Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Opptak og modulering Epileptiform aktivitet i gnager hjernen skiver koplet til Microelectrode matriser

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57548
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Rehab Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Vi illustrerer hvordan du utfører opptak og elektriske modulering av 4-aminopyridine-indusert epileptiform aktivitet i gnager hjernen skiver med microelectrode matriser. En egendefinert innspilling kammer opprettholder vev levedyktighet gjennom langvarig eksperimentelle økter. Live elektrode kartlegging og utvalg av stimulerende utføres av en egendefinert brukergrensesnitt.

Abstract

Tinninglappen epilepsi (TLE) er den vanligste delvise komplekse epileptiske syndromet og den minst responsive til medisiner. Dyp hjernestimulasjon (DBS) er en lovende tilnærming når farmakologisk behandling svikter eller nevrokirurgi anbefales ikke. Akutt hjernen skiver koplet til microelectrode matriser (tiltak) representerer et verdifullt verktøy for å studere nevrale nettverk interaksjoner og deres modulering av elektrisk stimulering. Sammenlignet med konvensjonelle ekstracellulære brenning gir de ekstra fordelene med et større antall observasjon poeng og en kjent distanse mellom elektrode, som tillater overføring banen og hastigheten på elektrofysiologiske signaler. Imidlertid kan vev oksygenering være sterkt svekket i MEA innspilling, som krever en høy perfusjon rente, som kommer på bekostning av redusert signal-til-støy-forhold og høyere svingninger i eksperimentell temperatur. Elektrisk stimulering ytterligere understreker hjernevev, gjør det vanskelig å forfølge lengre opptak/stimulering epoker. Videre trenger elektrisk modulering av hjernen stykke aktivitet å målrette bestemte strukturer/stier i hjernen sektoren, som krever at elektrode kartlegging raskt og enkelt utføres live under eksperimentet. Her vi illustrerer hvordan du utfører opptak og elektriske modulering av 4-aminopyridine (4AP)-indusert epileptiform aktivitet i gnager hjernen skiver med planar tiltak. Vi viser at hjernevevet fra mus utkonkurrerer rotte hjernevevet og er derfor bedre egnet for MEA eksperimenter. Denne protokollen garanterer den generasjon og vedlikehold av en stabil epileptiform mønster som trofast gjengir elektrofysiologiske funksjonene observert med konvensjonelle potensielle feltopptak vedvarer i flere timer og outlasts opprettholdes elektrisk stimulering for langvarig epoker. Vev levedyktighet hele eksperimentet oppnås gjennom bruk av en egendefinert innspilling av små volumer kammer tillater for laminær strømning og rask løsning utveksling selv på lav (1 mL/min) perfusjon priser. Rask MEA tilordning for sanntids overvåking og utvalg av stimulerende elektroder utføres av en tilpasset grafisk brukergrensesnitt (GUI).

Introduction

Epilepsi er en livstruende progressiv lidelse forårsaker ukontrollert aktivitet av hjernen1; bærer blant høyeste byrden av sykdom og betydelige sosiale stigma2,3. TLE er det hyppigste syndromet (40%) og de ofte (~ 30%) motstandsdyktig mot anti-epileptisk medisiner4. Mens kirurgisk ablasjon av epileptogenic vev kan forbedre pasientens tilstand, det er ikke mulig i alle pasienter og garantere fullstendig anfall-fritt liv5. Modulering av epileptiske limbiske nettverk av elektrisk DBS er en lovende tilnærming når farmakologisk behandling eller nevrokirurgi ikke er egnet.

Gnager hjernen stykker er et verdifullt verktøy for å studere hvordan nevrale nettverk-funksjonen i helse og sykdom6 med i vitro elektrofysiologi teknikker, som de bevare, i det minste i en del, den opprinnelige arkitektur og tilkobling av hjernen områdene rundt (ROI). Spesielt vannrett kombinert hippocampus-entorhinal cortex (hippocampus-EC) stykker utgjør de grunnleggende nevrale nettverkene involvert i TLE og er derfor rutinemessig ansatt i i vitro TLE forskning7.

Anfall-lignende aktivitet kan bli akutt indusert i hjernen skiver av endre ioniske sammensetningen av kunstige spinalvæske (ACSF), som reduserer magnesium mens økende kalium8,9,10, eller ved hjelp av farmakologiske manipulasjoner, som blokkerer hemmende GABAergic aktivitet (se11 for en omfattende gjennomgang). Men er disse modellene basert på ubalansert endring av eksitasjon og hemming; Derfor tillater de ikke studere samspillet og felles bidrag av eksitatoriske og inhibitory nettverk til ictogenesis. Kontinuerlig perfusjon av hjernen skiver med convulsant narkotika-4AP forbedrer både eksitatoriske og inhibitory neurotransmission, slik at for å studere akutt ictogenesis mens beholder synaptic aktivitet samlet12.

Tiltak tillate registrering av elektrisk aktivitet som genereres av nevrale nettverk fra et større antall observasjon poeng i forhold til konvensjonelle ekstracellulære felt potensielle opptak, der romlige begrensninger begrense antall elektroder som kan innkvartert på hjernen stykke overflaten. Videre MEA chips tilby den ekstra fordelen av kjente mellom elektrode avstanden, som er svært nyttig å spore forplantning og vurdere reiser hastigheten av innspilte signaler. Selv om utgangspunktet tenkt for opptak fra kulturperler neurons13,14, brukes tiltak nå også som karakteriserer de elektrofysiologiske funksjonene av akutt hjernen skiver fra gnagere15 og mennesker16. Således, i forbindelse med epilepsi forskning, tiltak representerer et verdifullt verktøy for å finne nevrale nettverk interaksjoner kjernen ictogenesis16,17,18.

Imidlertid bærer MEA opptak iboende tekniske utfordringer i å oppnå eller opprettholde en stabil epileptiform mønster gjennom lang (flere timer) eksperimentelle protokoller. Først kan vev oksygenering ikke være tilstrekkelig i de store og rundt neddykket-type opptak kammer19,20 typisk for kommersielt tilgjengelige tiltak, mens fattige signal-til-støy-forhold og temperatur ustabilitet kan påvirke kvaliteten på opptaket når en høy perfusjon rate (6-10 mL/min) brukes til å forbedre oksygen levering til hjernen stykke (se for eksempel tekniske notater på oppvarming og perfusjon utstyr21). Andre, tilbakevendende utslipp med høy frekvens komponenter, for eksempel epileptiform utslipp, er neppe observert ved neddykket-type opptak kamre19; Dette er spesielt tilfelle når akutte epileptiform mønsteret er kjemisk indusert og innebærer ephaptic mekanismer, så det er tilfellet for 4AP modell22 (se11 for en omfattende oversikt). For å overvinne disse begrensningene, foreslått flere strategier av forskere. For eksempel er øker perfusjon sats19,20 samtidig redusere hjernen stykke tykkelse (≤300 µM) og området17,18 avgjørende faktorer å oppnå tilstrekkelig oksygentilførsel til vev. I tillegg kan forbedret hjernen stykke levedyktighet også oppnås ved hjelp av perforerte tiltak (pMEAs), som tillater perfusing hjernevevet fra begge sider18.

Mens beskrevet tilnærminger har forbedret muligheten for MEA opptak fra hjernen stykker, de er ikke testet mot langvarig (flere timer) innspilling og elektrisk stimulering økter, den sistnevnte representerer en betydelig stress for hjernevev. Langvarig innspillingen kan pålegges å studere utviklingen av bestemte funksjoner i epileptiform mønstre som ikke ville være mulig å avsløre av kortsiktige mål. I forbindelse med DBS forskning, kan langvarig eksperimentelle protokoller pålegges å evaluere og sammenligne effekten av flere stimulering paradigmer i samme hjernen stykke.

Når bare spontan elektrisk aktivitet må registreres, tilordning av elektrodene forhold til Avkastningen er vanligvis gjort i posteriori, dvsunder dataanalyse; i stedet krever studien av evoked svar eller elektrisk neuromodulation paradigmer at stimulering skal leveres til bestemte ROI(s), dikterer behovet for rask og enkel live elektrode kartlegging under eksperimentet.

Her viser vi en enkel eksperimentelle protokoll som tillater for induksjon og vedlikehold av en stabil 4AP-indusert epileptiform mønster i voksen gnager hjernen skiver. Observerte aktiviteten gjengir elektrofysiologiske funksjonene i denne modellen som preget med konvensjonelle ekstracellulære elektrofysiologi teknikker. Det vedvarer i flere timer og outlasts vedvarende elektrisk stimulering for gjentatte langvarig epoker. Den kammer brukes til å vedlikeholde og ruge hjernen skiver kan være lett monteres ved hjelp av standard laboratorium forsyninger (figur 1A), mens en egendefinert innspilling kammer muliggjør optimale løsningen valutakurs og laminær strømning (figur 1B) kan hentes fra kommersielle kilder eller bruke 3D trykking teknologien til en rimelig pris. Rask tilordningen av ROI(s) for sanntids overvåking og valg av stimulerende elektrodene er gjort mulig av en tilpasset brukervennlig GUI kalt mapMEA, fritt tilgjengelig på forespørsel.

Figure 1
Figur 1: tilpasset utstyr som brukes for denne protokollen. (A) holde kamre for gjenoppretting, forvarming og pre-inkubering i 4AP er sammen med et beger og en Petriskål. Petriskål bør være mindre i diameter enn breaker og holdes på plass ved hjelp av en sprøytestempelet. Bunnen av Petriskål erstattes av en nylon maske (fra myke strømper) limt med cyanoacrylate på kanten av Petriskål. Oksygen er levert via en bøyd spinal nål (22 G), satt inn mellom veggene i Petriskål og begeret. Bobler bør være nye fra siden av kanne og aldri nå nylon mesh å unngå hjernen stykke forskyvning. Toppen av en Petriskål kan brukes som et lokk å unngå ACSF fordampning og opprettholde oksygenmetning. (B) egendefinert innspilling kammeret. i: innløp reservoaret til oppvarming kanyle og referanse elektroden. ut: stikkontakt reservoaret å imøtekomme sugekraft nålen. REC: opptak kammeret. (C) Glass Pasteur pipette, krøllet av brann-polering, brukes til å håndtere vevet og justere sin posisjon i innspillingen kammeret. (D) egendefinerte skive hold ned anker. (E) sluttmontering av opptak chamber montert på MEA chip. En hjerne skive hviler på bunnen holdt på plass av ankeret. Den røde pilen viser PTFE slangen dekker oppvarming kanyle, mens den røde sirkelen angir referanse elektrode, mettet KCl pellets neddykket av ACSF i innløpet reservoaret. Den blå pilen viser sugekraft nålen i stikkontakt reservoaret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av det italienske Forsvarsdepartementet helse (autorisasjon n. 860/2015-PR) i henhold til EUs direktiv 2010/63/EF på dyr velferd.

1. forberedelse av MEA/Custom kammer

Merk: Start 2 dager før eksperimentet. Bruke en MEA uten en ring (se Materialer tabell).

  1. Rengjør MEA (varighet: 35-40 minutter).
    1. Oppløse en enzymatisk renere pulver i destillert vann. Børste varmt rensemiddel på MEA overflaten og suge MEA inn varmt rensemiddel for minst 3 timer.
    2. Skyll MEA grundig med destillert vann og tørke den med en lofri no-scratch vev.
  2. Montere MEA med innspillingen kammeret (varighet: 10 min + overnatting).
    1. Jevnt spredt cellegummi tetningsmasse på undersiden av opptak chamber. Kontroller at det ikke er noen bobler.
    2. Montere opptak kammeret på MEA ved hjelp av pinsett og bruke lett trykk. Hvis det er bobler, litt flytte kammeret i en sirkel mens bruke lett trykk med fingrene til alle boblene har forsvunnet. Spre en Tetningsmasse laget helt rundt yttermargen opptak kammeret.
      Merk: kritisk! Ikke dekk MEA kontaktene med tetningsmasse.
    3. Plass samlingen MEA/kammer inni en 15 cm Petriskål. Sted en 5 mL Petriskål eller en 10 mL kanne fylt med destillert vann nær MEA. Dekk alt for å opprettholde et fuktig miljø. La kur i romtemperatur over natten.
      Merk: Protokollen kan pauses her.
  3. Pels MEA for å gjøre det hydrofile (varighet: 5-10 min + overnatting).
    1. Plass MEA i en 15 cm Petriskål. Hell 50 µL av poly-D-lysine til MEA innspillingen området. Lukk Petriskål forsegle den med tetting film og lagre over natten på 4 ° C.
    2. Skyll MEA grundig med destillert vann og lagre MEA på 4 ° C i destillert vann.
      Merk: Protokollen kan pauses her. Bestrøket tiltak kan lagres og gjenbrukes for flere eksperimenter. Rutinemessig rengjøring og re belegg MEA hjelper fjerne vev rusk og forbedre signal-til-støy-forhold.

2. forberedelse av lager løsninger

Merk: Starte 1 dag før eksperimentet (varighet: ~ 2 h). Lager løsninger hjelper speed-up eksperimentet eksperimentelle dag. De kan være forberedt på forhånd og lagret. Se tabell 1 for konsentrasjon faktor og komposisjon. Se tabell 2 for sammensetningen av endelige løsninger.

  1. Oppløse kjemikaliene i destillert vann ved romtemperatur. Filtrere lager løsninger med en flaske filter (filter diameter: 0.22 µm).
  2. Butikken på 4 ° C (se tabell 1 for anbefalte maksimale tid).
    Merk: Protokollen kan pauses her.

3. forberedelse av Agar

Merk: Starte 1 dag før eksperimentet (varighet: ~ 1 h).

  1. Hell 250 mL destillert vann i en 500 mL kanne og begynne røring 350 RPM. Legge til 5 g av agar og vent til det er fullstendig oppløst.
  2. Varme løsningen på 250-300 ° C. La vannet fordamper til løsningen er ~ 200 mL til en 2,5% w/v agar løsning.
    Merk: Temperaturen skal være høy nok til å la vannet fordampe uten bobler.
  3. Hell agar løsningen på en 200 mL plast firkantet boks av ~1.5 cm høye vegger og la den avkjøles til romtemperatur før den blir heldekkende.
  4. Dekke boksen og lagre den på 4 ° C. Agar blokken er bra for flere uker.
    Merk: Protokollen kan pauses her.

4. forberedelse av frosne flyet

Merk: Start 1 dag før eksperimentet.

  1. Fyll en flat bunn rustfritt stål bolle med destillert vann til 0,5 - 1 cm under kanten.
  2. Lagre på 20 ° C over natten.

5. forberedelse av Neuroprotective kutte ACSF

Merk: Starte 1 dag før eksperimentet eller samme dag av eksperimentet (se tabell 1 og tabell 2) (varighet: 30 min).

  1. Hell 200 mL destillert vann i et 500 mL beaker og begynne under omrøring med en magnetisk rørestang 350 RPM.
  2. Legge til 50 mL av lager B og 50 mL av lager C (se tabell 1).
  3. Legge 3 mM pyruvic acid, 208 mM sukrose, 10 mM D-glukose og 1 mM L-ascorbic acid.
    Merk: Den faktiske mengden pyruvic syre avhenger av tetthet og renhet og kan variere med bunken. Alltid beregne et bestemt volum når du åpner en ny gruppe.
  4. Dekk med tetting film og la røre i 30 min.
  5. Overføre løsningen til en 500 mL volumetriske kolbe og legge destillert vann for å fylle kolbe.
  6. Seal volumetriske kolbe med tetting film og forsiktig Inverter 3 - 5 ganger før løsningen er jevnt klart.
  7. Overføre kutte ACSF til en glassflaske med cap.
  8. Lagre kutte ACSF på-80 ° C i 20-30 min eller 4 ° C over natten for å kjøle ned 4 ° C.
    Merk: Protokollen kan pauses her hvis natten kjøling foretrekkes. Ellers tiden kreves for kjøling kutte ACSF kan brukes til å forfølge trinn 6.

6. utarbeidelse av holder ACSF

Merk: Forberede løsning frisk på dagen for eksperimentet (varighet: 5-10 min). Holde ACSF brukes til å rense hjernen skiver av klipping ACSF under kutting prosedyren (se trinn 8,16) og hjernen stykke langtidslagring og forvarming. For å rense hjernen skiver, er 100 mL holder ACSF tilstrekkelig. Holding og pre oppvarming kamrene i denne protokollen er skreddersydd og inneholder et antall 300 mL og 100 mL, henholdsvis (jf figur 1A). Med denne innstillingen er 500 mL holder ACSF tilstrekkelig. Chambers fra kommersielle kilder kan inneholde et annet volum, som tilfellet den totale mengden holder ACSF være forberedt bør bli justert tilsvarende.

  1. Hell 200 mL destillert vann i en 500 mL volumetriske kolbe.
  2. Legge til 50 mL av lager A, 50 mL av lager B, 6,5 mL lager M og 1 mM L-askorbinsyre. Forsiktig røre med roterende bevegelser til L-askorbinsyre er fullstendig oppløst.
  3. Legg destillert vann til å nå det siste bindet, forsegle volumetriske kolbe med tetting film, og forsiktig Inverter 3 - 5 ganger før løsningen er jevnt klart. Se tabell 2 for å holde ACSF komposisjon.

7. forberedelse av eksperimentelle benkene

Merk: Dette krever 15 min, pluss 30 min å få en jevn temperatur på varmt bad.

  1. Innspillingen benk
    1. Starte det varmt bad, sett den til 32 ° C og dekke det å opprettholde temperaturen.
      Merk: Den varmt bad i denne protokollen kan være skreddersydd bruker en hard plast boksen og en akvariet termostat ved ønsket temperatur. Jevn ønsket temperatur kan nås på ~ 30 min fra rom temperatur. Siden pre oppvarming og rugende kamrene sitter i bunnen av boksen plast, burde vannstanden være akkurat nok til å dekke termostaten for å holde kamrene fra flytende.
    2. Beholdning og pre oppvarming kamrene (jf figur 1A), og helle holdt ACSF i dem. Holde holder kammeret ved romtemperatur og plasser det pre oppvarming kammeret inni den varmt bad. Start boblende løsninger med 95% O2/5% CO2 gassblanding og fjern fanget bobler med en invertert Pasteur pipette. Holde dekket.
  2. Kutting benken og vibratome
    1. Fest en liten agar blokk på midten av prøveplaten bruker cyanoacrylate lim.
    2. Sett en 250 mL kanne i en isen bøtte og hell kutte ACSF i den.
    3. Ta 100 mL kanner og hell 50 mL av holder ACSF i hver. La kanner ved romtemperatur. Dette er de skyllingsprosess kanner.
    4. Starte boblende løsninger med en 95% O2/5% CO2 gassblanding.
    5. Montere bufferbrettet på vibratome og omgi det med knust is. Hell noen etanol på knust is som hjelp til å opprettholde lave temperaturer under kutting prosedyren. Etter helle etanol, Legg mer is etter behov.
      Merk: En temperatur på 2 ° C er optimal.
    6. Plasser bubbler inne bufferbrettet, så montere og montere vibratome blad blokken.
      Merk: Sørg for at bladet er montert på klaringsvinkelen ~ 10 °.
    7. Sett knust is i en 500 mL kanne til 2/3 av volumet og fyll med destillert vann.
    8. Ta den frosne bollen ut av fryseren, plasser den opp-ned på slicing benken og dekke det med et papirhåndkle og en filter papir plate.
  3. Anestesi benk
    1. Plasser en liten bolle i en is-fylt brett og hell kutte ACSF i den. Starte bobler med en 95% O2/5% CO2 gassblanding.

8. hjernen stykke utarbeidelse og vedlikehold

Merk: Denne protokollen gjør bruk av voksen (4 - 6 uker gamle) mannlige CD1 mus, men andre stammer (f.eks, c57/bl617,18) kan brukes. Vi sammenligne også senere eksperimentelle produksjonen får musen hjernen skiver med det gitt av hjernen skiver fra hannrotter Sprague-Dawley på samme alder. Følgende trinn gjelder utarbeidelse av delvis koblet hjernen skiver som CA3-drevet rask interictal-lignende aktivitet er behersket til hippocampus riktig og kan ikke overføres til de parahippocampal halvdelene, som beskrevet i23. Hippocampus-cortex frakobling er nødvendig å forfølge elektrisk modulering studier ved hippocampus-EC hjernen stykke utarbeidelse. Vibratome brukt refererer til modellen oppført i Materialer tabell. Andre modeller kan kreve en annen prosedyre.

  1. Bedøve gnagere med isoflurane 5% i en carbogen gass blanding levert til en bedøvelse induksjon kammer på 2 L/min.
  2. Under dyp anestesi (ingen reflekser i reaksjon på foten og labber knip), ekstra hjernen innen 1 min følge standard prosedyrer som23. Plasser hjernen i små bollen med equilibrated iskald kutte ACSF og la chill 90 – 120 s.
    Merk: La ikke hjernen chill for lenge, ellers det kan fryse.
  3. Hell den iskalde kutte ACSF i bufferbrettet. Spre kutte ACSF på filter papiret på frosne bollen. Plasser hjernen på papiret filtrere og isolere nødvendig hjernen vev blokken ved å fjerne lillehjernen og kutte frontal pole ut rett.
  4. Med hjelp av en bøyd slikkepott, lim dorsal side av hjernen på prøveplaten med kutt frontal side agar blokken og occipital stangen vender vibratome bladet. Bruk et tynt lag med cyanoacrylate lim. Plasser prøveplaten i bufferbrettet umiddelbart og sikre den.
  5. Juster snitt området vert vibratome bladet hele veien over vevet til agar blokken. Juste prøven plate høyden for å nå et blad nivå med hjernen vev blokken.
  6. Forkaste delene vev til hippocampus er synlig (vanligvis ~ 900 µm). Deretter sette skive tykkelse på 400 µm og starte utstyr for å beholde delene vev. For hver hjernen del splitte de to halvkulene og trim unødvendige vev for å få to hjernen skiver. Som bufferbrettet forsterkes under etterfølgende avsnittene, fylle bufferen skuffen plass med destillert vann (se trinn 7.2.7).
  7. Bruk en invertert Pasteur Pipetter forsiktig overføre hjernen sektorene i første skyllingsprosess begeret, tømme Pasteur pipette, og overføre hjernen skiver til andre skyllingsprosess begeret. Deretter overføre hjernen skiver i holder kammeret og la dem i minst 60 minutter.
    Merk: Vanligvis er det mulig å få 6-8 hjernen skiver generelt. Protokollen kan pauses her.

9. forberedelse av ACSF inneholder 4-AP (4AP-ACSF)

Merk: Dette krever 10 min for utarbeidelse, pluss 20 min oppvarming. Advarsel! 4-AP er et convulsant stoff, og det er giftig. Arbeidshansker og unngå søl.

  1. Hell 200 mL destillert vann i en 500 mL volumetriske kolbe.
  2. Legge til 50 mL av lager A, 50 mL av lager B, 5 mL av lager M og 1 mM L-askorbinsyre. Forsiktig røre med roterende bevegelser til L-askorbinsyre er fullstendig oppløst.
  3. Legg til 500 µL av 4AP lager.
  4. Legg destillert vann til å nå det siste bindet, forsegle volumetriske kolbe med tetting film, og forsiktig invertere den 3 - 5 ganger før løsningen er jevnt klart.
  5. Montere 4AP incubating kammeret (jf figur 1A) og hell ~ 80 mL av 4AP-ACSF i den. Dekke kammeret, overføre det til den varme bad og starte bobler med en 95% O2/5% CO2 gassblanding. Fjerne fanget bobler med en invertert Pasteur pipette. Holde dekket.
  6. Vent til 4AP-ACSF temperaturen er 30-32 ° C (~ 20 min).
    Merk: Protokollen kan pauses her hvis hjernen skiver er fortsatt utvinne.

10. forvarming og inkubasjon av sektorer i 4AP (varighet: 90 min)

  1. Kontroller at den pre oppvarming ACSF og 4AP-ACSF temperaturen er 30-32 ° C.
  2. Bruk en invertert glass Pasteur pipette overføre 1 hjernen skive til pre oppvarming kammer og la vev resten for 25-30 min. Deretter overføre hjernen sektoren i 4AP-ACSF incubating kammeret og la den hvile i 60 minutter.

11. utarbeidelse av MEA oppsett

Merk: Start 15 minutter før du spiller inn.

  1. Overføre gjenværende volumet av 4AP-ACSF til en 500 mL Erlenmeyer kolbe.
  2. Plasser Erlenmeyer kolbe på en hylle over MEA forsterkeren og bruke slangen for å tillate løsningen du kontinuerlig innmating en 60 mL sprøyte. Juste høyden på Erlenmeyer kolbe og sprøyten for å tillate en gravity-innmatede hastighet på 1 mL/min.
    Merk: Riktig høyde, avhenger av rør indre diameter (ID). Rør av 5/32 inches ID er 30 cm tilstrekkelig.
  3. Starte boblende 4AP-ACSF Erlenmeyer kolbe og sprøyten med en 95% O2/5% CO2 gassblanding.
  4. La 4AP-ACSF flyten gjennom perfusjon slangen i et beaker til der er ingen luften inne; så stopp løsning flyten.
  5. Koble varmeelementet ved MEA til termostaten. Plasser tørr MEA chip inne MEA forsterkeren og sikre forsterker hodet. Bruke en plast Pasteur pipette for å overføre 4AP-ACSF til innløp og ytre reservoar av opptak kammeret.
  6. Sikre oppvarming kanyle en magnetisk innehaveren og plassere sine tips i innspillingen kammer innløp havnen. knytte magnetiske abonnenten til en magnetstripe på MEA forsterker hodet; koble perfusjon slangen til kanyle; koble kanyle til termostaten.
    Merk: Oppvarming kanyle bør dekkes av skrå polytetrafluoroethylene (PTFE) rør nå innspillingen kammeret innløp port og minimere støy som skyldes metallisk materialet kanyle. Når innløp reservoaret er tilstrekkelig fylt med 4AP-ACSF, skal drops faller fra perfusjon systemet ikke vises.
  7. Plasser sugekraft nålen inne reservoaret og kontroller at det er negative trykket av submerging sugekraft nålen til ACSF; Sjekk for en konstant lavfrekvente sugekraft støy.
    Merk: Sugekraft nålen plasseres slik at 4AP-ACSF å strømme like over hjernen stykke overflaten. En vakuum linje eller en lav støy vakuumpumpe kan brukes.
  8. Angi flyten regulator å tillate en strømningshastighet på 1 mL/min og starte perfusing.
    Merk: Gravity-innmatede perfusjon eliminerer støy som skyldes peristaltiske pumper; Hvis peristaltiske pumper er foretrukket, er støyfri modeller obligatorisk.
  9. Når 4AP-ACSF strømmer gjennom kanyle, slå på termostaten. Angi oppvarming kanyle 37 ° C og MEA basen til 32 ° C å oppnå en temperatur på 32-34 ° C inne i innspillingen kammeret.
    Merk: Advarsel! Aldri kan varme kanyle uten løsning i den eller den være irreversibelt skadet. Angi temperaturen på kanyle høyere enn opptak temperaturen (dvs., 32-34 ° C) står for den indre temperatur forskyvning mellom angitt verdi og virkelig verdi på spissen av oppvarming kanyle og opptak kammeret. Den flyt, miljø temperaturen og volum av opptaket kammer alle innflytelse temperaturen på innspillingen løsning. Innstillingene i steg 11,9 er optimalisert for beskrevet protokollen og utstyr. Alltid sjekke selve innspillingen temperaturen bruker en thermocouple og Juster innstillingene etter behov. Ikke varme MEA basen over 34 ° C for å unngå overoppheting hjernen sektoren.
  10. Plasser ekstern referanse elektrode i innspillingen kammer innløp reservoaret.
    Merk: Selv om MEA chips er utstyrt med en intern referanse elektrode, er dette dekket av egendefinert innspilling kammeret. Dermed må en ekstern referanse elektrode brukes. Mettet KCl pellets er den mest praktiske, siden det er klar til bruk uten behov for klorering.

12. MEA Live kartlegging

  1. Når 4AP-ACSF nivået og opptak temperaturen er stabilisert som ønsket, slå av perfusjon og suge stopcocks til av-stillingen midlertidig stoppe dem.
    1. Raskt overføre én hjernen sektor på MEA opptak kammeret ved hjelp av en invertert glass Pasteur pipette. Justere sin posisjon på MEA innspillingen området som nødvendig bruker en brann-polert krøllet Pasteur pipette (figur 1 c) eller en myk kompakt liten børste. Plass hold ned ankeret (figur 1 d) på hjernen sektoren. Starte av perfusjon og inntaks ved å slå sine stopcocks tilbake til på-stilling.
      Merk: kritisk! Stykket skal overføres, og perfusjonen gjenopptas innen 60 s eller vevet kan dø. Skive hold ned ankeret bør holdes i 4AP-ACSF å hindre hjernen sektoren i å flytte mens plassere ankeret på hjernen sektoren på grunn av forskjeller i overfladisk spenning. Ankeret å sikre hjernen sektoren på MEA kan være skreddersydd med rustfritt stål wire og nylon tråd (figur 1 d) eller innhentet fra kommersielle kilder. Figur 1E viser den endelige eksperimentelle set-up med MEA chip koblet til phono-inngangen på hodet: en hjerne skive hviler på MEA chip innenfor opptak kammeret er holdt nede ved egendefinerte ankeret. Referanse elektroden (røde sirkelen) og PTFE rør dekker oppvarming kanyle (rød pil) er plassert i innløpet reservoaret, mens sugekraft nålen (blå pil) er plassert i stikkontakt reservoaret.
  2. Ta et bilde av hjernen sektoren bruker et kamera montert på en invertert mikroskop scenen.
  3. Kjør skriptet mapMEA på dataprogrammer for å starte GUI for å tilordne elektrodene.
    Merk: Skreddersydd programvaren lar brukeren velge elektrodene som tilsvarer spesifikke strukturer i hjernen sektoren. Dette trinnet er avgjørende for å aktivere den riktige veien og undertrykke ictal aktivitet ved å bruke elektrisk stimulering.

Figure 2
Fig 2: GUI for live MEA elektrode kartlegging. (A) skjematisk fremstilling av kombinerte hippocampus-EC sektoren på MEA. Standard strukturene brukes for denne protokollen er cornu ammonis 3 (CA3), enthorinal cortex (EC), perirhinal cortex (PC), og subiculum (SUB). Referanse elektroden er schematized som en markør trekanten. Elektroder omkranset med stiplede linjer representerer XY-koordinater for bildet rette. (B) skjermen fange på GUI under bor MEA tilordningen. Flytskjema til venstre på fangst angir fremgangsmåte å følge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Klikk Bla gjennom for å laste bildet av hjernen sektoren. Kontroller at referansen elektroden vises i den øverste raden i til halv-venstre MEA (figur 2A, trekant merke). Aktivere pekeren klikk, og velg elektrodene øverst og nederst i den venstre raden i matrisen merke XY-koordinater til bildet rette og elektroden kartlegging.
  2. Velg vannrettfra rullegardinmenyen stykketype . Sjekke avkrysningsruten standard strukturer .
    Merk: Det er mulig å tilpasse strukturene ved å klikke Angi nye strukturer . Standard strukturer for vannrett hjernen skive er avbildet i figur 2A.
  3. Ved hjelp av nummererte tastene under hjernen stykke bildet, Velg elektrodene tilsvarer Avkastningen og klikk den tilhørende knappen i strukturer panel å tilordne dem (figur 2B); Gjenta dette trinnet for hver avkastning.
  4. Trykk Lagre : programvaren genererer resultatet mappen #EXP_LabelledElectrodes inneholder en tabell som rapporterer den valgte elektroder og ROIs.

13. opptak og elektriske modulering Epileptiform aktivitet

  1. Tillat hjernen sektoren å stabilisere innenfor opptak kammeret i 5-10 min før opptak.
  2. Slå på stimulans enhet minst 10 min før stimulering protokollen tillate selv kalibrering og stabilisering. Start stimulans kontroll programvare, og kontroller at stimulator og MEA forsterker er riktig koblet som angitt av en grønn LED i hovedpanelet i Kontrollprogramvaren stimulans. Se manualer instrument og programvare for ytterligere informasjon, jf Materialer tabell.
  3. Definere stimulering i bipolar konfigurasjon. Velg elektrode par i kontakt med pyramideformet celle laget CA1/proksimale subiculum (jf24,25) blant de kartlagt med skriptet mapMEA (jf delen 12). Bruk en wire for å koble en av valgte elektrodene for negative pluggen stimulator og andre elektroden til positiv pluggen på samme stimulator kanal. Bruk en annen wire for å koble bakken av stimulator i bakken av forsterkeren.
  4. Start innspillingen programvare. For å skaffe data, trykker du spill av-knappen i hovedpanelet på innspillingen programvare. Post minst 4 ictal utslipp.
    Merk: En samplingsfrekvens på 2 kHz kan anskaffe feltet potensialer med god oppløsning samtidig bruk av harddisk. En 5-min opptaksfil tar ~ 80 MB. Høyere samplingsfrekvenser kan være nødvendig, f.ekså registrere stimulans gjenstander eller multi-unit aktivitet. For å observere feltet potensialer bare, bruk en levende low pass-filteret på 300 Hz for å kutte multi-unit aktivitet.
  5. Bestemme stimulans intensiteten.
    1. I stimulans Kontrollprogramvaren, kan du bruke hovedpanelet for å designe en kvadrat bifasisk positive-negative gjeldende puls varighet på 100 µs/fase.
      Merk: Advarsel! Likestrøm stimulering krever en balansert kostnad puls å unngå å skade utstyret.
    2. Kjøre en rask inndata/utdata (i/u) test for å identifisere beste stimulans intensiteten. Levere stimulering pulsen designet på trinn 13.5.1 på 0,2 Hz eller lavere ved å legge et Inter puls intervall på 5 s eller mer i den riktige formen for Kontrollprogramvaren stimulans. Skriv inn en innledende puls amplitude 100 µA/fase i kategorien puls amplitude og øke ved 50-100 µA trinn på hvert forsøk til stimulering kan fremkalle pålitelig interictal-lignende hendelser i parahippocampal halvdelene (Sjekk signalene visualisert ved den innspillingen programvare).
  6. Elektrisk modulering av limbiske ictogenesis
  7. Programmet stimulans enheten å levere stimulering protokollen av interesse. Bruk stimulans amplituden identifisert under I/O testen.
    Merk: The failure rate av evoked svar skal ≤20%.
  8. Når stimulering stopper, kan du kontrollere nettverket utvinning før stimulans tilstand ved minst 4 ictal utslipp (som trinn 13,4).

Representative Results

Plane tiltak med 6 x 10 500 µm elektrode avstand ved oppsett og er den ideelle avspillingsenheten for eksperimentell protokollen beskrevet her, siden deres innspillingen området dekker hele hjernen sektoren i sin helhet (figur 3A, se også17). Selv om perforert tiltak (pMEAs) ville være å foretrekke å forbedre vev oksygenering, deres innspillingen området er for liten (~ 2 mm diameter). Dette tillater ikke samtidig visualisering av elektriske signaler hippocampus og parahippocampal halvdelene (data ikke vist; se18).

Observerte 4AP-indusert epileptiform mønsteret (figur 3A) gjengir hva er vanligvis observert i denne i vitro modellen bruker konvensjonelle felt potensielle opptak og består av tre typer aktivitet7, 26: (jeg) ictal-lignende hendelser (figur 3B, pilspisser) er robust langvarig (> 20 s, rekkevidde: 20-60 s) hendelser som ligner electrographic funksjonene i beslag aktivitet med tonic og kloniske komponenter (Figur 3 c); de er generert i parahippocampal halvdelene hver 3-5 minutter og re-Enter hippocampus dannelsen gjennom den dentate gyrus (figur 3D, pil); (ii) langsom interictal-lignende utslipp (figur 3B, EC spor, svart bar, utvidet i figur 3E) er kort (< 1 s) befolkningen hendelser generert mellom ictal hendelser overalt i hippocampus-EC hjernen stykke forberedelse og på en sakte tempo (området 10-30 s); (iii) rasktinterictal-lignende utslipp (figur 3B, CA3 spor, svart linje, utvidet i figur 3E) er regelmessige kort (< 1 s) befolkningen hendelser generert av CA3 hippocampus underfeltet; Når Schaffer Collaterals beholdes, fort CA3-drevet interictal hendelser overføre langs hippocampus loopen og utøve en anti-ictogenic effekt24 (data ikke vist). for å forhindre ictal aktivitet trekk, for beskrevet protokollen, CA3 utgang er forstyrret (jf figur 3B, E). Det må bemerkes at rask CA3-drevet interictal aktiviteten registrert bruker tiltak skjer med lavere tempo (~ 0,4 Hz) enn hva er observert med konvensjonelle feltet potensial med glass Pipetter (~ 1 Hz, utvalg: 0,5 - 2.0 Hz, data ikke vist).

Det vellykkede resultatet av elektriske neuromodulation i gnager hjernen skiver avhenger av aktivering av bestemte neuronal stier27 sammen med iboende tilkobling mellom regionene i forberedelse24. Vi har testet skiver fra voksne hannrotter Sprague-Dawley og CD1 mus og vi har funnet at mus heller enn rotte hjernen skiver tilbyr beste bytteforholdet størrelse, tykkelse og iboende tilkobling. Først takk til deres mindre størrelse, de passer små innspillingen området kommersielt tilgjengelig tiltak bedre (figur 4A, venstre: rotte, høyre: mus); andre, de er mer motstandsdyktige mot ufordelaktig betingelsen er innebygd MEA opptak (jf innføring): selv om ictal som elektrisitet generert av disse to vev (figur 4B) er lignende varighet ((Figur 4C ) venstre), deres frekvensen av forekomsten er betydelig kortere i musen hjernen skiver (n = 10 stykker hver arter; 2 tosidig kort t-test, p < 0,001; Figur 4C høyre). Sistnevnte lar fartsovertredelse opp eksperimentelle protokollene, gjør det mulig å teste flere hjernen skiver under én eksperimentelle dag: for dette settet med representant resultater, vi kunne teste et tilsvarende antall hjernen skiver fra to arter (rat: n = 58; mus: n = 52), men antall mus (n = 18) var 2-fold mindre enn rotter (n = 42).

Videre musen hjernen skiver vises med tettere forbindelser og er derfor mer sannsynlig til å reagere bedre vedvarende elektrisk neuromodulation (Figur 4 d). Dermed i dette i vitro modell av ictogenesis er levedyktigheten for elektrisk stimulering rettet kontrollere ictal aktivitet vesentlig større for mus enn for rotte hjernevev. Dette aspektet gjenspeiles også av betydelig høyere suksessrate på stimulering eksperimenter utført ved hjelp av musen mot rotte hjernen skiver selv når forfølge flere varig stimulering protokoller ()figur 4E). Faktisk vises musen hjernevev bedre tåle vedvarende elektrisk stimulering som foreslått av høyere overlevelse i testet eksperimentelle tidsrammen av 4 h (figur 4F). Dermed gjør mindre størrelsen med bedre bevaring av iboende tilkobling musen hjernen skiver den beste kandidaten til å utføre MEA registrerer tar sikte på å studere hippocampus-parahippocampal nettverk interaksjoner og evaluere elektrisk NeuroModulation protokoller som er relevante for TLE.

Periodiske pacing i CA1/subiculum er kjent for å kontrollere limbiske ictogenesis i den 4AP-behandlet hippocampus-EC skive forberedelse24,25,27, med 1 Hz som de mest effektive frekvens27. Således, det er også nyttig som en positiv evaluere effekten og effektiviteten av andre neuromodulation (se for eksempel25). Som nevnt ovenfor, elektriske pulser leveres direkte gjennom MEA (dvs.uten behovet av en ekstern stimulerende elektrode) kan fremkalle befolkningen svar i gnager hjernevev (se også28). Tilstrekkelig bevaring av neuronal nettverkstilkobling i hjernen sektoren, nøyaktig plassering av hjernen sektoren på MEA, og velger stimulerende elektrode par tillate drive elektriske neuromodulation eksperimenter som effektivt kontrollere ictogenesis. Som vist i figur 5A, er det mulig å gjengi kanoniske 1 Hz periodiske pacing protokollen bruker planar tiltak både som en innspilling og en stimulerende enhet, med fordelen at effekten av elektrisk stimulering kan bli visualisert gjennom det hjernen vev delen med mange like linjeavstand observasjon poeng i forhold til konvensjonelle feltet potensielle innspillingen. Figur 5B viser kvantifisering av resultatene oppnådd n = 9 hjernen skiver, som indikerer en betydelig reduksjon av totalen gripe tid (totalt ictal aktivitet varighet/observasjon tid25) under stimulering (én måte-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0,01, Fishers LSD legge hoc test, beskyttet). Resultatene er konsistente med litteraturen for eksterne stimulerende elektroder24,25.

Til å beregne totalen gripe tid, observasjon tiden avhenger av intervallet mellom ictal hendelser, og det også bestemmer minimumsvarighet for stimulering protokollen må trygt evaluere effekten av neuromodulation. Vi finner at opptak minst 4 ictal utslipp (og dermed minst 3 intervallene mellom ictal hendelser) er en god avveining mellom innsamlede eksemplene og nødvendig samling. I kontroll tilstand (dvs., ingen stimulering) er observasjon lag mellom utbruddet av den første målte ictal hendelsen og oppsigelse av det siste. Under neuromodulation lik observasjon stimulans protokollen varigheten, siden målet med målingen er å tallfeste fenomener som forekommer hele tiden som forstyrrelsene er innført i systemet. Databehandling og sammenligne totalen gripe tid i stedet for varighet og hendelsesintervallet ictal er den mest passende parameteren å unngå type II feil. Faktisk, med komplett undertrykkelse av ictal aktivitet er det også mulig at bare én ictal hendelsen genereres under elektrisk stimulering i motsetning til flere hendelsene observert kontroll tilstanden. I dette tilfellet, mens det ikke er mulig å måle intervallet mellom hendelser, representerer måle ictal varighet som en estimator av stimulering effekt ikke faktisk utfallet av neuromodulation (dvs., ictal aktivitet reduksjon).

Samlet viser resultatene som presenteres her at musen hjernen skiver koblet til tiltak er verdifulle verktøy for epilepsi forskning og utføre pålitelig neuromodulation studier som er relevante for fremme innen DBS epilepsi behandling. I tillegg protokollen beskrevet her forbedrer hjernen stykke levedyktighet og kan forfølge eksperimentelle økter i flere timer (figur 6), som kan være nødvendig, for eksempel for å sammenligne effekten av ulike elektrisk stimulering paradigmer.

Figure 3
Figur 3 : Typisk 4AP-indusert epileptiform mønster visualisert med ut MEAs. (A) musen hjernen stykke på en plan 6 x 10 MEA (elektrode avstand: 500 µm) og side-ved-side oversikt over 4AP-indusert epileptiform mønsteret visualisert med MEA opptak. Hver firkant i rutenettet tilpasset aktivitet innspilt på den tilsvarende plasseringen i hjernen sektoren. Stiplede blå linjer se elektrode radene for mer klarhet. Opptaksnummeret elektrode som er identifisert i blått i øvre venstre hjørne av hvert kvadrat. Den grå krysset firkantet representerer referanse elektroden. (B) representant spor segmenter av EU og CA3 mønstre visualisert på en raskere tidsskala. Pilspisser indikerer ictal hendelser. EC spor er det mulig å sette pris på forekomsten av langsom interictal utslipp (svart bar), mens CA3 underfeltet genererer typisk vedvarende fastinterictal mønsteret (svart bar). (C) utvidet opptak av en ictal utslipp viser den typiske tonisk-kloniske mønsteret. (D) Fast skala visualisering av pre-ictal-til-ictal overgangen tilsvarer EF (rød) og CA3 (svart) spor segmenter preget av den røde linjen med (B). Pilen viser utbruddet av ictal utslipp. Lagt spor markere at hendelsen ictal stammer i EU, og deretter overfører til CA3 underfeltet. (E) utvidet visning av interictal periodene preget av svarte striper i (B) understreker mangel på sammenheng mellom den langsomme og fastinterictal mønstre generert av EC (rød) og CA3 (svart), henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Mus hjernen skiver tilbyr en høyere eksperimentell produksjon enn rotte hjernen skiver. (A) hjernen stykke fra en rotten (venstre) og en mus (til høyre) i matchet aldre. Rotte hjernen stykket er mye større enn området MEA opptak og dens elektrisk aktivitet kan visualiseres i sin helhet. (B) direkte sammenligning visuelle av tilbakevendende ictal aktivitet som genereres av mus og rotten enthorinal cortex (EC). (C) Mus og rotten hjernen skiver generere ictal utslipp av lignende varighet, men intervallet mellom disse hendelsene er nesten 2-fold i rotte hjernevev. * p < 0,05. (D) idet sammenlignet med rotter, mus tilbyr en 2-fold høyere avkastning av hjernen skiver levedyktig for elektrisk stimulering eksperimenter sikte på å kontrollere ictogenesis. Elektrisk stimulering av subiculum kan fremkalle befolkningen svar i parahippocampal halvdelene i bare 20 av 58 (34%) rotte hjernen skiver, i motsetning til 33 av 52 (63%) musen hjernen skiver (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0,05. (E) blant levedyktig skiver, suksessraten kontrollere ictal aktivitet er 2-fold med musen versus rotte hjernen skiver (mus: 20 av 33 hjernen skiver, 60%: rotte: 6 av 20 hjernen skiver, 30%. Chi2: 4,67; p = 0,03). p < 0,05. (F) musen hjernen skiver kan tåle gjentatt langvarig epoker av vedvarende elektrisk stimulering (grå-fargede områder). På stimulans tilbaketrekking, musen hjernevev utstillinger full gjenoppretting av epileptiform mønsteret, mens rotte hjernen vev levedyktighet faller dramatisk på 3 h. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Representant eksperimentet av elektriske modulering av ictogenesis bruker hjernen skiver koplet til MEAs. (A) innspillinger av 4AP-indusert ictal aktivitet i EU og PC under kontroll tilstanden (ingen stimulering), periodiske pacing (PP) ved 1 Hz (stimulans gjenstand er avkuttet), og under gjenoppretting på stimulans tilbaketrekning. (B) kvantifisering av effekten av PP ved 1 Hz på totalen gripe tid. p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Representant langsiktige innspilling av 4AP-indusert ictal aktivitet. (A) spor segmenter innspilte 8 h etter hjernen kutting prosedyre og følgende 2 h 4AP programmet. (B) utvidet spor segmenter tilsvarer eske ictal utslipp identifiseres av bokstaver en, bog c i panelet (A) Vis konsistensen av genererte ictal aktivitet gjennom langvarig observasjon tid-enken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Lager A Kjemisk Molekylvekt Konsentrasjon (mM)
NaCl 58.44 1150
Løsemiddel: destillert vann KCl 74.55 20
Konsentrat: 10 x  KH2PO4 136.1 12.5
Lagringstemperatur: 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147.02 20
Maksimale tid: 1 uke D-glukose 180.2 250
Merk: filtrere ved hjelp av et 50 mm membran filter
Lager B Kjemisk Molekylvekt Konsentrasjon (mM)
NaHCO3 84.01 260
Løsemiddel: destillert vann
Konsentrat: 10 x 
Lagringstemperatur: 4 ° C
Maksimale tid: 1 uke
Merk: filtrere ved hjelp av et 50 mm membran filter
Lager C Kjemisk Molekylvekt Konsentrasjon (mM)
KCl 74.55 20
Løsemiddel: destillert vann KH2PO4 136.1 12.5
Konsentrat: 10 x MgCl2* 6 H2O 203.3 50
Lagringstemperatur: 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246.47 20
Maksimale tid: 2 wks CaCl2* 2 H2O 147.02 5
Merk: filtrere ved hjelp av et 50 mm membran filter
Stock M Kjemisk Molekylvekt Konsentrasjon (mM)
MgSO4* 6 H2O 246.47 100
Løsemiddel: destillert vann
Konsentrat: 100 x
Lagringstemperatur: 4 ° C
Maksimale tid: 4 wks
4AP aksje Kjemisk Molekylvekt Konsentrasjon (mM)
4-aminopyridine 94.11 250
Løsemiddel: destillert vann
Konsentrat: 1000 x
Lagringstemperatur: 4 ° C
Maksimale tid: 2 wks
Merk: vortex for 2-3 minutter eller stirr i 30-60 min
Merk: advarsel! 4-AP er giftig og cinvulsant. Bruk hansker og unngå å spre eller søl.

Tabell 1: Lager løsninger.

HOLDE ACSF OPPTAK ACSF KUTTE ACSF
Kjemisk C [mM] Kjemisk C [mM] Kjemisk C [mM]
NaCl 115 NaCl 115 Sukrose 208
KCl 2 KCl 2 KCl 2
KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25
MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5
CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2
D-glukose 25 D-glukose 25 CaCl2 0,5
NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-glukose 10
L-askorbinsyre 1 L-askorbinsyre 1 NaHCO3 26
L-askorbinsyre 1
pH 7.4 pH 7.4 Pyruvic syre 3
Osmolality 300 mOsm/Kg Osmolality 300 mOsm/Kg
pH 7.4
Osmolality 300 mOsm/Kg

Tabell 2: Løsninger komposisjon.

Feilsøking
PROBLEMET MOTTILTAK
Ictal utslipp se 'delvis' Redusere perfusjon frekvensen og/eller redusere ACSF volumet over hjernen sektoren ved å justere sugekraft nål plasseringen.
Ingen ictal aktivitet (1) Kontroller at CA3-drevet fort interictal hendelser ikke er spredd til cortex. Bruk en liten skalpell blad (f.eks n.10) eller en nål bryte Schaffer Collaterals hvis nødvendig, men vær forsiktig med å kutte nylon trådene til skive hold ned ankeret. En stereo- eller oppreist mikroskopet er best egnet, mens invertert mikroskop gjør oppgaven svært vanskelig.
(2) sjekk skive levedyktigheten: sterk elektrisk stimulering, kan utløse ictal aktivitet? Vent ca 2 timer med 4AP program og deretter endre hjernen stykke hvis ictal aktivitet ikke oppstår.
Hjernen stykket beveger seg når du plasserer hold ned ankeret (1) forsiktig fjerne skive ankeret og flytte hjernen sektoren.
(2) Kontroller at skive ankeret jevnt våte av 4AP-ACSF.
(3) fjerne det 4AP-ACSF fra innspillingen kammer å favorisere hjernen stykke vedheft til MEA.
(4) flytte skive hold ned ankeret.
Hjernen stykket flyter på MEA chip etter overføres (1) forsiktig Sug opp overflødig ACSF med en Pasteur pipette.
(2) the MEA chip kan må være re-belagt.
Elektrisk stimulering framprovosere ikke nettverk svar Øke stimulans intensitet, endre elektrode par.
Elektrisk stimulering kan framprovosere befolkningen reaksjoner i de proksimale men ikke distale kortikale områdene Problemet er ikely på grunn av dårlig tilkobling eller lavt stimulans intensitet. Elektrisk stimulering er ineffektive eller effektiv i noen kortikale områder bare. Det anbefales å endre hjernen stykke.
Signalet er bråkete (1) se referanse elektrode: støyende planlagte kan til tider være forårsaket av ufullstendig fyll av vik reservoaret slik at referanse elektrodene er ikke helt dypt inn i ACSF.
(2) kontroller generelle jording av utstyr.
(3) Juster sugekraft nål posisjon for å høre en konstant, myk sugekraft lyd. Bakken sugekraft nålen.
(4) Rengjør MEA eksterne kontakter med etanol med en bomullspinne.
(5) the MEA chip kan være skadet: endre MEA chip og sjekk gjenstander og signal-til-støy-forhold.

Tabell 3: feilsøking.

Discussion

Tiltak er et uvurderlig verktøy for nevrofysiologi undersøkelser og har nådd modenhet i de senere år takket være tiår med utforsking og utvikling. Sammenlignet med konvensjonelle felt potensielle opptak har tiltak den store fordelen av mange observasjon poeng og kjent mellom elektrode distanse, som er avgjørende for å nøyaktig finne nevrale nettverk interaksjoner.

MEA opptak teknikken kan også kobles til andre elektrofysiologi tilnærminger, som patch-klemme opptak15, å undersøke forholdet mellom enkelt Nevron og nevrale nettverksaktivitet. Videre kan se feltet potensialer og multi-unit aktivitet samtidig gir verdifull innsikt i sammenhengen mellom aktiviteten til små neuronal ensembler og kollektive nevrale nettverk. Kombinasjonen med spenning-sensitive fargestoffer, kalsium imaging og optogenetics29 kan dedusere nevrofysiologi fenomener bruke polyhedral tilnærminger. I tillegg til farmakologisk studier, muligheten for både opptak og stimulering med samme system gjør MEA opptak teknikken svært kraftig og allsidig: det er for eksempel mulig å studere synaptiske plastisitet fenomener på den kjernen i minne formasjon30, ved hjelp av neuromodulation protokoller presenteres her, som er relevante for DBS til å behandle epilepsi og en rekke hjernen lidelser. Nyere bevis at MEA opptak teknikken kan brukes med hell til epileptiske hjernen vev16 demonstrerer nytten uvurderlig i epilepsi forskning, både å forstå grunnleggende mekanismene bak denne ødeleggende sykdommen og finjustere DBS algoritmer for å forbedre den.

Men tiltak tvinge jakten på elektrofysiologi eksperimenter under 'begrense' vilkår for hjernen skiver, kravet om en neddykket opptak kammer og nødvendigheten av å la hjernen skjær resten på solid underlaget der mikro-elektrodene er integrert. Dermed mottar hjernevev ikke tilstrekkelig oksygentilførsel, som igjen kan påvirke kvaliteten på opptakene.

Protokollen beskrevet her kan pålitelig registrere og studere ictogenesis i gnager limbiske nettverk koblet til tiltak ved hjelp av akutt i vitro 4AP-modellen og forfølge langvarig epoker av elektrisk stimulering, som gir relevant informasjon for evalueringen DBS politikk.

Tidligere studier på elektrisk neuromodulation epileptiske limbiske nettverk basert på bruk av konvensjonelle potensielle feltopptak har brukt musen eller rotte hjernen skiver med lignende resultater24,25; men bruk av rotte hjernevev vist seg mer utfordrende, rimelig grunn svakere tilkobling i forhold til hjernevev innhentes fra mus7. Med hensyn til MEA teknikken er musen hjernen stykker best egnet i kraft av sin mindre størrelse. Videre, gitt høyere frekvensen av forekomsten av ictal-lignende utslipp i musen versus rotte hjernevev, er det mulig å teste betydelig mer hjernen skiver gjennom en eksperimentell dag, som i sin tur gjør datainnsamling raskere og mer effektiv, og kan redusere antall dyr som brukes.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder:

Ictal utslipp registrert bruker egendefinerte kammeret beskrevet her synes å være lik varigheten og frekvensen av forekomsten de observeres med konvensjonelle MEA ring kammeret og samme MEA type (planar mikro-elektroder, jf - 17). Men må det understrekes at hjernen stykke tykkelse må reduseres betydelig når bruker konvensjonelle runde opptak kammeret sammen med en lav perfusjon hastighet (1 mL/min), som kan hindre vellykket jakten på neuromodulation eksperimenter grunn å dårlig tilkobling.

I denne protokollen gir et lavt volum egendefinert innspilling kammer inspirert av oppdateringen-klemme opptak kammer design stabile og pålitelig laminær luftstrøm som er avgjørende for vellykket jakten på MEA innspillinger; Det kan også øke hjernen stykke tykkelsen til 400 µm for å oppnå en rettferdig avveining mellom vev levedyktighet og iboende tilkobling. Det er faktisk anerkjent at laminær strømning av innspillingen løsning innenfor kammeret er høylig attråverdig for hjernen stykke elektrofysiologi, siden den påvirkes ikke av temperatur, oksygen, og pH forløpninger som er observert i rundskriv-flow runde opptak Chambers19,20,31 (som de følger med kommersielt tilgjengelig MEA). Slike graderinger introdusere eksperimentelle bias og er også skadelig for hjernen sektoren. Innspillingen kammer av et relativt lite volum (~1.5 mL) sammen med en høy perfusjon rate (5-6 mL/min)16,31 tillate tilstrekkelig utveksling av perfusjon mediet (≥3 ganger / min). Egendefinerte kammeret kan lett hentes fra kommersielle kilder til en rimelig pris eller produsert internt med 3D trykking teknologien. Andre studier har rapportert MEA opptak fra 400 µm tykke menneskelige hjerne skiver16 ved hjelp av konvensjonelle MEA ring kammeret, mens holde ACSF volumet til 1 mL og håndheve en høy perfusjon rate (5-6 mL/min) ved hjelp av en lav støy peristaltiske pumpe. Men har forfattere brukt en annen modell av ictogenesis, dvs., den lave Mg2 +, som er trolig mindre påvirket enn den 4AP modellen av ephaptic mekanismer som involverer betydelige økninger i ekstracellulære K+ konsentrasjon 11 , 22. vi har funnet at en høy perfusjon rate ikke er ønskelig i 4AP modellen, muligens på grunn av rask vask ut av akkumulert ekstracellulære K+, hvilke må økes betraktelig i innspillingen ACSF16. Faktisk ictal hendelser ble vist mer 'delvis' ASCF perfusjon hastighet ble økt til 2-3 mL/min og hjernen stykket ble oversvømt av et tykt ACSF lag, mens fullverdig utslipp viser robust tonisk-kloniske komponenter kan gjenopprettes ved retur til en lavere perfusjon pris (1 mL/min) og en tynnere ACSF lag retten til vevet overflaten nivået (data ikke vist). Egendefinert innspilling kammeret beskrevet i denne protokollen kan utveksle perfusjon mediet 3 - 5 ganger / min på en strømningshastighet på 1 mL/min. Dermed forbedret den totale oksygentilførsel til hjernen skiver sterkt selv ved relativt lav perfusjon priser, fortsatt levere en stabil temperatur og høy signal-til-støy-forhold. Viktigst, er det mulig å holde ekstracellulære K+ konsentrasjonen til en fysiologisk verdi.

4AP modell av ictogenesis krever ikke noen vesentlig endring av ACSF ioniske sammensetning, for eksempel senke Mg2 + eller økende K+, og tilbyr unike fordelen av beholder både eksitatoriske og inhibitory overføringer 12, et aspekt som er svært relevant i epilepsi forskning i lys av avgjørende rollen som både glutamatergic og GABAergic nettverk i epileptiform synkronisering (jf. 7). 4AP-ACSF brukes i denne protokollen inneholder en fysiologisk K+ konsentrasjon (3,25 mM) og en litt lavere Mg2 + konsentrasjon enn holder ACSF (1 mM versus 1.3 mM). Denne konsentrasjonen fortsatt faller innenfor rapporterte fysiologiske verdiene av Mg2 + konsentrasjon i gnager CSF, og den brukes i mange laboratorier (se for eksempel17,18). Formålet med protokollen som beskrevet, har vi funnet at dette svak nedgang foretrekkes til hjelp i effekten av 4AP.

I tidligere arbeid utlignet 4AP til hjernen stykket når det allerede var plassert inne innspillingen kammer17,18. Hvis ikke eksperimentator trenger å observere tid ventetid mellom 4AP programmet og utbruddet av epileptiform mønstre, finner vi at denne tilnærmingen er ganske tidkrevende og er ikke egnet til å forfølge lengre opptak og stimulering økter beskrevet i denne protokollen. Pre-inkubering av hjernen skiver i 4AP ved 32 ° C kan spare mye eksperimentelle tid, siden hjernen skiver kan være pre-behandlet i serien mens forfølge eksperimentere med andre vev deler.

Langvarig levedyktigheten til hjernen skiver kan være nyttig å analysere nettverksfunksjoner på lang sikt. Videre er deres bedre resiliens å gjentatte elektrisk stimulering av stor fordel hvis eksperimentator ønsker å sammenligne flere stimulering protokoller, som må utføres i samme hjernen stykke for statistiske robusthet. I våre hender når du tester 3 stimulering protokoller, hver innledes med en kontroll fase og etterfulgt av en restitusjonsfasen, eksperimentet kan vare 3-5 h. I denne sammenheng er live MEA kartlegging avgjørende for å aktivere den riktige veien og undertrykke i stedet for å favorisere ictogenesis via elektrisk stimulering. Vår brukervennlig GUI representerer en rask, enkel og fleksibel verktøyet å kartlegge elektrodene på ulike hjernen strukturer. I motsetning til kommersiell programvare er det mulig å legge til egendefinerte MEA oppsett selv med grunnleggende programmering. Bilder kan skaffes i lyse-feltet. dermed egner alle generelt kamera som har god oppløsning og passer på et mikroskop. En invertert mikroskopet er viktig å visualisere microelectrodes posisjon i forhold til hjernen sektoren, siden dette ville være gjemt under vevet hvis bruker en oppreist mikroskop. Stereo-mikroskop anbefales imidlertid i tillegg til omvendt hvis eksperimentator må utføre kniv-kutt for å forstyrre bestemte neuronal stier.

Til slutt, en ytterligere fordel av den foreslåtte tilnærmingen er billig og relativt lett montering av de fleste av de nødvendige verktøyene, som egendefinert innspilling kammeret og holde chambers, varme bad og skive ankeret, i tillegg til unødvendig bruk av en kostbar lav støy peristaltiske pumpe.

Begrensninger av teknikken:

MEA opptak tillater ikke visualisere veldig treg bølger, dvs, DC skift i signalet. Slike opprinnelige avvisninger er kan hjelpe asymptotisk måling av ictal utslipp varighet, og viktigst, de er grunnleggende for å studere kortikale spre depresjon (et fenomen som gjelder plutselig uventede død i epilepsi32 og deles mellom epilepsi og migrene33).

Når det gjelder elektrisk neuromodulation kan protokollen beskrevet her utføre flere stimulering økter uten å påvirke hjernen stykke levedyktighet. Vi kunne utføre opptil 3 stimulering økter med 20-45 min, lik hva rapportert i forrige arbeid25. Selv om hjernen skiver kan sannsynligvis tåle mange stimulering økter eller lengre stimulering protokoller, gjorde vi ikke teste hjernen sektorene i denne forbindelse. Det anbefales at du begrenser antall stimulering protokoller til 3 og unngå langvarig (≥60 min) stimulering økter, noe som kan betydelig stress hjernevev vedlikeholdes under disse grense forhold til mangelen på utvinning på stimulans tilbaketrekning.

Avgjørende skritt i protokollen:

Flere kritiske faktorer kan hindre vellykket jakten på opptak og modulering av epileptiform aktiviteten i hjernen skiver koblet til MEA. Foruten gnagerarter brukes og kvaliteten på hjernen skiver, perfusjon hastigheten under opptak og dynamikk av ACSF (dvs., laminær versus rundskriv) i innspillingen kammeret, vi har funnet at vilkårene for utvinning og langsiktig vedlikehold av hjernen skiver samt modusen av 4AP programmet er de viktigste trinnene.

Når du bruker en neddykket holder kammer er det avgjørende å lagre hjernen skiver ved romtemperatur å bevare hjernen vev nettverksaktivitet og favorisere induksjon av ictal-lignende utslipp av 4AP program. I våre hender forverret utvinning og vedlikehold ved 32 ° C hjernevev innen 3-4 timer av slicing.

Inkubasjon av hjernen skiver i 4AP-ACSF ved romtemperatur og opptak ved 32 ° C er ikke ønskelig. Vi har funnet mange vanskeligheter i å observere robust tilbakevendende ictal utslipp i denne tilstanden. Lave temperaturer i området 20-24 ° C har blitt rapportert å dempe eller hindre 4AP-indusert ictogenesis både i vitro34 og i vivo35. Dermed 4AP inkubasjon og opptak temperaturen må være innenfor 30-34 ° C og må samsvare. For å unngå å sette hjernevev under mye stress på grunn av samtidige induksjon av hyperexcitability av 4AP og plutselig eksponering av hjernen skiver fra rom temperatur å varme (32 ° C) 4AP-ACSF, er det grunnleggende å utføre en mellomliggende forvarming trinn og la hjernen skiver venne i holder ACSF ved 32 ° C i 20-30 min. hopper over dette trinnet kan påvirke ictogenesis induksjon av 4AP.

Et annet aspekt som må nevnes er betydningen av D-glukose konsentrasjon i ACSF etter kutting. En 25 mM konsentrasjon bevarer hjernen skiver bedre enn 10 mM konsentrasjonen brukes i mange laboratorier og det også forbedrer frekvensen av forekomsten av ictal aktivitet, som er 2-fold raskere (dermed gjør det enklere å forfølge en lang rekke eksperimentelle protokoller i flere hjernen skiver hver dag).

Til slutt, noen viktige fine detaljer under kutting prosedyren må nevnes. Først, ikke tillater det intakt hjernen og hjernen skiver fryse i kulden kutte ACSF. Kjøling hjernen for < 2 min er tilstrekkelig gitt den lille størrelsen på musen hjernen. Vev delene skal overføres umiddelbart fra bufferbrettet til de skyllingsprosess kanner ved romtemperatur. Skylling kutte er ACSF svært viktig ellers high sukrose konsentrasjonen vil gjøre hjernen skiver stikke til nylon maske av holder kammeret. For å effektivt skyll vev, er det viktig å minimere kutte ACSF innholdet i overføring pipette slik at den ikke forurenser holde ACSF overdrevet. 2-trinns skylling hjelpemidler i å redusere forurensning. Ved ferdigstillelse av kutting prosedyren, skal vev delene overføres umiddelbart fra de skyllingsprosess kanner til holder kammeret, hvor det bløt nylon maske suspendert halvveis i holder ACSF lar vev oksygenering på begge sider. Det samme prinsippet bør brukes på alle stadier i kutting fremgangsmåten: hjernen skiver bør aldri sitte på bunnen av begeret, bør de ikke være i kontakt med sidene av holder kammer og de skal aldri i kontakt med hverandre eller overlappe.

Endringer og feilsøking:

ACSF komposisjon kan endres av eksperimentator behov. Narkotika kan for eksempel legges til dissekere bidrag av bestemte nevrotransmittere eller ionekanaler til effekten av elektriske neuromodulation. Videre kan pyruvic og askorbinsyre (jf. tabell 2) bli utelatt, selv om vi finner at de utøve en mektig neuroprotective rolle. Vi rapporterer i tabell 3 de vanligste problemene som kan oppstå i denne protokollen og hvordan håndtere dem.

Konklusjoner:

MEA innspillingen er utvilsomt en uvurderlig teknikk å ta samspillet av nevrale nettverk i helse og sykdom. I tillegg farmakologiske studier er det også mulig å vurdere elektrisk neuromodulation protokoller som er relevante for DBS brukes epilepsi og andre nevrologiske lidelser. I denne protokollen, har vi vist at det er mulig å gjenskape typiske periodiske stimuli eksperimenter med samme resultat de med konvensjonelle ekstracellulære felt potensielle opptak og eksterne stimulere elektroder. Den økende tilgjengeligheten av kommersielle brukervennlig utstyr og avansert programvareverktøy gjøre MEA opptak teknikken også egnet for lukket stimulering eksperimenter, å gi ad hoc stimulering hjernevev, og å undersøke bidrag av tilbakemelding mekanismer nevrale nettverk svar.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

G.P. er Marie Skłodowska-Curie Fellow finansiert av EU MSCA-hvis-2014 prosjektet Re.B.Us, G.A. n.660689, under framework programmet H2020. GUI-mapMEA er tilgjengelig ved forespørsel til forfatter ilaria.colombi@iit.it.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine  Sigma-Adrich P7886 Needed for MEA coating
NaCl Sigma-Adrich S9888 Chemical
KCl Sigma-Adrich P9541 Chemical
KH2PO4 Sigma-Adrich 795488 Chemical
CaCl2*2 H2O Sigma-Adrich C3306 Chemical
D-Glucose Sigma-Adrich RDD016 Chemical
NaHCO3 Sigma-Adrich S5761 Chemical
MgCl2*6 H2O Sigma-Adrich M2670 Chemical
MgSO4*6 H2O Sigma-Adrich M5921 Chemical
Sucrose Sigma-Adrich RDD023 Chemical
Pyruvic Acid, 98%  Sigma-Adrich 107360 Chemical
4-aminopyridine Sigma-Adrich A78403 Convulsant drug
STG-2004 Multichannel System STG4004-1.6mA 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060 Multichannel System N/A MEA amplifier
planar MEA Multichannel System 60MEA500/30iR-Ti w/o ring Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack Multichannel System Recording software
McStimulus II Multichannel System STG4004 control software
TC02 Multichannel System TC02 2-channel thermostat
PH01 Multichannel System PH01 Heating perfusion canula
MPH  Multichannel System MPH  Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43 Wacker E43 Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber Crisel Instrument SKE-chamber MEA Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm  Crisel Instrument 64-1309 Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme Sigma-Adrich Z273287-1EA Enzymatic cleaner
MATLAB The Mathworks Programming environment for electrodemapping
VT1000S Leica Biosystems VT1000S Vibratome
Warner Instruments 64-1309 Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
  2. WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
  3. Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
  4. Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
  5. Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
  6. Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
  7. Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
  8. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
  9. Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
  10. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
  11. Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
  12. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
  13. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
  14. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
  15. Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
  16. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
  17. Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
  19. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  20. Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
  21. MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
  22. Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  23. Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
  24. Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
  25. Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
  26. Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
  27. D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
  28. Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
  29. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
  30. Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
  31. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
  32. Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
  33. MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
  34. Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
  35. Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).

Tags

Nevrovitenskap problemet 135 epilepsi 4-aminopyridine hjernen stykke mus multielectrode matrise neuromodulation
Opptak og modulering Epileptiform aktivitet i gnager hjernen skiver koplet til Microelectrode matriser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Panuccio, G., Colombi, I.,… More

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter