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Neuroscience

Microelectrode सरणियों के साथ मिलकर मूषक मस्तिष्क स्लाइस में रिकॉर्डिंग और Epileptiform गतिविधि का मॉडुलन

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57548
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Rehab Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

हम microelectrode arrays का उपयोग कर कुतर मस्तिष्क स्लाइस में 4-aminopyridine प्रेरित epileptiform गतिविधि की रिकॉर्डिंग और विद्युत मॉडुलन प्रदर्शन करने के लिए कैसे वर्णन । एक कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर लंबे समय तक प्रयोगात्मक सत्र भर में ऊतक व्यवहार्यता रखता है । लाइव इलेक्ट्रोड मानचित्रण और उत्तेजक जोड़े का चयन एक कस्टम ग्राफिकल यूजर इंटरफेस द्वारा किया जाता है ।

Abstract

लौकिक पालि मिर्गी (TLE) सबसे आम आंशिक जटिल मिरगी सिंड्रोम और दवाओं के लिए कम से उत्तरदायी है । गहरी मस्तिष्क उत्तेजना (डीबीएस) एक आशाजनक दृष्टिकोण है जब औषधीय उपचार विफल रहता है या न्यूरोसर्जरी अनुशंसित नहीं है । तीव्र मस्तिष्क microelectrode arrays को युग्मित स्लाइसें (रहत) विद्युत उत्तेजना द्वारा एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए न्यूरॉन नेटवर्क बातचीत और उनके मॉडुलन का अध्ययन. पारंपरिक extracellular रिकॉर्डिंग तकनीक की तुलना में, वे अवलोकन अंक और एक ज्ञात अंतर इलेक्ट्रोड दूरी है, जो प्रचार मार्ग और electrophysiological की गति का अध्ययन करने की अनुमति की एक बड़ी संख्या के अतिरिक्त लाभ प्रदान संकेत. हालांकि, ऊतक ऑक्सीजन मेे रिकॉर्डिंग के दौरान काफी ख़राब हो सकता है, एक उच्च छिड़काव दर की आवश्यकता होती है, जो कम से कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और प्रयोगात्मक तापमान में उच्च दोलनों की कीमत पर आता है । विद्युत उत्तेजना आगे मस्तिष्क ऊतक तनाव, यह मुश्किल लंबे समय तक रिकॉर्डिंग का पीछा करने के लिए/ इसके अलावा, मस्तिष्क टुकड़ा गतिविधि के विद्युत मॉडुलन मस्तिष्क टुकड़ा के भीतर विशिष्ट संरचनाओं/रास्ते लक्ष्य की जरूरत है, कि इलेक्ट्रोड मानचित्रण आसानी से और जल्दी से प्रयोग के दौरान लाइव प्रदर्शन की आवश्यकता होती है. यहाँ, हम planar रहत का उपयोग कर कुतर मस्तिष्क स्लाइस में प्रेरित epileptiform गतिविधि-4-aminopyridine (4AP) की रिकॉर्डिंग और विद्युत मॉडुलन प्रदर्शन करने के लिए कैसे वर्णन । हम बताते हैं कि चूहों से प्राप्त मस्तिष्क ऊतक चूहे मस्तिष्क ऊतक का प्रदर्शन करता है और इस प्रकार मेे प्रयोगों के लिए बेहतर अनुकूल है । इस प्रोटोकॉल पीढ़ी और एक स्थिर epileptiform पैटर्न है कि ईमानदारी से electrophysiological पारंपरिक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के साथ मनाया सुविधाओं reproduces के रखरखाव की गारंटी देता है, कई घंटे के लिए बनी रहती है, और लगातार रहता है लंबे समय तक कछु के लिए बिजली की उत्तेजना । प्रयोग भर में ऊतक व्यवहार्यता एक छोटे मात्रा कस्टम रिकॉर्डिंग लामिना प्रवाह और त्वरित समाधान भी कम (1 मिलीलीटर/छिड़काव दरों पर विनिमय के लिए अनुमति चैंबर के उपयोग के लिए धंयवाद हासिल की है । वास्तविक समय निगरानी और उत्तेजक इलेक्ट्रोड के चयन के लिए त्वरित मेे मानचित्रण एक कस्टम ग्राफिक यूजर इंटरफेस (GUI) द्वारा किया जाता है ।

Introduction

मिर्गी मस्तिष्क की अनियंत्रित गतिविधि के कारण एक जीवन की धमकी प्रगतिशील विकार है1; यह रोग और महत्वपूर्ण सामाजिक कलंक2,3के सबसे अधिक बोझ के बीच किया जाता है । TLE सबसे अक्सर सिंड्रोम (४०%) और सबसे अक्सर (~ 30%) विरोधी मिरगी दवाओं के लिए प्रतिरोधी4। जबकि epileptogenic ऊतक के सर्जिकल पृथक रोगी की हालत उंनति कर सकते हैं, यह सभी रोगियों में संभव नहीं है और एक पूरी तरह से जब्ती मुक्त जीवन की गारंटी नहीं हो सकता है5। औषधीय उपचार या न्यूरोसर्जरी उपयुक्त नहीं हैं जब विद्युत डीबीएस द्वारा मिरगी अंगों का मॉडुलन एक आशाजनक दृष्टिकोण है ।

कुतर ब्रेन स्लाइस एक मूल्यवान उपकरण के अध्ययन के लिए कैसे ंयूरॉंस स्वास्थ्य और रोग में नेटवर्क समारोह6 के माध्यम से इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीकों में, के रूप में वे की रक्षा, कम से भाग में, मूल वास्तुकला और मस्तिष्क की कनेक्टिविटी (s) ब्याज के क्षेत्र (ROI) । विशेष रूप से, क्षैतिज संयुक्त हिप्पोकैम्पस-entorhinal प्रांतस्था (हिप्पोकैम्पस-ईसी) स्लाइसें TLE में शामिल आवश्यक न्यूरॉन नेटवर्क शामिल हैं और इसलिए नियमित रूप से इन विट्रो TLE अनुसंधान7में कार्यरत हैं ।

जब्ती की तरह गतिविधि तीव्रता से कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के ईओण संरचना बदलने से मस्तिष्क स्लाइस में प्रेरित किया जा सकता है, मैग्नीशियम को कम करने के रूप में बढ़ती जबकि पोटेशियम8,9,10, या औषधीय जोड़तोड़ के माध्यम से, जैसे निरोधात्मक GABAergic गतिविधि को अवरुद्ध (11 को व्यापक समीक्षा के लिए देखें) । हालांकि, इन मॉडलों उत्तेजना और निषेध के असंतुलित परिवर्तन पर आधारित हैं; इस प्रकार, वे बातचीत और उत्तेजक और निरोधात्मक नेटवर्क के ictogenesis को संगठित योगदान का अध्ययन करने की अनुमति नहीं है । convulsant दवा 4AP के साथ मस्तिष्क स्लाइस की सतत छिड़काव दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक neurotransmission को बढ़ाता है, इस प्रकार तीव्र ictogenesis का अध्ययन करने की अनुमति है, जबकि synaptic गतिविधि समग्र बरकरार रखते हुए12।

के रूप में पारंपरिक extracellular क्षेत्र की क्षमता रिकॉर्डिंग, जहां स्थानिक प्रतिबंध हो सकता है इलेक्ट्रोड की संख्या सीमा की तुलना में अवलोकन अंक की एक बड़ी संख्या से ंयूरॉंस नेटवर्क द्वारा उत्पंन बिजली की गतिविधि रिकॉर्डिंग अनुमति रहत मस्तिष्क टुकड़ा सतह पर समायोजित । इसके अलावा, विदेश मंत्रालय के चिप्स ज्ञात अंतर इलेक्ट्रोड दूरी है, जो बहुत प्रचार का पता लगाने और रिकॉर्ड संकेतों के यात्रा वेग का आकलन करने के लिए उपयोगी है के अतिरिक्त लाभ प्रदान करते हैं । हालांकि शुरू में प्रसंस्कृत न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए कल्पना की13,14, रहत अब भी कुतर15 और मनुष्यों16से प्राप्त तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की electrophysiological सुविधाओं की विशेषता के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. इस प्रकार, मिर्गी अनुसंधान के संदर्भ में, रहत ictogenesis16,17,18के कोर पर न्यूरॉन नेटवर्क बातचीत को इंगित करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

हालांकि, विदेश मंत्रालय की रिकॉर्डिंग स्वाभाविक प्राप्त करने या लंबे समय (कई घंटे) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल भर में एक स्थिर epileptiform पैटर्न को बनाए रखने में तकनीकी चुनौतियों वहन करती है । सबसे पहले, ऊतक ऑक्सीजन पर्याप्त नहीं हो सकता है के भीतर बड़े और दौर जलमग्न-प्रकार रिकॉर्डिंग चैंबर19,20 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रहत की खासियत है, जबकि खराब संकेत करने वाली शोर अनुपात और तापमान अस्थिरता को प्रभावित हो सकता है रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता जब एक उच्च छिड़काव दर (6-10 मिलीलीटर/मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए ऑक्सीजन की आपूर्ति में सुधार करने के लिए प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए देखें हीटिंग और छिड़काव उपकरण पर तकनीकीनोट21) । epileptiform फर्ज के रूप में उच्च आवृत्ति घटकों, की विशेषता दूसरा, आवर्तक निर्वहन, शायद ही देखा जाता है जब जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग मंडलों का उपयोग कर19; यह विशेष रूप से मामला है जब तीव्र epileptiform पैटर्न रासायनिक प्रेरित है और ephaptic तंत्र शामिल है, के रूप में यह 4AP मॉडल22 के लिए मामला है (एक व्यापक सिंहावलोकन के लिए11 देखें) । इन सीमाओं को दूर करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा कई रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है । उदाहरण के लिए, छिड़काव दर में वृद्धि19,20 जबकि मस्तिष्क टुकड़ा मोटाई को कम करने (≤ ३०० µ मीटर) और क्षेत्र17,18 ऊतक के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं । इसके अलावा, बेहतर मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता भी छिद्रित रहत (pMEAs), जो दोनों पक्षों से मस्तिष्क के ऊतकों को perfusing की अनुमति का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है18.

जबकि वर्णित दृष्टिकोण काफी मस्तिष्क स्लाइस से विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग की व्यवहार्यता में सुधार हुआ है, वे लंबे समय तक (कई घंटे) रिकॉर्डिंग और बिजली उत्तेजना सत्र के खिलाफ परीक्षण नहीं किया गया है, एक महत्वपूर्ण प्रतिनिधित्व उत्तरार्द्ध मस्तिष्क के ऊतकों के लिए तनाव । लंबे समय तक रिकॉर्डिंग सत्र epileptiform पैटर्न की विशिष्ट सुविधाओं है कि अल्पकालिक माप द्वारा नकाब उतारना संभव नहीं होगा के समय में विकास का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हो सकता है । डीबीएस अनुसंधान के संदर्भ में, लंबे समय तक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए और एक ही मस्तिष्क टुकड़ा में कई उत्तेजना मानदंड के प्रभाव की तुलना करने की आवश्यकता हो सकती है ।

जब केवल सहज विद्युत गतिविधि के लिए दर्ज की जरूरत है, रॉय के संबंध में इलेक्ट्रोड की मानचित्रण आमतौर पर किया जाता है एक posteriori, यानी, डेटा विश्लेषण के दौरान; इसके बजाय, पैदा की प्रतिक्रियाओं या बिजली के neuromodulation मानदंड के अध्ययन की आवश्यकता है कि उत्तेजना विशिष्ट रॉय (ओं) को दिया, प्रयोग के दौरान त्वरित और आसान रहते इलेक्ट्रोड मानचित्रण की जरूरत है हुक्म ।

यहां, हम एक सरल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि प्रेरण और वयस्क कुतर मस्तिष्क स्लाइस में एक स्थिर 4AP प्रेरित epileptiform पैटर्न के रखरखाव के लिए अनुमति देता है उदाहरण देकर स्पष्ट करना । मनाया गतिविधि ईमानदारी से इस मॉडल के रूप में पारंपरिक extracellular इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक का उपयोग कर विशेषता के electrophysiological सुविधाओं reproduces । यह कई घंटे के लिए बनी रहती है और दोहराया लंबे समय तक कछु के लिए निरंतर बिजली की उत्तेजना । कक्षों को बनाए रखने के लिए और मस्तिष्क स्लाइसें आसानी से मानक प्रयोगशाला की आपूर्ति (चित्र 1a) का उपयोग कर इकट्ठे किया जा सकता है, जबकि एक कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर इष्टतम समाधान विनिमय दर और लामिना प्रवाह (आंकड़ा 1b) के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल कर सकते है वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है या एक किफायती मूल्य पर 3 डी प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग । रॉय की त्वरित मानचित्रण (ओं) वास्तविक समय की निगरानी के लिए और उत्तेजक इलेक्ट्रोड के चयन के लिए एक कस्टम उपयोगकर्ता के अनुकूल जीयूआई नाम से संभव बनाया है mapMEA, स्वतंत्र रूप से अनुरोध पर उपलब्ध है ।

Figure 1
चित्र 1: इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किया जाने वाला कस्टम उपकरण. (क) वसूली के लिए होल्डिंग चैंबर, प्री-वार्मिंग, और 4AP में पूर्व-मशीन एक चोंच और एक पेट्री पकवान का उपयोग कर इकट्ठा कर रहे हैं । पेट्री डिश ब्रेकर से व्यास में छोटा होना चाहिए और जगह में एक सिरिंज गोताख़ोर के माध्यम से आयोजित किया जाता है । पेट्री डिश के नीचे एक नायलॉन जाल (नरम मोज़ा से) पेट्री पकवान के रिम पर cyanoacrylate के साथ चिपके की जगह है । ऑक्सीजन एक तुला रीढ़ की हड्डी सुई (22 ग्राम), पेट्री पकवान और चोंच की दीवारों के बीच डाला के माध्यम से आपूर्ति की है । बुलबुले चोंच के पक्ष से उभर जाना चाहिए और कभी नहीं तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा विस्थापन से बचने के लिए नायलॉन जाल । एक पेट्री डिश के ऊपर एक ढक्कन ACSF वाष्पीकरण से बचने और ऑक्सीजन संतृप्ति बनाए रखने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । (B) कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर । में: प्रवेश जलाशय हीटिंग प्रवेशनी और संदर्भ इलेक्ट्रोड को समायोजित करने के लिए । बाहर: आउटलेट जलाशय सक्शन सुई को समायोजित करने के लिए । आरईसी: रिकॉर्डिंग चैंबर । ( ग) ग्लास पाश्चर पिपेट, आग चमकाने के द्वारा कर्ल्ड, ऊतक संभाल और रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर अपनी स्थिति को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया । ( D) कस्टम स्लाइस होल्ड-डाउन एंकर । (ई) रिकॉर्डिंग चैंबर के अंतिम विधानसभा मेे चिप पर घुड़सवार । एक मस्तिष्क टुकड़ा लंगर द्वारा जगह में आयोजित नीचे पर टिकी हुई है । लाल तीर PTFE हीटिंग प्रवेशनी को कवर टयूबिंग इंगित करता है, जबकि लाल वृत्त संदर्भ इलेक्ट्रोड, एक संतृप्त KCl प्रवेश जलाशय में ACSF द्वारा जलमग्न गोली इंगित करता है । नीला तीर आउटलेट जलाशय में सक्शन सुई इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया है (प्राधिकरण n. 860/2015-पीआर) पशु कल्याण पर यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/ईसी के अनुपालन में ।

1. विदेश मंत्रालय/

नोट: प्रयोग से पहले 2 दिन की शुरुआत करें. एक अंगूठी के बिना एक विदेश मंत्रालय का उपयोग करें ( सामग्री तालिकादेखें) ।

  1. मेे सफाई (अवधि: ३५-४० मिनट) ।
    1. गर्म आसुत जल में एक एंजाइमी क्लीनर पाउडर भंग । विदेश मंत्रालय की सतह पर गर्म सफाई समाधान ब्रश तो कम से कम 3 एच के लिए गर्म सफाई समाधान में विदेश मंत्रालय सोख ।
    2. आसुत जल के साथ विदेश मंत्रालय कुल्ला और यह एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त कोई खरोंच ऊतक का उपयोग कर सूखी ।
  2. रिकॉर्डिंग चैंबर के साथ मेे इकट्ठे (अवधि: 10 मिनट + रातोंरात) ।
    1. समान रूप से रिकॉर्डिंग चैंबर के नीचे सतह पर elastomeric सीलेंट फैल गया । सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले हैं ।
    2. चिमटी की मदद से रिकॉर्डिंग चैंबर मेे पर माउंट और कोमल दबाव लागू होते हैं । किसी भी बुलबुले हैं, तो थोड़ा एक सर्कल में कक्ष ले जाते हैं, जबकि उंगलियों के साथ कोमल दबाव लागू जब तक सभी बुलबुले गायब हो गए हैं । रिकॉर्डिंग चैंबर के बाहरी सीमा के चारों ओर एक सीलेंट परत फैले ।
      नोट: महत्वपूर्ण! सीलेंट के साथ विदेश मंत्रालय के संपर्कों को कवर न करें ।
    3. एक 15 सेमी पेट्री डिश के अंदर विदेश मंत्रालय/ विदेश मंत्रालय के करीब 5 मिलीलीटर पेट्री डिश या 10 एमएल वाला चोंच भर आसुत पानी के साथ रखें । एक नम वातावरण बनाए रखने के लिए सब कुछ कवर । कमरे के तापमान पर रात भर इलाज करते हैं ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  3. कोट मेे यह हाइड्रोफिलिक (अवधि: 5-10 मिनट + रातोंरात) बनाने के लिए ।
    1. मेे एक 15 सेमी पेट्री डिश में रखें । ५० µ के पाली-डी-मेे रिकॉर्डिंग क्षेत्र पर lysine एल डालो । पेट्री डिश बंद, यह सील फिल्म के साथ सील, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान ।
    2. आसुत जल का उपयोग करके मेे अच्छी तरह से कुल्ला करें और आसुत जल में 4 डिग्री सेल्सियस पर विदेश मंत्रालय की दुकान ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । लेपित रहत संग्रहित किया जा सकता है और कई प्रयोगों के लिए reused । नियमित रूप से सफाई और पुनः कोटिंग मेे मदद करता है ऊतक मलबे को हटाने और संकेत करने के लिए शोर अनुपात में सुधार होगा ।

2. स्टॉक समाधानों की तैयारी

नोट: प्रयोग से पहले 1 दिन (अवधि: ~ 2 h) प्रारंभ करें । शेयर समाधान प्रयोगात्मक दिन पर प्रयोग स्पीड अप मदद करते हैं । वे पहले से तैयार किया जा सकता है और संग्रहीत । एकाग्रता कारक और संरचना के लिए तालिका 1 देखें । अंतिम समाधान की संरचना के लिए तालिका 2 देखें ।

  1. कमरे के तापमान पर आसुत जल में रसायनों को भंग । फ़िल्टर बोतल के साथ शेयर समाधान फ़िल्टर (फिल्टर व्यास: ०.२२ µm) ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (अनुशंसित अधिकतम संग्रहण समय के लिए तालिका 1 देखें) ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

3. आगर की तैयारी

नोट: प्रयोग से पहले 1 दिन (अवधि: ~ 1 h) प्रारंभ करें ।

  1. एक ५०० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की २५० मिलीलीटर डालो और ३५० rpm पर सरगर्मी शुरू करते हैं । आगर के 5 ग्राम जोड़ें और जब तक यह पूरी तरह से भंग है रुको ।
  2. २५०-३०० डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्मी । पानी जब तक समाधान है ~ २०० मिलीलीटर एक २.५% w/v आगर समाधान उपज है ।
    नोट: तापमान पर्याप्त उच्च के लिए bubbling बिना पानी लुप्त हो जाना चाहिए ।
  3. एक २०० मिलीलीटर प्लास्टिक के वर्ग बॉक्स पर आगर समाधान डालो ~ १.५ cm-उच्च दीवारों और इसे कमरे के तापमान पर ठंडा जब तक यह ठोस हो जाता है ।
  4. बॉक्स कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान । आगर ब्लॉक कई हफ्तों से अच्छा है ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

4. जमे हुए विमान की तैयारी

नोट: प्रयोग से पहले 1 दिन की शुरुआत करें ।

  1. रिम नीचे ०.५-1 सेमी तक आसुत जल के साथ एक फ्लैट नीचे स्टेनलेस स्टील कटोरा भरें ।
  2. -20 डिग्री सेल्सियस रात भर की दुकान ।

5. न्यूरोप्रोटेक्टिव कटिंग ACSF की तैयारी

नोट: experiment या प्रयोग के उसी दिन से 1 दिन पहले प्रारंभ करें ( तालिका 1 और तालिका 2देखें) (अवधि: 30 min) ।

  1. एक ५०० मिलीलीटर चोंच में आसुत पानी की २०० मिलीलीटर डालो और ३५० rpm पर एक चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर सरगर्मी शुरू करते हैं ।
  2. स्टॉक B का ५० ml और स्टॉक C का ५० ml जोड़ें ( तालिका 1देखें) ।
  3. 3 मिमी पाइरुविक एसिड, २०८ मिमी सुक्रोज, 10 मिमी डी-ग्लूकोज, और 1 मिमी एल-ascorbic एसिड जोड़ें ।
    नोट: पाइरुविक एसिड की वास्तविक मात्रा घनत्व और पवित्रता पर निर्भर करता है और बैच के साथ भिंन हो सकते हैं । एक नया बैच खोलते समय हमेशा आवश्यक वॉल्यूम की गणना करें ।
  4. फिल्म सील के साथ कवर और चलो 30 मिनट के लिए हलचल ।
  5. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी और आसुत जल जोड़ने के लिए कुप्पी भरने के लिए समाधान स्थानांतरण ।
  6. सील फिल्म के साथ volumetric कुप्पी मुहर और धीरे 3-5 बार पलटना जब तक समाधान समान रूप से स्पष्ट है ।
  7. टोपी के साथ एक गिलास बोतल में काटने ACSF हस्तांतरण ।
  8. ACSF पर काटने की दुकान-८० ° c 20-30 मिनट के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए शांत करने के लिए 4 ° c ।
    नोट: यदि रातोंरात कूलिंग पसंद की जाती है तो प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है । अंयथा काटने ACSF ठंडा करने के लिए आवश्यक समय 6 कदम आगे बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

6. होल्डिंग ACSF की तैयारी

नोट: प्रयोग के दिन पर ताजा समाधान तैयार करें (अवधि: 5-10 मिनट). होल्डिंग ACSF टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान काटने ACSF से मस्तिष्क के स्लाइस कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (८.१६ कदम देखें) और मस्तिष्क के लिए लंबी अवधि के भंडारण और पूर्व वार्मिंग टुकड़ा । मस्तिष्क स्लाइस कुल्ला करने के लिए, होल्डिंग ACSF के १०० मिलीलीटर पर्याप्त है । होल्डिंग और पूर्व वार्मिंग चैंबर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया कस्टम कर रहे है और ३०० मिलीलीटर और १०० मिलीलीटर, क्रमशः (cf. चित्र 1a) की एक मात्रा होते हैं । इस सेटिंग के साथ, होल्डिंग ACSF के ५०० मिलीलीटर पर्याप्त है । वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त कक्षों में एक अलग मात्रा हो सकती है, जिस स्थिति में होल्डिंग ACSF को तैयार करने की समग्र राशि तदनुसार समायोजित की जानी चाहिए.

  1. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में आसुत पानी की २०० मिलीलीटर डालो ।
  2. शेयर के ५० मिलीलीटर एक, स्टॉक बी की ५० मिलीलीटर, स्टॉक एम के ६.५ मिलीलीटर, और 1 मिमी एल-ascorbic एसिड जोड़ें । धीरे L-ascorbic एसिड पूरी तरह से भंग हो गया है जब तक आंदोलनों घूर्णन का उपयोग कर आंदोलन ।
  3. आसुत जल जोड़ें अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए, सील फिल्म के साथ volumetric कुप्पी सील, और धीरे 3-5 बार पलटना जब तक समाधान समान रूप से स्पष्ट है । होल्डिंग ACSF संरचना के लिए तालिका 2 देखें ।

7. प्रायोगिक बेंचों की तैयारी

नोट: यह 15 मिनट की आवश्यकता है, प्लस 30 मिनट गर्म स्नान के एक स्थिर तापमान प्राप्त करने के लिए ।

  1. रिकॉर्डिंग पीठ
    1. गर्म स्नान शुरू, यह ३२ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट, और यह अपने तापमान को बनाए रखने के लिए कवर किया ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल गर्म स्नान कस्टम किया जा सकता है एक कठिन प्लास्टिक बॉक्स और वांछित तापमान पर एक मछलीघर थर्मोस्टेट पूर्व निर्धारित का उपयोग कर बनाया । स्थिर वांछित तापमान ~ 30 मिनट कमरे के तापमान से शुरू में पहुंचा जा सकता है । चूंकि पूर्व वार्मिंग और मशीन चैंबर प्लास्टिक बॉक्स के तल पर बैठते हैं, पानी के स्तर को सिर्फ थर्मोस्टेट इतनी के रूप में तैरते से चैंबर रखने के लिए कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।
    2. इकट्ठा होल्डिंग और पूर्व वार्मिंग मंडलों (cf. चित्र 1a), और उंहें में धारण ACSF डालना । कमरे के तापमान पर होल्डिंग चैंबर रखें और गर्म स्नान के अंदर पूर्व वार्मिंग चैंबर जगह है । ९५% O2/5% कं2 गैस मिश्रण के साथ समाधान bubbling शुरू और किसी भी फंस एक औंधा पाश्चर पिपेट का उपयोग कर बुलबुले को हटा दें । ढक कर रखें ।
  2. टुकड़ा करने की क्रिया पीठ और vibratome
    1. गोंद cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर नमूना डिस्क के केंद्र पर एक छोटे से आगर ब्लॉक ।
    2. एक बर्फ बाल्टी में एक २५० मिलीलीटर चोंच रखो और इसे काटने में ACSF डालना ।
    3. २ १०० मिलीलीटर यूरिन लें और प्रत्येक में ACSF होल्डिंग के ५० मिलीलीटर डालें । कमरे के तापमान पर यूरिन छोड़ दें । ये कुल्ला करने वाला यूरिन है ।
    4. एक ९५% ओ2के साथ समाधान bubbling शुरू करें2 /
    5. vibratome पर बफर ट्रे माउंट और यह कुचल बर्फ के साथ चारों ओर । कुचल बर्फ पर कुछ इथेनॉल डालो टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान ठंड के तापमान को बनाए रखने में सहायता । इथेनॉल डालने के बाद, अधिक बर्फ की जरूरत के रूप में जोड़ें ।
      नोट: 2 डिग्री सेल्सियस का तापमान इष्टतम है ।
    6. बफर ट्रे के अंदर bubbler प्लेस, तो इकट्ठा और vibratome ब्लेड ब्लॉक माउंट ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि ब्लेड ~ 10 ° की मंजूरी कोण पर मुहिम शुरू की है ।
    7. मात्रा के 2/3 तक एक ५०० मिलीलीटर चोंच में कुचल बर्फ रखो और आसुत जल के साथ भरें ।
    8. फ्रीजर से बाहर जमे हुए कटोरा ले लो, यह जगह उल्टा टुकड़ा करने की क्रिया पीठ पर नीचे, और यह एक कागज तौलिया और एक फिल्टर कागज डिस्क के साथ कवर ।
  3. संज्ञाहरण पीठ
    1. एक बर्फ भरी ट्रे में एक छोटी कटोरी रखें और उस में ACSF काटने डालो । एक ९५% ओ2के साथ bubbling शुरू%2 सह गैस मिश्रण ।

8. ब्रेन स्लाइस तैयारी और रखरखाव

नोट: इस प्रोटोकॉल वयस्क का उपयोग करता है (4-6 सप्ताह पुराने) पुरुष CD1 चूहों, लेकिन अंय उपभेदों(जैसे, c57/bl617, 18) इस्तेमाल किया जा सकता है । हम भी बाद में प्रयोगात्मक एक ही उंर के पुरुष Sprague-Dawley चूहों से प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस द्वारा झुकेंगे के साथ माउस मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग कर प्राप्त उत्पादन की तुलना करें । निंनलिखित चरणों में आंशिक रूप से डिस्कनेक्ट मस्तिष्क स्लाइस जिसमें CA3 चालित तेजी से interictal गतिविधि हिप्पोकैम्पस उचित करने के लिए प्रतिबंधित है और parahippocampal cortices के लिए प्रचार नहीं कर सकते है की तैयारी करने के लिए देखें, के रूप में 23में बताई । हिप्पोकैम्पस-प्रांतस्था वियोग हिप्पोकैम्पस-चुनाव आयोग मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी का उपयोग करने में विद्युत मॉडुलन अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए एक पूर्व अपेक्षित है । उपयोग किया गया vibratome सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध मॉडल को संदर्भित करता है । अंय मॉडल एक अलग प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है ।

  1. Anesthetize एक carbogen गैस 2 एल पर एक संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष के लिए दिया मिश्रण में isoflurane 5% का उपयोग कर कुतर/
  2. गहरी संज्ञाहरण के तहत (पैर और पंजे चुटकी के जवाब में कोई सजगता),23में के रूप में मानक प्रक्रियाओं के बाद 1 मिनट के भीतर मस्तिष्क निकालने. equilibrated बर्फ युक्त छोटी कटोरी में मस्तिष्क प्लेस-ठंड काटने ACSF और चलो ९०-१२० एस के लिए ठंडा ।
    नोट: मस्तिष्क को बहुत देर तक सर्द न होने दें, अन्यथा यह फ्रीज हो सकता है ।
  3. बफर ट्रे में बर्फ ठंडा काटने ACSF डालो । जमे हुए कटोरा पर रखा फिल्टर कागज पर ACSF काटने फैल गया । फिल्टर कागज पर मस्तिष्क प्लेस और सेरिबैलम को हटाने और सीधे बाहर ललाट पोल काटने से आवश्यक मस्तिष्क ऊतक ब्लॉक को अलग ।
  4. एक तुला रंग की मदद के साथ, कट ललाट पक्ष के साथ नमूना डिस्क पर मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष गोंद आगर ब्लॉक का सामना करना पड़ रहा है और पश्चकपाल vibratome ब्लेड का सामना करना पड़ पोल । cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत का प्रयोग करें । नमूना डिस्क को बफ़र ट्रे में तुरंत रखें और उसे सुरक्षित करें ।
  5. अनुभागीय रेंज को समायोजित करें ताकि vibratome ब्लेड को आगर ब्लॉक तक टिशू में सभी तरह से ले जाया जा सके । नमूना डिस्क ऊंचाई को समायोजित मस्तिष्क ऊतक ब्लॉक के साथ ब्लेड स्तर तक पहुंचने के लिए ।
  6. हिप्पोकैम्पस स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है जब तक ऊतक वर्गों त्यागें (आमतौर पर ~ ९०० µm). फिर, ४०० µm की एक स्लाइस मोटाई सेट और ऊतक वर्गों को बनाए रखने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करते हैं । प्रत्येक मस्तिष्क अनुभाग के लिए दो गोलार्द्धों विभाजित और दो मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करने के लिए अनावश्यक ऊतक ट्रिम कर दीजिए. के रूप में बफर ट्रे बाद वर्गों के दौरान बढ़ रहा है, ठंडी आसुत जल के साथ बफर ट्रे वृद्धाश्रम भरें (कदम 7.2.7 देखें) ।
  7. एक उल्टे पाश्चर पिपेट का प्रयोग करके धीरे से ब्रेन स्लाइस को पहले कुल्ला करने वाले यूरिन में ट्रांसफर कर दीजिये, पाश्चर पिपेट को खाली कर दीजिये, और ब्रेन स्लाइस को दूसरी कुल्ला करने वाले यूरिन में ट्रांसफर कर दीजिये. फिर, मस्तिष्क स्लाइस होल्डिंग चैंबर में स्थानांतरण और उंहें कम से कम ६० मिनट के लिए ठीक ।
    नोट: आमतौर पर यह 6-8 मस्तिष्क स्लाइसें समग्र प्राप्त करने के लिए संभव है । प्रोटोकॉल यहां ठहर सकता है ।

9. ACSF युक्त 4-एपी (4AP-ACSF) की तैयारी

नोट: यह तैयारी के लिए 10 मिनट की आवश्यकता है, प्लस वार्मिंग के 20 मिनट । सावधानी! 4-एपी एक convulsant दवा है और यह विषाक्त है । दस्ताने के साथ संभाल और फैल से बचें ।

  1. एक ५०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में आसुत पानी की २०० मिलीलीटर डालो ।
  2. शेयर के ५० मिलीलीटर एक, स्टॉक बी की ५० मिलीलीटर, स्टॉक एम के 5 मिलीलीटर, और 1 मिमी एल-ascorbic एसिड जोड़ें । धीरे आंदोलन घूर्णन आंदोलनों का उपयोग कर जब तक एल ascorbic एसिड पूरी तरह से भंग है ।
  3. 4AP स्टॉक के ५०० µ l को जोड़ें ।
  4. आसुत जल जोड़ें अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए, फिल्म सील के साथ volumetric कुप्पी सील, और धीरे से यह 3-5 बार पलटना जब तक समाधान समान रूप से स्पष्ट है ।
  5. 4AP मशीनिंग चैंबर (cf. figure 1a) को इकट्ठा करने और इसे में 4AP-ACSF के ~ ८० मिलीलीटर डालो । चैंबर कवर, यह गर्म स्नान करने के लिए स्थानांतरण, और एक ९५% के साथ bubbling शुरू2/ किसी भी फंस बुलबुले एक औंधा पाश्चर पिपेट का उपयोग कर निकालें । ढक कर रखें ।
  6. 4AP-ACSF तापमान 30-32 ° c (~ 20 मिनट) है जब तक प्रतीक्षा करें ।
    नोट: यदि मस्तिष्क स्लाइस अभी भी ठीक कर रहे है प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

10. पूर्व वार्मिंग और 4AP में स्लाइस की मशीन (अवधि: ९० मिनट)

  1. जांच करें कि प्री-वार्मिंग ACSF और 4AP-ACSF तापमान 30-32 डिग्री सेल्सियस है ।
  2. एक औंधा गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए पूर्व वार्मिंग चैंबर में 1 मस्तिष्क टुकड़ा हस्तांतरण और 25-30 मिनट के लिए ऊतक आराम करते हैं । फिर 4AP-ACSF मशीनिंग चैंबर में मस्तिष्क टुकड़ा हस्तांतरण और इसे ६० मिनट के लिए आराम करते हैं ।

11. मेे सेट-अप की तैयारी

नोट: रिकॉर्डिंग से पहले 15 मिनट शुरू करें ।

  1. 4AP-ACSF के शेष खंड को ५०० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में स्थानांतरित करते हैं ।
  2. विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर के ऊपर एक शेल्फ पर Erlenmeyer कुप्पी प्लेस और टयूबिंग का उपयोग करने के लिए लगातार एक ६० मिलीलीटर सिरिंज फ़ीड करने के लिए समाधान की अनुमति । Erlenmeyer कुप्पी और सिरिंज की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए एक गुरुत्वाकर्षण फेड दर की अनुमति देने के लिए 1 मिलीलीटर/
    नोट: सही ऊंचाई टयूबिंग भीतरी व्यास (आईडी) पर निर्भर करता है । 5/32 इंच आईडी की टयूबिंग के लिए, 30 सेमी पर्याप्त हैं ।
  3. bubbling शुरू 4AP-Erlenmeyer कुप्पी में ACSF और एक ९५% के साथ सिरिंज में2/5% CO2 गैस मिश्रण ।
  4. एक चोंच में छिड़काव टयूबिंग के माध्यम से 4AP-ACSF प्रवाह चलो जब तक वहां कोई हवा अंदर है; तब समाधान प्रवाह रोकें ।
  5. थर्मोस्टेट बेस पर हीटिंग तत्व को कनेक्ट करें । शुष्क मेे चिप मेे एम्पलीफायर के अंदर रखें और वर्धक सिर को सुरक्षित करें । रिकॉर्डिंग चैंबर के प्रवेश और बाहरी जलाशय के लिए 4AP-ACSF हस्तांतरण करने के लिए एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें ।
  6. एक चुंबकीय धारक को हीटिंग प्रवेशनी सुरक्षित और रिकॉर्डिंग चैंबर प्रवेश बंदरगाह के अंदर अपनी टिप जगह; चुंबकीय धारक को विदेश मंत्रालय के एम्पलीफायर सिर पर एक चुंबकीय पट्टी करने के लिए संलग्न; प्रवेशनी करने के लिए छिड़काव टयूबिंग कनेक्ट; थर्मोस्टेट के लिए प्रवेशनी कनेक्ट ।
    नोट: हीटिंग प्रवेशनी बेवल्ड polytetrafluoroethylene (PTFE) टयूबिंग द्वारा कवर किया जाना चाहिए रिकॉर्डिंग चैंबर प्रवेश बंदरगाह तक पहुंचने के लिए और प्रवेशनी की धातु सामग्री के कारण शोर को कम करने के लिए । जब प्रवेश जलाशय पर्याप्त रूप से 4AP-ACSF से भरा है, छिड़काव प्रणाली से गिरने बूंदें दिखाई नहीं होना चाहिए ।
  7. जलाशय के अंदर सक्शन सुई प्लेस और सत्यापित करें कि ACSF में सक्शन सुई को विलय करके नकारात्मक दबाव है; एक निरंतर कम आवृत्ति सक्शन शोर के लिए जाँच करें ।
    नोट: सक्शन सुई तो रखा जाना चाहिए के रूप में 4AP-ACSF सिर्फ मस्तिष्क टुकड़ा सतह के ऊपर प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए । एक वैक्यूम लाइन या कम शोर वैक्यूम पंप इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  8. प्रवाह नियामक 1 एमएल/मिनट की एक प्रवाह दर की अनुमति देने के लिए सेट और perfusing शुरू करते हैं ।
    नोट: गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव शोर है कि सिकुड़नेवाला पंपों की वजह से हो सकता है समाप्त; यदि सिकुड़नेवाला पंप पसंद कर रहे हैं, कम शोर मॉडल अनिवार्य हैं ।
  9. एक बार 4AP-ACSF प्रवेशनी के माध्यम से बह रहा है, थर्मोस्टेट पर बारी । ३७ डिग्री सेल्सियस और विदेश मंत्रालय के आधार पर ३२ डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग प्रवेशनी सेट करने के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर के अंदर ३२-३४ डिग्री सेल्सियस का तापमान प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: सावधानी! कभी नहीं प्रवेशनी में समाधान के बिना गर्मी या यह क्षतिग्रस्त अचल हो सकता है । सेट मूल्य और हीटिंग प्रवेशनी की नोक पर और रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर वास्तविक मूल्य के बीच ऑफसेट आंतरिक तापमान के लिए खाते में रिकॉर्डिंग तापमान (यानी, ३२-३४ डिग्री सेल्सियस) से अधिक प्रवेशनी के तापमान निर्धारित करें । प्रवाह की दर, पर्यावरण के तापमान, और रिकॉर्डिंग चैंबर की मात्रा सभी रिकॉर्डिंग समाधान के तापमान को प्रभावित करते हैं । चरण ११.९ में रिपोर्ट की गई सेटिंग्स वर्णित प्रोटोकॉल और उपकरणों के लिए ऑप्टिमाइज़ की गई हैं । हमेशा एक thermocouple का उपयोग कर वास्तविक रिकॉर्डिंग तापमान की जाँच करें और जरूरत के रूप में सेटिंग्स को समायोजित । मस्तिष्क स्लाइस overheating से बचने के लिए ३४ ° c ऊपर मेे आधार गर्मी मत करो ।
  10. रिकॉर्डिंग चैंबर प्रवेश जलाशय में बाहरी संदर्भ इलेक्ट्रोड प्लेस ।
    नोट: हालांकि विदेश मंत्रालय के चिप्स एक आंतरिक संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ सुसज्जित हैं, यह कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर द्वारा कवर किया जाता है. इस प्रकार, एक बाहरी संदर्भ इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाना चाहिए । एक संतृप्त KCl गोली सबसे व्यावहारिक है, क्योंकि यह chlorination के लिए जरूरत के बिना उपयोग करने के लिए तैयार है ।

12. मेे रहते मानचित्रण

  1. 4AP-ACSF स्तर और रिकॉर्डिंग तापमान वांछित के रूप में स्थिर कर रहे हैं एक बार, छिड़काव और सक्शन stopcocks बंद स्थिति के लिए अस्थायी रूप से उन्हें रोकने के लिए बारी.
    1. जल्दी से एक औंधा गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर मेे रिकॉर्डिंग चैंबर पर एक मस्तिष्क टुकड़ा हस्तांतरण । एक आग पॉलिश कर्ल्ड पाश्चर पिपेट (चित्रा 1C) या एक नरम कॉंपैक्ट छोटे ब्रश का उपयोग कर की जरूरत के रूप में विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग क्षेत्र पर अपनी स्थिति को समायोजित करें । ब्रेन स्लाइस पर होल्ड-डाउन एंकर (चित्र 1 d) रखें. छिड़काव और चूषण अपने stopcocks को वापस चालू स्थिति में बदल कर पुनः आरंभ करें ।
      नोट: महत्वपूर्ण! टुकड़ा स्थानांतरित किया जाना चाहिए, और छिड़काव के भीतर पुनः आरंभ ६० s या ऊतक मर सकता है । स्लाइस होल्ड-डाउन एंकर को 4AP-ACSF में रखा जाना चाहिए, जबकि सतही तनाव में मतभेदों के कारण ब्रेन स्लाइस पर लंगर को चलते हुए ब्रेन स्लाइस को बढ़ने से रोकना चाहिए । लंगर मेे पर मस्तिष्क टुकड़ा सुरक्षित करने के लिए कस्टम स्टेनलेस स्टील वायर और नायलॉन धागे का उपयोग किया जा सकता है (चित्र 1 d) या वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त की । चित्रा 1E अंतिम प्रायोगिक सेट-मेे चिप के साथ एम्पलीफायर के सिर से जुड़ा से पता चलता है: एक मस्तिष्क टुकड़ा रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर मेे चिप पर आराम कर नीचे कस्टम एंकर द्वारा आयोजित किया जाता है । संदर्भ इलेक्ट्रोड (लाल वृत्त) और हीटिंग प्रवेशनी (लाल तीर) को कवर PTFE टयूबिंग प्रवेश जलाशय में तैनात हैं, जबकि सक्शन सुई (नीला तीर) आउटलेट जलाशय में तैनात है ।
  2. एक औंधा माइक्रोस्कोप मंच पर घुड़सवार एक कैमरा का उपयोग कर मस्तिष्क स्लाइस की एक तस्वीर ले लो.
  3. कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर पर स्क्रिप्ट mapMEA चलाएं GUI को मैप करने के लिए प्रारंभ करने के लिए इलेक्ट्रोड ।
    नोट: कस्टम-निर्मित सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता मस्तिष्क टुकड़ा के विशिष्ट संरचनाओं के अनुरूप इलेक्ट्रोड का चयन करने के लिए अनुमति देता है. यह कदम सही मार्ग को सक्रिय करने और बिजली की उत्तेजना का उपयोग करके ictal गतिविधि को दबाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

Figure 2
अंजीर 2: लाइव मेे इलेक्ट्रोड मैपिंग के लिए GUI । (क) संयुक्त हिप्पोकैम्पस-चुनाव आयोग स्लाइस विदेश मंत्रालय पर तैनात की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए गए डिफ़ॉल्ट संरचनाएं cornu ammonis 3 (CA3), enthorinal प्रांतस्था (ईसी), perirhinal प्रांतस्था (PC), और subiculum (उप) हैं । संदर्भ इलेक्ट्रोड एक त्रिकोण मार्कर के रूप में schematized है. इलेक्ट्रोड बिंदीदार रेखाओं में घेर छवि सीधे के लिए XY निर्देशांक का प्रतिनिधित्व करते हैं । (B) लाइव मेे मैपिंग के दौरान GUI का स्क्रीन कैप्चर । कैप्चर के बाईं ओर प्रवाह चार्ट चरण दर चरण प्रक्रिया का पालन करने के लिए इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. ब्रेन स्लाइस के चित्र को लोड करने के लिए ब्राउज़ बटन क्लिक करें । सुनिश्चित करें कि संदर्भ इलेक्ट्रोड मेे (चित्र 2a, त्रिभुज चिह्न) के बाएं आधे किनारे की ऊपरी पंक्ति में प्रकट होता है । सूचक सक्रिय करें बटन पर क्लिक करके, फिर XY को छवि सीधे और इलेक्ट्रोड मैपिंग के लिए निर्देशांक चिह्नित करने के लिए सरणी की सबसे बाईं पंक्ति में ऊपर और नीचे इलेक्ट्रोड का चयन करें ।
  2. स्लाइस प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू से क्षैतिजका चयन करें । डिफ़ॉल्ट संरचना एं चेकबॉक्स को चुनें ।
    नोट: यह नई संरचनाएं दर्ज करें बटन का चयन करके संरचनाओं को अनुकूलित करने के लिए संभव है । क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस के लिए डिफ़ॉल्ट संरचनाओं चित्र 2aमें दर्शाया गया है ।
  3. मस्तिष्क टुकड़ा चित्र के नीचे गिने pushbuttons का उपयोग करना, रॉय के लिए इसी इलेक्ट्रोड का चयन करें और उन्हें (चित्रा बी.) आवंटित करने के लिए संरचनाओं पैनल में इसी pushbutton क्लिक करें; प्रत्येक ROI के लिए इस चरण को दोहराएँ.
  4. सहेजें बटन दबाएं: सॉफ़्टवेयर चयनित इलेक्ट्रोड और ROIs की रिपोर्ट करने वाली तालिका वाले #EXP_LabelledElectrodes नामक एक परिणाम फ़ोल्डर जेनरेट करता है.

13. रिकॉर्डिंग और Epileptiform गतिविधि के विद्युत मॉडुलन

  1. रिकॉर्डिंग से पहले 5-10 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर स्थिर करने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा की अनुमति दें ।
  2. उत्तेजना इकाई पर बारी उत्तेजना प्रोटोकॉल करने के लिए पहले से कम 10 मिनट आत्म अंशांकन और स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए । उत्तेजना नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू और पुष्टि करें कि उत्तेजितकर्ता और विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर सही ढंग से उत्तेजना नियंत्रण सॉफ्टवेयर के मुख्य पैनल में एक हरे रंग की एलईडी द्वारा संकेत के रूप में जुड़े हुए हैं । कृपया अतिरिक्त विवरण, cf. सामग्री तालिकाके लिए विशिष्ट उपकरणों और सॉफ़्टवेयर की नियमावली देखें ।
  3. द्विध्रुवी विंयास में उत्तेजना की स्थापना की । CA1/समीपस्थ subiculum (cf.24,25) के पिरामिडीय कोशिका परत के साथ संपर्क में इलेक्ट्रोड जोड़े का चयन करें स्क्रिप्ट mapMEA (cf. धारा 12) के साथ मैप किए गए लोगों के बीच. एक तार का उपयोग करने के लिए चयनित इलेक्ट्रोड के नकारात्मक प्लग करने के लिए कनेक्ट करने के लिए एक उत्तेजक और अन्य इलेक्ट्रोड के सकारात्मक प्लग करने के लिए एक ही उत्तेजितकर्ता चैनल. एक और तार का उपयोग करने के लिए एम्पलीफायर के जमीन के लिए उत्तेजक की जमीन से कनेक्ट.
  4. रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें । डेटा प्राप्त करने के लिए, रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर के मुख्य फलक में चलाएं बटन दबाएं । रिकार्ड में कम से 4 ictal फर्ज है ।
    नोट: 2 kHz की एक नमूना आवृत्ति हार्ड डिस्क स्थान उपयोग को कम करते हुए उचित संकल्प के साथ क्षेत्र क्षमता प्राप्त करने की अनुमति देता है. एक 5-ंयूनतम रिकॉर्डिंग फ़ाइल लेता है ~ ८० एमबी । उच्च नमूना आवृत्तियों की आवश्यकता हो सकती है, जैसे, उत्तेजना कलाकृतियों या बहु इकाई गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए. केवल क्षेत्र क्षमता का पालन करने के लिए, ३०० हर्ट्ज पर एक जीवित कम पास फिल्टर का उपयोग करने के लिए बहु इकाई गतिविधि में कटौती ।
  5. उत्तेजना तीव्रता निर्धारित करते हैं ।
    1. उत्तेजना नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, मुख्य पैनल का उपयोग करने के लिए एक वर्ग biphasic सकारात्मक नकारात्मक वर्तमान पल्स अवधि के डिजाइन १०० µs/
      नोट: सावधानी! प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना एक संतुलित प्रभारी नाड़ी की आवश्यकता के लिए उपकरण हानिकारक से बचें ।
    2. सबसे अच्छा उत्तेजना तीव्रता की पहचान करने के लिए एक तेज इनपुट/आउटपुट (I/O) परीक्षण चलाएं । उत्तेजना नियंत्रण सॉफ्टवेयर के उपयुक्त रूप में 5 एस या लंबे समय के एक अंतर पल्स अंतराल जोड़ने के द्वारा ०.२ हर्ट्ज या कम पर कदम 13.5.1 पर डिजाइन उत्तेजन पल्स उद्धार । पल्स आयाम टैब में एक प्रारंभिक पल्स आयाम दर्ज करें १०० µA/चरण और ५० द्वारा वृद्धि-१०० µA कदम प्रत्येक परीक्षण पर जब तक उत्तेजना मज़बूती से parahippocampal cortices में interictal की तरह घटनाओं पैदा कर सकते है (द्वारा visualized संकेतों की जांच करें रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर) ।
  6. अंग ictogenesis के विद्युत मॉडुलन
  7. कार्यक्रम उत्तेजना इकाई ब्याज की उत्तेजना प्रोटोकॉल उद्धार करने के लिए । उत्तेजना मैं/O परीक्षण के दौरान पहचान आयाम का प्रयोग करें ।
    नोट: उदाहरण के लिए प्रतिक्रियाओं की विफलता दर ≤ 20% होना चाहिए ।
  8. उत्तेजना बंद हो जाता है के बाद, पहले से कम 4 ictal निर्वहन रिकॉर्डिंग द्वारा पूर्व उत्तेजना हालत के लिए नेटवर्क वसूली सत्यापित (के रूप में १३.४ चरण में) ।

Representative Results

Planar रहत के साथ 6 x 10 लेआउट और ५०० µm इलेक्ट्रोड रिक्ति यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए आदर्श रिकॉर्डिंग डिवाइस हैं, के बाद से उनके रिकॉर्डिंग क्षेत्र अपनी संपूर्णता में मस्तिष्क टुकड़ा भर में फैला है (चित्र 3, यह भी17देखें). हालांकि छिद्रित रहत (pMEAs) ऊतक ऑक्सीजन में सुधार करने के लिए बेहतर होगा, उनके रिकॉर्डिंग क्षेत्र बहुत छोटा है (~ 2 मिमी व्यास). यह हिप्पोकैम्पस और parahippocampal cortices द्वारा उत्पंन विद्युत संकेतों के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति नहीं देता है (डेटा नहीं दिखाया गया है;18देखें) ।

मनाया 4AP-प्रेरित epileptiform पैटर्न (आंकड़ा 3ए) ईमानदारी से reproduces क्या आम तौर पर इस में इन विट्रो मॉडल पारंपरिक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग का उपयोग कर में मनाया जाता है और गतिविधि के तीन प्रकार के7शामिल, 26: (i) ictal-घटनाओं की तरह (चित्र3बी, ऐरोहेड) मजबूत लंबे समय से स्थाई है (> 20 एस, रेंज: 20-60 एस) टॉनिक और क्लोनल घटकों के साथ जब्ती गतिविधि की electrographic सुविधाओं जैसी घटनाओं वे parahippocampal cortices हर 3-5 मिनट के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं और dentate गाइरस के माध्यम से हिप्पोकैम्पस गठन फिर से दर्ज करें(चित्रा 3d, तीर); (ii) धीमी interictal-जैसे फर्ज (चित्र 3 बी, ईसी ट्रेस, काली पट्टी; चित्र 3Eमें विस्तारित) लघु हैं (< 1 s) जनसंख्या घटनाओं के बीच उत्पन्न ictal घटनाओं के बीच बैरे हिप्पोकैम्पस-EC ब्रेन स्लाइस तैयारी और एक धीमी गति से हो (रेंज 10-30 s); (iii) तेजी सेinterictal-जैसे फर्ज (चित्र 3 बी, CA3 ट्रेस, काली पट्टी; चित्रा 3Eमें विस्तारित) आवर्ती संक्षिप्त (< 1 s) जनसंख्या घटनाओं CA3 हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्र द्वारा उत्पंन कर रहे हैं; जब Schaffer संपार्श्वों संरक्षित कर रहे हैं, तेजी से CA3 संचालित interictal घटनाओं हिप्पोकैम्पस पाश के साथ प्रचार और एक विरोधी ictogenic प्रभाव24 (दिखाया नहीं डेटा) लागू; ictal गतिविधि खड़ा करने को रोकने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए, CA3 आउटपुट बाधित (cf. चित्र बी, ई) है । यह ध्यान देने की जरूरत है कि तेजी से CA3 संचालित interictal गतिविधि रहत का उपयोग कर दर्ज की एक धीमी गति से होता है (~ ०.४ हर्ट्ज) क्या ग्लास पिपेट के साथ पारंपरिक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग का उपयोग कर मनाया जाता है (~ 1 हर्ट्ज, रेंज: ०.५-२.० हर्ट्ज, डेटा नहीं दिखाया गया है).

कुतर मस्तिष्क स्लाइस में विद्युत neuromodulation के सफल परिणाम की तैयारी24में शामिल क्षेत्रों के बीच आंतरिक कनेक्टिविटी के साथ-साथ विशिष्ट ंयूरॉंस रास्ते27 के सक्रियकरण पर निर्भर करता है । हम वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहों और CD1 चूहों से प्राप्त स्लाइस का परीक्षण किया है और हमने पाया है कि माउस के बजाय चूहे मस्तिष्क स्लाइस का सबसे अच्छा व्यापार बंद आकार, मोटाई, और आंतरिक कनेक्टिविटी के बीच की पेशकश । सबसे पहले, उनके छोटे आकार के लिए धन्यवाद, वे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रहत के छोटे रिकॉर्डिंग क्षेत्र फिट बेहतर (चित्र 4a, वाम: चूहा, ठीक है: माउस); दूसरा, वे अधिक से अधिक लाभप्रद हालत है कि विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग (cf. परिचय): ictal-जैसे इन दो ऊतकों (चित्रा 4B) द्वारा उत्पंन निर्वहन के लिए आंतरिक है के लिए लचीला कर रहे है समान अवधि के हैं । (चित्र 4c बाएँ), उनकी घटना की दर माउस मस्तिष्क स्लाइस में काफी कम है (n = 10 प्रत्येक प्रजातियों स्लाइस; 2-पूंछ ख़राब t-परीक्षण, p < ०.००१; चित्र 4c दाईं ओर) । बाद तेजी-प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल ऊपर, यह एक प्रायोगिक दिन के दौरान मस्तिष्क स्लाइस की एक बड़ी संख्या में परीक्षण संभव बनाने की अनुमति देता है: प्रतिनिधि परिणामों के इस सेट के लिए, हम दो प्रजातियों में से मस्तिष्क स्लाइस की एक समान संख्या का परीक्षण कर सकता है (चूहा: n = ५८; माउस: n = ५२), लेकिन चूहों की संख्या (n = 18) था 2-गुना छोटे चूहों की संख्या से (n = ४२).

इसके अलावा, माउस मस्तिष्क स्लाइसें को सघन कनेक्शन के साथ मौजूद दिखाई देते है और इसलिए अधिक से अधिक निरंतर विद्युत neuromodulation (चित्रा 4d) के लिए बेहतर प्रतिक्रिया की संभावना है । इस प्रकार, ictogenesis के इस इन विट्रो में मॉडल, बिजली ictal गतिविधि को नियंत्रित करने के उद्देश्य से उत्तेजना के लिए व्यवहार्यता काफी चूहे मस्तिष्क ऊतक के लिए की तुलना में माउस के लिए अधिक है । यह पहलू भी उत्तेजना प्रयोगों के काफी उच्च सफलता दर से परिलक्षित होता है माउस बनाम चूहे मस्तिष्क स्लाइसें भी जब कई निरंतर उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग प्रदर्शन किया (चित्रा 4E) । वास्तव में, माउस मस्तिष्क ऊतक बेहतर निरंतर विद्युत उत्तेजना झेलने के रूप में परीक्षण प्रयोगात्मक समय 4 एच (चित्रा 4F) के फ्रेम के भीतर उच्च जीवित रहने की दर से सुझाव दिया है । इस प्रकार, आंतरिक कनेक्टिविटी के बेहतर संरक्षण के साथ छोटे आकार माउस मस्तिष्क के लिए सबसे अच्छा उंमीदवार को स्लाइस करने के लिए हिप्पोकैम्पस-parahippocampal नेटवर्क बातचीत का अध्ययन करने और बिजली का मूल्यांकन करने के उद्देश्य मेे रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करता है neuromodulation प्रोटोकॉल जो TLE के लिए प्रासंगिक हैं ।

आवर्ती पेसिंग CA1/subiculum में 4AP-इलाज हिप्पोकैम्पस में अंग ictogenesis को नियंत्रित करने के लिए जाना जाता है-ईसी स्लाइस तैयारी24,25,27, के साथ 1 हर्ट्ज के रूप में सबसे प्रभावी आवृत्ति27. इस प्रकार, यह भी एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोगी है प्रभावकारिता और अंय neuromodulation नीतियों की क्षमता का मूल्यांकन (उदाहरण के लिए देखें25) । जैसा कि ऊपर कहा गया है, बिजली के सीधे विदेश मंत्रालय के माध्यम से दिया दालों (यानी, एक बाहरी उत्तेजक इलेक्ट्रोड की आवश्यकता के बिना) कुतर मस्तिष्क के ऊतकों में जनसंख्या प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकते हैं (28भी देखें). मस्तिष्क टुकड़ा के भीतर ंयूरॉंस नेटवर्क कनेक्टिविटी के पर्याप्त संरक्षण, विदेश मंत्रालय पर मस्तिष्क टुकड़ा की सटीक स्थिति, और प्रेरित इलेक्ट्रोड जोड़े के उपयुक्त विकल्प विद्युत neuromodulation प्रयोगों का पीछा करने की अनुमति है कि प्रभावी रूप से नियंत्रण ictogenesis । के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है, यह विहित 1 हर्ट्ज आवर्ती पेसिंग प्रोटोकॉल planar रहत एक रिकॉर्डिंग के रूप में और एक उत्तेजक उपकरण के रूप में दोनों का उपयोग कर, जोड़ा लाभ है कि बिजली की उत्तेजना के प्रभाव में visualized किया जा सकता है के साथ पुन: पेश करने के लिए संभव है पारंपरिक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग की तुलना में समान रूप से रिक्ति वाले प्रेक्षण बिंदुओं की एक उच्च संख्या के साथ मस्तिष्क ऊतक अनुभाग । चित्रा 5B n = 9 मस्तिष्क स्लाइस के लिए प्राप्त परिणामों के ठहराव से पता चलता है, कुल जब्त समय की एक महत्वपूर्ण कमी का संकेत (कुल ictal गतिविधि अवधि/अवलोकन समय25) उत्तेजना के दौरान (एक ही रास्ता-ANOVA, एफ (df): 6.84 (2), p < 0.01, फिशर का एलएसडी पोस्ट हॉक परीक्षण, रक्षित) । परिणाम बाह्य उत्तेजक इलेक्ट्रोड24,25के लिए साहित्य के अनुरूप हैं ।

कुल जब्त समय की गणना करने के लिए, अवलोकन समय ictal घटनाओं के बीच अंतराल पर निर्भर करता है, और यह भी उत्तेजना के लिए आत्मविश्वास से neuromodulation के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल की ंयूनतम अवधि निर्धारित करता है । हम पाते है कि रिकॉर्डिंग से कम 4 ictal निर्वहन (और इसलिए ictal घटनाओं के बीच कम से कम 3 अंतराल) एकत्र नमूनों और आवश्यक संग्रह समय के बीच एक अच्छा व्यापार बंद है । नियंत्रण हालत में (यानी, कोई उत्तेजना), प्रेक्षण समय पहले मापा ictal घटना और पिछले एक की समाप्ति की शुरुआत के बीच अंतराल है । neuromodulation के दौरान, अवलोकन समय उत्तेजना प्रोटोकॉल अवधि के बराबर होती है, क्योंकि माप का उद्देश्य गड़बड़ी प्रणाली में पेश किया गया है कि समय के दौरान होने वाली घटनाओं को बढ़ाता है । कंप्यूटिंग और अवधि और ictal घटनाओं के अंतराल के बजाय कुल जब्त समय की तुलना प्रकार द्वितीय त्रुटि से बचने के लिए सबसे उपयुक्त पैरामीटर है । वास्तव में, ictal गतिविधि का पूरा दमन के साथ, यह भी संभव है कि केवल एक ictal घटना विद्युत उत्तेजना के दौरान उत्पंन होता है के रूप में कई घटनाओं के विरोध में नियंत्रण हालत में मनाया । इस मामले में, घटनाओं के बीच अंतराल को मापने जबकि संभव नहीं है, उत्तेजना प्रभावकारिता के एक अनुमानक के रूप में ictal अवधि को मापने neuromodulation के वास्तविक परिणाम का प्रतिनिधित्व नहीं करता है (अर्थात, ictal गतिविधि में कमी) ।

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत परिणामों से संकेत मिलता है कि माउस मस्तिष्क स्लाइसें से मिलकर रहत मिर्गी अनुसंधान के लिए मूल्यवान उपकरण है और विश्वसनीय neuromodulation अध्ययन है कि मिर्गी के इलाज के लिए डीबीएस के क्षेत्र अग्रिम प्रासंगिक है प्रदर्शन करते हैं । इसके अलावा, प्रोटोकॉल यहां वर्णित मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता में सुधार और कई घंटे (चित्रा 6), जो आवश्यक हो सकता है के लिए प्रयोगात्मक सत्र का पीछा करने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, विभिंन विद्युत उत्तेजना के प्रभाव की तुलना करने के लिए मानदंड.

Figure 3
चित्र 3 : ठेठ 4AP प्रेरित epileptiform पैटर्न planar रहत के साथ visualized । (a) माउस मस्तिष्क स्लाइस पर तैनात एक planar 6 x 10 मेे (इलेक्ट्रोड रिक्ति: ५०० µm) और साथ-साथ 4AP-प्रेरित epileptiform पैटर्न की कल्पना मेे रिकॉर्डिंग के साथ-साथ अवलोकन । ग्रिड में प्रत्येक वर्ग मस्तिष्क टुकड़ा के भीतर इसी स्थान पर दर्ज गतिविधि को समायोजित । धराशायी नीली लाइनें और अधिक स्पष्टता के लिए इलेक्ट्रोड पंक्तियों को देखें । रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड संख्या नीले रंग में प्रत्येक वर्ग के ऊपरी-बाएँ कोने पर पहचाना जाता है । ग्रे पार वर्ग संदर्भ इलेक्ट्रोड का प्रतिनिधित्व करता है. (ख) चुनाव आयोग और CA3 एक तेजी से समय पैमाने पर visualized पैटर्न के प्रतिनिधि ट्रेस क्षेत्रों । ऐरोहेड संकेत ictal घटनाक्रम । चुनाव आयोग ट्रेस में यह धीमी गति से interictal निर्वहन (काली पट्टी) की घटना की सराहना करने के लिए संभव है, जबकि CA3 उपक्षेत्र ठेठ निरंतर fastinterictal पैटर्न (काली पट्टी) उत्पन्न करता है. (ग) ठेठ टॉनिक क्लोनिंग पैटर्न दिखा एक ictal निर्वहन की रिकॉर्डिंग विस्तारित । (D) पूर्व-ictal-से-ictal संक्रमण के लिए संबंधित चुनाव आयोग (लाल) और CA3 (काला) ट्रेस सेगमेंट (B) में लाल पट्टी द्वारा चिह्नित तीव्र पैमाने के दृश्य । तीर ictal निर्वहन की शुरुआत को इंगित करता है । आरोपित निशान पर प्रकाश डाला है कि ictal घटना चुनाव आयोग में शुरू होता है और बाद में CA3 उपक्षेत्र के लिए प्रचार । (E) में काली पट्टियों द्वारा चिह्नित interictal अवधियों का विस्तारित दृश्य (B), क्रमश: चुनाव आयोग (red) और CA3 (black) द्वारा उत्पंन धीमे और fastinterictal प्रतिमानों के बीच सहसंबंध की कमी पर बल देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : माउस मस्तिष्क स्लाइसें चूहे मस्तिष्क स्लाइस की तुलना में एक उच्च प्रयोगात्मक उत्पादन प्रदान करते हैं । (एक) एक चूहा (बाएं) और मिलान उंर के एक माउस (दाएं) से मस्तिष्क टुकड़ा । चूहे मस्तिष्क टुकड़ा मेे रिकॉर्डिंग क्षेत्र की तुलना में बहुत बड़ा है और इसकी विद्युत गतिविधि पूर्ण में visualized नहीं किया जा सकता है । (ख) माउस और चूहे enthorinal प्रांतस्था (ईसी) द्वारा उत्पंन आवर्तक ictal गतिविधि की प्रत्यक्ष दृश्य तुलना । (ग) माउस और चूहे मस्तिष्क स्लाइसें इसी तरह की अवधि के ictal निर्वहन उत्पंन, लेकिन इन घटनाओं के बीच अंतराल लगभग 2 है-चूहे मस्तिष्क ऊतक में गुना । * p < 0.05 । (घ) चूहों की तुलना में, चूहों ictogenesis को नियंत्रित करने के उद्देश्य से विद्युत उत्तेजना प्रयोगों के लिए व्यवहार्य मस्तिष्क स्लाइस की एक 2 गुना उच्च उपज प्रदान करते हैं । subiculum की बिजली की उत्तेजना ५८ (३४%) चूहे मस्तिष्क स्लाइस, के रूप में ३३ ५२ (६३%) माउस ब्रेन स्लाइस (ची2: ९.२२ में से केवल 20 में parahippocampal cortices में जनसंख्या प्रतिक्रियाओं पैदा सकता है; p = ०.००२) । * p < 0.05 । (ई) व्यवहार्य स्लाइस के बीच, ictal गतिविधि को नियंत्रित करने में सफलता की दर है 2-माउस बनाम चूहे मस्तिष्क स्लाइसें (माउस के साथ गुना: ३३ मस्तिष्क स्लाइसें, ६०% की 20: चूहा: 20 मस्तिष्क स्लाइसें, 30% की 6; ची२: ४.६७; p = ०.०३) । * p < 0.05 । (च) माउस मस्तिष्क स्लाइसें निरंतर बिजली उत्तेजना (ग्रे छायांकित क्षेत्रों) के लंबे समय तक कछु सामना कर सकते हैं । उत्तेजना वापसी पर, माउस मस्तिष्क ऊतक epileptiform पैटर्न की पूरी वसूली प्रदर्शित, जबकि चूहे मस्तिष्क ऊतक व्यवहार्यता नाटकीय रूप से 3 घंटे में गिर जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5 : ictogenesis के विद्युत मॉडुलन का प्रतिनिधि प्रयोग मस्तिष्क के टुकड़े को मिलकर रहत का उपयोग कर. (एक) चुनाव आयोग और पीसी में नियंत्रण की स्थिति (कोई उत्तेजना) के दौरान 4AP प्रेरित ictal गतिविधि की रिकॉर्डिंग, आवधिक पेसिंग (पीपी) 1 हर्ट्ज पर (उत्तेजना विरूपण साक्ष्य छोटा है), और उत्तेजना वापसी पर वसूली के दौरान. (ख) कुल जब्त समय पर 1 हर्ट्ज पर पीपी के प्रभाव का ठहराव । * p < 0.05 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : 4AP प्रेरित ictal गतिविधि की लंबी अवधि के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग. (A) ट्रेस खंड मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के बाद 8 ज दर्ज की गई और 4AP आवेदन के 2 एच निम्नलिखित । (ख) विस्तृत ट्रेस खंड बॉक्सिंग ictal निर्वहन पत्र ए, बी, और पैनल में सी द्वारा की पहचान के लिए इसी (a) लंबे समय तक प्रेक्षण समय में उत्पंन ictal गतिविधि की निरंतरता-विधवा दिखाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

शेयर एक रासायनिक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी)
Nacl ५८.४४ ११५०
विलायक: आसुत जल KCl ७४.५५ 20
ध्यान केंद्रित: 10x  KH2पो4 १३६.१ १२.५
भंडारण तापमान: 4 ° c CaCl२* २ एच२हे १४७.०२ 20
अधिकतम संग्रहण समय: 1 wk D-ग्लूकोज १८०.२ २५०
नोट: ५० mm झिल्ली फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें
स्टॉक B रासायनिक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी)
NaHCO3 ८४.०१ २६०
विलायक: आसुत जल
ध्यान केंद्रित: 10x 
भंडारण तापमान: 4 ° c
अधिकतम संग्रहण समय: 1 wk
नोट: ५० mm झिल्ली फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें
स्टॉक C रासायनिक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी)
KCl ७४.५५ 20
विलायक: आसुत जल KH2पो4 १३६.१ १२.५
ध्यान केंद्रित: 10x MgCl२* ६ एच२हे २०३.३ ५०
भंडारण तापमान: 4 ° c MgSO४* ६ एच२हे २४६.४७ 20
अधिकतम संग्रहण समय: 2 wks CaCl२* २ एच२हे १४७.०२ 5
नोट: ५० mm झिल्ली फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें
स्टॉक मी रासायनिक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी)
MgSO४* ६ एच२हे २४६.४७ १००
विलायक: आसुत जल
ध्यान दें: 100x
भंडारण तापमान: 4 ° c
अधिकतम संग्रहण समय: 4 wks
4AP शेयर रासायनिक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी)
4-aminopyridine ९४.११ २५०
विलायक: आसुत जल
ध्यान दें: 1000x
भंडारण तापमान: 4 ° c
अधिकतम संग्रहण समय: 2 wks
नोट: 2-3 मिनट या 30-60 मिनट के लिए सरगर्मी के लिए भंवर
ध्यान दें: सावधानी! 4-एपी विषाक्त और cinvulsant है । दस्ताने का उपयोग करें और फैलने या फैल से बचें ।

तालिका 1: स्टॉक समाधान ।

होल्डिंग ACSF रिकॉर्डिंग ACSF कटिंग ACSF
रासायनिक सी [mM] रासायनिक सी [mM] रासायनिक सी [mM]
Nacl ११५ Nacl ११५ Sucrose २०८
KCl 2 KCl 2 KCl 2
KH२PO4 १.२५ KH२PO4 १.२५ KH२PO4 १.२५
MgSO4 १.३ MgSO4 1 MgCl2 5
CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2
D-ग्लूकोज 25 D-ग्लूकोज 25 CaCl2 ०.५
NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-ग्लूकोज 10
L-Ascorbic एसिड 1 L-Ascorbic एसिड 1 NaHCO3 26
L-Ascorbic एसिड 1
फोन ७.४ फोन ७.४ पाइरुविक अम्ल 3
परासरणीयता ३०० mOsm किग्रा/ परासरणीयता ३०० mOsm किग्रा/
फोन ७.४
परासरणीयता ३०० mOsm किग्रा/

तालिका 2: समाधान संरचना ।

समस्या निवारण
समस्या Countermeasures
Ictal फर्ज देखिए ' घ्यावेत ' छिड़काव दर में कमी और/या चूषण सुई स्थिति का समायोजन करके मस्तिष्क टुकड़ा के ऊपर ACSF मात्रा कम ।
कोई ictal गतिविधि नहीं (1) सत्यापित करें कि CA3-चालित फ़ास्ट interictal ईवेंट्स प्रांतस्था में प्रोपेगेट नहीं होते हैं । एक छोटे स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें (जैसे, एन .10) या एक सुई Schaffer जमानतों विच्छेद करने के लिए अगर जरूरत हो, लेकिन टुकड़ा पकड़ नीचे लंगर के नायलॉन धागे में कटौती नहीं सावधान रहना । एक स्टीरियो या ईमानदार माइक्रोस्कोप सबसे अच्छा अनुकूल हैं, जबकि उल्टे सूक्ष्मदर्शी इस कार्य को बहुत मुश्किल बना देता है ।
(2) स्लाइस व्यवहार्यता की जांच करें: मजबूत विद्युत उत्तेजना ट्रिगर ictal गतिविधि कर सकते हैं? 4AP आवेदन के बारे में 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें, तो ictal गतिविधि उत्पन्न नहीं होती है, तो मस्तिष्क टुकड़ा बदल जाते हैं.
मस्तिष्क टुकड़ा चालें जब पकड़ नीचे लंगर रखने (1) धीरे टुकड़ा लंगर हटाने और मस्तिष्क टुकड़ा की स्थिति ।
(2) की जांच करें कि टुकड़ा लंगर समान रूप से 4AP-ACSF की गीली है ।
(3) 4AP-ACSF रिकॉर्डिंग चैंबर से हटाने के लिए मस्तिष्क विदेश मंत्रालय के लिए आसंजन टुकड़ा एहसान ।
स्लाइस होल्ड-डाउन एंकर की स्थिति (4) ।
तबादला होने के बाद मेे चिप पर तैरता ब्रेन स्लाइस (१) एक पाश्चर पिपेट साथ लिएर महाप्राण अतिरिक्त ACSF ।
(2) मेे चिप को फिर से लेपित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
विद्युत उत्तेजना के नेटवर्क प्रतिक्रियाओं नहीं बटोरना उत्तेजना तीव्रता बढ़ाएँ, इलेक्ट्रोड जोड़े बदल जाते हैं.
विद्युत उत्तेजना समीपस्थ में जनसंख्या प्रतिक्रियाओं लेकिन बाहर नहीं cortical क्षेत्रों में बटोरना कर सकते है समस्या गरीब कनेक्टिविटी या बहुत कम उत्तेजना तीव्रता के कारण ikely है । विद्युत उत्तेजना अप्रभावी या कुछ cortical क्षेत्रों में ही प्रभावी हो सकता है । यह मस्तिष्क टुकड़ा बदलने की सिफारिश की है ।
सिग्नल है हंगामेदार (1) संदर्भ इलेक्ट्रोड की जाँच: शोर आधारभूत समय पर प्रवेश जलाशय के अधूरा भरने के कारण हो सकता है कि इस तरह के संदर्भ इलेक्ट्रोड पूरी तरह से ACSF में गहरी नहीं है.
(2) उपकरणों की समग्र जमीन की जांच करें ।
(3) एक स्थिर, मुलायम चूषण ध्वनि सुनने के लिए इतना के रूप में सक्शन सुई स्थिति को समायोजित करें । सक्शन सुई जमीन ।
(4) एक कपास झाड़ू का उपयोग कर इथेनॉल के साथ मेे बाहरी संपर्कों को साफ ।
(5) मेे चिप खराब हो सकती है: परिवर्तन मेे चिप और जांच कलाकृतियां और सिग्नल-टू-शोर अनुपात ।

तालिका 3: समस्या निवारण ।

Discussion

रहत neurophysiology जांच के लिए एक अमूल्य उपकरण है और अंवेषण और विकास के दशकों के लिए धंयवाद हाल के वर्षों में परिपक्वता तक पहुंच चुके हैं । के रूप में पारंपरिक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग की तुलना में, रहत अवलोकन अंक और ज्ञात अंतर इलेक्ट्रोड दूरी है, जो सही ंयूरॉंस नेटवर्क बातचीत के लिए महत्वपूर्ण है की एक उच्च संख्या के महान लाभ प्रदान करते हैं ।

विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग तकनीक भी अंय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी दृष्टिकोण के लिए युग्मित किया जा सकता है, इस तरह के पैच के रूप में15रिकॉर्डिंग दबाना, एक ंयूरॉन और ंयूरॉंस नेटवर्क गतिविधि के बीच संबंध की जांच । इसके अलावा, क्षेत्र की क्षमता और बहु इकाई गतिविधि visualizing की संभावना एक साथ छोटे ंयूरॉंस पहनावा और सामूहिक ंयूरॉंस नेटवर्क की गतिविधि के बीच संबंध में कीमती अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । वोल्टेज के साथ संयोजन के प्रति संवेदनशील रंजक, कैल्शियम इमेजिंग, और optogenetics29 बहुतलीय दृष्टिकोण का उपयोग कर neurophysiology घटनाएं प्रदान करने की अनुमति देता है । औषधीय अध्ययनों के अलावा, दोनों रिकॉर्डिंग और एक ही प्रणाली के साथ उत्तेजना प्रदर्शन की संभावना मेे रिकॉर्डिंग तकनीक बहुत शक्तिशाली और बहुमुखी बनाता है: उदाहरण के लिए, यह synaptic में प्लास्टिक की घटना का अध्ययन करने के लिए संभव है कोर स्मृति गठन के30, यहां प्रस्तुत neuromodulation प्रोटोकॉल का उपयोग कर, जो डीबीएस के लिए प्रासंगिक है मिर्गी और मस्तिष्क विकारों की एक विस्तृत विविधता का इलाज । हाल ही में सबूत है कि विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग तकनीक सफलतापूर्वक मानव मिरगी मस्तिष्क ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है16 मिर्गी अनुसंधान में अपनी अमूल्य उपयोगिता को दर्शाता है, दोनों बुनियादी इस विनाशकारी रोग अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए और फ़ाइन-ट्यून डीबीएस एल्गोरिदम को उन्नत करने के लिए.

हालांकि, रहत बल मस्तिष्क स्लाइस के लिए ' सीमा ' शर्तों के तहत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों की खोज, एक जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर की आवश्यकता के कारण और ठोस सब्सट्रेट पर मस्तिष्क टुकड़ा आराम दे जहां माइक्रो इलेक्ट्रोड्स की आवश्यकता एकीकृत कर रहे हैं । इस प्रकार, मस्तिष्क ऊतक पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति है, जो बारी में रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं प्राप्त नहीं हो सकता है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित के लिए मज़बूती से रिकॉर्ड और अध्ययन में ictogenesis के लिए तैयार की जाती है और इन विट्रो 4AP मॉडल में तीव्र का उपयोग रहत के लिए युग्मित नेटवर्कों को आगे बढ़ाने के लिए बिजली की उत्तेजना है, जो मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक जानकारी प्रदान की लंबे समय तक कछु डीबीएस की नीतियां ।

पारंपरिक क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के उपयोग के आधार पर मिरगी अंग नेटवर्क के विद्युत neuromodulation पर पिछले अध्ययनों या तो माउस या इसी तरह के परिणाम के साथ चूहे मस्तिष्क स्लाइस का इस्तेमाल किया है24,25; लेकिन चूहे मस्तिष्क ऊतक के उपयोग को और अधिक चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया, काफी कमजोर कनेक्टिविटी के कारण के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में चूहों से प्राप्त7। मेे तकनीक के संबंध में, माउस मस्तिष्क स्लाइसें सबसे अच्छा उनके छोटे आकार के आधार पर अनुकूल हैं । इसके अलावा, माउस बनाम चूहे मस्तिष्क ऊतक में निर्वहन की तरह ictal की घटना की उच्च दर को देखते हुए, यह एक प्रायोगिक दिन भर में काफी अधिक मस्तिष्क स्लाइसें परीक्षण संभव है, जो बारी में डेटा संग्रह तेजी से और अधिक कुशल बनाता है, और कर सकते है इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:

Ictal शुल्क कस्टम चैंबर का उपयोग कर दर्ज की यहां वर्णित अवधि और उन के लिए घटना की दर में समान प्रतीत पारंपरिक विदेश मंत्रालय के रिंग चैंबर और एक ही मेे प्रकार का उपयोग कर मनाया (planar माइक्रो इलेक्ट्रोड, cf. 17) । हालांकि, यह है कि मस्तिष्क टुकड़ा मोटाई काफी कम हो जाना चाहिए जब एक कम छिड़काव दर (1 एमएल/मिनट) है, जो neuromodulation प्रयोगों के सफल पीछा बाधा हो सकती है के साथ पारंपरिक दौर रिकॉर्डिंग चैंबर का उपयोग करने पर बल दिया जाना चाहिए खराब कनेक्टिविटी के लिए ।

इस प्रोटोकॉल में, पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग चैंबर डिजाइन से प्रेरित एक कम मात्रा कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर मेे रिकॉर्डिंग की सफल खोज के लिए महत्वपूर्ण है कि स्थिर और विश्वसनीय लामिना प्रवाह प्रदान करता है; यह भी ४०० µm को मस्तिष्क टुकड़ा मोटाई बढ़ाने के क्रम में एक निष्पक्ष व्यापार को प्राप्त करने के लिए ऊतक व्यवहार्यता और आंतरिक कनेक्टिविटी के बीच बंद की अनुमति देता है । यह वास्तव में मांयता प्राप्त है कि कक्ष के भीतर रिकॉर्डिंग समाधान के लामिना प्रवाह मस्तिष्क टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अत्यधिक वांछनीय है, क्योंकि यह तापमान, ऑक्सीजन, और पीएच ढाल है कि परिपत्र प्रवाह दौर रिकॉर्डिंग में मनाया जाता है से प्रभावित नहीं है चेंबर्स19,20,31 (जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विदेश मंत्रालय के साथ उपलब्ध कराई गई हैं) । इस तरह की ढाल प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह परिचय और भी मस्तिष्क टुकड़ा के लिए हानिकारक हैं । एक उच्च छिड़काव दर (5-6 एमएल/मिनट) के साथ एक अपेक्षाकृत छोटी मात्रा (~ १.५ एमएल) के चैंबररिकॉर्डिंग16, 31 छिड़काव माध्यम के पर्याप्त आदान प्रदान के लिए अनुमति दें (≥ 3 बार/ कस्टम कक्ष आसानी से एक किफायती मूल्य पर वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है या में उत्पादित घर 3 डी प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग कर । अंय अध्ययनों से ४०० µm-मोटी मानव मस्तिष्क स्लाइसें16 पारंपरिक मेे रिंग चैंबर का उपयोग कर, जबकि 1 मिलीलीटर के लिए ACSF मात्रा रखने और एक उच्च छिड़काव दर (5-6 एमएल/ंयूनतम) एक कम शोर सिकुड़नेवाला पंप की मदद से लागू करने की रिपोर्ट मेे रिकॉर्डिंग है । हालांकि, लेखकों ictogenesis के एक अलग मॉडल का इस्तेमाल किया है, यानी, कम मिलीग्राम2 +, जो की संभावना कम extracellular K+ एकाग्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि शामिल तंत्र द्वारा 4AP मॉडल से प्रभावित है 11 , 22. हमने पाया है कि 4AP मॉडल में एक उच्च छिड़काव दर वांछनीय नहीं है, संभवत: जमा extracellular K+के तेज़ धोने के कारण, जो रिकॉर्डिंग ACSF16में काफी बढ़ सकती है । वास्तव में, ictal घटनाओं और ' हिस्सा ' जब ASCF छिड़काव गति 2-3 मिलीलीटर/मिनट और मस्तिष्क टुकड़ा एक मोटी ACSF परत से जलमग्न हो गया था, जबकि पूर्ण-उड़ा निर्वहन मजबूत टॉनिक का प्रदर्शन-क्लोनल घटकों के लिए वापसी पर बहाल किया जा सकता है दिखाई एक कम छिड़काव दर (1 मिलीलीटर/मिनट) और सही ऊतक सतह के स्तर पर एक पतले ACSF परत (दिखाया नहीं डेटा) । कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर इस प्रोटोकॉल में वर्णित छिड़काव माध्यम का आदान प्रदान की अनुमति देता है 3-5 बार/मिनट की एक प्रवाह की दर से 1 मिलीलीटर/ इस प्रकार, मस्तिष्क स्लाइस करने के लिए समग्र ऑक्सीजन की आपूर्ति दृढ़ता से भी अपेक्षाकृत कम छिड़काव दरों में सुधार हुआ है, जबकि अभी भी एक स्थिर रिकॉर्डिंग तापमान और उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात की गारंटी. सबसे महत्वपूर्ण बात, यह एक शारीरिक मूल्य के लिए extracellular K+ एकाग्रता रखने के लिए संभव है.

ictogenesis के 4AP मॉडल ACSF ईओण संरचना के किसी भी महत्वपूर्ण संशोधन की आवश्यकता नहीं है, जैसे मिलीग्राम2 + या बढ़ती कश्मीर+, और दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक प्रसारण रखने का अनूठा लाभ प्रदान करता है बरकरार 12, एक पहलू है कि epileptiform तुल्यकालन (cf. 7) में दोनों glutamatergic और GABAergic नेटवर्क की महत्वपूर्ण भूमिका के प्रकाश में मिर्गी अनुसंधान में अत्यधिक प्रासंगिक है । 4AP-ACSF इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एक शारीरिक कश्मीर+ एकाग्रता (३.२५ mm) और एक थोड़ा कम मिलीग्राम2 + धारण ACSF (1 मिमी बनाम १.३ मिमी) से एकाग्रता शामिल हैं । इस एकाग्रता अभी भी मिलीग्राम की रिपोर्ट शारीरिक मूल्यों के भीतर गिर जाता है2 + कुतर सीएसएफ में एकाग्रता और यह कई प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए17,18देखें). वर्णित प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए, हमने पाया है कि इस मामूली कमी 4AP के प्रभाव में सहायता करने के लिए पसंद किया जाता है ।

पिछले काम में, 4AP मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए लागू किया गया है जब यह पहले से ही रिकॉर्डिंग चैंबर17,18के अंदर तैनात किया गया था । जब तक प्रयोगकर्ता 4AP आवेदन और epileptiform पैटर्न की शुरुआत के बीच समय विलंबता का पालन करने की जरूरत है, हम पाते है कि इस दृष्टिकोण बल्कि समय लेने वाली है और लंबे समय तक रिकॉर्डिंग और उत्तेजना सत्र को आगे बढ़ाने के लिए उपयुक्त नहीं है इस प्रोटोकॉल में वर्णित है । मस्तिष्क स्लाइस अन्य ऊतक वर्गों का उपयोग कर प्रयोग का पीछा करते हुए श्रृंखला में पूर्व इलाज किया जा सकता है के बाद से ३२ डिग्री सेल्सियस पर 4AP में मस्तिष्क स्लाइस की प्री-मशीन, बहुत प्रयोगात्मक समय बख्शना की अनुमति देता है.

मस्तिष्क स्लाइस की लंबी व्यवहार्यता लंबी अवधि में नेटवर्क सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है । इसके अलावा, दोहराव विद्युत उत्तेजना के लिए उनके सुधार लचीलापन महान लाभ की है अगर प्रयोगकर्ता कई उत्तेजना प्रोटोकॉल है, जो सांख्यिकीय मजबूती के लिए एक ही मस्तिष्क टुकड़ा में प्रदर्शन किया जाना चाहिए की तुलना करना चाहता है । हमारे हाथ में, जब परीक्षण 3 उत्तेजना प्रोटोकॉल, एक नियंत्रण चरण से पहले और एक वसूली चरण के बाद, प्रयोग पिछले मई 3-5 एच । इस संदर्भ में, जीना विदेश मंत्रालय मानचित्रण महत्वपूर्ण है क्रम में सही मार्ग को सक्रिय करने और दबाने के बजाय बिजली उत्तेजना के माध्यम से ictogenesis एहसान । हमारे उपयोगकर्ता के अनुकूल जीयूआई विभिन्न मस्तिष्क संरचनाओं के इलेक्ट्रोड को मैप करने के लिए एक त्वरित, सरल और लचीला उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के विपरीत, यह भी बुनियादी प्रोग्रामिंग कौशल के साथ कस्टम मेे लेआउट जोड़ने के लिए संभव है । छवियों उज्ज्वल क्षेत्र में प्राप्त किया जा सकता है; इस प्रकार, किसी भी सामांय प्रयोजन कैमरा है कि अच्छा संकल्प किया है और एक खुर्दबीन पर फिट बैठता है उपयुक्त है । एक औंधा माइक्रोस्कोप मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए रिश्तेदार microelectrodes स्थिति कल्पना करने के लिए आवश्यक है, के बाद से इन ऊतक के नीचे छिपा होगा अगर एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । प्रयोगकर्ता विशिष्ट ंयूरॉंस रास्ते को बाधित करने के लिए चाकू कटौती करने की जरूरत है हालांकि, एक स्टीरियो-माइक्रोस्कोप उल्टे प्रकार के अलावा में सिफारिश की है.

अंत में, प्रस्तावित दृष्टिकोण का एक और लाभ के सस्ते और अपेक्षाकृत आसान विधानसभा है आवश्यक उपकरणों के अधिकांश, कस्टम रिकॉर्डिंग चैंबर और होल्डिंग चैंबर की तरह, गर्म स्नान और टुकड़ा लंगर, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक महंगा के अनावश्यक उपयोग कम शोर सिकुड़नेवाला पंप ।

तकनीक की सीमाएं:

विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग बहुत धीमी तरंगों visualizing की अनुमति नहीं है, यानी, डीसी संकेत में बदलाव । इस तरह के आधारभूत विक्षेपों ictal निर्वहन अवधि के asymptotic माप में मदद कर सकते हैं और, सबसे महत्वपूर्ण, वे cortical फैल अवसाद का अध्ययन करने के लिए मौलिक हैं (एक घटना है कि मिर्गी३२ में अचानक अप्रत्याशित मौत से संबंधित है और साझा किया जाता है मिर्गी और माइग्रेन के बीच३३).

विद्युत neuromodulation के संबंध में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना कई उत्तेजना सत्र प्रदर्शन की अनुमति देता है । हम सफलतापूर्वक 20-45 मिनट के 3 उत्तेजना सत्र, क्या पिछलेकाम25 में रिपोर्ट के समान करने के लिए प्रदर्शन कर सकता है । हालांकि मस्तिष्क स्लाइस शायद उत्तेजना सत्र या अब उत्तेजना प्रोटोकॉल की एक उच्च संख्या का सामना कर सकते हैं, हम इस संबंध में मस्तिष्क स्लाइस परीक्षण नहीं किया । हम 3 से उत्तेजना प्रोटोकॉल की संख्या सीमित करने और लंबे समय तक (≥ ६० मिनट) उत्तेजना सत्र, जो काफी तनाव मस्तिष्क ऊतक इन सीमा शर्तों के तहत बनाए रखा, उत्तेजना वापसी पर वसूली की कमी के लिए कर सकते है परहेज की सलाह देते हैं ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम:

कई महत्वपूर्ण कारकों की रिकॉर्डिंग और मस्तिष्क मेे करने के लिए मिलकर स्लाइस में epileptiform गतिविधि के मॉडुलन के सफल पीछा बाधा हो सकती है । इसके अलावा इस्तेमाल किया और मस्तिष्क स्लाइसें की गुणवत्ता, रिकॉर्डिंग के दौरान छिड़काव दर और ACSF प्रवाह की गतिशीलता (यानी, लामिना बनाम परिपत्र) रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर, हमने पाया है कि वसूली की शर्तों और मस्तिष्क स्लाइस की लंबी अवधि के रखरखाव के साथ ही 4AP आवेदन की विधा सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं ।

जब एक जलमग्न होल्डिंग चैंबर का उपयोग कर यह मस्तिष्क ऊतक नेटवर्क गतिविधि को बनाए रखने और 4AP आवेदन द्वारा ictal की तरह फर्ज की प्रेरण एहसान करने के लिए कमरे के तापमान पर ब्रेन स्लाइस स्टोर करने के लिए महत्वपूर्ण है । हमारे हाथ में, वसूली और रखरखाव पर ३२ ° c टुकड़ा करने की क्रिया के 3-4 h के भीतर मस्तिष्क के ऊतकों बिगड़ा ।

३२ डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान और रिकॉर्डिंग में 4AP-ACSF में मस्तिष्क स्लाइस की मशीन है, तथापि, वांछनीय नहीं है । हमें इस हालत में दमदार आवर्तन ictal फर्ज को देख कर कई कठिनाइयों का पता चला है. दरअसल, 20 में कम तापमान-24 ° c सीमा को गीला करना या भी 4AP प्रेरित ictogenesis दोनों इन विट्रो३४ और vivo३५में रोकने के लिए सूचित किया गया है । इस प्रकार, 4AP मशीन और रिकॉर्डिंग तापमान 30-34 डिग्री सेल्सियस के भीतर गिर जाना चाहिए और मिलान किया जाना चाहिए । से बचने के लिए बहुत ज्यादा तनाव के तहत मस्तिष्क के ऊतकों को 4AP द्वारा hyperexcitability के एक साथ प्रेरण के कारण और कमरे के तापमान से मस्तिष्क स्लाइस के अचानक जोखिम गर्म करने के लिए (३२ ° c) 4AP-ACSF, यह एक मध्यवर्ती पूर्व वार्मिंग प्रदर्शन करने के लिए मौलिक है कदम और मस्तिष्क ACSF में habituate स्लाइसें 20-30 मिनट के लिए ३२ ° c पर धारण करते हैं । इस चरण को छोड़ना 4AP द्वारा ictogenesis प्रेरण को प्रभावित कर सकता है ।

एक और पहलू है कि उल्लेख किया जाना चाहिए डी के महत्व को टुकड़ा करने के बाद ACSF में ग्लूकोज एकाग्रता है । एक 25 mm एकाग्रता मस्तिष्क स्लाइसें 10 mM कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया एकाग्रता से बेहतर बरकरार रखता है और यह भी ictal गतिविधि की घटना की दर में सुधार, जो 2 गुना तेजी से है (इस प्रकार, यह आसान प्रयोगात्मक की एक लंबी श्रृंखला का पीछा करने के लिए बना कई मस्तिष्क स्लाइस में प्रोटोकॉल प्रत्येक दिन) ।

अंत में, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान कुछ महत्वपूर्ण ठीक विवरण उल्लेख किया जाना चाहिए । सबसे पहले, बरकरार मस्तिष्क और मस्तिष्क स्लाइसें ठंड काटने ACSF में फ्रीज करने की अनुमति नहीं है । के लिए मस्तिष्क द्रुतशीतन < 2 min पर्याप्त माउस मस्तिष्क के छोटे आकार दिया जाता है । ऊतक वर्गों तुरंत बफर ट्रे से कमरे के तापमान पर कुल्ला यूरिन के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए । काटने ACSF धोने बहुत महत्वपूर्ण है अन्यथा उच्च सुक्रोज एकाग्रता मस्तिष्क स्लाइस होल्डिंग चैंबर के नायलॉन जाल करने के लिए छड़ी कर देगा. प्रभावी ढंग से ऊतक कुल्ला करने के लिए, यह हस्तांतरण पिपेट के भीतर काटने ACSF सामग्री को कम करने के लिए इतना के रूप में धारण ACSF जरूरत से ज्यादा दूषित नहीं महत्वपूर्ण है । 2-चरण धोने में एड्स संक्रमण को कम करने में । टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के पूरा होने पर, ऊतक वर्गों धोने यूरिन से होल्डिंग चैंबर के लिए तुरंत स्थानांतरित किया जाना चाहिए, जहां नरम नायलॉन जाल निलंबित आधे रास्ते होल्डिंग ACSF में दोनों पक्षों पर ऊतक ऑक्सीजन की अनुमति देता है । एक ही सिद्धांत टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के बाद सभी चरणों में लागू किया जाना चाहिए: मस्तिष्क स्लाइसें चोंच के नीचे कभी नहीं बैठना चाहिए, वे होल्डिंग चैंबर के पक्षों के साथ संपर्क में नहीं होना चाहिए, और वे एक दूसरे के साथ संपर्क में कभी नहीं होना चाहिए और न ही ओवरलैप.

संशोधन और समस्या निवारण:

ACSF रचना को प्रयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, दवाओं को विद्युत neuromodulation की प्रभावकारिता के लिए विशिष्ट न्यूरोट्रांसमीटर या आयन चैनलों के योगदान को काटना करने के लिए जोड़ा जा सकता है. इसके अलावा, पाइरुविक और ascorbic एसिड (cf. 2 तालिका) लोप हो सकता है, हालांकि हम पाते हैं कि वे एक शक्तिशाली न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका डालती. हम तालिका 3 में रिपोर्ट करते है जो इस प्रोटोकॉल में सामना किया जा सकता है और उनसे कैसे निपटना है, सबसे सामांय समस्याएं ।

निष्कर्ष:

मेे रिकॉर्डिंग निस्संदेह स्वास्थ्य और रोग में न्यूरॉन नेटवर्क की बातचीत को संबोधित करने के लिए एक अमूल्य तकनीक है । औषधीय अध्ययनों के अलावा, यह भी विद्युत neuromodulation प्रोटोकॉल है कि डीबीएस के लिए प्रासंगिक मिर्गी और अंय स्नायविक विकारों के लिए लागू मूल्यांकन करने के लिए संभव है । इस प्रोटोकॉल में, हमें पता चला है कि यह पारंपरिक extracellular क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग और बाहरी उत्तेजक इलेक्ट्रोड के साथ प्राप्त करने वालों के समान परिणाम के साथ ठेठ आवधिक उत्तेजना प्रयोगों को पुन: पेश करने के लिए संभव है. वाणिज्यिक प्रयोक्ता के अनुकूल उपकरण और उंनत सॉफ्टवेयर उपकरण की बढ़ती उपलब्धता मेे रिकॉर्डिंग तकनीक भी बंद लूप उत्तेजना प्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाने के लिए, मस्तिष्क ऊतक को तदर्थ उत्तेजना प्रदान करने के लिए, और ंयूरॉन नेटवर्क प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया तंत्र के योगदान की जांच ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

G.P. एक Marie Skłodowska-क्यूरी साथी यूरोपीय संघ MSCA द्वारा वित्त पोषित है-अगर-२०१४ परियोजना Re.B.Us, G.A. एन 660689, फ्रेमवर्क कार्यक्रम के तहत H2020 । जीयूआई mapMEA लेखक ilaria.colombi@iit.it के अनुरोध पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine  Sigma-Adrich P7886 Needed for MEA coating
NaCl Sigma-Adrich S9888 Chemical
KCl Sigma-Adrich P9541 Chemical
KH2PO4 Sigma-Adrich 795488 Chemical
CaCl2*2 H2O Sigma-Adrich C3306 Chemical
D-Glucose Sigma-Adrich RDD016 Chemical
NaHCO3 Sigma-Adrich S5761 Chemical
MgCl2*6 H2O Sigma-Adrich M2670 Chemical
MgSO4*6 H2O Sigma-Adrich M5921 Chemical
Sucrose Sigma-Adrich RDD023 Chemical
Pyruvic Acid, 98%  Sigma-Adrich 107360 Chemical
4-aminopyridine Sigma-Adrich A78403 Convulsant drug
STG-2004 Multichannel System STG4004-1.6mA 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060 Multichannel System N/A MEA amplifier
planar MEA Multichannel System 60MEA500/30iR-Ti w/o ring Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack Multichannel System Recording software
McStimulus II Multichannel System STG4004 control software
TC02 Multichannel System TC02 2-channel thermostat
PH01 Multichannel System PH01 Heating perfusion canula
MPH  Multichannel System MPH  Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43 Wacker E43 Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber Crisel Instrument SKE-chamber MEA Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm  Crisel Instrument 64-1309 Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme Sigma-Adrich Z273287-1EA Enzymatic cleaner
MATLAB The Mathworks Programming environment for electrodemapping
VT1000S Leica Biosystems VT1000S Vibratome
Warner Instruments 64-1309 Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

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References

  1. Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
  2. WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
  3. Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
  4. Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
  5. Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
  6. Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
  7. Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
  8. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
  9. Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
  10. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
  11. Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
  12. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
  13. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
  14. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
  15. Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
  16. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
  17. Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
  19. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  20. Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
  21. MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
  22. Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  23. Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
  24. Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
  25. Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
  26. Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
  27. D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
  28. Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
  29. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
  30. Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
  31. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
  32. Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
  33. MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
  34. Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
  35. Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).

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Panuccio, G., Colombi, I.,… More

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

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