-lysin på området MEA inspelning. Stäng petriskål, försegla det med tätning film och lagra över natten vid 4 ° C.
    2. Skölj MEA noggrant med destillerat vatten och lagra MEA vid 4 ° C i destillerat vatten.
      Obs: Protokollet kan pausas här. Belagda MEAs kan lagras och återanvändas för flera experiment. Rutinmässigt rengöring och åter beläggning MEA hjälper till att avlägsna vävnad skräp och förbättra signal-brus-förhållande.

2. beredning av stamlösningar

Obs: Starta 1 dag innan experimentet (varaktighet: ~ 2 h). Stamlösningar hjälpa påskynda experimentet den experimentella dagen. De kan vara beredda i förväg och lagras. Se tabell 1 för koncentrationsfaktor och sammansättning. Se tabell 2 för sammansättningen av slutliga lösningar.

  1. Lös upp kemikalierna i destillerat vatten vid rumstemperatur. Filtrera de Lagerföra lösningarna med filter flaska (filter diameter: 0,22 µm).
  2. Förvaras vid 4 ° C (se tabell 1 för rekommenderade maximala lagringstid).
    Obs: Protokollet kan pausas här.

3. beredning av Agar

Obs: Starta 1 dag innan experimentet (varaktighet: ~ 1 h).

  1. Häll 250 mL destillerat vatten i en 500 mL-glasbägare och börja omrörning vid 350 rpm. Tillsätt 5 g agar och vänta tills det är helt upplöst.
  2. Värm lösningen på 250-300 ° C. Låt vattnet avdunsta tills lösningen är ~ 200 mL ge en 2,5% w/v agar lösning.
    Obs: Temperaturen bör vara tillräckligt hög för att låta vattnet avdunsta utan bubblar.
  3. Häll över agar lösningen till en 200 mL fyrkantig plastlåda av ~1.5 cm höga väggar och låt den svalna i rumstemperatur tills den blir fast.
  4. Täcka rutan och förvara den vid 4 ° C. Agar blocket är bra i flera veckor.
    Obs: Protokollet kan pausas här.

4. beredning av Frozen planet

Obs: Börja 1 dag innan experimentet.

  1. Fyll en platt botten rostfritt stål skål med destillerat vatten upp till 0,5 - 1 cm under kanten.
  2. Förvaras vid-20 ° C över natten.

5. beredning av nervskyddande skära ACSF

Obs: Starta 1 dag innan experimentet eller samma dag av experiment (se tabell 1 och tabell 2) (varaktighet: 30 min).

  1. Häll 200 mL destillerat vatten i en 500 mL-bägare och börja omrörning med en magnetomrörare på 350 rpm.
  2. Tillsätt 50 mL lager B och 50 mL lager C (se tabell 1).
  3. Lägga till 3 mM pyrodruvsyra, 208 mM sackaros, 10 mM D-glukos och 1 mM L-ascorbic syra.
    Obs: Den faktiska volymen pyrodruvsyra beror på täthet och renhet och kan variera till batchen. Alltid beräkna volym krävs när du öppnar en ny batch.
  4. Täck med tätande film och låt rör om 30 minuter.
  5. Överför lösningen till en 500 mL mätkolv och Tillsätt destillerat vatten för att fylla kolven.
  6. Tillslut mätkolven med tätande film och vänd försiktigt 3 - 5 gånger tills lösningen är jämnt klar.
  7. Överföra styckning ACSF i en glasflaska med lock.
  8. Lagra styckning ACSF vid-80 ° C i 20-30 min eller vid 4 ° C över natten för att kyla ned till 4 ° C.
    Obs: Protokollet kan pausas här om natten kyla är att föredra. Tid som annars krävs kylning styckning ACSF kan användas till att driva steg 6.

6. beredning av jordbruksföretaget ACSF

Obs: Förbereda lösning färska på dagen för experimentet (varaktighet: 5-10 min). Jordbruksföretaget ACSF används för att skölja hjärnan skivor från tillskärning ACSF under förfarandet för skivning (se steg 8.16) och för hjärnan slice långsiktig lagring och före uppvärmningen. För att skölja hjärnan skivor, räcker 100 mL holding ACSF. Holdingbolag och före uppvärmningen kamrarna används i detta protokoll är skräddarsydda och innehåller en volym 300 mL och 100 mL, respektive (jfr figur 1A). Med denna inställning räcker 500 mL holding ACSF . Chambers som erhållits från kommersiella källor kan innehålla en annan volym, i vilket fall det totala beloppet för holding ACSF förberedas bör justeras.

  1. Häll 200 mL destillerat vatten i en 500 mL-mätkolv.
  2. Tillsätt 50 mL lager A, 50 mL lager B, 6,5 mL lager M och 1 mM L-Askorbinsyra. Skaka försiktigt med roterande rörelser tills L-askorbinsyra är helt upplöst.
  3. Tillsätt destillerat vatten att nå den slutliga volymen, försegla mätkolven med tätning film och vänd försiktigt 3 - 5 gånger tills lösningen är jämnt klar. Se tabell 2 för jordbruksföretaget ACSF sammansättning.

7. förberedelse av de experimentella bänkarna

Obs: Detta kräver 15 min, plus 30 min att få en jämn temperatur av varma bad.

  1. Inspelning bänk
    1. Starta det varma badet, sätta den till 32 ° C och täcka det för att behålla dess temperatur.
      Obs: Det varma badet som används i detta protokoll kan vara skräddarsydda använder en hård plastlåda och akvarium termostat förinställd på önskad temperatur. Stadig önskad temperatur kan nås på ~ 30 min start från rumstemperatur. Eftersom pre värmande och ruvande kamrarna sitta längst ned i rutan plast, bör vattennivån vara precis tillräckligt för att täcka termostaten så att hålla avdelningar från flytande.
    2. Montera anläggningen och före uppvärmningen kamrarna (jfr figur 1A), och häll jordbruksföretaget ACSF i dem. Hålla innehav kammaren vid rumstemperatur och placera den före uppvärmningen kammaren inuti varma badet. Starta bubblande lösningarna med 95% O2/5% CO2 gasblandningen och ta bort eventuella fångade bubblor med hjälp av en inverterad Pasteur-pipett. Hålla täckt.
  2. Skivning bänk och vibratome
    1. Limma en liten agar block på mitten av Preparatskivan med cyanoakrylat lim.
    2. Sätta en 250 mL bägare i en ishink och häll skära ACSF i den.
    3. Ta två 100 mL-bägare och häll 50 mL holding ACSF i varje. Lämna bägarna i rumstemperatur. Dessa är de skölja bägarna.
    4. Starta bubblande lösningar med en 95% O2/5% CO2 gasblandning.
    5. Montera buffertbrickan på vibratome och omge det med krossad is. Häll lite etanol på krossad is till stöd i att upprätthålla kalla temperaturer under förfarandet för skivning. Efter hälla etanol, lägga till mer is som behövs.
      Obs: En temperatur på 2 ° C är optimalt.
    6. Placera bubbelflaskan inuti buffertbrickan, sedan montera och montera vibratome blade blocket.
      Obs: Kontrollera att klingan är monterad på släppningsvinkel ~ 10 °.
    7. Lägg krossad is i en 500 mL-glasbägare till 2/3 av volymen och fyll på destillerat vatten.
    8. Ta frysta bunken ur frysen, placera den uppochned på bänken skivning och täcka den med en pappershandduk och en filterpapper skiva.
  3. Anestesi bänk
    1. Placera en liten skål i en is-fyllda fack och häll skära ACSF i den. Starta bubblande med en 95% O2/5% CO2 gasblandning.

8. hjärnan Slice förberedelser och underhåll

Obs: Detta protokoll använder sig av vuxen (4 - 6 veckor gamla) CD1 hanmöss, men andra stammar (t.ex., c57/bl617,18) kan användas. Vi jämför också senare experimentella utdata erhållits med musen hjärnan skivor med som framkommit genom hjärnan skivor från manliga Sprague-Dawley-råttor i samma ålder. Följande steg avser utarbetandet av delvis frikopplad hjärnan skivor där CA3-driven snabb interictal-liknande aktivitet hindras att hippocampus korrekt och inte sprids till de parahippocampal cortices, som beskrivs i23. Hippocampus-cortex urkoppling är en förutsättning för att driva elektriska modulering studier med hippocampus-EG hjärnan slice beredning. Den vibratome som används refererar till modellen i Material tabell. Andra modeller kan kräva ett annat förfarande.

  1. Söva gnagare med isofluran 5% i ett carbogen gas blandningen levereras till en anestesi induktion kammare på 2 L/min.
  2. Under djup anestesi (inga reflexer i svar till foten och tassar nypa), extrahera hjärnan inom 1 min efter standardiserade förfaranden som i23. Placera hjärnan i liten skål innehållande skakad iskall skärande ACSF och låt chill för 90-120 s.
    Obs: Låt inte hjärnan chill för länge, annars kan det frysa.
  3. Häll den iskalla styckningen ACSF i buffertbrickan. Sprida skära ACSF på filter papperet placeras på frysta skålen. Placera hjärnan på pappersfiltret och isolera blocket krävs hjärnans vävnad genom att ta bort lillhjärnan och skära frontal stången rakt ut.
  4. Med hjälp av en böjd spatel, limma ryggsidan av hjärnan på Preparatskivan med skurna frontal vänd agar blocket och occipital Polen inför vibratome bladet. Använd ett tunt lager av cyanoakrylat lim. Placera Preparatskivan i buffertbrickan omedelbart och säkra den.
  5. Justera snittningen intervallet så att flytta bladet vibratome hela vägen över vävnaden upp till kvarteret agar. Justera preparatet skiva höjden för att nå nivån bladet med hjärnans vävnad block.
  6. Kassera vävnadssnitt tills hippocampus syns tydligt (vanligtvis ~ 900 µm). Sedan ange en slice tjocklek 400 µm och starta skivning för att behålla vävnadssnitt. För varje avsnitt som hjärnan delas de två hjärnhalvorna och trimma den onödiga vävnaden för att få två hjärnan skivor. Som buffertbrickan förstärks under efterföljande avsnitt, fylla den buffert fack inkommer med iced destillerat vatten (se steg 7.2.7).
  7. Använd en inverterad Pasteur-pipett för att försiktigt överföra hjärnan skivor i första skölja bägaren tömma den Pasteur-pipetten och överföra hjärnan skivor till andra skölja bägaren. Sedan överföra hjärnan skivor in i jordbruksföretaget kammaren och låta dem återhämta sig i minst 60 min.
    Obs: Oftast det är möjligt att få 6-8 hjärnan skivor övergripande. Protokollet kan pausas här.

9. beredning av ACSF innehållande 4-AP (4AP-ACSF)

Obs: Detta kräver 10 min för beredning, plus 20 min uppvärmning. Försiktighet! 4-AP är en konvulsiv drog och det är giftigt. Hantera med handskar och undvika spill.

  1. Häll 200 mL destillerat vatten i en 500 mL-mätkolv.
  2. Tillsätt 50 mL lager A, 50 mL lager B, 5 mL lager M och 1 mM L-Askorbinsyra. Skaka försiktigt med roterande rörelser tills den L-askorbinsyra är helt upplöst.
  3. Tillsätt 500 µL av 4AP lager.
  4. Tillsätt destillerat vatten att nå den slutliga volymen, försegla mätkolven med tätning film och vänd den försiktigt 3 - 5 gånger tills lösningen är jämnt klar.
  5. Montera 4AP ruvande kammaren (jfr figur 1A) och häll det ~ 80 mL 4AP-ACSF. Täcka kammaren, överföra den till det varma badet och starta bubblande med en 95% O2/5% CO2 gasblandning. Ta bort eventuella fångade bubblor med hjälp av en inverterad Pasteur-pipett. Hålla täckt.
  6. Vänta tills 4AP-ACSF temperaturen är 30-32 ° C (~ 20 min).
    Obs: Protokollet kan pausas här om hjärnan skivor återhämtar sig fortfarande.

10. före uppvärmningen och inkubering av skivor i 4AP (längd: 90 min)

  1. Kontrollera att den före uppvärmningen ACSF och 4AP-ACSF temperaturen är 30-32 ° C.
  2. Använd en inverterad glas Pasteur-pipett för att överföra 1 hjärnan skiva in i pre värmande kammaren och låt vävnad resten för 25-30 min. Sedan överföra hjärnan skiva in i 4AP-ACSF ruvande kammaren och låt den vila i 60 min.

11. beredning av MEA Set-up

Obs: Börja 15 min innan inspelning.

  1. Över återstående mängd 4AP-ACSF till en 500 mL-Erlenmeyerkolv.
  2. Placera Erlenmeyerkolven på en hylla ovanför MEA förstärkaren och använda slangar till att lösningen kontinuerligt flöde en 60 mL spruta. Justera höjden på Erlenmeyerkolven och sprutan så att medge en gravitation matad av 1 mL/min.
    Obs: Rätt höjd beror på slangen innerdiametern (ID). För slangar av 5/32 tum ID räcker 30 cm.
  3. Starta bubblar den 4AP-ACSF i Erlenmeyerkolven och sprutan med en 95% O2/5% CO2 gasblandning.
  4. Låt den 4AP-ACSF flödet genom perfusion slangen till en bägare tills det är ingen luft inne; sedan stoppa lösning flödet.
  5. Anslut värme-element på MEA basen till termostaten. Placera det torra MEA chipset inuti MEA förstärkaren och säkra förstärkaren huvudet. Använd en plast Pasteur-pipett för att överföra 4AP-ACSF till inlopp och yttre reservoar av inspelning kammaren.
  6. Säkra värme kanylen till en Magnethållare och placera dess spets inuti den inspelning kammare inloppsport; bifoga den magnetisk hållaren till en magnetremsan på MEA förstärkare huvudet; Anslut perfusion slangen till kanylen; Anslut kanylen till termostaten.
    Obs: Värme kanylen bör omfattas av avfasade polytetrafluoreten (PTFE) slangar att nå inspelning kammaren inloppsport och minimera buller på grund av det metalliska materialet av kanylen. När reservoaren inlopp är tillräckligt fylld med 4AP-ACSF, bör droppar faller från perfusion systemet inte vara synlig.
  7. Placera sug nålen inuti behållaren och verifierar att det är undertryck genom att dränka sug nålen till ACSF; Kontrollera om en konstant sug lågfrekvent buller.
    Obs: Sug nålen bör placeras så att den 4AP-ACSF flöda strax ovanför hjärnan slice ytan. En vakuum linje eller en låg ljudnivå vakuumpump kan användas.
  8. Ställa in flödet regulatorn tillåter ett flöde av 1 mL/min och börja startas.
    Obs: Gravity matad perfusion eliminerar buller som orsakas av Peristaltiska pumpar; om Peristaltiska pumpar är att föredra, är låg ljudnivå modeller obligatoriska.
  9. När 4AP-ACSF flödar genom kanylen, slå på termostaten. Ställ in värme kanylen på 37 ° C och MEA basen till 32 ° C att uppnå en temperatur på 32-34 ° C inne i inspelning kammaren.
    Obs: försiktighet! Värme kanylen utan lösning i det eller det kanske aldrig skadas irreversibelt. Ställa in temperaturen av kanylen högre än inspelningen temperaturen (dvs., 32-34 ° C) att ta hänsyn till de inneboende temperaturkompensation mellan inställt värde och verkliga värde vid spetsen av värme kanylen och inom inspelning kammaren. Den flöde, temperatur och volym av inspelningen kammare allt inflytande temperatur inspelning lösningen. Inställningarna rapporterade i steg 11,9 är optimerade för den beskrivna protokollet och utrustning. Alltid kontrollera själva inspelningen temperaturen med ett termoelement och justera inställningarna efter behov. Värm inte MEA basen över 34 ° C att undvika överhettning på hjärnan-segmentet.
  10. Placera den externa referenselektroden i reservoaren inspelning kammare inlopp.
    Obs: Även om MEA marker är utrustade med en inre referenselektrod, detta täcks av anpassad inspelning kammaren. Således, en extern referenselektrod måste användas. En mättad KCl pellets är det mest praktiska, eftersom det är klar att använda utan behovet av klorering.

12. MEA Live kartläggning

  1. En gång 4AP-ACSF nivån och inspelningen temperaturen har stabiliserats som önskat, turn perfusionen och en sug Avstängningskranar till läge off att tillfälligt stoppa dem.
    1. Snabbt överföra ett hjärnan segment på MEA inspelning kammaren med en inverterad glas Pasteur-pipett. Justera dess position på området MEA inspelning som behövs med eld polerade böjda Pasteur pipett (figur 1 c) eller en mjuk kompakt liten borste. Placera hold-down ankaret (figur 1 d) på hjärnan skiva. Starta om perfusionen och sug genom att vrida sin Avstängningskranar tillbaka till läget.
      Obs: kritiska! Segmentet ska överföras, och perfusionen startas om inom 60 s eller vävnaden kan dö. Skiva hold-down ankaret bör hållas i 4AP-ACSF vill att hjärnan slice flyttas medan placera ankaret på hjärnan skiva på grund av skillnader i ytliga spänning. Ankaret att säkra hjärnan slice på MEA kan vara skräddarsydda använder rostfritt stål wire och nylon tråd (figur 1 d) eller erhållits från kommersiella källor. Figur 1E visar den slutliga experimentella set-up med MEA chip ansluten till förstärkarens huvud: lite hjärnan vilar på MEA chip inom inspelning kammaren hålls nere av anpassade ankaret. Referenselektroden (röd cirkel) och PTFE slangar som omfattar uppvärmning kanylen (röd pil) är placerade i reservoaren inlopp, medan sug nålen (blå pil) är placerad i reservoaren utlopp.
  2. Ta en bild av hjärnan segmentet med hjälp av en kamera monterad på en inverterade Mikroskop scenen.
  3. Kör det script mapMEA på den dator programvaran för att starta GUI för att mappa elektroderna.
    Obs: Skräddarsydda programvaran tillåter användaren att välja elektroderna som motsvarar specifika strukturer i hjärnan segmentet. Detta steg är avgörande för att aktivera den rätta vägen och undertrycka ictal aktivitet genom att använda elektrisk stimulering.

Figure 2
Fig 2: GUI för live MEA elektrod mappning. (A) Schematisk bild av kombinerade hippocampus-EG slice placerad på MEA. De standard strukturer används för detta protokoll är cornu ammonis 3 (CA3), enthorinal cortex (EG), perirhinal cortex (PC), och subiculum (SUB). Referenselektroden är schematized som triangel markör. Elektroder som omringade i streckade linjerna representerar XY koordinater för bild uträtning. (B) Screen capture GUI under levande MEA mappningen. Flödesschemat till vänster om fånga anger stegvisa förfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Klicka på knappen Bläddra för att ladda bilden av hjärnan segmentet. Kontrollera att referenselektroden visas i den övre raden i halv-vänster på MEA (figur 2A, triangel markerar). Klicka på knappen Aktivera pekare , och välj sedan toppen och botten elektroderna i raden längst till vänster i matrisen att markera XY koordinater för bild uträtning och elektroden kartläggning.
  2. Segmenttypen nedrullningsbara menyn Välj horisontell. Markera kryssrutan standard strukturer .
    Obs: Det är möjligt att anpassa strukturerna genom att välja knappen Ange nya strukturer . Strukturerna som standard för det horisontella hjärna segmentet avbildas i figur 2A.
  3. Med de numrerade knapparna under hjärnan slice bilden, Välj elektroderna motsvarar ROI och klicka på motsvarande tryckknappen på panelen strukturer att tilldela dem (figur 2B). Upprepa detta steg för varje ROI.
  4. Tryck på knappen Spara : programvaran genererar en resultat-mapp som heter #EXP_LabelledElectrodes som innehåller en tabell rapportering den valda elektroder och ROIs.

13. inspelning och elektriska modulering av Epileptiform aktivitet

  1. Låt hjärnan segmentet att stabilisera inom inspelning kammaren för 5-10 min innan inspelning.
  2. Slå på stimulans enheten minst 10 min före stimulering protokollet tillåta självkalibrering och stabilisering. Starta programvaran stimulus kontroll och kontrollera att stimulator och MEA förstärkare är korrekt anslutna som indikeras av en grön lysdiod i huvudpanelen av programvaran stimulus kontroll. Se handböckerna av särskilda instrument och programvara för ytterligare detaljer, jfr Material tabell.
  3. Ställa in stimulering i bipolär konfiguration. Välj elektrod par i kontakt med det pyramidala celllagrar av den CA1/proximala subiculum (jfr24,25) bland de mappas med den skriften mapMEA (jfr avsnitt 12). Använd en tråd för att ansluta en av valda elektroderna till den negativa kontakten på stimulatorn och andra elektroden till den positiva kontakten på samma stimulator kanal. Använda en annan tråd för att ansluta marken av stimulatorn till marken av förstärkaren.
  4. Starta inspelningsprogrammet. För att förvärva data, tryck på knappen spela i huvudpanelen i inspelningsprogrammet. Spela in minst 4 ictal utsläpp.
    Obs: En samplingsfrekvens på 2 kHz kan förvärva fältet potentialer med rättvis lösning samtidigt minimera hård avkasta utrymmesanvändning. En 5-min inspelningsfil tar ~ 80 MB. Högre samplingsfrekvenser kan krävas, t.ex., att registrera stimulans artefakter eller flera förbandsverksamheten. För att observera fältet potential bara, Använd en levande lågpassfilter vid 300 Hz för att skära av flera förbandsverksamheten.
  5. Bestämma den stimulus intensiteten.
    1. I stimulus kontroll mjukvaran, Använd huvudpanelen för att utforma torget bifasisk positiv-negativ nuvarande pulslängd 100 µs/fas.
      Obs: försiktighet! Likström stimulering kräver en balanserad laddpulsen att undvika att skada utrustningen.
    2. Kör en snabb indata/utdata (I/O) test för att identifiera den bästa stimulus intensiteten. Leverera stimulering pulsen utformad vid steg 13.5.1 vid 0.2 Hz eller lägre genom att lägga till ett mellan puls intervall på 5 s eller längre i en lämplig form av programvaran stimulus kontroll. I fliken pulsamplitud ange en inledande pulsamplitud 100 µA/fas och öka med 50-100 µA steg vid varje rättegång tills stimulering kan tillförlitligt framkalla interictal-liknande händelser i de parahippocampal cortices (kolla signalerna visualiseras av den inspelning programvara).
  6. Elektriska modulering av limbiska ictogenesis
  7. Programmera stimulans enheten att leverera protokollet stimulering av intresse. Använda stimulans amplituden identifierats under testet I/O.
    Obs: Misslyckanden hastighet framkallat svar bör ≤20%.
  8. Efter stimulering slutar, verifiera nätverk återhämtning före stimulans villkor genom att registrera minst 4 ictal utsläpp (som i steg 13,4).

Representative Results

Planar MEAs med 6 x 10 500 µm elektrod avstånd vid layout och är den idealiska inspelningsenheten för det experimentella protokollet som beskrivs här, eftersom deras inspelning område sträcker sig över hela hjärnan segmentet i sin helhet (figur 3A, se även17). Även om perforerade MEAs (pMEAs) skulle vara att föredra att förbättra vävnad syresättning, deras inspelning är för litet (~ 2 mm diameter). Detta tillåter inte samtidiga visualisering av elektriska signaler som genereras av hippocampus och de parahippocampal cortices (data som inte visas, se18).

Observerade 4AP-inducerad epileptiform mönstret (figur 3A) återger troget vad observeras vanligtvis i in vitro- modellen använder konventionella fält potentiella inspelning och består av tre typer av aktivitet7, 26: (jag) ictal-liknande händelser (figur 3B, pilspetsar) är robust långvariga (> 20 s, intervall: 20-60 s) händelser som liknar de electrographic funktionerna i krampaktivitet med tonic och kloniska komponenter (figur 3 c); de är genererade inom de parahippocampal cortices varje 3-5 min och återinträda på Hippocampus bildandet genom dentate gyrus (figur 3D, pil); (ii) långsam interictal-liknande utsläpp (figur 3B, EG trace, svart bar, expanderade i figur 3E) är korta (< 1 s) befolkningen händelser som genereras mellan ictal händelser ubiquitously inom hippocampus-EG hjärnan slice beredning och sker vid långsamt (räckvidd 10-30 s); (iii) snabbinterictal-liknande utsläpp (figur 3B, CA3 spåra, svart streck; expanderat i figur 3E) är återkommande kort (< 1 s) befolkningen händelser som genererats av CA3 Hippocampus delfältet; När de Schaffer säkerheter bevaras, snabbt CA3-driven interictal händelser sprids längs Hippocampus slingan och utöva en anti-ictogenic effekt24 (inga data anges); för att förhindra ictal aktivitet nedsliten, i syfte att protokollet beskrivs, CA3 produktion störs (jfr figur 3B, E). Det bör noteras att den snabbt CA3-driven interictal aktivitet inspelade med MEAs sker i en långsammare takt (~ 0,4 Hz) än vad som observerats med hjälp av konventionella fältet potential inspelning med glas pipetter (~ 1 Hz, intervall: 0,5 - 2,0 Hz, data som inte visas).

Det lyckade resultatet av elektriska neuromodulation i gnagare hjärnan skivor beror på aktivering av specifika neuronala vägar27 tillsammans med den inneboende connectivity bland de regioner som ingår i det preparats24. Vi har testat skivor som erhållits från vuxna manliga Sprague-Dawley-råttor och CD1 möss och vi har hittat som musen i stället för att råttan hjärnan skivor erbjuda bästa avvägningen mellan storlek, tjocklek och inneboende anslutning. Först, tack vare sin mindre storlek, de passar området små inspelning av kommersiellt tillgängliga MEAs bättre (figur 4A, vänster: råtta, höger: mus); för det andra, de är mer motståndskraftiga mot de ofördelaktiga tillstånd som är inneboende till MEA inspelning (jfr inledningen): även om ictal-liknande utsläpp som genereras av dessa två vävnader (figur 4B) är av liknande varaktighet ()Figur 4 c vänster), deras förekomst är betydligt kortare i mus hjärnan skivor (n = 10 skivor varje arter; 2-tailed oparat t-test, p < 0,001; Figur 4 c höger). Det senare gör att påskynda de experimentella protokoll, vilket gör det möjligt att testa ett större antal hjärnan skivor under en experimentell dag: för denna uppsättning representativa resultat, vi kunde testa ett liknande antal hjärnan skivor från de två arterna (råtta: n = 58. mus: n = 52), men antalet möss (n = 18) var 2 gånger mindre än antalet råttor (n = 42).

Dessutom mus hjärnan skivor visas att presentera med tätare förbindelser och är därför mer benägna att svara bättre på ihållande elektriska neuromodulation (figur 4 d). Således i denna in vitro- modell av ictogenesis är livskraft för elektrisk stimulering som syftar till att styra ictal aktivitet betydligt större för mus än för råtta hjärnvävnad. Denna aspekt återspeglas också av betydligt högre andelen framgångsrika stimulering experiment utförs med musen kontra råtta hjärnan skivor även när bedriver flera ihållande stimulering protokoll ()figur 4E). I själva verket verkar mus hjärnvävnad bättre motstå ihållande elektrisk stimulering som föreslagits av den högre överlevnaden inom testade experimentella tidsramen på 4 h (figur 4F). Således gör den mindre storleken tillsammans med bättre bevarande av inneboende anslutning musen hjärnan skivor den bästa kandidaten att utföra MEA inspelning syftar till att studera Hippocampus-parahippocampal nätverk interaktioner och utvärdera elektriska neuromodulation protokoll som är relevanta för TLE.

Periodiska pacing levereras i den CA1/subiculum är känd för att styra limbiska ictogenesis i 4AP-behandlade hippocampus-EG slice förberedelse24,25,27, med 1 Hz som den mest effektiva frekvens27. Således, det är också användbart som en positiv kontroll för att utvärdera effekten och effektiviteten av övriga neuromodulation politik (se till exempel25). Som nämnts ovan, elektriska pulser levereras direkt via MEA (dvs.utan behov av en extern stimulerande elektrod) kan framkalla befolkningen svaren i gnagare hjärnvävnad (se även28). Tillräcklig konservering av neuronala nätverksanslutningen inom hjärnan slice, exakt positionering av hjärnan slice på MEA och ett lämpligt val av stimulerande elektrod par tillåta bedriver elektriska neuromodulation experiment som effektivt kontrollera ictogenesis. Som visas i figur 5A, det är möjligt att reproducera den kanoniska 1 Hz periodiska pacing protokoll använder planar MEAs både som en inspelning och en stimulerande enhet, med fördelen att effekten av elektrisk stimulering kan visualiseras i hela den hjärnans vävnad avsnitt med ett högre antal lika fördelade observationspunkter jämfört med konventionella fältet potentiella inspelningen. Figur 5B visar kvantifiering av de resultat som erhålls för n = 9 hjärnan skivor, som visar en signifikant minskning av den totala beslagta tid (total ictal aktivitet varaktighet/observation tid25) under stimulering (ett sätt-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0,01, Fishers LSD post hoc test, skyddade). Resultaten stämmer överens med litteraturen för externa stimulerande elektroder24,25.

Att beräkna den totala beslagta tid, observationstid som beror på intervallet mellan ictal händelser, och den bestämmer också minimitiden för protokollet stimulering krävs för att tryggt utvärdera effekterna av neuromodulation. Vi tycker att inspelning minst 4 ictal utsläpp (och därmed minst 3 intervall mellan ictal händelser) är en bra kompromiss mellan insamlade prover och krävs upphämtningstid. I villkoret kontroll (dvs, ingen stimulering) är observationstiden det långa glappet mellan uppkomsten av den första uppmätta ictal händelsen och avslutandet av den sista. Under neuromodulation motsvarar observationstiden stimulans protokoll varaktighet, eftersom syftet med mätningen är att kvantifiera de fenomen som inträffar under den tid som störning introduceras i systemet. Computing och jämföra den totala beslagta tid snarare än varaktighet och intervall av ictal händelser är den mest lämpliga parametern undvika typ II fel. I själva verket tillsammans med komplett undertryckande av ictal aktivitet är det också möjligt att endast en ictal händelse genereras under elektrisk stimulering i motsats till flera händelser observerades i villkoret kontroll. I det här fallet, det är inte möjligt att mäta intervallet mellan händelser, representerar mäta ictal längd som en estimator för stimulering effekt inte det faktiska utfallet av neuromodulation (dvs, ictal verksamhet minskning).

Sammantaget visar de resultat som presenteras här att mus hjärnan skivor kopplat till MEAs är värdefulla verktyg för epilepsi forskning och pålitlig neuromodulation studier som är relevanta att avancera fältet DBS för behandling av epilepsi. Dessutom protokollet beskrivs här förbättrar hjärnan slice livskraft och tillåter bedriver experimentell sessioner i flera timmar (figur 6), som kan behövas, till exempel för att jämföra effekterna av olika elektrisk stimulering paradigm.

Figure 3
Figur 3 : Typiska 4AP-inducerad epileptiform mönster visualiseras med planar basenhet (A) mus hjärnan slice placerad på en planar 6 x 10-MEA (elektrod avstånd: 500 µm) och side-by-side översikt över 4AP-inducerad epileptiform mönstret visualiseras med MEA inspelning. Varje ruta i rutnätet rymmer aktiviteten registreras på motsvarande plats inom hjärnan segmentet. Streckad blå linjer avser elektrod raderna för mer klarhet. Elektroden inspelningsnumret identifieras i blå på det övre vänstra hörnet av varje ruta. Den grå korsade kvadrat representerar referenselektroden. (B) representativa trace segment av EG och CA3 mönster visualiseras på en snabbare tid-skala. Pilspetsar visar ictal händelser. I EG spårningen är det möjligt att uppskatta förekomsten av långsam interictal utsläpp (svart bar), medan CA3 delfältet genererar typiska ihållande fastinterictal mönstret (svart fält). (C) expanderat inspelning av en ictal ansvarsfrihet visar typiska tonisk-kloniska mönstret. (D) Fast-skalan visualisering av pre-ictal-till-ictal övergången motsvarar EG (röd) och CA3 (svart) spåra segment präglas av den röda stapeln i (B). Pilen anger uppkomsten av ictal ansvarsfrihet. De överlagrade spår belysa att händelsen ictal har sitt ursprung i EG och därefter sprider till CA3 delfältet. (E), den utökade vyn av de interictal perioderna präglas av de svarta fälten i (B) betonar bristen på korrelation mellan den långsamma och fastinterictal mönster genereras av EG (röd) och CA3 (svart), respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Mus hjärnan skivor erbjuder en högre experimentell produktion än råtta hjärnan skivor. (A) hjärnan skiva från en råtta (vänster) och en mus (höger) i matchade åldrar. Rat hjärnan slice är mycket större än området MEA inspelning och dess elektriska aktiviteten inte kan visualiseras i sin helhet. (B) direkt visuell jämförelse av återkommande ictal aktivitet som genereras av mus och råtta enthorinal cortex (EG). (C) Mus och råtta hjärnan segment genererar ictal utsläpp av liknande längd, men intervallet mellan dessa händelser är nästan 2-faldigt i råtta hjärnvävnad. * p < 0,05. (D) jämfört med råttor, möss erbjudande 2-faldigt högre avkastning av hjärnan skivor lönsamt för elektrisk stimulering experiment som syftar till att kontrollera ictogenesis. Elektrisk stimulering av subiculum kunde framkalla befolkningen svaren i de parahippocampal cortices i endast 20 av 58 (34%) råtta hjärnan skivor, i motsats till 33 av 52 (63%) mus hjärnan skivor (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0,05. (E) bland livskraftig skivor, framgång i att kontrollera ictal aktivitet är 2-faldig med mus kontra råtta hjärnan skivor (mus: 20 av 33 hjärnan skivor, 60%: råtta: 6 av 20 hjärnan skivor, 30%; Chi2: 4,67; p = 0,03). p < 0,05. (F) mus hjärnan skivor tål upprepad långvarig epoker av ihållande elektrisk stimulering (grå-skuggade områden). Vid stimulus uttag, mus hjärnvävnad uppvisar fullständig återhämtning av epileptiform mönster, medan rat brain vävnad livskraft faller dramatiskt på 3 h. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Representativa experiment av elektriska modulering av ictogenesis använder hjärnan skivor kopplat till basenhet (A) inspelningar av 4AP-inducerad ictal aktivitet i EG och PC under kontroll skick (ingen stimulering), periodiska pacing (PP) vid 1 Hz (stimulans artefakt är trunkerade), och under återställning vid stimulans uttag. (B) kvantifiering av effekten av PP vid 1 Hz på den totala beslagta tid. p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Representativa långsiktiga inspelning av 4AP-inducerad ictal aktiviteten. (A) Trace segmenten inspelade 8 h efter hjärnan skivning förfarande och följande 2 h 4AP ansökan. (B) utvidgad spåra segment som motsvarar de boxed ictal utsläpp som identifierats av de bokstäver en boch c i panelen (A) Visa konsekvens av genererade ictal verksamhet under hela långvarig observation tid-änka. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lager A Kemiska Molekylvikt Koncentration (mM)
NaCl 58.44 1150
Spädningsvätska: destillerat vatten KCl 74.55 20
Koncentrat: 10 x  KH2PO4 136,1 12.5
Temperatur vid förvaring: 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147.02 20
Maximal lagringstid: 1 wk D-glukos 180,2 250
Obs: filtrera med filtermembran 50 mm
Lager B Kemiska Molekylvikt Koncentration (mM)
NaHCO3 84.01 260
Spädningsvätska: destillerat vatten
Koncentrat: 10 x 
Temperatur vid förvaring: 4 ° C
Maximal lagringstid: 1 wk
Obs: filtrera med filtermembran 50 mm
Lager C Kemiska Molekylvikt Koncentration (mM)
KCl 74.55 20
Spädningsvätska: destillerat vatten KH2PO4 136,1 12.5
Koncentrat: 10 x MgCl2* 6 H2O 203,3 50
Temperatur vid förvaring: 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246.47 20
Maximal lagringstid: 2 wks CaCl2* 2 H2O 147.02 5
Obs: filtrera med filtermembran 50 mm
Lager M Kemiska Molekylvikt Koncentration (mM)
MgSO4* 6 H2O 246.47 100
Spädningsvätska: destillerat vatten
Koncentrat: 100 x
Temperatur vid förvaring: 4 ° C
Maximal lagringstid: 4 wks
4AP lager Kemiska Molekylvikt Koncentration (mM)
4-aminopyridin 94.11 250
Spädningsvätska: destillerat vatten
Koncentrat: 1000 x
Temperatur vid förvaring: 4 ° C
Maximal lagringstid: 2 wks
Obs: virvel för 2-3 min eller stirr för 30-60 min
Obs: försiktighet! 4-AP är giftig och cinvulsant. Använd handskar och Undvik spridning eller spilla.

Tabell 1: Lager lösningar.

HOLDING ACSF INSPELNING ACSF STYCKNING ACSF
Kemiska C [mM] Kemiska C [mM] Kemiska C [mM]
NaCl 115 NaCl 115 Sackaros 208
KCl 2 KCl 2 KCl 2
KH2PO4 1,25 KH2PO4 1,25 KH2PO4 1,25
MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5
CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2
D-glukos 25 D-glukos 25 CaCl2 0,5
NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-glukos 10
L-Askorbinsyra 1 L-Askorbinsyra 1 NaHCO3 26
L-Askorbinsyra 1
pH 7,4 pH 7,4 Pyrodruvsyra 3
Osmolalitet 300 mOsm/Kg Osmolalitet 300 mOsm/Kg
pH 7,4
Osmolalitet 300 mOsm/Kg

Tabell 2: Lösningar sammansättning.

Felsökning
FRÅGA MOTÅTGÄRDER
Ictal utsläpp ser 'chunked' Minska andelen perfusion och/eller Sänk ACSF volymen ovanför hjärnan segmentet genom att justera positionen sug nål.
Ingen ictal aktivitet (1) Kontrollera att CA3-driven snabbt interictal händelser inte sprids till cortex. Använd en liten skalpell blad (t.ex. n.10) eller en nål för att kapa de Schaffer säkerheter om behövs, men var noga med att inte skära nylon trådarna av slice hold-down ankra. En stereo- eller upprätt Mikroskop är bäst, medan den inverterade mikroskopet gör uppgiften mycket svårt.
(2) kontrollera skiva livskraft: stark elektrisk stimulering, som kan utlösa ictal aktivitet? Vänta tills ca 2 h 4AP ansökan och sedan ändra hjärnan skiva om ictal verksamhet inte uppstår.
Hjärnan slice flyttas när du placerar hold-down ankaret (1) försiktigt bort slice ankaret och flytta hjärnan segmentet.
(2) Kontrollera att skiva ankaret är jämnt blöt av 4AP-ACSF.
(3) ta bort den 4AP-ACSF från inspelningen kammaren att gynna hjärnan slice vidhäftningen till MEA.
(4) flytta segment hold-down ankaret.
Hjärnan slice flyter på MEA chip efter överförs (1) aspirera försiktigt överskottet ACSF med en Pasteur-pipett.
(2) the MEA chip kan behöva vara åter belagd.
Elektrisk stimulering inte framkalla nätverk svar Öka stimulus intensitet, ändra elektrod par.
Elektrisk stimulering kan framkalla befolkningen svaren i de proximala men inte distala kortikala områdena Frågan är troligt på grund av dålig anslutning eller för låg stimulus intensitet. Elektrisk stimulering kan vara ineffektiv eller effektiv i vissa kortikala områden endast. Det är rekommenderas att ändra hjärnan slice.
Signalen är bullriga (1) kontrollera referenselektroden: bullriga baslinjen kan ibland orsakas av ofullständig fyllningen av inlopp behållaren så att referens elektroderna gör inte helt djupt in ACSF.
(2) kontrollera den övergripande jordning av utrustning.
(3) justera positionen sug nål för att höra ett konstant, mjukt sug ljud. Marken sug nålen.
(4) ren MEA externa kontakter med etanol med hjälp av en bomullspinne.
(5) the MEA chip kan skadas: ändra MEA chip och kontrollera artefakter och signal-brus-förhållande.

Tabell 3: Felsökning.

Discussion

MEAs är ett ovärderligt verktyg för neurofysiologi utredningar och har nått mognad under de senaste åren tack vare decennier av prospektering och utveckling. Jämfört med konventionella fält potentiella inspelning har MEAs den stora fördelen med ett högre antal observationspunkter och kända mellan elektrod avstånd, vilket är avgörande för att exakt lokalisera neuronala nätverk interaktioner.

MEA inspelning tekniken kan också kopplas till andra elektrofysiologi metoder, såsom patch-clamp inspelning15, att undersöka relationen mellan enda neuron och neuronala nätverksaktivitet. Dessutom kan möjligheten att visualisera fältet potentialer och flera förbandsverksamheten samtidigt ge värdefulla insikter i sambandet mellan verksamhet i små neuronala ensembler och kollektiva neuronala nätverk. Kombinationen med spänningskänsliga färgämnen, kalcium imaging och optogenetik29 tillåter inferring neurofysiologi fenomen med polyedriska metoder. Utöver farmakologiska studier, möjlighet att utföra både inspelning och stimulering med samma system gör MEA inspelning tekniken mycket kraftfull och mångsidig: exempelvis är det möjligt att studera de synaptiska plasticitet fenomen på den kärnan i minnet bildning30, med protokollen neuromodulation presenteras här, som är relevanta för DBS att behandla epilepsi och ett brett utbud av sjukdomar i hjärnan. Senaste beviset att MEA inspelning tekniken kan tillämpas framgångsrikt till epileptiska hjärnans vävnad16 visar dess ovärderliga användbarhet i epilepsi forskning, både för att förstå de grundläggande mekanismerna bakom denna förödande sjukdom och för att finjustera DBS algoritmer för att lindra den.

Men MEAs tvinga utövande av elektrofysiologi experiment 'limit' villkor för hjärnan skivor, på grund av kravet på en nedsänkt inspelning kammare och nödvändigheten av att låta hjärnan skiva resten på fast substrat där mikro-elektroderna är integrerade. Hjärnvävnad får således inte tillräcklig syretillförsel, som i sin tur kan påverka kvaliteten på inspelningarna.

Protokollet beskrivs här tillåter att tillförlitligt spela in och studera ictogenesis i gnagare limbiska nätverk kopplat till MEAs med akut in vitro-4AP-modellen och utöva långvarig epoker av elektrisk stimulering, som ger relevant information för utvärdering DBS politik.

Tidigare studier på elektriska neuromodulation av epileptiska limbiska nätverk baserade på användning av konventionella fält potentiella inspelning har använt antingen mus eller råtta hjärnan skivor med liknande resultat24,25; men användningen av råtta hjärnvävnad visade mer utmanande, rimligen på grund av den svagare anslutningen jämfört med hjärnvävnad som erhållits från möss7. När det gäller tekniken som MEA är mus hjärnan segment bäst enligt deras storlek. Dessutom är ges den högre frekvensen av förekomsten av ictal-liknande utsläpp i mus kontra råtta hjärnvävnad, det möjligt att testa betydligt mer hjärna skivor under en experimentell dagen, vilket i sin tur gör datainsamlingen snabbare och effektivare, och kan minska antalet djur som används.

Betydelse med avseende på befintliga metoder:

Ictal utsläpp inspelade med anpassade kammaren beskrivs här verkar vara liknande i varaktighet och uppkomst som de som observerades med konventionella MEA ring kammaren och samma MEA (planar mikro-elektroder, jfr 17). Det måste dock understrykas att hjärnan slice tjocklek måste minskas avsevärt när använder konventionella runda inspelning kammaren tillsammans med en låg perfusion hastighet (1 mL/min), vilket kan hindra den framgångsrika jakten på neuromodulation experiment på grund till dålig anslutning.

I detta protokoll ger en låg volym anpassad inspelning kammare inspirerad av patch-clamp inspelning kammare design stabil och pålitlig laminärt flöde som är avgörande för framgångsrik strävan efter MEA inspelningar; Det kan också öka tjockleken hjärnan skiva till 400 µm för att uppnå en rättvis avvägning mellan vävnad livskraft och inneboende anslutning. Det känns verkligen att laminärt flöde av inspelning lösningen i kammaren är mycket önskvärt för hjärnan slice elektrofysiologi, eftersom den inte påverkas av temperatur, syre, och pH toningar som observeras i cirkulär-flöde runt inspelning Chambers19,20,31 (som de med kommersiellt tillgängliga MEA). Sådan lutningar införa experimentella bias och är också skadliga för hjärnan segmentet. Inspelning avdelningar med en relativt liten volym (~1.5 mL) tillsammans med en hög perfusion rate (5-6 mL/min)16,31 möjliggöra adekvat utbyte av perfusion medium (≥3 gånger / min). Enkelt kan anpassade kammaren erhålls från kommersiella källor till ett överkomligt pris eller produceras internt med 3D tryckteknik. Andra studier har rapporterat MEA inspelningar från 400 µm tjock mänskliga hjärnan skivor16 använder konventionella MEA ring kammaren, samtidigt hålla ACSF volymen 1 ml och upprätthålla en hög perfusion hastighet (5-6 mL/min) med hjälp av en låg ljudnivå peristaltiska pumpen. Men har författarna använt en annan modell av ictogenesis, dvs, den låg Mg2 +, som sannolikt mindre påverkade än 4AP modellen av ephaptic mekanismer som innebär betydande ökningar av extracellulära K+ koncentration 11 , 22. vi har funnit att en hög perfusion skattesats inte är önskvärt i 4AP modellen, möjligen på grund av den snabba wash-out av ackumulerade extracellulära K+, vilket kan behöva ökas betydligt i inspelningen ACSF16. I själva verket verkade ictal händelser mer 'chunked' när ASCF perfusion hastigheten ökades till 2-3 mL/min och hjärnan slice dränktes av ett tjockt ACSF lager, medan fullt utvecklad utsläpp uppvisar robust tonisk-kloniska komponenter kunde återställas när återvänder till en lägre perfusion (1 mL/min) och en tunnare ACSF layer rätt på vävnaden ytan nivå (inga data anges). Anpassad inspelning kammaren beskrivs i detta protokoll tillåter utbyte av perfusion medium 3 - 5 gånger / min med en flödeshastighet av 1 mL/min. Alltså bättre övergripande syretillförseln till hjärnan skivor starkt även vid relativt låg perfusion priser, samtidigt som man fortfarande garanterar en stabil temperatur och hög signal-brus-förhållande. Viktigast av allt, är det möjligt att hålla extracellulära K+ koncentrationen till en fysiologisk värde.

4AP modellen av ictogenesis kräver inte någon betydande ändring av ACSF Joniska sammansättning, såsom blodtryckssänkande Mg2 + eller ökande K+, och erbjuder unika fördelen av att hålla både retande och hämmande överföringar intakt 12, en aspekt som är mycket relevant i epilepsi forskning mot bakgrund av den avgörande rollen som både glutamaterg och GABAergic nätverk i epileptiform synkronisering (jfr 7). Den 4AP-ACSF används i detta protokoll innehåller en fysiologisk K+ koncentration (3,25 mM) och en något lägre Mg2 + koncentration än innehavet ACSF (1 mM jämfört med 1,3 mM). Denna koncentration fortfarande faller inom de rapportera fysiologiska värden av Mg2 + koncentration i gnagare CSF och det används i många laboratorier (se till exempel17,18). Att syftet med protokollet beskrivs, har vi funnit att denna liten minskning är att föredra till stöd i effekten av 4AP.

I tidigare arbete, har 4AP tillämpats på hjärnan skiva när den var redan placerad inuti den inspelning kammare17,18. Såvida inte experimenter behöver iaktta tid fördröjning mellan 4AP ansökan och uppkomsten av epileptiform mönster, finner vi att detta tillvägagångssätt är ganska tidskrävande och lämpar sig inte att fullfölja långvarig inspelning och stimulering sessioner beskrivs i detta protokoll. Före inkubering av hjärnan skivor i 4AP vid 32 ° C kan skona mycket experimentell tid, eftersom hjärnan skivor kan förbehandlas i serien samtidigt fullfölja experimentet med andra vävnadssnitt.

Hjärnan skivor långvarig lönsamhet kan vara användbart att analysera nätverksfunktioner på lång sikt. Dessutom är sin förbättrad motståndskraft mot repetitiva elektrisk stimulering av stor fördel om experimenter vill jämföra flera stimulering protokoll, som måste utföras i samma hjärnan segment för statistiska robusthet. I våra händer, när 3 stimulering testprotokoll, varje föregås av en kontroll-fas och följt av en återhämtningsfas, experimentet kan pågå 3-5 h. I detta sammanhang är levande MEA mappning avgörande för att aktivera den rätta vägen och undertrycka istället för att gynna ictogenesis via elektrisk stimulering. Våra användarvänliga GUI representerar ett snabbt, enkelt och flexibelt verktyg för att kartlägga olika hjärnstrukturer elektroder. Tvärtemot kommersiell programvara är det möjligt att lägga till anpassade MEA layouter även med grundläggande kunskaper i programmering. Bilder kan förvärvas i ljusa fält; någon generell kamera som har bra upplösning och passar på ett Mikroskop är därför lämplig. Ett inverterat Mikroskop är viktigt att visualisera mikroelektroder position i förhållande till hjärnan slice, eftersom dessa skulle döljas under vävnaden om använder en upprätt Mikroskop. Stereo-Mikroskop rekommenderas dock utöver den inverterade typ om experimenter behöver utföra kniv-nedskärningar för att störa särskilda neuronala vägar.

Slutligen, en ytterligare fördel med det föreslagna tillvägagångssättet är billigt och relativt lätt montering av de flesta av de nödvändiga verktyg, som anpassad inspelning kammaren och innehav kamrarna, varma badet och slice ankaret, liksom onödig användning av en kostsam låg ljudnivå peristaltiska pumpen.

Begränsningar av tekniken:

MEA inspelning tillåter inte visualisera mycket långsamma vågor, dvs, DC skiftar i signalen. Sådan baslinjen omläggningar kan hjälpa asymptotiska mätning av ictal ansvarsfrihet varaktighet och, viktigast, de är grundläggande att studera kortikala spreading depression (ett fenomen som avser plötslig oväntad död i epilepsi32 och delas mellan epilepsi och migrän33).

När det gäller elektriska neuromodulation tillåter protokollet beskrivs här utför flera stimulering sessioner utan att påverka hjärnan slice livskraft. Vi kan utföra upp till 3 stimulering sessioner på 20-45 min, likvärdig med vad som rapporterats i tidigare arbete25. Även om hjärnan skivor kan förmodligen klara ett högre antal stimulering sessioner eller längre stimulering protokoll, gjorde vi inte testa hjärnan skivor i detta avseende. Vi rekommenderar att begränsa antalet stimulering protokoll 3 och undvika långvarig (≥ 60 min) stimulering sessioner, som avsevärt kan betona hjärnvävnad som hållits under dessa förhållanden som gräns, upp till bristen på återhämtning vid stimulans uttag.

Kritiska steg i protokollet:

Flera kritiska faktorer kan hindra framgångsrik strävan efter inspelning och modulering av den epileptiform aktiviteten i hjärnan skivor kopplat till MEA. Förutom de gnagararter som används och kvaliteten på hjärnan skivor, perfusion graden under inspelning och dynamiken i ACSF flödet (dvs., laminär kontra cirkulär) inom inspelning kammaren, har vi funnit att villkoren för återhämtning och långsiktiga underhåll av hjärnan skivor samt funktionsläget av 4AP program är de mest kritiska steg.

När du använder en nedsänkt innehav kammare är det viktigt att lagra hjärnan skivor i rumstemperatur att bevara vävnad nätverk hjärnaktivitet och gynna induktion av ictal-liknande utsläpp genom 4AP ansökan. I våra händer försämrades återhämtning och underhåll vid 32 ° C hjärnvävnaden inom 3-4 h för skivning.

Inkubering av hjärnan skivor i 4AP-ACSF vid rumstemperatur och inspelning vid 32 ° C är dock inte önskvärt. Vi har hittat många svårigheter i att observera robust återkommande ictal utsläpp i detta tillstånd. Faktiskt, låga temperaturer i intervallet 20 – 24 ° C rapporterats att dämpa eller ens förhindra 4AP-inducerad ictogenesis både in vitro34 och i vivo35. Således, 4AP inkubation och inspelning temperaturerna måste falla inom den 30-34 ° C och måste matchas. För att undvika att lägga hjärnvävnaden under alltför mycket stress på grund av samtidiga induktion av hyperexcitabilitet av 4AP och plötslig exponering av hjärnan skivor från rumstemperatur till den varma (32 ° C) 4AP-ACSF, är det grundläggande att utföra en mellanliggande före uppvärmningen steg och låt hjärnan skivor habituerar i jordbruksföretaget ACSF vid 32 ° C i 20-30 min. hoppa över detta steg kan påverka ictogenesis induktion av 4AP.

En annan aspekt som måste nämnas är vikten av D-glukos koncentration i ACSF efter skivning. En 25 mM koncentration bevarar hjärnan skivor bättre än 10 mM koncentrationen används i många laboratorier och det förbättrar också graden av förekomsten av ictal aktivitet, vilket är 2-faldigt snabbare (således lättare att fullfölja en lång serie av experimentella protokoll i flera hjärnan skivor varje dag).

Slutligen behöver några viktiga fina detaljer under förfarandet för skivning nämnas. Först, låt inte den intakt hjärnan och hjärnans skivor att frysa i kylan skära ACSF. Kylning av hjärnan för < 2 min är tillräcklig med tanke på mus hjärnan liten storlek. Vävnadssnitt bör överföras omedelbart från buffertbrickan till de skölja bägarna i rumstemperatur. Sköljning vid styckning är ACSF mycket viktigt annars hög sackaroshalten gör hjärnan skivor fastnar nylon mesh på jordbruksföretaget avdelningen. För att effektivt skölja vävnaden, är det viktigt att minimera skärning ACSF innehållet inom överföring pipetten för att inte förorena jordbruksföretaget ACSF överdrivet. 2-stegs Filtersköljningen hjälpmedel för att minimera kontaminering. Efter avslutad skivning förfarandet, bör vävnadssnitt överföras omedelbart från de skölja bägarna till jordbruksföretaget kammaren, där den mjuka nylon mesh hängande halvvägs i jordbruksföretaget ACSF tillåter vävnad syresättning på båda sidor. Samma princip bör tillämpas på alla stadier efter förfarandet för skivning: hjärnan skivor ska aldrig sitta på botten av bägaren, de bör inte vara i kontakt med sidorna av jordbruksföretaget kamrarna och de bör aldrig i kontakt med varandra eller överlappar varandra.

Modifieringar och felsökning:

ACSF sammansättning kan modifieras alltefter de experimenter's. Droger kan till exempel läggas för att dissekera bidrag specifika neurotransmittorer eller jonkanaler att effekten av elektriska neuromodulation. Dessutom utelämnas pyrodruvsyra och askorbinsyra (jfr tabell 2), även om vi finner att de utövar en kraftfullt nervskyddande roll. Vi rapporterar i tabell 3 de vanligaste problem som kan uppkomma i detta protokoll och hur man handskas med dem.

Slutsatser:

MEA inspelning är utan tvekan en ovärderlig teknik att hantera samspelet mellan neuronala nätverk vid hälsa och sjukdom. Utöver farmakologiska studier är det också möjligt att utvärdera elektriska neuromodulation protokoll som är relevanta för DBS tillämpas på epilepsi och andra neurologiska sjukdomar. I detta protokoll, har vi visat att det är möjligt att reproducera typiska periodiska stimulering experiment med liknande resultat som de som uppnås med konventionella extracellulära fält potentiella inspelning och externa stimulera elektroder. Den ökande tillgången till kommersiell användarvänlig utrustning och avancerad programvaruverktyg göra MEA inspelningsteknik passar även slutna stimulering experiment, att ge ad hoc- stimulering att hjärnvävnaden och undersöka bidraget av återkopplingsmekanismer till neuronala nätverk svaren.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

G.P. är Marie Skłodowska-Curie Fellow finansieras av Europeiska unionens behöriga myndigheters-om-2014 projektet Re.B.Us, G.A. n.660689, under ramen programmet Horisont 2020. Den GUI mapMEA är fritt tillgängliga på begäran till författare ilaria.colombi@iit.it.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine  Sigma-Adrich P7886 Needed for MEA coating
NaCl Sigma-Adrich S9888 Chemical
KCl Sigma-Adrich P9541 Chemical
KH2PO4 Sigma-Adrich 795488 Chemical
CaCl2*2 H2O Sigma-Adrich C3306 Chemical
D-Glucose Sigma-Adrich RDD016 Chemical
NaHCO3 Sigma-Adrich S5761 Chemical
MgCl2*6 H2O Sigma-Adrich M2670 Chemical
MgSO4*6 H2O Sigma-Adrich M5921 Chemical
Sucrose Sigma-Adrich RDD023 Chemical
Pyruvic Acid, 98%  Sigma-Adrich 107360 Chemical
4-aminopyridine Sigma-Adrich A78403 Convulsant drug
STG-2004 Multichannel System STG4004-1.6mA 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060 Multichannel System N/A MEA amplifier
planar MEA Multichannel System 60MEA500/30iR-Ti w/o ring Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack Multichannel System Recording software
McStimulus II Multichannel System STG4004 control software
TC02 Multichannel System TC02 2-channel thermostat
PH01 Multichannel System PH01 Heating perfusion canula
MPH  Multichannel System MPH  Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43 Wacker E43 Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber Crisel Instrument SKE-chamber MEA Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm  Crisel Instrument 64-1309 Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme Sigma-Adrich Z273287-1EA Enzymatic cleaner
MATLAB The Mathworks Programming environment for electrodemapping
VT1000S Leica Biosystems VT1000S Vibratome
Warner Instruments 64-1309 Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58, (4), 522-530 (2017).
  2. WHO. Epilepsy Facts Sheet. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
  3. Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14, (5), 444 (2014).
  4. Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78, (20), 1548-1554 (2012).
  5. Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17, (4), 339-349 (2008).
  6. Dingledine, R. Brain slices. Plenum Press. (1984).
  7. Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68, (3), 167-207 (2002).
  8. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54, (5), 1363-1374 (1985).
  9. Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57, (3), 869-888 (1987).
  10. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14, (5), 627-634 (2011).
  11. Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. (2017).
  12. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57, (6), 1911-1924 (1987).
  13. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6, (2-3), 101-105 (1977).
  14. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2, (1), 19-31 (1980).
  15. Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
  16. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
  17. Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171, (1), 268-283 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60, (7-8), 1142-1153 (2011).
  19. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29, (2), 319-327 (2009).
  20. Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
  21. MultichannelSystems. Manual PH01. Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
  22. Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34, (4), 1409-1419 (2014).
  23. Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39, (3), 372-380 (2010).
  24. Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17, (23), 9308-9314 (1997).
  25. Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
  26. Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566, (Pt 3), 885-900 (2005).
  27. D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19, (1-2), 119-128 (2005).
  28. Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096, (1), 70-84 (2006).
  29. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
  30. Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28, (4), 409-422 (2012).
  31. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, (9), e6925 (2009).
  32. Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7, (282), 282ra246 (2015).
  33. MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
  34. Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70, (2-3), 200-210 (2006).
  35. Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43, (3), 240-245 (2002).
Inspelning och modulering av Epileptiform aktivitet i gnagare hjärnan skivor kopplat till mikroelektrod matriser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).More

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter